ANDRÉA DUMSCH DE ARAGON FERREIRA

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ANDRÉA DUMSCH DE ARAGON FERREIRA

ESTUDO DA EFICÁCIA DO ÁCIDO L-GLUTÂMICO NA

PREVENÇÃO DA CALCIFICAÇÃO DE SEGMENTOS DE

PERICÁRDIO BOVINO FIXADOS EM GLUTARALDEÍDO,

ESTUDO EM RATOS

CURITIBA 2005

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Livros Grátis

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ANDRÉA DUMSCH DE ARAGON FERREIRA

ESTUDO DA EFICÁCIA DO ÁCIDO L-GLUTÂMICO NA

PREVENÇÃO DA CALCIFICAÇÃO DE SEGMENTOS DE

PERICÁRDIO BOVINO FIXADOS EM GLUTARALDEÍDO,

ESTUDO EM RATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Medicina.

Orientador: Prof. Dr. Francisco Diniz Affonso da Costa

Coordenador:Prof.Dr.Paulo Roberto Slud Brofman

CURITIBA

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FERREIRA, Andréa Dumsch de Aragon

Estudo da eficácia do ácido L-glutâmico na prevenção na calcificação de segmentos de pericárdio bovino fixados em glutaraldeído: estudo em ratos./ Andréa Dumsch de Aragon Ferreira – Curitiba, 2005.

55 p.

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós Graduação em Clínica Cirúrgica da Pontifícia Universidade Católica do Paraná) Orientador: Prof. Dr. Francisco Diniz Affonso da Costa 1. Pericárdio – Calcificação. 2. Ácido glutâmico.

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ANDRÉA DUMSCH DE ARAGON FERREIRA

ESTUDO DA EFICÁCIA DO ÁCIDO L-GLUTÂMICO NA PREVENÇÃO DA CALCIFICAÇÃO DE SEGMENTOS DE PERICÁRDIO BOVINO FIXADOS EM

GLUTARALDEÍDO, ESTUDO EM RATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Medicina. COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. Prof. Dr. Prof. Dr. CURITIBA, _____ DE _________ DE 2005

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Aos meus pais Arnaldo Dumsch e Silvia Krelling, exemplos de luta, dedicação e amor aos filhos;

Ao Enio, pelo carinho e incentivo durante as etapas deste trabalho, e aos meus filhos, Diego e Tiago, pela alegria irradiante nas nossas horas de convívio familiar e ao meu avô Osvaldo pela dedicação prestada à sua neta, ao longo de seus 90 anos.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas as pessoas que acompanharam a trajetória deste trabalho, compartilhando a sua vivência e oferecendo a sua colaboração, contribuindo para a realização final.

Ao Prof. Dr. Paulo Roberto Slud Brofman, pela oportunidade de estar entre o grupo de Mestrandos de Clínica Cirúrgica da Pontifícia Universidade Católica do Paraná.

Ao Prof. Dr. Francisco Diniz Affonso da Costa, orientador, pelo incentivo à produção científica e pelo apoio imprescindível à concretização desta tese.

Ao Prof. Dr. Iseu de Santo Elias Affonso da Costa, pelos valiosos ensinamentos e minuciosas correções deste trabalho.

À Dra. Maria de Lourdes Pessole Biondo Simões, à dedicação prestada aos seus alunos.

Ao Dr. Eduardo Antonio Andrade dos Santos, pelo auxílio na execução deste trabalho.

Aos Drs. Evandro Sardeto, Sergio Veiga, Claudinei Colatusso, Carlos Henrique Gorigomes, pelo harmonioso convívio profissional que possibilitaram a execução deste trabalho.

À bioquímica da CARDIOPROTESE, Sra. Angela Maria Peruzzo, pelo processamento e fornecimento do pericárdio bovino.

À Profa Dra Mônica Cat, pela disponibilidade e competência na realização do estudo estatístico.

À funcionária Sra. Jozyara Sandin Visloski, pelo trabalho de digitação deste trabalho.

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SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ... . ix

LISTA DE FIGURAS ... .. x

LISTA DE ABREVIATURAS ... ..xi

RESUMO ... vii ABSTRACT ... viii 1 INTRODUÇÃO ... ..1 1.1 OBJETIVO. ... ..3 2 REVISÃO DA LITERATURA ... ..4 3 MÉTODOS... 10 3.1 MODELO EXPERIMENTAL ... 11

3.2. OBTENÇÃO DO PERICÁRDIO BOVINO... 13

3.3 PROCEDIMENTO QUÍMICO ... 13 3.4 PREPARO PRÉ-OPERATÓRIO... 14 3.5 ANESTESIA ... 14 3.6 TÉCNICA OPERATÓRIA ... 15 3.7 OBSERVAÇÃO PÓS-OPERATÓRIA... 16 3.8 ANÁLISE MICROSCÓPICA... 16 3.9 MENSURAÇÃO DO CÁLCIO ... 17 3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 18 4 RESULTADOS ... 19

4.1 DESCRIÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO POR ESPECTROSCOPIA POR ABSORÇÃO ATÔMICA ... 20 4.1.1 Grupo I ou Controle... 20 4.1.2 Grupo II... 20 4.1.3 Grupo III ... 21 4.1.4 Grupo IV ... 22 4.1.5 Grupo V ... 22 4.1.6 Grupo VI ... 23

4.2 ANÁLISE DA CALCIFICAÇÃO DISTRÓFICA NOS GRUPOS DE ESTUDO POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA... 25

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4.3 ANÁLISE MICROSCÓPICA (HISTOLÓGICA) DA CALCIFICAÇÃO

DISTRÓFICA NOS GRUPOS DE ESTUDO ... 26

4.3.1 Com 15 dias de sacrifício dos animais ... 26

4.3.2 Com 30 dias de sacrifício dos animais... 29

4.3.3 Com 60 dias de sacrifício dos animais... 31

5 DISCUSSÃO ... 35

6 CONCLUSÕES... 42

7 REFERÊNCIAS ... 44

NORMAS ADOTADAS ... 51

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Tratamento dos segmentos de pericárdio nos diferentes grupos ... 12

Tabela 2 - Distribuição dos ratos em subgrupos... 12

Tabela 3 - Classificação da calcificação distrófica ... 17

Tabela 4 - Calcificação atômica (espectroscopia por absorção atômica, em microgramas) aos 15, 30 e 60 dias ... 24

