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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E PERFIL FITOQUÍMICO DE CAESALPINIA PYRAMIDALIS TULL. (FABACEAE)

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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E PERFIL FITOQUÍMICO DE

CAESALPINIA PYRAMIDALIS TULL. (FABACEAE)

1

Antonio Marcos Saraiva*; 2Maria Glaudey Saraiva; 3Admário Marques Gonçalves; 4José Guedes Sena Filho; 5Haroudo Satiro Xavier; 6Maria Nelly Caetano Pisciottano

RESUMO: Os extratos secos extraídos seqüencialmente por extração com n-hexano, acetato de etila e metanol do mesmo material de Caesalpinia pyramidalis Tull. (folha, casca do caule, casca da raiz, exocarpo do fruto e flor) foram investigados por sua atividade antimicrobiana e triagem fitoquímica. Os métodos utilizados foram poços difusão em agar e CMI diluição em Agar e triagem fitoquímica por CCD. Os resultados obtidos mostraram que os extratos metanólicos da folha, casca do caule e flor apresentaram atividade antimicrobiana frente à Escherichia coli (AM31), Enterococcus faecalis (AM128), Klebsiella pneumoniae (AM50), Salmonella spp. (AM149), Staphylococcus aureus (AM103) e Pseudomonas aeruginosa (AM206). O CMI do extrato da casca da raiz extraído por acetato de etila foi classificado como ativo frente AM103, AM50 e AM206, o extrato metanólico da flor classificado como ativo frente AM103 e AM31 e o extrato metanólico da folha classificado como ativo frente AM206 e AM31. Na análise fitoquímica foram detectados: flavonóides, triterpenos, esteróides (sitosterol), ácidos fenólicos (ácido gálico e ácido elágico), proantocianidinas condensadas, leucoantocianidinas e açúcares redutores.

Unitermos: Catingueira, Triagem antimicrobiana, Triagem fitoquímica.

EVALUATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND PHYTOCHEMICAL PROFILE OF

CAESALPINIA PYRAMIDALIS TULL. (FABACEAE)

ABSTRACT: The dry extracts by sequential extraction with hexane, ethyl acetate and methanol from

Caesalpinia pyramidalis Tull. (Leaf, Stem bark, peel of the root, exocarp of the fruit and flower) were

investigated for their antimicrobial activity and phytochemical screening. The methods used to evaluate the antimicrobial activity were agar wells diffusion and MIC agar dilution and phytochemical screening by TLC. The results obtained in the methanol extracts of leaf, flower and stem bark showed antimicrobial activity against Escherichia coli (AM31), Enterococcus faecalis (AM128), Klebsiella

pneumoniae (AM50), Salmonella spp. (AM149), Staphylococcus aureus (AM103) and Pseudomonas aeruginosa (AM206). The MIC of the extract of peel of the root extracted with ethyl acetate was

classified as active against AM103, AM206 and AM50, the methanol extract of the flower classified as active against AM103 and AM31 and methanol extract of the leaf classified as active against AM206 and AM31. In phytochemical analysis were detected: Flavonoids, triterpenes, steroids (sitosterol), phenolic acid (gallic acid and ellagic acid), condensed proanthocyanidins, leucoanthocyanidins and sugar reducers.

1

Mestre em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, CEP: 50.740-521, Recife, PE, Brasil (saraivas2@yahoo.com.br); 2Odontóloga, Universidade de Pernambuco, Camaragibe, PE, Brasil (gaby_mirandiba@hotmail.com); 3Farmacêutico, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil (admarioxviii@hotmail.com); 4Doutor em Ciências Farmacêuticas, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Aracaju, SE, Brasil (guedesena@yahoo.com.br); 5Prof. Adjunto IV, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil (hadouro@yahoo.com.br); 6Profª. Associado I, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil (nellycaetano@yahoo.com.br).

