OBTENÇÃO DA PROTEÍNA NÃO ESTRUTURAL NS1 DO VÍRUS
NATIVO
DA
DENGUE
DO
TIPO
II
(DENV-2)
POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
T. S. Estrázulas1; D. R. Gondim1; M. V. Tilburg2; M. I. F. Guedes2; D. F. de Oliveira2; I. J. Silva Jr1
1-Departamento de Engenharía Química – Universidade Federal do Ceará
Grupo de Pesquisa em Separação por Adsorção – GPSA. Campus do Pici, Bloco 709, CEP: 60455-760 – Fortaleza – CE – Brasil
Telefone: (85) 99840-4144 – Email: ivanildo@ufc.br
2- Laboratório de Biotecnologia e Biologia Molecular – Universidade Estadual do Ceará
Av. Dr. Silas Munguba, 1700 - Campus do Itaperi - bloco D, 1 andar, Sala 01, CEP: CEP:60740-903 – Fortaleza – CE – Brasil
Telefone: (85) 3101-9822 – Email: mauricio_van_tilburg@yahoo.com.br
RESUMO: O objetivo do trabalho foi identificar a adsorção da proteína não estrutural NS1 do vírus nativo da Dengue Tipo II (DENV-2), através de um perfil cromatográfico utilizando cromatografia de afinidade, com coluna empacotada com corante Procion Red MX-5B imobilizado a matriz de Quitosana. Foram realizados ensaios cromatográficos com amostra de NS1-DENV2 diluída em Tampão Fosfato de Sódio pH 5,9, cuja finalidade foi identificar a retenção de NS1 nas amostras das etapas cromatográficas. Nestes ensaios, foi possível confirmar que a fase estacionária promoveu significativa retenção por NS1, uma vez que, as amostras coletadas na etapa de eluição, demonstraram a presença desta proteína (SDS-PAGE). Foi possível confirmar através da técnica Dot-Blot, a presença de NS1 em 4 amostras coletadas ao longo da etapa de eluição.
PALAVRAS-CHAVE: Vírus da dengue (DENV); Proteína não estrutural NS1; Cromatografia de Afinidade; Ligantes-Corantes.
ABSTRACT: The aim of this work was to identify the adsorption of the NS1 non-structural protein of Dengue Type II native virus (DENV-2), through a chromatographic profile using affinity chromatography, with column packed with Procion Red MX-5B dye immobilized the matrix of Chitosan. Chromatographic assays were performed with NS1-DENV2 sample diluted in Sodium Phosphate Buffer pH 5.9, whose purpose was to identify the retention of NS1 in the samples of the chromatographic steps. In these assays, it was possible to confirm that the stationary phase promoted significant retention by NS1, since the samples collected in the elution stage demonstrated the presence of this protein (SDS-PAGE). It was possible to confirm through the Dot-Blot technique the presence of NS1 in 4 samples collected along the elution step.
KEYWORDS: Dengue virus (DENV); Non-structural protein–NS1; Affinity chromatography; Binders-Dyes.
1.
INTRODUÇÃO
A Dengue é uma doença sem contagio, porém, infecciosa ocasionada pelo vírus da dengue (DENV), o qual é transmitido pela fêmea da espécie Aedes aegypti através da sua saliva. A DENV já infectou em torno de 100 milhões de pessoas no mundo, onde 500 mil pessoas apresentaram os dois estágios mais avançados da doença: a febre hemorrágica da dengue e a síndrome de choque da dengue (WHO, 2016).
Este vírus trata-se de um arbovírus (vírus transmitidos por insetos e aracnídeos), da família Flaviviridae sendo o gênero dos flavivírus, o qual apresenta quatro sorotipos virais, tais como, DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, que podem ocasionar a forma clássica da doença e a mais grave como a Dengue Hemorrágica (Musso e Gubler, 2016 e Westaway et al., 1996). Estes tipos virais são transmitidos por mosquitos em maior parte dos casos (Ciota e Kramer, 2010).