Tabela 5 - Distribuição do grau de calcificação distrófica aos 15 dias... 27

Tabela 6 - Distribuição do grau de calcificação distrófica aos 30 dias... 29

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Rato anestesiado em decúbito ventral após realização do implante de pericárdio bovino... 15 Figura 2 - Espectrômetro Perkin-Elmer, 4100® - aparelho utilizado para

mensuração do cálcio no pericárdio bovino ... 18 Figura 3 - Gráfico ilustrando a variação da calcificação distrófica nos diferentes

tratamentos realizados nos segmentos de pericárdio (visão da evolução de acordo com o dia de sacrifício dos animais)... 25 Figura 4 - Gráfico ilustrando a variação da calcificação distrófica nos diferentes

tratamentos realizados nos segmentos de pericárdio (visão dos grupos) ... 26 Figura 5 - Fotomicrografia mostrando os graus de calcificação do pericárdio

bovino de acordo com os tratamentos empregados nos grupos I, II, III, IV, V e VI com 15 dias de implante na tela subcutânea dos animais (HE 40x)... 28 Figura 6 - Fotomicrografia mostrando os graus de calcificação do pericárdio

bovino de acordo com os tratamentos empregados nos grupos I, II, III, IV, V e VI com 30 dias de implante na tela subcutânea dos animais (HE 40x)... 30 Figura 7 - Fotomicrografia mostrando os graus de calcificação do pericárdio

bovino de acordo com os tratamentos empregados nos grupos I, II, III, IV, V e VI com 60 dias de implante na tela subcutânea dos animais (HE 40x)... 32 Figura 8 - Gráficos ilustrando a distribuição do grau de calcificação distrófica de

acordo com os diferentes tipos de tratamento aplicado ao segmento pericárdico e de acordo com o tempo de sacrifício dos animais ... 34

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LISTA DE ABREVIATURAS

AlCl3 - Cloreto de alumínio

FeCl3 - Cloreto de ferro

GDA - Glutaraldeído

HE - Hematoxilina-Eosina

LACTEC - Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento PUC-PR - Pontifícia Universidade Católica do Paraná SUS - Sistema Único de Saúde

A.O.A - Ácido Amino Oléico

SSI - Soro Fisiológico 0,9%

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RESUMO

Objetivo: Avaliar a eficácia do ácido L-glutâmico na prevenção de calcificação de segmentos de pericárdio bovino quando implantados na tela subcutânea de ratos jovens. Métodos: Utilizaram-se 54 ratos Wistar, machos, distribuídos em 6 grupos de nove animais, nos quais foram implantados, na tela subcutânea, segmentos de pericárdio bovino. Em cada grupo, denominados, grupo I (controle), II, III, IV, V, VI, foram realizadas a mensuração do cálcio e a análise microscópica quanto a presença de calcificação após períodos de 15, 30 e 60 dias de implante. Inicialmente todos os grupos foram fixados com glutaraldeído a 0,5% por 72 horas. Após este período, os pericárdios do grupo I (controle) foram estocados em GDA 0,2%, e no grupo II em solução Paraben. Os pericárdios dos grupos III e IV, após a fixação em GDA 0,5%, foram submetidos ao tratamento com ácido L-glutâmico por 48h, com pH 7,4 no grupo III e pH 3,5 no grupo IV. Em seguida foram estocados em Paraben. Os grupos V e VI foram semelhantes aos grupos III e IV, exceto pela concentração do ácido L-glutâmico (0,8% e 8%, respectivamente). Resultados: A mensuração por espectroscopia de absorção atômica, demonstrou aumento progressivo da calcificação nos grupos I, II, III aos 15, 30 e 60 dias (grupo I, 15 dias = 0,5 ± 0,095µg de cálcio/mg de tecido, 30 dias = 1,096 ± 0,223µg de cálcio/mg de tecido, 60 dias = 1,933 ± 0,378µg/de cálcio/mg de tecido; grupo II, com 15 dias = 0,220 ± 0,043µg de cálcio/mg de tecido, 30 dias = 1,183 ± 0,388µg de cálcio/mg tecido, 60 dias = 2,700 ± 1,126 µg de cálcio/mg de tecido; grupo III com 15 dias = 0,266 ± 0,104 µg de cálcio/mg de tecido, 30 dias = 0,800 ± 0,655 µg de cálcio/mg de tecido, 60 dias = 1,233 ± 0,737µg de cálcio/mg de tecido) . Já nos grupos IV, V e VI os níveis de cálcio permaneceram quase inalterados nos períodos estudados (grupo IV com 15 dias = 0,043 ± 0,057µg de cálcio/mg de tecido, 30 dias = 0,061 ± 0,050 µg de cálcio/mg de tecido, 60 dias = 0,063 ± 0,011 µg de cálcio/mg de tecido; grupo V, com 15 dias = 0,013 ± 0,003µg de cálcio/mg de tecido, 30 dias = 0,014 ± 0,013 µg de cálcio/mg de tecido, 60 dias = 0,356 ± 0,389 µg de cálcio/mg de tecido; grupo VI, com 15 dias = 0,006 ± 0,000 µg de cálcio/mg de tecido, 30 dias = 0,008 ± 0,002µg de cálcio/mg de tecido; 60 dias = 0,066 ± 0,005µg de cálcio/mg de tecido). A análise microscópica demonstrou calcificação distrófica progressiva nos grupos I, II e III. Apesar dos níveis de cálcio serem menores no grupo III, essa diferença não foi estatisticamente significante (p= 0,34). Nos grupos IV, V e VI a calcificação, quando observada, foi focal e de grau leve, sem diferença estatística significante entre eles.

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Conclusão: o uso do ácido L-glutâmico em segmentos de pericárdio bovino, fixados pelo glutaraldeído, foi efetivo na prevenção da calcificação quando implantados na tela subcutânea de ratos por até 60 dias. Apesar de ser efetivo nas concentrações de 0,8% e 8%, sua ação foi mais evidente em pH ácido.

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ABSTRACT

Objective: Analyze the effectiveness of L-glutamic acid in calcification prevention of bovine pericardic segment implanted subcutaneously in young rats. Methods: 54 young rats were used, distributed in 6 groups of nine rats each, in which was implanted one pericard segment in the subcutaneous. In each group, denominated group I or control, II, III, IV, V, VI, it was accomplished the measure of the calcium and performed a microscopic analysis seeking for any calcification, its location and intensity during 15, 30 and 60 days after the implant. Firstly, all groups received fixation with GDA 0,5% for 72 hours. After this period, the pericardic segments of groups I were storaged in a solution with GDA 0,2% and in the group II with SSI Paraben. The pericardic segments of groups III and IV, after the fixation with GDA 0,5% were treated with L-glutamic acid for 48 hours, with pH = 7,4 in group III and pH = 3,5 in group IV, and then storaged with Paraben. The V and VI groups were similar to III and IV groups in its treatment, except for the L-glutamic acid concentration (0.8% and 8%, respectively). Results: The measure by atomic espectroscopy shows progressive increase of calcification in groups I, II and III on days 15, 30 and 60 (group I, 15 days = 0.5 ± 0.095µg calcium/mg of tissue, 30 days = 1.096 ± 0.223µg calcium/mg of tissue, 60 days = 1.933 ± 0.378 µg calcium/mg of tissue; group II, 15 days = 0.220 ± 0.043µg calcium/mg of tissue, 30 days = 1.183 ± 0.388µg calcium/mg of tissue, 60 days = 2.700 ± 1.126 µg calcium/mg of tissue; group III, 15 days = 0.266 ± 0.104 µg calcium/mg of tissue, 30 days = 0.800 ± 0.655