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Uniterms: Catingueira, Antibacterial Screening, Phytochemical Screening. INTRODUÇÃO

A cura de várias doenças através das plantas e origem do conhecimento das propriedades dos vegetais confunde-se com a própria história humana (Coutinho, 2004; Cowan, 1999). Tais propriedades proporcionaram o desenvolvimento de vários medicamentos, sejam estes obtidos por síntese a partir de molécula protótipo ou através do isolamento dos componentes bioativos. Estima-se que 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica atual foram desenvolvidos de fontes naturais, sendo 25% de plantas, 13% de microrganismos e 3% de animais (Calixto, 2003). Devido a tudo isso, vê-se um interesse crescente na utilização e pesquisa de plantas medicinais, objetivando fins terapêuticos, aliadas à boa aceitabilidade e das altas cifras que circundam este mercado, cerca de US$ 20 bilhões por ano (Barbosa, 2010; Simões, 2002).

A Caesalpinia pyramidalis Tull. faz parte da família das Leguminosae (Fabaceae), classe das

Dicotiledoneae. Esta planta é endêmicas do Sertão Nordestino, sendo popularmente conhecida por:

“catingueira”, “pau-de-porco”, “catinga de porco” (Braga, 1960), habitando lugares pedregosos (Silva, 1998) e podendo atingir até 4 metros de altura. Na medicina popular as flores, folhas e cascas são usadas no tratamento das infecções catarrais, nas diarréias e disenterias (Braga, 1960), ainda apresenta ação antipirética e como diurética (Mendes, 2000). Das folhas de C. pyramidalis Tull. foram isolados: lupeol, β-sitosterol, caesalflavona, podocarpusflavona, canferol, apigenina, agastisflavone, 4,4'-dihidroxi-2'-methoxychalcona, siringaresinol e galato de metila (Mendes, 2000; Bahia, 2005; Bahia, 2010).

MATERIAL E MÉTODO Químicos e reagentes

Os padrões utilizados no estudo fitoquímico foram: β-amirina, β-sitosterol, canferol e saponina (Extrasynthese®); ácido gálico e D(+)-glicose (Merck®). Os reagentes e solventes empregados neste estudo foram: 2,3,5-cloridrato de trifeniltetrazólio (Sigma®), ácido fórmico (Vetec®), ácido acético glacial (Merck, 99,8%), n-hexano (Vetec, 99%), acetato de etila (Vetec, 99,5%), metanol (Vetec, 99,8%), dimetilsufoxido (Vetec, 99,9%), Tween 80 (Vetec).

Coleta e identificação

A planta foi coletada na cidade de Carnaubeira da Penha, Sertão de Pernambuco, latitude: 08º19’09”, longitude: 38º44’41” e altitude: 446 metros (MME, 2005), entre os meses de março e junho de 2004, foi então identificada pela curadora do Herbário IPA, Dra. Rita de Cássia Pereira e depositada no mesmo, sob registro de n° 70.008.

Preparação dos extratos secos

As partes da planta: folhas, casca do caule, casca da raiz, flores, casca do exocarpo do fruto (exceto folha, casca do caule e raiz, as demais por extração a fresco) foram trituradas, pesadas e então feitas três extrações sucessivas pelo processo de infusão, sob agitação constante por dez minutos e deixadas em maceração em intervalos médios de 72 horas entre cada solvente. O processo se iniciou com o n-hexano P.A., em seguida o acetato de etila P.A. e por ultimo metanol P.A. Os extratos foram filtrados e levados à secura em rotaevaporador, subseqüentes pesados e calculados os rendimentos (Tabela 1).

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Partes da Catingueira Solvente extrator Sigla Pesos (g) RE Planta EBS Folha (F) n-Hexano (H) FH 313,60 7,30 2,3% Acetato de Etila (A) FA 5,80 1,8%

Metanol (M) FM 19,50 6,2% Casca do caule (C) n-Hexano CH 261,52 1,87 0,7% Acetato de Etila CA 4,30 1,6% Metanol CM 9,70 3,7% Cont cont Casca da Raiz (R) n-Hexano RH 44,33 1,40 3,2% Acetato de Etila RA 2,90 6,5% Metanol RM 3,02 6,8% Exocarpo do Fruto (Fr) n-Hexano FrH 326,34 11,08 3,4% Acetato de Etila FrA 4,50 1,4%