Cada partícula do vírus consiste de um genoma viral com uma fita simples de RNA com polaridade positiva com aproximadamente 11 mil pares de base. O genoma codifica uma poliproteína que é dividida em três proteínas estruturas (E, prM e C) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). As proteínas estruturais que são responsáveis por proteger o RNA viral são, a proteína do capsídeo (C), a pré membrana (M), e a proteína do envelope (E). Já as proteínas não estruturais são responsáveis pela replicação do vírus (Lindenbach, et al., 2007).
A proteína não estrutural, NS1 é codificada pelo genoma viral e pode ser encontrada em duas formas (monômero e dímero). Esta proteína pode ser expressa em sua forma solúvel que passa a ser secretada para o sangue pelas células infecciosas. A forma secretada da proteína NS1 pode ser utilizada para a produção de anticorpos mono e policlonais através da sua purificação e posterior imunização, cuja atividade desses anticorpos geram proteção ao vírus (Costa, et al., 2006). Esta proteína está relacionada com a patogenicidade da infecção e, mais recentemente, vem sendo utilizada como marcador precoce da infecção por DENV, visto a possibilidade de identificação quanto à presença de NS1 no soro de pacientes infectados, uma vez que, que esta proteína circula em níveis
elevados no sangue durante a fase aguda da doença. (Stohlman, et al., 1975; Westaway, et al., 1996).
Na literatura existem alguns estudos que trabalham com a purificação da NS1, sendo obtida de forma recombinante, com adição de uma cauda de histidina, ou utilizando sistema de expressão em bactérias com organismos procariotos, através do uso da Escherichia coli que é amplamente utilizada neste tipo sistema de expressão, devido ao baixo custo e à facilidade de manipulação (Gagnon, et al., 2012; Yohan, et al., 2016 e Amorin, et al., 2010).
Através deste tipo de expressão, é possível utilizar técnicas de purificação com cromatografia de afinidade em coluna niquelada, devido á especificidade que este tipo de coluna possuí com a cauda de histidina, bem como a utilização de duas etapas de purificação, sendo utilizado primeiramente uma coluna de imunoafinidade, seguida por uma coluna de troca iônica (Amorin, et al., 2010 e Falconar e Young, 1990).
Entretanto, estes sistemas de expressão, na maioria das vezes não são eficazes na produção de proteínas recombinantes semelhantes à forma selvagem (nativa do vírus) devido à sua simplicidade. Ainda neste contexto, o arranjo conformacional do epítopo do vírus sintetizado não é semelhante ao epítopo do vírus nativo, afetando desta forma a produção de anticorpos que são gerados pela resposta imune, posterior a imunização do vírus no organismo. Nestes tipos de sistemas (bactérias) os mecanismos não são capazes de realizar modificações pós-traducionais os quais estão presentes em organismos superiores (Kamionka, 2011).
Variedades de técnicas de separação são aplicadas em processos de adsorção, visando a purificação de proteínas, dentre as quais se destacam as técnicas cromatográficas por afinidade. A cromatografia de afinidade é um método de separação bioquímica que proporciona uma interação reversível entre o ligante e a proteína de interesse. Essa alta especificidade de ligação proporcionada pelo ligante é utilizada para adsorção seletiva de proteínas alvo em uma mistura complexa de proteínas. A etapa de eluição é através de competitivos análogos ou através de ajustes em fatores, como pH e força iônica. Este tipo de método cromatográfico oferece significante
vantagem para a purificação de anticorpos e fragmentos de anticorpos, para qualquer fonte de proteínas, proporcionando uma alta seletividade e alta capacidade para com a proteína alvo (Ayyar et al., 2012; Healthcare, 2010).