µg calcium/mg of tissue, 60 days = 1.233 ± 0.737µg calcium/mg of tissue). In groups IV, V and VI, the calcification levels remain almost similar in the treatment periods (group IV, 15 days = 0.043 ± 0.057µg calcium/mg of tissue, 30 days = 0.061 ± 0.050 µg calcium/mg of tissue, 60 days = 0.063 ± 0.011 µg calcium/mg of tissue; group V, 15 days = 0.013 ± 0.003 µg calcium/mg of tissue, 30 days = 0.014 ± 0.013 µg calcium/mg of tissue, 60 days = 0.356 ± 0.389 µg calcium/mg of tissue; group VI, 15 days = 0.006 ± 0.000 µg calcium/mg of tissue, 30 days = 0.008 ± 0.002 µg calcium/mg of tissue; 60 days = 0.066 ± 0.005 µg calcium/mg of tissue). The microscopic analysis shows progressive dystrophic calcification in groups I, II and III. Although the calcification levels were smaller than in group III, this difference was not statististical significant (p = 0.34). In groups IV, V and VI when the calcification occurs it was slight and localized with no statistical difference. Conclusion: The L-glutamic acid use in bovine pericardic segment, with GDA fixation, was effective in calcification prevention

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when implanted subcutaneously in young rats for until 60 days. Although effective in 0.8% and 8% concentrations, its action was more obvious in acid pH.

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No mundo, aproximadamente 170.000 valvas humanas são substituídas por ano. Das próteses utilizadas nos países desenvolvidos, em torno de 60% são mecânicas, e 40%, feitas com tecidos biológicos.(1) No Brasil, a cada ano, 9.000 próteses biológicas são utilizadas em pacientes atendidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS).(2)

As próteses mecânicas apresentam maior durabilidade, mas por apresentarem risco elevado de tromboembolismo requerem o uso constante de drogas anti-coagulantes, aumentando a possibilidade de complicações hemorrágicas.(3-5)

As próteses biológicas são opção para pacientes nos quais o uso de anti-coagulantes é indesejável ou contra indicado. Entretanto, a sua durabilidade é limitada, especialmente em pacientes jovens.

Tecidos biológicos têm sido usados como substituto valvar desde 1962, quando uma valva aórtica humana fresca foi transplantada.(6) Posteriormente, foram introduzidas próteses manufaturadas, como a valva aórtica porcina por BINET em 1965 e CARPENTIER, em 1968,(7-8) pericárdio bovino por IONESCU em 1967,(9) dura-máter humana por PUIG e VERGINELLI em 1971,(10) entre outras.

A fixação de tecidos biológicos com glutaraldeído (GDA) tem sido amplamente utilizada nas últimas três décadas.(11) O seu emprego contribui para a estabilização do colágeno e para a redução da rejeição.(12) Apesar disso, a calcificação das cúspides valvares tratadas com o GDA ainda representa a principal causa de falência destes implantes.(13-18)

A fixação do tecido biológico pelo GDA por si só, pode ser agente facilitador da calcificação, em decorrência da presença de polímeros aldeídos tóxicos remanescentes no tecido.(13,18,19,20)

Em vista disto, diversos tratamentos químicos alternativos, visando diminuir ou retardar, o processo de calcificação têm sido propostos. Algumas substâncias empregadas com essa finalidade são: o etanol,(14,15,21,22) o ácido L-glutâmico,(18,23) os difosfonatos,(20,24,25,26) os

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íons metálicos trivalentes,(27-28) o ácido amino oléico,(29-32) os surfactantes, (19,33) e a decelularização.(34-35)

Estudos experimentais demonstraram que o tratamento do pericárdio bovino com o ácido L-glutâmico, previamente fixados em GDA, não só melhorou sua bio-compatibilidade como também reduziu de forma significativa a calcificação. Apesar dos mecanismos responsáveis pela eficácia não serem totalmente compreendidos.(18,23)

A análise dos procedimentos que possam diminuir a intensidade da calcificação do pericárdio bovino utilizado em biopróteses, comporta estudos mais detalhados. A aplicação de um método eficiente na produção de biopróteses é desejável, pois poderia levar ao aumento da durabilidade e conseqüentemente diminuir a necessidade de reoperações, particularmente em países em desenvolvimento, nos quais o emprego de próteses biológicas são mais freqüente.

A Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR) possui linha de pesquisa para o estudo de próteses valvares biológicas. Assim sendo, parece adequado estudar os efeitos do ácido L-glutâmico na prevenção da calcificação de pericárdio bovino tratados com GDA e implantados na tela subcutânea de ratos.

1.1 OBJETIVO

Analisar a eficácia do ácido L-glutâmico a 0,8% e 8%, com pH 3,5 e pH 7,4, na prevenção da calcificação de segmentos de pericárdio bovino fixados em GDA e implantados na tela subcutânea de ratos jovens.

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Os primeiros tecidos biológicos empregados nas confecções de próteses valvares foram de origem autóloga ou homóloga. ROSS em 1962 e BARRATT-BOYES em 1964 descreveram os primeiros implantes ortotópicos com valvas humanas frescas.(6,36) SENNING em 1967 substituiu valvas aórticas com próteses manufaturadas a partir de fáscia-lata autóloga.(37)

Não tardou para que tecidos heterólogos também fossem empregados como substitutos valvares e testados clinicamente. O primeiro destes foi a valva porcina conservada em formaldeído.(7) Essas próteses apresentaram elevada incidência de degeneração precoce, sendo posteriormente evidenciado que isto se devia ao tratamento químico empregado.

CARPENTIER em 1968 propôs a fixação tecidual com o GDA, o que propiciou o desenvolvimento de diversos tipos de substitutos valvares heterólogos com resultados clínicos mais satisfatórios.(38-39)

Dentre os tecidos empregados, a prótese porcina e a prótese de pericárdio bovino foram os modelos mais utilizados.(7,9,38)

No Brasil, a prótese de pericárdio bovino foi desenvolvida por BRAILE em 1974, enquanto a prótese porcina foi introduzida por VANDRECIC em 1997.(40-41)

Uma importante contribuição brasileira para os estudos iniciais com próteses valvares foi realizada por PUIG e VERGINELLI em 1971, que usaram dura-máter humana para a confecção de próteses valvares cardíacas.(10)

Apesar de existirem diversos mecanismos de disfunção das biopróteses, a calcificação continua sendo a principal forma de degeneração dos tecidos biológicos. Por este motivo, diversos pesquisadores vêm estudando novos métodos químicos para retardar este processo, e conseqüentemente, aumentar a durabilidade das próteses.