Metanol FRM 4,80 1,5%

Flor (Fl)

n-Hexano FLH

46,12

0,3 0,65 Acetato de Etila FLA 0,4 0,87

Metanol FLM 10,80 23,42

EBS: extrato bruto seco; RE: rendimento. Linhagens Bacterianas

O estudo de atividade antimicrobiana da planta foi realizado frente a seis bactérias de interesse clínico:

 Staphylococcus aureus (ATCC 6538, AM103);

 Salmonella spp serotype Montevideo (ATCC 8387, AM149);  Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031, AM50);

 Escherichia coli (ATCC 9723, AM31);

 Enterococcus faecalis (ATCC 33186, AM128);  Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14502, AM206);

ATCC – American Type Culture Collection; AM – Coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Departamento de Ciências Farmacêuticas – UFPE

Preparação dos inóculos

Os inóculos foram preparados a partir de culturas de 24h em agar Muller-Hinton (Himedia), e suspendidas em soro fisiológico estéril, ajustando a turvação dos inóculos a da escala 0,5 McFarland (108 UFC/ml) (CLSI, 2003).

Teste de Atividade Antimicrobiana

Os estudos se basearam em dois métodos de ensaios: medida do halo de inibição por técnica de poços/difusão em agar e concentração mínima inibitória (CMI) diluição em agar.

Preparação das soluções e diluições dos extratos

Os extratos secos oriundo de extração metanólica foram ressuspendidos em DMSO:água (50%) (Sakagami, 2005), e aqueles extraídos em acetato de etila e n-hexano foram ressuspendidos em tween 80:água (4%). O antibiótico padrão para ambas as técnicas foi a tetraciclina (TT) (Sigma) a 300 g/mL

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para a técnica de poços/difusão em agar e nas concentrações de 0,31g/ml a 640g/ml por placa (fator de diluição = 2), para a determinação da CMI.

As diluições dos extratos para determinação do halo de inibição e Concentração Mínima Inibitória (CMI) foram, respectivamente, 100 mg/mL e 50 mg/mL (Leite, 2006) e 31, 25g/mL à 2000 g/mL (fator de diluição = 2).

Os controles negativos para ambas as técnicas (DMSO 50% e tween 4%) foram realizados. Determinação do Halo de Inibição

Após o semeio dos inóculos bacterianos em agar Muller-Hinton, foram realizadas as perfurações (6 mm de diâmetro), e aplicado os extratos (100l por poço), nas concentrações de 10 mg por poço e 5 mg por poço. O antibiótico padrão (30 g por poço). Os resultados foram avaliados conforme o diâmetro dos halos.

Determinação da Concentração Mínima Inibitória

Este foi realizado, incorporando ao meio de cultura (fluido) as diluições acima citadas na proporção de (1:9 v/v), obtendo diluições de 31,25 g/mL à 2000 g/ mL.

Assepticamente, os sete inóculos foram semeados nas placas e incubadas 37ºC  1 por 24h. Os controles dos inóculos foram feitos no início e no final do processo, em meio ágar Muller-Hinton (Padrão de crescimento).

Triagem fitoquímica

A pesquisa dos metabólitos de Caesalpinia pyramidalis, sistemas de eluição e reveladores utilizados estão dispostos na Tabela 2. Como padrões foram utilizados: pilocarpina (alcalóides), -amirina e ácido ursólico (triterpenos), -sitosterol (esteróides), glicose (açucares), ácido gálico, ácido elágico e galato de metila (ácidos fenólicos), quecertina e canferol (flavonóides e outros polifenóis), epicatequina e catequina (proantocianidinas e leucoantocianidinas).

TABELA 2. Sistemas cromatográficos utilizados para screening fitoquímico de Caesalpinia

pyramidalis Tull

Metabólitos Sistema de

Eluição Revelador Referência

Alcalóides A Dragendorff Wagner, 1984

Esteróides B Liebermann

Burchard Harbone, 1998

Triterpenóides B Liebermann

Burchard Harbone, 1998 Iridóides A Vanilina Sulfúrica Wagner, 1984

Saponinas A Anisaldeído Wagner, 1996

Açúcares C Trifeniltetrazólio Metz, 1961

Cumarinas D U.V Wagner, 1996

Derivados Cinâmicos A NEU Wagner, 1996

Flavonóides A NEU Wagner, 1984

Markham, 1982

Fenilpropanoglicosídeos A NEU Wagner, 1996

Leucoantocianidinas A Vanilina Clorídrica Robertson, 1956 Proantocianidinas A Vanilina Clorídrica Robertson, 1956

