1 Pós-graduanda em Ciência dos Alimentos – Departamento de Ciência dos Alimentos – UFLA – 37200-000 – Lavras – MG– Brasil. E-mail: nadia.nb@ hotmail.com
2 Engenheira de Alimentos – Kerry Group – 37410-000 - Três Corações – MG – Brasil.
3 Professora – Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo – IFES – 29375-000 – Venda Nova do Imigrante - ES – Brasil. 4 Professora Associada – Departamento de Ciência dos Alimentos - UFLA – 37200-000 – Lavras – MG – Brasil.
Endereço para correspondência: Nádia Nara BATISTA, UFLA – 37200-000 – Lavras – MG– Brasil. E-mail: nadia.nb@hotmail.com
Formação de biofilme por Pseudomonas aeruginosa sobre
aço inoxidável em contato com leite e seu controle por
óleos essenciais
Resumo
Objetivo: Avaliar a ação bacteriostática e bactericida de
diferentes óleos essenciais sobre células planctônicas de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, bem como verificar a ação sanitizante, dos óleos essenciais que apresentarem a menor Concentração Mínima Inibitória (CMI), sobre o biofilme formado por esta espécie.
Material e Métodos: A ação bacteriostática foi realizada
por meio da determinação das CMIs dos óleos de Zingiber
officinale, Eugenia caryophyllus, Elettaria cardamomum, Citrus limon e Citrus reticulata v. tangerine. O tempo de
morte bacteriana foi determinado utilizando-se as CMIs de cada óleo essencial submetidos a diferentes tempos de contato. O biofilme de P. aeruginosa foi desenvolvido em cupons de aço inoxidável AISI 304 dispostos em placa de Petri contendo leite tratado por Ultra Alta Temperatura (UAT), sendo incubado sob agitação de 70 rpm, a 37 °C/96 horas. Células aderidas foram removidas através de swabs e enumeradas por contagem em placas após submissão a diferentes tratamentos. Resultados: Todos
os óleos essenciais apresentaram efeito bacteriostático, se destacando Z. officinale, E. caryophyllus e E. cardamomum, por apresentarem menor CMI. O tempo de morte de P.
aeruginosa foi de 10 minutos quando utilizadas soluções
a base de E. cardamomum e E. caryophyllus. No entanto, quando testados em biofilme, apenas E. caryophyllus eliminou as células bacterianas viáveis de P. aeruginosa.
Conclusão: E. caryophyllus é uma nova alternativa para
o controle do biofilme de P. aeruginosa na indústria de alimentos, pois, além de sua alta atividade antimicrobiana, é um composto natural, o que atende as exigências do mercado consumidor.
Palavras-chave: Atividade antibacteriana; óleos
essenciais; Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Objective: To evaluate bacteriostatic and bactericidal
effects of various essential oils on planktonic cells of
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and to test the
sanitizing efficiency of these oils in terms of minimum inhibitory concentration (MICs) toward the biofilm formed by this species. Materials and Methods: To verify the
bacteriostatic action, we determined the MICs of essential oils from Zingiber officinale, Eugenia caryophyllus,
Elettaria cardamomum, Citrus limon, and Citrus reticulata v. tangerine. The time-kill curves for P. aeruginosa were
constructed from the MICs of each essential oil (various contact periods). The P. aeruginosa biofilm was created on coupons of stainless steel AISI 304, which were placed in Petri dishes containing ultra-high-temperature milk. The incubation lasted for 96 hours at 37 °C, with agitation at 70 rpm. Adherent cells were removed with
swabs and counted by plating after various treatments.
Results: All the essential oils showed a bacteriostatic
effect, especially oils from Z. officinale, E. caryophyllus, and E. cardamomum, which showed a lower MIC. The
P. aeruginosa time-kill was 10 minutes when we used a
solution containing E. cardamomum or E. caryophyllus essential oil. Nevertheless, when we tested the essential oils on the biofilm, only the E. caryophyllus oil eliminated all the viable cells of P. aeruginosa. Conclusion: Essential
oil from E. caryophyllus is a promising bacteriostatic agent for control of P. aeruginosa biofilms in the food industry because this oil is a natural substance and has a strong antimicrobial activity. This combination of properties meets the requirements of the consumers.
Keywords: antibacterial activity; essential oil;
Pseudomonas aeruginosa.