Esses ligantes podem ser bioespecíficos ou pseudobiespecíficos. Os bioespecíficos possuem elevada afinidade pela biomolécula alvo, no entanto, possuem custo elevado e geralmente precisam de condições drásticas para eluição dessas biomoléculas. Em compensação, os ligantes pseudobiespecíficos apresentam média afinidade com a proteína alvo e possuem baixo custo. Os ligantes pseudobioespecíficos são relacionados a purificação através de corantes, aminoácidos e íons metálicos, que apresentam normalmente média afinidade para proteínas típicas do soro e têm se mostrado seletivo para a purificação de albumina e imunoglobulina humanas (Vijayalakshmi, 1989).
As matrizes à base de quitosana podem ser utilizadas para purificação de biomoléculas devido a sua disponibilidade e facilidade de obtenção. Nexte contexto, há estudos sobre o uso de adsorvente à base de quitosana/alginato modificada quimicamente na adsorção de BSA e celulase em sistema de leito fixo. Esta modificação na matriz foi capaz de adsorver estas biomoléculas com capacidade de adsorção moderada, quando comparado com materiais similares, bem como, boa estabilidade mecânica e química e regenerabilidade (Gondim, 2012; Rodrigues, 2010).
Ainda neste contexto, a literatura aborda que corantes têxteis, têm sido utilizados na cromatografia de afinidade devido ao seu baixo custo (Yavuz et al., 2006). Esses corantes imobilizados em diferentes matrizes cromatográficas têm sido empregados como ligantes de afinidade para adsorção de proteína, por possuírem grande afinidade por biomoléculas (Bayramoglu et al., 2007, Wongchuplan et al., 2009). Isso se deve às interações específicas e não específicas por efeito de permutação de cátions, como se deve aos efeitos de interações hidrofóbicos ou de ligações de hidrogênio entre a biomolécula e os anéis aromáticos do corante.
Buscou-se identificar o perfil cromatográfico de retenção da proteína não estrutural NS1 do vírus nativo da Dengue Tipo II (DENV-2) utilizando cromatografia de afinidade com corante Procion
Red MX-5B imobilizado a matriz de quitosana/alginato epoxidado – QAE, a fim de determinar um método cromatográfico que permita proporcionar uma maior concentração desta proteína.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Materiais
O corante Procion Red MX-5B e os reagentes, anticorpo monoclonal Anti-Dengue vírus NS1, anticorpo produzido em rato, corante Coomassie Brilliant Blue, tetrametilenodiamina (TEMED), persulfato de amônio e o Trizma-base (TRIS) foram obtidos da Sigma-Aldrich (EUA). A solução de 30% de Acrilamida/bis foi obtida da Bio-Rad. A quitosana utilizada foi obtida da Polymar (Brasil). O alginato de sódio e o fosfato de sódio foram obtidos da VETEC (Brasil). A Albumina do soro bovino (BSA) foi obtida da Inlab. O padrão de baixo peso molecular (LMW) contendo as seguintes proteínas: Phophorylase - 97 kDa, Albumine - 66 kDa, Ovalbumin Carbonic - 45 kDa, Anhydrase - 30 kDa, Trypsin inhibitor – 20,1 kDa, foi adquirido da GE Healthcare (EUA). Os demais reagentes utilizados são de grau analítico. Todas as soluções foram feitas com água ultrapura Mili-Q.
O procedimento de síntese do compósito Quitosana/Alginato Epoxidado (QAE), s e a imobilização do corante Procion Red MX-5B (PR-MX5B), foi descrito em trabalhos anteriores (Gondim, 2012; Gondim, et al., 2012; Gondim, et al., 2014).
2.2. Métodos
2.2.1. Obtenção da proteína não estrutural NS1 nativa do vírus da Dengue do tipo II (DENV-2): As amostras de NS1 produzidas em Células Vero foram cultivadas em garrafas de 75 cm2 a 37º C em meio L-15 acrescido de 5% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina) até atingirem confluência igual ou superior a 90%. Em seguida, as garrafas contento as células foram lavadas com PBS pH 7,4 e infectadas com o vírus da Dengue 2 por duas horas e 37º C. Após esse período, foi acrescentado meio L-15 com 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina) sem soro fetal bovino e incubadas a 37º C por aproximadamente 4 dias,
período. Decorrido esse período, o meio de cultura contendo o vírus e suas partículas virais, foram coletados.