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Condensadas

A-AcOEt–HCOOH–AcOH–H2O (100:11:11:26 v/v); B- AcOEt–HCOOH–AcOH–H2O (100:0,5:0,5:0,5 v/v); C- n-BuOH-Me2CO-Tampão Fosfato pH = 5,0 (40:50:10 v/v); D- Et2O-Tolueno-AcOH 10 % (50:50:50 v/v); NEU: 2-Aminoetildifenil borinato.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo fitoquímico das partes de Caesalpinia pyramidalis (folha, casca do caule e da raiz, exocarpo do fruto e flor) revelou as presenças, em todos os extratos, de vários polifenóis (flavonóides e derivados cinâmicos), esteróides (sitosterol), açúcares (glicose). Ácido gálico e ácido elágico na flor e exocarpo do fruto, este último também casca da raiz, outros polifenóis (Rf = 0,17 e 0,25) e catequina na casca do caule e da raiz. Outra leucoantocianidina (Rf 0,63), ácido ursólico, quercetina visualizado na casca da raiz. Não foi visualizado no estudo fitoquímico: alcalóides, iridóides, fenilpropanóides, saponinas e cumarinas (Tabela 3).

TABELA 3. Resultado da triagem fitoquímica de Caesalpinia pyramidalis Tull. Metabólitos Caesalpinia pyramidalis (MeOH)

F C R Fr FL Alcalóides (-) (-) (-) (-) (-) Triterpenóides (-) (-) + (-) (-) Esteróides + + + + + Iridóides (-) (-) (-) (-) (-) Saponinas (-) (-) (-) (-) (-) Açúcares + + + + + Cumarinas (-) (-) (-) (-) (-) Derivados Cinâmicos + + + + + Ácidos fenólicos + + + + + Flavonóides + + + + + Fenilpropanoglicosídeos (-) (-) (-) (-) (-) Proantocianidinas Condensadas (-) + + (-) (-) Leucoantocianidinas (-) + + (-) (-)

F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; Fr: Exocarpo do Fruto; FL: Flor; +: Positivo para o grupo de metabólitos

secundários; (-): Negativo para o grupo de metabólitos secundários; MeOH: metanol;

Das duas metodologias utilizadas para determinação da atividade antimicrobiana, a técnica de poços/difusão em agar, que segundo Lenette (1987) é expressada pela medida do halo de inibição de um determinado produto teste frente a um microorganismo em particular, sendo particularmente utilizada para uma triagem daqueles compostos com esperada ação antimicrobiana, e seus resultados avaliado conforme os parâmetros de Alves (2000) que classifica o potencial antimicrobiano, sendo halos de inibição: < 9 mm, inativo; 9 a 12 mm, parcialmente ativo; de 13 a 18 mm, ativo; > 18 mm, muito ativo). A segunda metodologia, determinação da concentração mínima inibitória diluição em agar, nos possibilita conhecer a menor concentração do extrato que visivelmente inibe o crescimento do microorganismo teste, e que pode ser avaliado seguindo estes parâmetros: CMI ≤ 100,0 µg/ml, muito

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ativo; CMI > 100,0 e ≤ 500,0 µg/ml, ativo; CMI > 500,0 e < 1000,0 µg/mL, moderadamente ativo; CMI > 1000,0 e ≤ 2000,0 µg /mL, fracamente ativo; CMI > 2000,0 µg /mL, inativo.