Nádia Nara BATISTA 1*
Natália Gonçalves CAMARGOS 2
Maíra Maciel Mattos de OLIVEIRA 3
Roberta Hilsdorf PICCOLI 4
Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on stainless
steel in contact with milk and its control by essential oils
Introdução
Biofilmes podem ser definidos como comunidades microbianas que se encontram aderidas a superfícies sólidas e protegidas por uma matriz de exopolissacarídeos (15, 24).
Na indústria de alimentos o patógeno Pseudomonas
aeruginosa apresenta-se amplamente distribuído por
possuir características como a capacidade de sobreviver a baixas concentrações de nutrientes e de se multiplicar mesmo sob refrigeração, o que o torna conhecido como um microrganismo psicrotrófico (19).
Conforme Shah (21), a maioria dos psicrotróficos não sobrevive à pasteurização e ao tratamento por Ultra Alta Temperatura (UAT). Contudo, durante seu crescimento, produzem enzimas termoresistentes podendo causar gelatinização do leite UAT, desenvolvimento de sabor e aroma indesejáveis em leite pasteurizado, diminuição do rendimento de queijos e alterações sensoriais em iogurte. A presença de bactérias psicrotróficas na indústria de laticínio pode ocorrer, entre outros fatores, devido a deficiências em procedimentos de higienização (1, 2, 7, 8, 11, 18, 23).
Assim, diante da importância que a higienização desempenha na obtenção de alimentos seguros e de qualidade, além da adoção de práticas corretas para execução da mesma, novos procedimentos ou produtos nesta área vêm sendo pesquisados com intuito de tornar mais eficiente a remoção de resíduos de alimentos e a eliminação de microrganismos de superfícies industriais, evitando a formação de biofilmes microbianos. A utilização de óleos essenciais como sanitizantes naturiais, por exemplo, é uma dessas novas alternativas (14). Possibilidade ainda pouco estudada é a utilização em conjunto de óleos essenciais e detergentes, o que poderia reduzir para apenas uma etapa o procedimento de higienização.
Óleos essenciais, metabólitos secundários vegetais voláteis, se destacam pelas propriedades antibacterianas (14). Embora seu mecanismo de ação não seja plenamente compreendido, possivelmente esteja inicialmente ligado a perturbações dos compostos lipofílicos da membrana citoplasmática (3, 6).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação bacteriostática e bactericida de diferentes óleos essenciais sobre células planctônicas de P. aeruginosa ATCC 27853, bem como verificar a eficiência sanitizante, sobre o biofilme formado por esta espécie, dos óleos essenciais de
Eugenia caryophyllus e Elettaria cardamomum, utilizados
em soluções com ou sem a adição de detergente alcalino.
Material e Métodos
Cepa bacteriana utilizada, padronização, estocagem e preparo do inóculo
O microrganismo utilizado foi P. aeruginosa ATCC 27853. Para a padronização do número de células, a cepa foi inicialmente inoculada em 200 mL de caldo Brain Heart Infusion (BHI), o qual foi incubado a 37°C. Em seguida, a partir do BHI, a curva de crescimento foi determinada pela
realização periódica de leituras da absorbância da cultura a 600 nm e de diluições seriadas em água peptonada (0,1% p/v) com posterior plaqueamento em superfície para a determinação do Log UFC/mL, utilizando-se como meio de cultura ágar Triptona de Soja (TSA). Durante a realização de todo o experimento, a cepa foi estocada congelada em meio de cultura de congelamento (por 100 mL de água destilada: 15 mL de glicerol; 0,5 g de peptona bacteriológica; 0,3 g de extrato de levedura; 0,5 g de NaCl; pH 7,2). Para a reativação e utilização, uma alíquota do meio de cultura de congelamento foi transferida para tubos de ensaio contendo BHI, incubados a 37°C por 24 horas. Em seguida, a cultura foi estriada em TSA vertido em placas de Petri e incubada a 37°C por 24 horas. Das colônias formadas na superfície do TSA, uma alçada foi retirada e transferida para 200 mL de BHI, o qual foi incubado a 37°C, até atingir o número de células necessárias para a utilização no experimento, aproximadamente 9 Log UFC/mL, correspondente a densidade ótica de 1,01 a 600 nm.
Óleos essenciais
Foram utilizados óleos essenciais da casca de
Citrus reticulata v. tangerine (tangerina) e Citrus limon
(limão siciliano), da raiz deZingiber officinale (gengibre), dos botões florais de E. caryophyllus (cravo botão) e das sementes de E. cardamomum (cardamomo), sendo estes adquiridos da Ferquima Indústria e Comércio Ltda. Os constituintes majoritários, dos mesmos, indicados pela empresa fornecedora, foram, respectivamente: limoneno, limoneno, zingibereno e beta-sesquifelandreno, eugenol e α-terpineol.