2.2.2. Caracterização inicial da amostra bruta com a proteína NS1-DENV2: A amostra bruta coletada no meio de cultura, apresentou várias proteínas além da NS1. Neste caso estão presentes proteínas do capsídeo, envelope e membrana, bem como a presença de albumina em decorrência do acréscimo de soro fetal bovino para etapa de expressão em células Vero da proteína NS1 e proteínas da própria célula Vero. Para isso foi necessário realizar etapas de caracterização da amostra bruta, pela técnica de eletroforese SDS-PAGE e Dot-Blot (DB), a fim de confirmar a presença da NS1 no meio de cultura.
2.2.3. Ensaios Cromatográficos: Os experimentos cromatográficos com amostras de NS1-DENV2 foram realizados com a injeção de um pulso de 1 mL de solução de proteína com concentração de 0,4 mg/mL e vazão de 1 mL/min. As soluções foram preparadas no tampão Fosfato de Sódio pH 5,9 25 mM e a eluição foi realizada com a adição de NaCl 1,0 M ao tampão de adsorção. A etapa de lavagem após a injeção de 1 mL foi cerca de 15 min, a vazão utilizada foi de 1 mL/min. Para esse estudo foi utilizado o sistema em leito fixo constituído por: uma bomba peristáltica (Watson Marlow, Modelo Q 400), uma coluna cromatográfica (C 10/10 da GE Healthcare), empacotada com a fase estacionária (Procion Red MX-5B imobilizado a matriz de Quitosana Alginato Epoxidado - QAE), um coletor de frações (Buchi, Modelo C-660) e um espectrofotômetro (Thermo Cientific Biomat 3).
2.2.4. Determinação de proteínas totais: As concentrações de proteínas totais das amostras coletadas nos ensaios cromatográficos foram determinadas de acordo com a metodologia de Bradford e utilizou-se albumina de soro bovino (BSA) para a construção da curva de calibração para este método, conforme reportado na metodologia descrita por Bradford (BRADFORD, 1976). A quantificação das amostras coletadas nos ensaios cromatográficos foi utilizando 0,20 uL de amostra em contato com 1,0 mL do reagente de Bradford por aproximadamente 10 min em cubetas de poliestireno em ambiente que proporcionasse ausência de luz. Após esse período, as leituras das amostras foram realizadas em espectrofotômetro
no comprimento de onda de 595 nm. Em seguida, foram obtidos os valores de concentração de proteínas totais com a curva de calibração anteriormente estabelecida.
2.2.5. Eletroforese (SDS-PAGE): A técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes e não redutoras (SDS-PAGE) foi utilizada para caracterização inicial das amostras brutas com NS1-DENV2 a fim de identificar a presença de NS1 e demais proteínas presentes na amostra. As análises foram realizadas no equipamento Mini Protean III (BioRad, EUA) utilizando o gel de poliacrilamida (30% de acrilamida e 2,7% de bisacrilamida), conforme protocolo apresentado por Laemmli (1970), na concentração de 10%. As frações cromatográficas de cada etapa foram aquecidas a 95 °C por 4 min e alíquotas de 10 à 20 µL de cada amostra foram aplicadas aos géis. Os géis foram submetidos a uma voltagem de 150 V, em cubas verticais e a coloração foi realizada com o corante comassie brilhante blue.