A calcificação das próteses é progressiva e multifatorial, sendo dependente do tempo do implante, do estresse mecânico, de fatores biológicos do receptor e de fatores bioquímicos

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da fixação tecidual. A calcificação de biopróteses em crianças e jovens, por exemplo, é mais intensa do que em idosos, assim também como em pacientes com insuficiência renal, a mineralização é mais intensa.(1,3,19,42,43,44,45,46,47,48)

Na degeneração das biopróteses, o principal e mais freqüente mecanismo de falência é a calcificação intrínseca, nas quais os depósitos de cálcio estão relacionados ao colágeno das cúspides e ao tecido conectivo celular. Os depósitos de cálcio predominam no tecido comissural adjacente ao pilar de sustentação e na base de fixação marginal, áreas onde a curvatura dos folhetos provoca a deformação e o estresse mecânicos máximos.(44,45,49,50,51,52,53)

O processo de calcificação extrínseca, que ocorre na superfície das cúspides, em trombos e vegetações infectadas também está presente, entretanto, em menor intensidade.(50)

A calcificação intrínseca é um processo dominante, observado tardiamente (três a quatro anos após o implante em adultos), enquanto a calcificação extrínseca pode ocorrer associada a trombos ou endocardite, o que pode ocorrer rapidamente, com até uma semana após o implante.(51)

A mineralização do tecido conectivo das biopróteses pode ser causada pela desvitalização celular induzida pelo GDA, devido a ruptura na regulação do cálcio. Nas células intactas vivas dos animais, existe baixa concentração intracelular de cálcio livre (aproximadamente 10-7M), enquanto o tecido extracelular tem cálcio livre muito maior (aproximadamente 10-3M), resultando em gradiente através da membrana citoplasmática. A disfunção da bomba de cálcio propicia a nucleação de cristais de fosfato de cálcio.(19)

SCHOEN e LEVY em 1999 afirmaram que a patologia e fisiopatologia do processo de calcificação independem do local do implante e, por isso, os estudos podem ser feitos em diversos modelos experimentais.(1,45,49,50,51,52,54,55) Dentre eles, pode-se citar o implante em tecido subcutâneo de ratos, coelhos ou carneiros; implante de próteses em posição ortotópica e/ou heterotópica em carneiros ou bezerros, assim como dentro de corações artificiais. Em

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todos os modelos experimentais, incluindo localização subcutânea, o tecido biológico calcifica progressivamente, com morfologia similar àquela observada em experimentos clínicos, porém com uma cinética acelerada.(44,54,55)

O modelo do subcutâneo de ratos é bastante utilizado por ser econômico e eficiente, além de possibilitar estudo controlado do ponto de vista metodológico. Por esse motivo, alguns autores sugerem o seu emprego de forma rotineira como o primeiro na avaliação de novos métodos de anticalcificação. Somente, depois de demonstrada a eficácia no subcutâneo de ratos, é que outros estudos mais sofisticados e complexos deveriam ser realizados.(45,50,51,52,55,56)

Alguns detalhes de metodologia parecem influenciar os resultados nesse modelo. Dessa forma, NILLESEN, demonstrou que em ratos da raça Sprague- Dawleyresultam em calcificação mais intensa e precoce quando comparada com a raça Wistar. Entretanto na revisão da literatura, em diversos estudos encontrou-se a utilização tanto da raça Wistar como da Sprague Dawley. Da mesma forma, alguns autores enfatizam a importância do uso de animais jovens (entre três a quatro semanas de idade) por serem um modelo mais reprodutivo, visto que a calcificação é mais intensa quando comparada com animais mais velhos.(57)

Para aumentar a durabilidade e estender a vida funcional das biopróteses valvares muitos tratamentos de antimineralização de tecidos têm sido propostos. Apesar da maioria deles ainda estar em fase experimental, alguns já passaram a ser avaliados em estudos clínicos.

Dentre as estratégias de anti-calcificação encontrou-se: (a) terapêuticas sistêmicas com agentes anticalcificantes; (b) terapêuticas localizadas, com dispositivos locais e liberação de drogas e (c) agentes farmacológicos que modifiquem as características químicas ou físicas destes tecidos ou ambas. Porém, o mecanismo de ação da maioria dos tratamentos para a antimineralização dos tecidos de biopróteses valvares não são completamente

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conhecidos.(14,19)

Várias substâncias, com mecanismos específicos de ação e ausência de efeitos adversos demonstraram potencial utilidade clínica como agentes anticalcificantes.(1) Dentre eles, citam-se:(25,26,58,59) difosfonatos, íons metálicos trivalentes,(27-28) ácido aminoléico,(29,20,32) surfactantes,(19,60) decelularização,(34,35,61) etanol(14,15,21,22) e ácido L-glutâmico.(18,23)

O etano hidroxidifosfonato foi aprovado pelo U.S. Food and Drug Administration (FDA) para uso em humanos para inibir calcificação patológica e para tratar hipercalcemia maligna. Compostos desta modalidade provavelmente inibem a calcificação diminuindo o crescimento dos cristais de cálcio. O pré-tratamento de tecidos com compostos de difosfonatos, com terapia sistêmica ou local do hospedeiro, inibiram a calcificação em modelos experimentais.(62)

VYAVAHARE em 1997 refere que próteses porcinas fixadas pelo glutaraldeído, quando tratadas previamente com etanol 80%, têm a calcificação prevenida em trocas valvares mitrais, em ovelhas, e implante subcutâneo, em ratos. O tratamento com etanol promoveu a extração quase total dos fosfolipídios e do colesterol e causou alteração permanente na conformação do colágeno. Nas cúspides, houve interação da água com os lipídeos que aumentou a resistência á ação da colagenase.(14,15)

Recentemente o ácido aminooléico, usado como detergente, demonstrou prevenir a calcificação das biopróteses porcinas.(29,30,63) Os resultados mostraram que o ácido amino oléico (AOA) reduz significativamente a calcificação dos folhetos das biopróteses implantadas na posição aórtica, em ovelhas. Entretanto, os resultados quanto a estabilidade em vivo e a possibilidade de degradação do AOA remanescente no tecido necessitam ser resolvidos.(14,29)

Segundo WEBB, o pré-tratamento de cúspides porcinas e pericárdio bovino com FeCl3

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tela subcutânea de ratos. Estes cátions atuam formando fosfatos complexos, prevenindo a formação de fosfatos de cálcio que são ativos quando liberados de um polímero controle implantados. Tanto o FeCl3 quanto o AlCl3 alteram a molécula da elastina, diminuindo a

calcificação.(27)

O pré-tratamento com detergente sulfato de sódio duodecil (SDS) pode inibir a calcificação pela remoção dos fosfolipídios do substrato. Entretanto, os detergentes afetam a superfície da membrana e as fibras colágenas, resultando, por vezes, em marcada diminuição da durabilidade das biopróteses.(14,63,64)