Seguindo os parâmetros citados acima, na maior concentração de 10 mg/poço o extrato metanólico do caule (CM) obteve os melhores halos de inibição frentes a E. coli (AM31) e Salmonella

spp. (AM149), classificados como ativos Já na concentração menor (5 mg/Poço) frente a E. coli se

destacaram os extratos CM e casca da raiz extraído com n-hexano (RH), parcialmente ativo, e para

Salmonella spp a CM (ativos). O exocarpo do fruto extraído com metanol (FrM) obteve os melhores

resultados frente as cepas de S. aureus (AM103), sendo que a folha (FM) e flor (FLM) ambos extraídos em metanol, também obtiveram o mesmo halo de inibição para S. aureus (AM103) (muito ativos) e ainda a FLM obteve o frente a E. faecalis (AM128) à 5 mg/poço (ativo) e 10 mg/poço (muito ativo), FM frente a P. aeruginosa a 10 mg/poço (muito ativo) e CM e FLM (ativos) a 5 mg/poço (Figuras 1 e 2). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 FM CM RM FrM FLM FA CA RA FrA FH CH RH FrH TT E. coli K. pneumoniae S. aureus E. faecalis Salmonella spp. P. aeruginosa

FIGURA 1. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis (10 mg/poço)

F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; Fr: Fruto; FL: Flor: M: Metanol; A: Acetato de etila; H: n-hexano; TT:

Tetraciclina; AM: Coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Departamento de Ciências Farmacêuticas – UFPE. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 FM CM RM FrM FLM FA CA RA FrA FH CH RH FrH TT E. coli K. pneumoniae S. aureus E. faecalis Salmonella spp. P. aeruginosa

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F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; Fr: Fruto; FL: Flor: M: Metanol; A: Acetato de etila; H: n-hexano; TT:

Tetraciclina; AM: Coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Departamento de Ciências Farmacêuticas – UFPE.

Quando avaliado a atividade antimicrobiana dos extratos de C. pyramidalis pelos resultados das CMI, alguns foram convergentes, com os resultados da técnica anterior classificados como ativos, com aqueles dos halos de inibição, como: a atividade antibacteriana de FM frente a P. aeruginosa, com a CMI de 125 g/ml. As CMI de 500 e 250 g/ml do RA, respectivamente, frente às cepas de E. coli e S.

aureus, para o FLM teve as CMI de 250 g/ml frente a E. coli. O extrato metanólico da casca da raiz

(RM) frente a cepa de E. faecalis (AM128) foi moderadamente ativo (Tabela 4). Em todos os extratos de C. pyramidalis, observamos a presença de metabólitos secundários com reconhecida propriedade antimicrobiana, tais como: flavonóides (Cowan, 1999), sitosterol (Virtuoso, 2005) e derivados cinâmicos (Almeida, 2002). Ainda, são encontrados no exocarpo do fruto, na casca do caule e da raiz ácido gálico e ácido elágico (Vattem, 2005). Ácido ursólico (Amorim, 2003), quercetina e catequina (Cowan, 1999) na casca da raiz, sendo que este último está presente também na casca do caule.

Não evidenciamos atividade antimicrobiana para os produtos controle (DMSO 50% e Tween 4%).

TABELA 4. Determinação da CMI de Caesalpinia pyramidalis Tull. Produtos CMI (g/ml) das. cepas (AM)

31 50 103 128 149 206 FM 500 >2000 2000 >2000 2000 125 CM >2000 1000 2000 >2000 >2000 1000 CA 1000 >2000 2000 2000 2000 >2000 RM 2000 1000 500 1000 2000 1000 RA 1000 500 250 2000 >2000 500 FrM >2000 >2000 2000 >2000 >2000 >2000 FrA >2000 2000 2000 >2000 >2000 >2000 FLM 250 1000 500 2000 1000 1000 TT 1 0,5 0,5 0,5 0,5 2

F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; Fr; Fruto; FL: Flor: M: Metanol; A: Acetato de etila; TT: Tetraciclina; AM: Coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Departamento de Ciências Farmacêuticas – UFPE.

CONCLUSÃO

Os extratos de Caesalpinia pyramidalis, em particular, da folha, casca da raiz e flor apresentaram boa atividade antimicrobiana frente às linhagens de Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus que pode ser justificado pela a

presença de metabólitos secundários de reconhecida atividade antioxidante (flavonóides e ácidos fenólicos), o que está intimamente relacionado com a ação antimicrobiana. Mais estudos se fazem necessários, em particular, prosseguirmos com a prospecção ativa dos metabólitos secundários potencialmente ativos, que poder-se-á ser guiado pela técnica de bioautografia.

REFERÊNCIAS

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