Condução do experimento
O experimento foi conduzido em duas etapas. A primeira testou a atividade antibacteriana de diferentes óleos essenciais, com o objetivo de selecionar os mais efetivos para o desenvolvimento de soluções a serem utilizadas no controle do biofilme de P. aeruginosa. A segunda objetivou a formação do biofilme sobre superfície de aço inoxidável em contato com leite e a avaliação da atividade antibacteriana de soluções contendo os óleos essenciais selecionados, elaboradas com ou sem a adição de detergente alcalino (SANDET 874).
Atividade antibacteriana dos óleos essenciais contra células planctônicas
Concentrações Mínimas Inibitórias (CMIs)
As CMIs dos óleos essenciais de C. reticulata
v. tangerine, Z. officinale, C. limon, E. caryophyllus e E. cardamomum foram determinadas pela técnica de
diluição em ágar de acordo com metodologia proposta por Oussalah et al. (16), com adaptações. Foram preparados 50 mL de TSA acrescido de 0,5% de Tween 80 e os óleos essenciais foram adicionados em diferentes concentrações (0,0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 e 5,0 v/v). Para cada concentração, foram feitas duas repetições, cada qual representada por uma placa de Petri contendo,
aproximadamente, 25 mL de meio de cultura. A cepa da
P. aeruginosa foi transferida para caldo BHI e incubada
a 37ºC até atingir a concentração de aproximadamente 9 Log UFC/mL, sendo monitorada pelo espectrofotômetro. O plaqueamento em superfície foi realizado transferindo 0,1 mL do inóculo para a placa de Petri, e espalhado com alça de Drigalsky. A incubação foi realizada a 37°C por 24 horas. A menor concentração que resultou em ausência de crescimento bacteriano na superfície do ágar foi denominada CMI.
Curvas de morte bacteriana
As curvas de morte de P. aeruginosa foram determinadas utilizando-se as CMIs de cada óleo essencial. A cepa de P. aeruginosa foi inoculada em 200 mL de caldo BHI e incubada a 37ºC até atingir a concentração de aproximadamente 9 Log UFC/mL. Soluções foram elaboradas com os óleos essenciais nas CMIs, completando-se o volume referente ao óleo escompletando-sencial para 10% (v/v) do volume total da solução com etanol 95%. Água peptonada 0,1% (p/v) foi utilizada para completar o volume total da solução para 100% (v/v). A solução controle, por sua vez, continha apenas água peptonada e etanol. Em seguida, 1 mL do inóculo foi transferido para 25 mL de solução. As soluções foram mantidas a temperatura ambiente (25°C). A quantificação de P. aeruginosa foi realizada pela técnica da microgota após 10, 20 e 30 minutos. Para tanto, diluições seriadas foram realizadas em água peptonada 0,1% (p/v) e 10 µL das diluições adequadas foram inoculadas em placas de Petri contendo TSA que foram incubadas a 37°C por 18 horas. O resultado foi expresso em Log UFC/mL. A atividade bactericida foi detectada ao se obter resultados abaixo do limite de detecção da técnica de plaqueamento empregada (<3,00 Log UFC/mL).
Atividade antibacteriana dos óleos essenciais contra células em biofilme
Formação do biofilme bacteriano
A cepa de P. aeruginosa foi inoculada em 200 mL de caldo BHI e incubada a 37ºC até atingir a concentração de aproximadamente 8 Log UFC/mL. Em seguida, 0,6 mL do inóculo foi transferido para 59,4 mL de leite integral tratado por UAT. Posteriormente, os 60 mL foram transferidos para uma placa de Petri de 15 cm de diâmetro que continha 20 cupons de aço inoxidável AISI 304 (0,1 x 0,8 x 1,8 cm) devidamente higienizados (limpos individualmente em acetona, detergente alcalino, álcool 70% e enxaguados em água destilada estéril) e esterilizados (121°C por 15 minutos em autoclave). O sistema foi incubado a 37°C por 48 horas sob agitação de 70 rpm.
Após as 48 horas iniciais, os cupons foram lavados três vezes em água peptonada, para remoção das células não aderidas, e transferidos para uma nova placa de Petri estéril contendo 60 mL de leite UAT integral sem o inóculo bacteriano. O sistema foi novamente mantido sob agitação de 70 rpm a 37°C por 48 horas para permitir a formação completa do biofilme.