Pelo fato de a mineralização ocorrer no interior das células conectivas desvitalizadas do tecido das biopróteses, procurou-se retirar estas células, o que resultaria numa matriz menos propensa ao acúmulo de cálcio. Este processo denominado de decelularização, foi proposto por autores como WILSON e COURTMAN.(34,35,61)

O ácido L-glutâmico utilizado na preservação de segmentos de pericárdio bovino implantados na tela subcutânea dos ratos promoveu redução significativa nos índices de calcificação e de infiltração de células inflamatórias.(18) Os autores sugerem que o ácido L-glutâmico reage com grupos de aldeídos presentes no tecido, os quais são responsáveis pelo início da nucleação do cálcio, além de reagir também com aldeídos na superfície das fibras de colágeno, formando acetato e ésteres. O pH ácido durante o tratamento com o ácido L-glutâmico favorece a despolimerização dos polímeros de GDA, tornado a molécula menor e mais leve, facilitando a lavagem do excesso do aldeído tóxico.(18,23)

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Este trabalho foi realizado nos Laboratórios de Cirurgia Experimental da Disciplina de Técnica Operatória da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR), no Laboratório da Cardioprótese Ltda, no Laboratório de Patologia Clínica da Santa Casa de Misericórdia de Curitiba e no Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento (LACTEC).

Foram adotadas as Normas de Apresentação de Trabalhos de Vancouver (1997) e a Nomina Anatômica Veterinária (1983). Respeitaram-se os princípios éticos de experimentação animal, conforme preconizado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.(65)

O Comitê de Ética em Pesquisa com animais da PUC-PR aprovou este experimento sob o registro no CEPA/PUC-PR n° 62.

3.1 MODELO EXPERIMENTAL

Foram utilizados 54 ratos machos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia),da linhagem Wistar, provenientes do biotério da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, com idade média de 33,0 + 3 dias e peso médio de 90,0 + 4g.

Os animais foram divididos em 6 grupos (I, II, III, IV, V e VI) com 9 animais cada, conforme o tratamento químico do pericárido bovino implantado, demonstrado na Tabela 1.

Cada grupo foi subdividido em 3 subgrupos, de acordo com o tempo de evolução pós-operatório por ocasião da eutanásia do animal para o explante do segmento do pericárdio bovino (15, 30 e 60 dias) (Tabela 2).

(28)

Tabela 1– Tratamento dos segmentos de pericárdio nos diferentes grupos

Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3

Grupo Fixação do tecido Tratamento alternativo Estocagem I fixados em GDA 0,5% por 72h _ Solução de GDA 0,2% pH 7,4% II fixados em GDA 0,5% por 72h

_ SSI com Paraben

III fixados em GDA 0,5% por 72h

Ácido L-glutâmico 0,8%, pH 7,4, em água destilada por 48 h.

SSI com Paraben IV fixados em GDA

0,5% por 72h

Ácido L-glutâmico 0,8%, pH 3,5, em água destilada por 48h

SSI com Paraben V fixados em GDA

0,5% por 72h

Ácido L-glutâmico 8%, pH 7,4, em água destilada por 48 h.

SSI com Paraben VI fixados em GDA

0,5% por 72h

Ácido L-glutâmico 8%, pH 3,5, em água destilada por 48h

SSI com Paraben Nota: GDA-Glutaraldeído

Tabela 2 – Distribuição dos ratos em subgrupos

Grupos Tempo de Observação Sub-grupo IA n=3 I GDA IB n=3 * (GDA) n=9 15 dias 30 dias 60 dias IC n=3 IA n=3 II GDA IB n=3 ** (Paraben) n=9 15 dias 30dias 60 dias IC n=3 IA n=3 III AG 0,8% IB n=3 pH 7,4 n=9 15 dias 30dias 60 dias IC n=3 IA n=3 IV AG 0,8% IB n=3 pH 3,5 n=9 15 dias 30dias 60 dias IC n=3 IA n=3 V AG 8% IB n=3 pH 7,4 n=9 15 dias 30dias 60 dias IC n=3 IA n=3 VI AG 8% IB n=3 pH 3,5 n=9 15 dias 30dias 60 dias IC n=3

Nota: *GDA (*GA)=Armazenado em glutaraldeído 0,2% ** GA (Paraben)= Armazenado em Paraben

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3.2 OBTENÇÃO DO PERICÁRDIO BOVINO

Os pericárdios bovinos foram obtidos em frigorífico de animais em idade de abate comercial, logo após o seu sacrifício. Ainda no matadouro, os pericárdios foram dissecados e liberados da gordura mediastínica e pleural, lavados e transportados em solução gelada de Ringer Lactato a 4° C até o laboratório, onde foram processados.

3.3 PROCEDIMENTO QUÍMICO

Em todos os grupos os segmentos de pericárdio foram previamente fixados em GDA a 0,5% em solução tampão fosfato, com pH = 7,4, por 72 horas, em temperatura ambiente (fixação padrão). Após esta fase, foi realizado o tratamento dos segmentos de pericárdio de forma diferente entre os grupos (Tabela 1).

O grupo I ou grupo controle, recebeu o tratamento convencional empregado em biopróteses comercialmente disponíveis, isto é, após a fixação inicial com GDA a 0,5%, foi estocado em solução tamponada com GDA a 0,2%. Os pericárdios do grupo II foram fixados de forma igual ao grupo I, diferindo deste apenas na sua estocagem que foi feita em solução com Paraben. No grupo III, após ser fixados em GDA 0,5%, o segmento pericárdico foi tratado com solução tamponada contendo ácido L-glutâmico a 0,8% com pH = 7,4 por 48 horas, sendo posteriormente armazenado em SSI com Paraben. No grupo IV, após a mesma fixação, o segmento pericárdico foi tratado com solução de ácido L-glutâmico a 0,8% com pH=3,5 por 48 horas, sendo posteriormente armazenado em SSI com Paraben.

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No grupo V, após fixação, o segmento pericárdico foi tratado com solução tamponada contendo ácido L-glutâmico a 8% com pH = 7,4 por 48 horas, sendo posteriormente armazenado em SSI com Paraben e no grupo VI com o mesmo tratamento, mas com pH = 3,5.

3.4 PREPARO PRÉ-OPERATÓRIO

Os ratos foram mantidos no biotério da PUC-PR, em gaiolas, agrupados no máximo em número de 5 animais, onde receberam ração balanceada para espécie (Nuvitab CR1@), água potável e condições de temperatura de 20±2 °C e luminosidade com ciclos claro escuro de 12h.

3.5 ANESTESIA

Foi utilizado para a indução e manutenção anestésicas, quetamina na dose de 60mg/Kg e xilasina na dose de 10mg/kg, administradas por via intra muscular. No período pós-operatório foi utilizado dipirona, via oral, na dose de 1ml/kg, por 48 horas.