2.2.6. Dot-Blot (DB): A membrana de nitrocelulose (MN) (Membrana de nitrocelulose SIGMA Dura-blottm, com poro de 0,45 mm) foram adicionadas na membrana 60 poços onde adicionou-se, em cada poço, 3 µL de cada fração cromatográfica obtida nos ensaios cromatográficos. Na MN foram adicionados dois poços contendo o controle positivo (Solução com presença de NS1) e um controle negativo (Solução sem a presença de NS1). Os sítios livres de ligação de proteínas presentes foram bloqueados com 5% de leite desnatado em PBS + 0,05% de Tween20 por 60 minutos. Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes por 10 min com PBS + 0,05% de Tween20, a fim de remover totalmente a solução de bloqueio, para posterior etapa de adição do anticorpo monoclonal Anti Dengue vírus NS1, anticorpo produzido em rato (SIGMA-ALDRICH) diluído (1/5000) em PBS + 0,05% de Tween20 por 1 hora. Após sucessivas lavagens com PBS + 0,05% de Tween20, seguiu-se incubação com anticorpo secundário, Anti-Mouse IgG, produzido em bode (SIGMA-ALDRICH) diluído (1/5000) em PBS + 0,05% de Tween20, acoplado a peroxidase por mais uma hora. Após lavagens sucessivas com PBS + 0,05% de Tween20, a membrana foi revelada com a solução de 30 mL com PBS + 0,01 g de 3,3' Diaminobenzidina tetrahidrocloreto
(DAB) - Sigma + H2O2 + 0,04 g de Nitrato de Prata.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Experimentos Cromatográficos
A NS1-DENV2 possui seu ponto isoelétrico (pI) de 5,8 (Amorin, et al., 2010). É justamente neste ponto em que as cargas das proteínas são nulas, de modo que a proteína passa a ser adsorvida como molécula específica no ligante da coluna de afinidade. A Figura 1 demonstra o perfil cromatográfico obtido na corrida eluição isocrática de 30 min utilizando a amostra de NS1-DENV2 diluída em Tampão Fosfato de Sódio pH 5,9 25 mM, com concentração de 0,4 mg/mL, essas condições foram utilizadas a fim de acompanhar o comportamento cromatográfico utilizando corantes pseudobioespecíficos (PR-MX-5B) para adsorção de NS1-DENV2.
Figura 1. Perfil cromatográfico da injeção de 1,0 mL da amostra NS1-Denv-2 (C=0,4 mg/mL) na coluna empacotada com QAE-PR-MX5B. Etapas:
7-9 min (adsorção); 10-23 min (lavagem); 24-54 min (eluição); 55-60 min (Re-equilíbrio).
Neste ensaio foram coletadas amostras de 1 em 1 min através de um coletor de frações (Buchi, Modelo C-660) e todas as amostras desta corrida foram quantificadas pelo método de Bradford. As amostras que obtiveram concentrações que indicassem a presença de proteínas foram utilizadas para realizar a eletroforese e identificar a presença de NS1 (Figura 2-A e Figura 2-B).
Neste ensaio houve um aparecimento de um pico significativo de maior intensidade na etapa de
lavagem. Destaca-se que a partir de 30 min da corrida, houve somente a formação de 4 picos na etapa de eluição. Este fato deve-se que a maioria das proteínas que foram adsorvidas na coluna, apareceram na etapa de eluição, conforme pode ser visto na Tabela 1, onde praticamente todas proteínas adsorvidas saíram na eluição, haja vista que o balanço de massa (massa de proteínas que entrou = massa de proteínas que sairam) fechou, ou seja, tudo que entrou (injetado) na coluna saiu na eluição (41,85%).