Tratamento dos cupons de aço inoxidável
Os óleos essenciais de E. caryophyllus e E.
cardamomum foram utilizados por apresentar maior efeito
antibacteriano nos testes iniciais. As composições das soluções de tratamento encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1. Composição das soluções de tratamento dos
cupons de aço inoxidável que continham células sésseis de
P. aeruginosa. Solução Composição (%) AP1 E2 DA3 OE4 Controle A 90,00 10,00 - -Controle B 89,00 10,00 1,00 -Tratamento A de E. cardamomum 89,75 10,00 - 0,25 Tratamento B de E. cardamomum 88,75 10,00 1,00 0,25 Tratamento A de E. caryophyllus 89,75 10,00 - 0,25 Tratamento B de E. caryophyllus 88,75 10,00 1,00 0,25
1Água peptonada, 2Etanol, 3Detergente alcalino, 4Óleo essencial
Os cupons foram lavados três vezes em água peptona, para eliminação de qualquer célula planctônica, e submetidos aos tratamentos durante 15 e 30 minutos de contato em condições estáticas e a temperatura ambiente (25°C).
Enumeração das células bacterianas aderidas
Após 96 horas de formação do biofilme, o número de células aderidas aos cupons de aço inoxidável foi determinado após os tratamentos com as soluções sanitizantes à base de óleos essenciais com ou sem detergente alcalino e solução controle. Cupons não submetidos a nenhum tratamento também foram enumerados, o que caracterizou a contagem do biofilme.
Após a exposição das células aderidas aos tratamentos, os cupons foram lavados três vezes em solução de água peptonada e as células foram retiradas utilizando swab previamente esterilizados. Os swabs foram transferidos para 10 mL de água peptonada e agitados por 2 minutos em vórtex. Posteriormente, foram realizadas as diluições necessárias, as quais foram inoculadas em TSA utilizando a técnica de microgota (10 µL) com incubação a 37°C por 18 horas. Os resultados foram obtidos em Log UFC/cm2 com limite de detecção
de 2,84 Log UFC/cm2. Análise estatística
Foram realizadas três repetições e a variável resposta foi o Log de redução obtido após tratamento do biofilme com as soluções controle e antibacterianas. Foi utilizado Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC) em esquema fatorial 6 x 2 (tratamentos controle e antibacterianos x tempos de contato). Foi realizada análise de variância (ANOVA) e, após detectar a existência de diferença estatística significativa entre os tratamentos, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. O nível de significância adotado foi de 5%.
Resultados
Todos os óleos essenciais apresentaram atividade bacteriostática, sendo os óleos essenciais de Z. officinale,E.
caryophyllus e E. cardamomum os que apresentaram maior
efeito inibitório sobre P. aeruginosa (Tabela 2).
O tempo de morte de P. aeruginosa em contato com soluções à base de óleo essencial foi menor quando utilizados os óleos essenciais de E. cardamomum e E.
caryophyllus, os quais apresentaram atividade bactericida
em 10 minutos. Os óleos essenciais de C. reticulata v.
tangerine e C. limon apresentaram efeito bactericida em
30 minutos e Z. officinale apresentou apenas redução das células viáveis (Tabela 3).
Na Tabela 4 pode-se notar que houve diferença estatística apenas entre os tratamentos empregados aos cupons de aço inoxidável, apontando que o efeito das soluções foi independente do tempo de contato, bem como não foi verificada interação entre os fatores estudados.
O biofilme de P. aeruginosa apresentou resistência ao tratamento A de E. cardamomum e ao controle A (p<0,05). Para o controle B e demais tratamentos o óleo essencial apresentou atividade bactericida (Tabela 5). Os melhores tratamentos foram os constituídos de detergente alcalino e óleo essencial de Eugenia caryophyllus (p<0,05).
Discussão
Óleos essenciais são reconhecidos na literatura científica por sua propriedade antimicrobiana, sendo utilizados no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes (4). Todos os óleos essenciais empregados apresentaram, ao menos, efeito bacteriostático contra o microrganismo alvo. No entanto, as células do biofilme de P. aeruginosa apresentaram-se mais resistentes aos óleos essenciais do que as células planctônicas (Tabelas 3 e 5). Sabe-se que vários fatores são responsáveis pela maior resistência a antimicrobianos químicos de células em biofilme, tais como: difusão limitada de agentes antimicrobianos por meio da matriz extracelular (EPS) do biofilme, interações de agentes antimicrobianos com a matriz, resistência mediada por enzimas, níveis de atividade metabólica dentro do biofilme, adaptação genética e outras estruturas da membrana (5). O presente estudo destaca que esta diferente capacidade de resistência entre células planctônicas e sésseis também pode ocorrer quando utilizados óleos essenciais, compostos antimicrobianos naturais.