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3.6 TÉCNICA OPERATÓRIA

Após a indução anestésica, os animais foram posicionados em decúbito ventral sobre pranchas cirúrgicas, com os quatro membros em abdução, os quais foram fixados às pranchas por meio de elásticos.

Foi realizada tricotomia elétrica da região dorsal alta, limpeza mecânica e anti-sepsia da região operatória com polivinilpirrolidona-iodo (Povidine®), seguido da colocação de campo cirúrgico estéril fenestrado sobre a área operatória.

Foi praticada incisão de aproximadamente 2cm na região dorsal e confeccionada loja subcutânea para o implante do pericárdio bovino sob a pele do animal. A síntese da pele foi realizada com dois pontos simples com fio de nailon 3.0 (Mononylon Ethicon®) (Figura 1).

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3.7 OBSERVAÇÃO PÓS-OPERATÓRIA

Após as operações, os ratos foram marcados com canetas demográficas e colocados em gaiolas apropriadas. Em cada gaiola ficaram cinco animais. Os ratos foram mantidos com alimentação e cuidados usuais do biotério, sendo submetidos à eutanásia com 15, 30 e 60 dias com dose letal de tiopental sódico, 400 mg/kg, por via intra peritoneal. Posteriormente, foi realizada incisão longitudinal na região dorsal e remoção dos implantes para análise microscópica e mensuração do cálcio por espectroscopia de absorção atômica com atomização em chama.

3.8 ANÁLISE MICROSCÓPICA

Os explantes foram fixados em solução de formalina a 10% e encaminhados para análise microscópica. O exame histológico foi realizado por um mesmo observador, sem conhecimento do grupo ao qual pertencia o espécime.

A preparação do material histológico seguiu os métodos de histotécnica adotados pelo Laboratório de Patologia da Santa Casa de Curitiba. Após fixação em solução de formalina tamponada a 10%, o material da amostra foi desidratado pelo álcool etílico, em concentrações progressivas de 70 % a 100%, diafanizados por impregnação com xilol e imersos em parafina a 60%, para constituição de blocos. Realizaram-se cortes de 2 a 4 µm de espessura, corados com hematoxilina-eosina (HE).

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A avaliação da calcificação distrófica foi então realizada por meio de microscópico tetraocular (American Optical x8) e classificada em quatro níveis, de acordo com o percentual da peça comprometido por calcificação (Tabela 3).

Tabela 3 – Classificação da calcificação distrófica Graus de calcificação

1 Calcificação distrófica compreendendo 0-10% da superfície da peça 2 Calcificação distrófica compreendendo 10-30% da superfície da peça 3 Calcificação distrófica compreendendo30-70% da superfície da peça 4 Calcificação distrófica compreendendo mais de 70% da superfície da peça

3.9 MENSURAÇÃO DO CÁLCIO

As amostras de pericárdio bovino foram submetidas a solubilização com ácido clorídrico e enviadas ao Laboratório do Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento (LACTEC) da Universidade Federal do Paraná, aonde a determinação quantitativa do cálcio foi realizada por espectroscopia de absorção atômica, com espectrômetro Perkin Elmer, 4100 (Figura 2).

A quantidade total de cálcio foi expressa em miligramas por amostra e extrapolada para µ g/mg de tecido pré-implantado. Deste modo, foi possível estimar a quantidade de cálcio incorporada por miligrama de tecido seco implantado e não do tecido seco explantado, cujo peso reflete não só na quantidade de cálcio incorporada, como também a infiltração das células do hospedeiro.

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Figura 2 – Espectrômetro Perkin-Elmer, 4100® - aparelho utilizado para mensuração do cálcio no pericárdio bovino

3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As variáveis, tanto a quantificação de cálcio por espectroscopia de absorção atômica, quanto a análise da calcificação distrófica foram inicialmente submetidas à avaliação de sua distribuição através de testes de normalidade, coeficiente de variação e análise de histogramas.

Para avaliar as possíveis diferenças existentes entre os 6 grupos nos índices de calcificação distrófica foi aplicado o modelo de Análise da Variância (ANOVA) de Kruskal-Wallis e de Friedman, considerando a distribuição assimétrica das variáveis e ausência de homocedasticidade entre os grupos.

Para todos foram utilizados os testes bicaudais, considerando que as diferenças poderiam estar distribuídas para ambos os lados da curva, com nível de significância mínimo de 5%. O tamanho da amostra foi estimado considerando um erro de tipo I de 5% (alfa) e erro do tipo II de 10%.

(35)

(36)

4.1 DESCRIÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO POR ESPECTROSCOPIA POR ABSORÇÃO ATÔMICA

4.1.1 Grupo I ou Controle

O grupo controle apresentou calcificação progressiva conforme o dia de sacrifício dos animais.

Com 15 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 0,510 ± 0,095µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 0,410 e 0,600, com mediana de 0,520.

Com 30 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 1,096 ± 0,223µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 0,840 e 1,250, com mediana de 1,200.

Com 60 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 1,933 ± 0,378µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 1,500 e 2,200; com mediana de 2,100 (Tabela 4).

4.1.2 Grupo II

No grupo II também pode-se observar calcificação progressiva ao longo do tempo, não havendo diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo I (p = 0,11). Com 15 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 0,220 ± 0,043µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 0,190 e 0,270; com mediana de 0,200.

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Com 30 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 1,183 ± 0,388µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 0,750 e 1,500; com mediana de 1,300.

Com 60 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 2,700 ± 1,126µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 1,400 e 3,400, com mediana de 3,300 (Tabela 4).

4.1.3 Grupo III

Os pericárdios do grupo III também apresentaram calcificação progressiva, entretanto, com níveis de cálcio significativamente menores do que os observados no grupo I (p = 0,02), mas semelhante ao do grupo II (p = 0,22). Com 15 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 0,266 ± 0,104µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 0,150 e 0,350; com mediana de 0,300.

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4.1.4 Grupo IV

No grupo IV observa-se significativa redução da calcificação do pericárdio mesmo após 60 dias de permanência na tela subcutânea dos animais, com diferença estatisticamente significativa em relação aos grupos I (p = 0,001), grupo II (p = 0,01) e grupo III (p = 0,008). Com 15 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 0,043 ± 0,057µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 0,009 e 0,110; com mediana de 0,012.

4.1.5 Grupo V

No grupo V observa-se níveis de calcificação maiores do que no grupo IV aos 60 dias (p = 0,03) e níveis de calcificação significativamente diferentes dos grupos I (p = 0,04), II (p = 0,001), IV (p = 0,03) e em menor proporção em relação ao grupo IV (p = 0,09). Com 15 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 0,013 ± 0,003µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrados foram, respectivamente, de 0,009 e 0,015; com mediana de 0,015.

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4.1.6 Grupo VI

No grupo VI os resultados foram tão satisfatórios quanto o grupo IV, não havendo tendência de calcificação aos 60 dias. Com 15 dias os níveis de cálcio observados foram em média de 0,006 ± 0,000µcg de cálcio/mg de tecido. Os valores mínimo e máximo registrado foram, respectivamente, de 0,006 e 0,007; com mediana de 0,007.