Tabela 1. Balanço de massa por etapa Etapa Massa (g) Porcentagem (%)
Injeção 0,405 100,00% Adsorção 0,005 1,11% Lavagem 0,227 55,93% Eluição 0,170 41,85% Re-Equilibrio 0,000 0,00% Total 0,401 98,89%
Esta corrida resultou em 60 amostras coletadas, para posterior quantificação por Bradford e ensaios de SDS-Page 10%. Em cada gel foi adicionado poço com amostra inicial (NS1-DENV2) e o poço 10
com
albumina (A).Analisando a eletroforese das amostras (Figura 2-A e 2-B), foi possível perceber um pico significativo na etapa de lavagem (Figura 2-A - Amostras 10 a 16), este apresentou uma concentração de 0,24 mg/mL. Comprova-
se pelo
aparecimento de maior quantidade de albumina, destacado em amarelo na Figura 2-A (comparado com o padrão de referência Albumina – A – peso molecular 66 kDa), ou seja, nesta condição grande parte da Albumina presente na amostra inicial não é adsorvida, uma vez que, o pI (ponto isoelétrico) da albumina é de 4,7, ou seja, não esta sendo favorável a adsorção desta proteína nesta fase. Neste contexto, também destaca-se a possibilidade da NS1 presente na amostra inicial estar sendo adsorvida pela matriz de pseudobioafinidade.Figura 2-A e 2-B. SDS-PAGE 10% – Eluição isocrática 30 min – Concentração de 0,35 mg/mL. Descrição dos poços da eletroforese: Padrão de Baixo Peso Molecular – LMW, Amostra Inicial – I (NS1-DENV2
diluída em Tampão Fosfato de Sódio pH 5,9), Amostras 10 a 16 (lavagem); 32 a 54 (eluição) (conferir Figura 1), Proteína de Referência Albumina – A; Colchetes amarelos (Presença de bandas próximas ao peso molecular da Albumina 66 kDa nos poços) e Colchetes vermelho (Presença de bandas de proteínas referente
ao peso molecular da NS1, 45-50 kDa)
Nas amostras coletadas a partir de 32 min na etapa de eluição com 1M de NaCl, é possível perceber que somente na amostra 31 aparece uma banda leve de albumina (destacado em amarelo na Figura 2-A), seguida por uma banda leve de proteína com peso molecular próximo ao da NS1 (45–50 kDa) destacado em vermelho na Figura 2-A.
Neste ensaio, só foi possível perceber bandas mais leves de albumina (Destacado em amarelo na Figura 2-B), a partir de 48 min, referente ao segundo pico da etapa de eluição. Com isso é possível destacar que boa parte da albumina presente na amostra inicial, não foi adsorvida pelo pela matriz de pseudobioafinidade, nas condições utilizadas para a etapa de lavagem e com isso pouca quantidade desta proteína é perceptível na eluição.
Contudo ao longo da corrida só foi possível perceber proteína no peso molecular da NS1, somente na amostra 31, destacado em vermelho no segundo gel da Figura 2-A. O aparecimento de bandas de proteínas leve, deve-se ao fato da baixa concentração de NS1 na amostra inicial (I).
Tais resultados demonstram também que o adsorvente possui pouca afinidade com a albumina
presente na amostra e identificou uma afinidade relativa com a proteína NS1. Neste ensaio, foi possível perceber o aparecimento de proteína referente a NS1, somente na amostra 31 (Eluição – Pico 1), porém nota-se que aparece uma banda mais leve desta proteína. Com isso, todas as amostras coletadas neste ensaio com coluna C10/10-PR-MX5B-QAE foram utilizadas para realizar uma busca quanto a presença de NS1 pela técnica de Dot-Blot (DB) no item 3.2.
3.2. Técnica Dot-Blot (DB) das amostras
coletadas
A Figura 3 representa a membrana de nitrocelulose (MN), onde foram adicionadas os Dot-Blots na ordem de 1 até 60 as amostras referentes ao ensaio cromatográfico (Figura 1) com amostra de NS1-DENV2 diluída em Tampão Fosfato de Sódio pH 5,9 25 mM. Nesta membrana foram utilizados o controle positivo (C+) e negativo (C-). O controle positivo refere-se a uma amostra adicionada que contenha a proteína NS1. Já o controle negativo refere-se a uma amostra que não tenha a presença de NS1 no meio.