Nas indústrias de alimentos, contaminações durante o processamento podem ocorrer devido ao desprendimento de células de biofilmes formados nos equipamentos e tubulações, acarretando em risco a saúde do consumidor e/ ou prejuízos para a indústria. Após 96 horas de formação do biofilme de P. aeruginosa, a concentração de células aderidas aos cupons de ácido inoxidável foi de 5,40 Log UFC/cm2 (Tabela 5). Concentrações acima de 3 Log UFC/
cm2 já podem ser consideradas biofilmes maduros (25,20),
Tabela 2. Concentrações mínimas inibitórias (CMIs) dos
óleos essenciais.
Óleos essenciais CMIs (% v/v)
Z. officinale 0,25
C. reticulata v. tangerine 1,00
C. limon 0,50
E. caryophyllus 0,25
E. cardamomum 0,25
Tabela 3. Sensibilidade de P. aeruginosa aos óleos
essenciais em Log UFC/mL.
Tratamento Tempo de contato (minutos)#
10 20 30 Controle 7,86 8,26 7,63 Z. officinale 6,55 6,14 4,61 C. reticulata v. tangerine 6,38 5,56 <3,00 C. limon 4,05 3,45 <3,00 E. caryophyllus < 3,00 < 3,00 < 3,00 E. cardamomum < 3,00 < 3,00 < 3,00 #média de três replicatas
Tabela 4. Tabela Resumo da análise de variância (ANOVA).
Fonte de variação gl SQ QM F p Tratamento 5 150,402 30,080 1580,410 <0,001 Tempo de contado 1 0,001 0,001 0,037 0,848 Tratamento X Tempo de contato 5 0,011 0,002 0,116 0,988 Erro 24 0,457 0,019
Tabela 5. Log de redução (média±desvio-padrão) do
biofilme de P. aeruginosa submetido a tratamentos com diferentes soluções.
Solução Tempo de contato (minutos) Total
15 30 Controle A 1,03±0,27 0,95±0,00 0,99±0,17 a Tratamento A de E. cardamomum 1,12±0,34 1,15±0,20 1,13±0,24 a Controle B 5,40±0,00 5,40±0,00 5,40±0,00 b Tratamento A de E. caryophyllus 5,40±0,00 5,40±0,00 5,40±0,00 b Tratamento B de E. caryophyllus 5,40±0,00 5,40±0,00 5,40±0,00 b
a,bletras iguais indicam similaridade estatística pelo teste de Tukey para α=5%.
o que mostra que a cepa bacteriana utilizada é capaz de formar biofilmes se práticas corretas de higiene não forem realizadas.
O controle de biofilmes bacterianos deve ser realizado utilizando práticas rigorosas de limpeza e sanitização. Neste estudo, realizado tendo como alvo a bactéria P. aeruginosa, o detergente alcalino apresentou atividade bactericida sobre as células sésseis, com Log de redução de 5,4 (Tabela 5). Por suas características de ação, o mesmo pode ter atuado em proteínas e lipídeos do envoltório celular bacteriano (13). Contudo, destaca-se o resultado obtido quando utilizado o óleo essencial de E. caryophyllus, que foi capaz de eliminar as células viáveis enumeráveis por contagem em placas do biofilme de P. aeruginosa. Verificou-se também que o mesmo apresentou maior efeito do que o óleo essencial de E. cardamomum (Tabela 5), o que pode ter ocorrido devido ao elevado potencial antimicrobiano do seu componente majoritário, o eugenol, composto fenólico que tem demonstrado atividade bactericida contra diversos microrganismos, devido à inibição da respiração e divisão celular (4, 9, 10, 12, 17, 22).
Conclusão
Os óleos essenciais de C. reticulata v. tangerine,
Z. officinale, C. limon, E. caryophyllus e E. cardamomum
apresentaram atividade antibacteriana contra as células planctônicas de P. aeruginosa, com destaque aos óleos essenciais de E. caryophyllus e E. cardamomum. A utilização de soluções contendo detergente alcalino e/ou óleo essencial de E. caryophyllus a temperatura ambiente foi suficiente para eliminar as células bacterianas viáveis do biofilme de P. aeruginosa, sendo o óleo essencial uma nova alternativa natural para o controle do biofilme de P.
aeruginosa na indústria de alimentos.
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