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Tabela 4 – Calcificação atômica (espectroscopia de absorção atômica, em microgramas) aos 15, 30 e 60 dias

Grupo Rato 15 dias 30 dias 60 dias

Grupo I R1 0,520 1,250 1,500 R2 0,600 0,840 2,100 R3 0,410 1,200 2,200 Média 0,510 1,096667 1,933333 Grupo II R1 0,270 0,750 3,400 R2 0,190 1,300 3,300 R3 0,200 1,500 1,400 Média 0,220 1,18333 2,700 Grupo III R1 0,350 0,700 1,500 R2 0,300 1,500 0,400 R3 0,150 0,200 1,800 Média 0,266667 0,8 1,23333 Grupo IV R1 0,110 0,005 0,070 R2 0,009 0,080 0,070 R3 0,012 0,100 0,050 Média 0,043667 0,061667 0,063333 Grupo V R1 0,015 0,006 0,200 R2 0,009 0,008 0,070 R3 0,012 0,030 0,800 Média 0,013 0,014667 0,356667 Grupo VI R1 0,007 0,008 0,070 R2 0,007 0,011 0,060 R3 0,006 0,007 0,070 Média 0,006667 0,008667 0,066667

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4.2 ANÁLISE DA CALCIFICAÇÃO DISTRÓFICA NOS GRUPOS DE ESTUDO POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA

Quando se comparam os grupos, com o objetivo de analisar a calcificação distrófica de acordo com os diferentes tratamentos dados ao pericárdio, observa-se que houve diferença estatisticamente significativa entre eles (p < 0,003), sendo o grupo I semelhante aos grupos II e III (p = 0,11) e o grupo II semelhante ao III (p = 0,22). Os grupo V e VI apresentaram níveis também semelhantes de calcificação (p = 0,37) enquanto o grupo IV diferiu de todos os grupos (p < 0,05).

Observa-se, desta forma, que os grupos I, II e III apresentaram comportamento semelhante enquanto o mesmo ocorreu com os grupos IV, V e VI. Nos grupos I, II e III, houve aumento dos níveis de calcificação de acordo com o dia de sacrifício dos animais enquanto nos grupos IV, V e VI estes níveis permaneceram praticamente inalterados (Figura 3).

Figura 3 – Gráfico ilustrando a variação da calcificação distrófica nos diferentes tratamentos realizados nos segmentos de pericárdio (visão da evolução de acordo com o dia da eutanásia dos animais)

GRUPO I GRUPO II GRUPO III GRUPO IV GRUPO V GRUPO VI

Variação da Calcificação Distrófica entre os Grupos de Estudo

(visão da evolução de acordo com o dia de sacrifício dos animais) ANOVA de Kruskal-Wallis - p < 0,003 m c g -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

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Nos primeiros três grupos verificou-se aumento dos níveis de calcificação de acordo com o tempo de sacrifício dos animais, mais notadamente nos grupos I e II, embora sem diferença estatisticamente significativa entre eles (p = 0,34). Nos grupos IV, V e VI este fato não ocorre e os níveis de calcificação permanecem praticamente inalterados em relação ao tempo de sacrifício dos animais (Figura 4).

Figura 4 – Gráfico ilustrando a variação da calcificação distrófica nos diferentes tratamentos realizados nos segmentos de pericárdio (visão dos grupos)

4.3 ANÁLISE MICROSCÓPICA (HISTOLÓGICA) DA CALCIFICAÇÃO DISTRÓFICA NOS GRUPOS DE ESTUDO

4.3.1 Com 15 dias de sacrifício dos animais

A análise microscópica confirmou os dados obtidos pela espectroscopia de absorção atômica. Após 15 dias, os pericárdios dos grupos I,II,III, já evidenciavam calcificação distrófica, mais acentuadamente na porção central do tecido. Já nos grupos IV,V e VI, a

15 dias 30 dias 60 dias

Variação da Calcificação Distrófica entre os Grupos

(visão dos grupos) ANOVA de Kruskal-Wallis - p < 0,003 m c g -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

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calcificação esteve ausente ou era de intensidade mínima e de caráter focal (Tabela 5, Figura 5).

Tabela 5 – Distribuição do grau de calcificação distrófica aos 15 dias Classificação do grau de calcificação distrófica

0-10% 10-30% 30-70% > 70% Total 15 dias n % n % n % n % I 0 0 0 0 6 100 0 0 6 II 0 0 4 66,67 2 33,33 0 0 6 III 0 0 4 66,67 2 33,33 0 0 6 IV 4 66,67 0 0 2 33,33 0 0 6 V 2 33,33 4 66,67 0 0 0 0 6 VI 6 100,0 0 0 0 0 0 0 6

Teste Qui-quadrado para tendências lineares – p < 0,0001

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Figura 5 – Fotomicrografia mostrando os graus de calcificação do pericárdio bovino de acordo com os tratamentos empregados nos grupos I, II, III, IV, Ve VI com 15 dias de implante na tela subcutânea dos animais (he 40x)

I II

III IV

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Com 30 dias verificou-se que, de forma semelhante ao que se observou aos 15 dias, a calcificação compreendendo maiores taxas percentuais de tecido ocorreu com maior freqüência nos grupos I, II e III enquanto que nos grupos IV, V e VI a calcificação ocorreu no seu grau mais leve (0-10% da peça) (Tabela 6, Figura 6).

0-10% 10-30% 30-70% > 70% Total 30 dias n % n % n % n % I 0 0 0 0 1 16,67 5 83,33 6 II 0 0 0 0 3 50,0 3 50,0 6 III 0 0 1 16,67 0 0 5 83,33 6 IV 3 50,0 1 16,67 0 0 2 33,33 6 V 4 66,67 0 0 2 33,33 0 0 6 VI 6 100,0 0 0 0 0 0 0 6

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Figura 6 – Fotomicrografia mostrando os graus de calcificação do pericárdio bovino de acordo com os tratamentos empregados nos grupos I, II, III, IV, V e VI com 30 dias de implante na tela subcutânea dos animais (he 40x)

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Com 60 dias verificou-se que, de forma semelhante do que se observou aos 15 e 30 dias, a calcificação compreendendo maiores taxas percentuais de tecido ocorreu com maior freqüência nos grupos I, II e III enquanto que nos grupos IV, V e VI a calcificação ocorreu no seu grau mais leve (0-10% da peça) (Tabela 7, Figura 7).