Na Figura 3 percebeu-se que, na etapa
de
eluição isocrática, a partir de 29 min de ensaio cromatográfico, as amostras 29, 31, 36 e 37 (1ºPico da Eluição) marcaram a presença de NS1. Entretanto, nota-se que as amostras 29 e 31 marcaram levemente a proteína de interesse, no Dot-Blot, tendo em vista a baixa concentração desta proteína nesta amostra. Nas amostras 36 e 37 houve a presença desta proteína, de forma mais significativa. Não foi possível verificar a presença de NS1 em nenhuma outra amostra injetada até o final a Linha 6 (L-6) desta membrana
Figura 3. (MN) – Membrana de nitrocelulose utilizada na técnica Dot-Blot; Amostras 29, 31, 36
e 37, coletadas no ensaio com a amostra de NS1-DENV2 indicando as proteínas que marcaram a presença de NS1 de acordo com a membrana
utilizada na técnica de Dot Blot (MN). (C+) Controle Positivo – Presença de NS1 Recombinante; (C-) Controle Negativo – Sobrenadante L-15 sem a presença de NS1; (X)
Nenhuma mostra injetada no Dot-Blot; Com isso, pode-se destacar que o adsorvente obteve certa afinidade pela proteína NS1, uma vez que, foi identificado a presença desta proteína em 4 amostras da etapa de eluição, com destaque nos Dot-Blots das amostras 36 e 37, destacando uma quantidade significativa de NS1, eluídas da matriz PR-MX5B-QAE nesta etapa.
Ao analisar a eletroforese das amostras coletadas ao longo do perfil cromatográfico (Figura 2-A e Figura 2-B), que somente a amostra 31, apresentou uma banda de proteína próxima à da NS1 (45-50 kDa). Com isso, através da técnica Dot-Blot (Figura 3) foi possível verificar a real presença desta proteína nesta amostra.
Não foi possível verificar a presença de NS1, na etapa de Re-equilibrio, pois nesta etapa não foram removidas proteínas, uma vez que, todas as proteínas adsorvidas na coluna, foram removidas na etapa de eluição (Tabela 1). Essa é
uma das vantagens em se trabalhar com fases estacionárias sintetizadas (PR-MX5B-QAE) neste estudo, pois se exige condições mais amenas para eluição de proteínas, quando comparado a utilização de colunas de afinidade bioespecíficas e dessa maneira diminui as chances de causar danos na proteína dessorvida.
4. CONCLUSÃO
Este trabalho tinha como objetivo identificar a retenção da proteína não estrutural NS1, através de um perfil cromatográfico com coluna de afinidade. Através do estudo feito, foi possível destacar que a matriz de pseudobioafinidade utilizada neste trabalho apresentou grande potencial para vir a ser utilizada na retenção da proteína não estrutural NS1, objetivando obter uma maior concentração desta proteína, pois conforme observado na eletroforese o adsorvente, apresentou significativa retenção pela proteína NS1, uma vez que, foi possível identificar, o aparecimento de NS1 e outras proteínas na etapa de eluição. Com a técnica Dot-Blot, das amostras coletadas na etapa de eluição isocrática, foi possível perceber a presença de NS1 em 4 amostras, demonstrando que a matriz utilizada reteve a proteína de interesse nas condições utilizadas nos ensaios cromatográfico com cromatografia de afinidade.
5. REFERÊNCIAS
AMORIM, J. H.; PORCHIA, B. F. M. M.; BALAN, A.; CAVALCANTE, R. C. M.; COSTA, S. M.; ALVES, A. M. B.; FERREIRA, L. C. S. Refolded dengue virus type 2 NS1 protein expressed in Escherichia coli preserves structural and immunological properties of the native protein. Journal of Virological Methods, v. 167, p. 186– 192, 2010.
AYYAR, B. V. et al. Affinity chromatography as a tool for antibody purification. Methods, v. 56, n. 2, p. 116-29, 2012.
BAYRAMOGLU, G.; SENEL, A. U.; ARICA, M. A. Adsorption of IgG on spacer-arm and larginine ligand attached poly (GMA/MMA/EGDMA). Journal of Applied Polymer Science, v. 104, p. 672- 679, 2007.
CIOTA, A.; KRAMER, L. Insights into Arbovirus Evolution and Adaptation from Experimental Studies. Viruses, v. 2, p. 2594-2617, 2010.
COSTA, S. M.; FREIRE, M. S.; ALVES, A. M. DNA vaccine against the non-structural 1 protein (NS1) of dengue 2 virus. Vaccine, v. 24, n. 21, p. 4562-4564, 2006.
FALCONAR A.K.; YOUNG P.R., Immunoaffinity purification of native dimer forms of the flavivirus non-structural glycoprotein, NS1, J Journal of Virological Methods, v. 30 p. 323–332, 1990. GAGNON, R. K.; MORELAND, J. N.; RUEDL, C.; VASUDEVAN. G. S. Expression and immunoaffinity purification of recombinant dengue virus 2 NS1 protein as a cleavable SUMOstar fusion. Protein Expression and Purification, v. 82 p 20–25 2012.
HEALTHCARE. Strategies for Protein Purification Handbook. p. 167, 2010.
GONDIM, R. D.; LIMA L. P.; SOUZA, M. C. M.; BRESOLIN, T. L. I.; ADRIANO, S. W.; Azevedo, C. S. D.; SILVA, J. I. JR. Dye Ligand Epoxide Chitosan/Alginate: A Potential New Stationary Phase for Human IgG Purification. Adsorption Science & Technology, v. 30, n. 8, p. 701-712, 2012.
GONDIM, R. D.; DIAS, A. N.; BRESOLIN, T. L. I.; BAPTISTIOLLI, M. A.; AZEVEDO, C. S. D.; SILVA, J. I. JR Human IgG adsorption using dye-ligand epoxy chitosan/alginate as adsorbent: influence of buffer system. Adsorption-Journal of the International Adsorption Society, v. 20, n. 8, p. 925-934, 2014.
GONDIM, D. R. Quitosana/alginato epoxilado com corantes imobilizados como potencial fase estacionária para purificação de IgG do soro humano. Dissertação de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Universidade Federal do Ceará-UFC. Fortaleza, 2012.
KAMIONKA, M. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Current Pharmaceutical Biotechnology, v. 12, n. 2, p. 268-74, 2011.
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, n. 5259, p. 680-5, 1970. LINDENBACH, B. D.; THIEL, H. J.; CHARLES M. RICE, C. M. Flaviviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology., v.2, p.1102-1152, 2007.
MUSSO, D.; GUBLER, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews, v. 29, p. 487–524, 2016. RODRIGUES, E. C. Estudo de adsorção de celulase e albumina de soro bovino utilizando microesferas de quitosana/alginato quimicamente modificadas com epicloridrina. Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, Dissertação de Mestrado, Fortaleza – CE, 2010.
STOHLMAN, S. A. et al. Dengue virus-induced modifications of host cell membranes. Journal of Virological Methods, v. 16, p. 1017-26, 1975. VIJAYALAKSHMI, M. A. Pseudobioespecific ligand affinity chromatography. Trends Biotechnol. v. 7, p. 71, 1989.
WESTAWAY, E. G.; KHROMYKH, A. A.; HARVEY, T. J.; ABEDINIA, M. Expression and purification of the seven nonstructural proteins of the flavivirus Kunjin in the E. coli and the baculovirus expression systems. Journal of Virological Methods, v. 61, p. 47-58, 1996. WONGCHUPHAN, R., TEY, T. B., TAN, W. S., TAIP, F. S., KAMAL, S. M. M., LING, T. C. Application of dye-ligands affinity adsorbent in capturing of rabbit immunoglobulin G. Biochemical Engineering Journal, v. 45, p. 232-238, 2009
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Media Centre: Dengue and severe dengue.
Disponível em:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs11 7/en/.
YOHAN, B.; WARDHANI, P.; ARYATI.; TRIMARSANTO, H.; SASMONO, T. R. Production of recombinant dengue non-structural 1 (NS1) proteins from clinical virus isolates. Protein Expression and Purification, v. 129, p. 53-59, 2016.