0-10% 10-30% 30-70% > 70% Total 60 dias n % n % n % n % I 0 0 0 0 1 16,67 5 83,33 6 II 0 0 0 0 1 16,67 5 83,33 6 III 0 0 1 16,67 3 50,0 2 33,33 6 IV 6 100,0 0 0 0 0 0 0 6 V 3 50,0 2 33,33 1 16,67 0 0 6 VI 5 83,33 1 16,67 0 0 0 0 6

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Figura 7 – Fotomicrografia mostrando os graus de calcificação do pericárdio bovino de acordo com os tratamentos empregados nos grupos I, II, III, IV, V e VI com 60 dias de implante na tela subcutânea dos animais (he 40x)

O conjunto de gráficos da Figura 8 ilustra a evolução em cada grupo, de acordo com o tempo da eutanásia dos animais, evidenciando a redução progressiva da extensão da calcificação distrófica do segmento pericárdico, de acordo com o tratamento aplicado. Observou-se no grupo I, predomínio de graus acentuados de calcificação distrófica do segmento pericárdico, acometendo 30-70% do tecido aos 15 dias de sacrifício dos animais, e

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se acentuando para > 70% da área tecidual aos 30 e 60 dias (Figura 8, gráfico do grupo I). No grupo II, aos 15 dias, observou-se em alguns animais, calcificação de gradação mais leve (10-30% da área tecidual), mas com acentuação aos 30 e 60 dias para graus mais elevados de calcificação (30-70% e > 70% da área tecidual) (Figura 8, gráfico do grupo II).

No grupo III, aos 15, 30 e 60 dias, já se pode observar a presença de grau mais leve de calcificação (10-30% da área tecidual), embora cada vez menor, de acordo com o tempo de sacrifício dos animais. Observou-se neste grupo que apesar de aos 15 dias os níveis de calcificação sejam de grau mais leve, há importante acentuação para os graus de calcificação de 30-70% e > 70% da área tecidual (Figura 8, gráfico do grupo III).

Nos grupos IV, V e VI observou-se nítido predomínio do grau mais leve de calcificação, ou seja, de 0 a 10% da área tecidual, especialmente dos grupos IV e VI. O grupo V ainda apresentou, na evolução, acentuação dos níveis de calcificação e no grupo VI verificaram-se os melhores resultados, quando praticamente todos os animais apresentaram o grau de calcificação mais leve em todos os tempos evolutivos avaliados (Figura 8, Gráficos dos grupos IV, V e VI).

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Figura 8 – Gráficos ilustrando a distribuição do grau de calcificação distrófica de acordo com os diferentes tipos de tratamento aplicado ao segmento pericárdico e de acordo com o tempo de sacrifício dos animais. 0 1 2 3 4 5 6 7 15 30 60 ₁₅ ₃₀ ₆₀ 0 1 2 3 4 5 6 7 15 30 60 0 1 2 3 4 5 6 7 15 30 60 0 1 2 3 4 5 6 7 15 30 60 0-10% 10-30% 30-70% >70% 0 1 2 3 4 5 6 7 15 30 60 GI GII GIII GIV GV GVI 0 1 2 3 4 5 6 7 Dias _Dias Dias Dias Dias Dias

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A fixação de tecidos biológicos pelo GDA foi inicialmente testada por Carpentier em 1968.(38) A partir de então, próteses valvares biológicas assim tratadas foram usadas clinicamente. Os resultados clínicos iniciais demonstraram que essas próteses tinham bom desempenho hemodinâmico e baixo índice de trombogenicidade, porém apresentavam durabilidade limitada em decorrência da degeneração tecidual. De todos os fatores arrolados como responsáveis pela degeneração protética na atualidade, os de maior importância, e que têm grande parte dos estudos dirigidos para sua pesquisa, são a calcificação e a toxicidade do GDA.(1,66)

Dentre os mecanismos de calcificação, tem-se a evidência de que a presença de células mortas e debris de restos celulares funcionariam como núcleos de calcificação, permitindo a deposição de cristais de fosfatos e carbonatos de cálcio, sódio e magnésio.(1) Adicionalmente, o próprio tratamento com GDA funcionaria como fator desencadeante da deposição de cálcio. Já foi demonstrado que altos teores de GDA incorporado ao tecido biológico se relacionam com maior tendência à calcificação, em modelo experimental em ratos.(67) A relação causal entre pré-tratamento com GDA já foi estudada por NIMNI em 1988, que demonstraram que os polímeros de GDA e os resíduos carbonílicos livres na matriz de colágeno provêm um sítio inicial para a deposição dos complexos de cálcio.(13)

Diversas estratégias têm sido avaliadas com o objetivo de eliminar ou minimizar a degeneração tecidual induzida por estes fatores VYAVAHARE em 1997, estudaram os efeitos de várias concentrações do etanol. Mostraram que numa concentração de 80% há inibição da calcificação das cúspides aórticas implantadas na tela subcutânea de ratos ou no sistema circulatório de ovelhas, como substituto mitral. Sugeriram que a extração do colesterol e fosfolipídios seja o principal mecanismo de sua ação anticalcificante, embora haja outros fatores que possam influenciar na mineralização do tecido bioprotético.(14) No centro

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de pesquisa na PUC-PR, também estudou-se o efeito do etanol a 80% nas cúspides aórticas porcinas e chegou-se a resultados semelhantes.(68)

Ambos os trabalhos demonstraram que, apesar da efetividade do tratamento com o etanol na prevenção da calcificação das cúspides valvares, o mesmo não foi efetivo quando foi analisada a parede aórtica porcina.

A extração de lipídios também pode ser efetuada através de processamento do tecido com detergentes, como o sulfato de sódio duodecil (SDS). Entretanto, os detergentes podem afetar a superfície da membrana e as fibras colágenas, o que poderia ocasionar diminuição da durabilidade das biopróteses.(14,60,64)

Recentemente demonstrou-se que o ácido amino oléico usado como detergente, preveniu a calcificação das biopróteses porcinas.(29,30,63) Os resultados mostraram que o ácido amino oléico reduz significativamente a calcificação dosfolhetos das biopróteses implantadas na posição aórtica em ovelhas. Entretanto, os resultados quanto a estabilidade “in vivo” e a possibilidade de degradação do ácido amino oléico remanescente no tecido ainda não estão completamente resolvidos.(14,29)

O emprego sistêmico de hidroxi e amino-difosfonatos foram também testados experimentalmente, mas os altos teores necessários interferiram no metabolismo do cálcio, com retardo do crescimento ósseo e desenvolvimento estatural dos animais. Entretanto, quando os bifosfonatos são colocados junto a folhetos de valvas porcinas implantadas na tela subcutânea de ratos, sua liberação lenta e localizada, inibe a calcificação, sem os efeitos adversos do uso sistêmico.(58)

GOLOMB e EZRA em 1991, trataram as cúspides aórticas porcinas com íons metálicos trivalentes, e observaram marcada, ação anticalcificante nestes, mesmo com baixas concentrações. Estudos morfológicos com os tecidos das biopróteses pré-tratadas com o

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alumínio e cloridrato de ferro revelaram que o AL3 e o Fe3 são responsáveis pela

desvitalização celular.(69)

HIRSCH (1993) e VYAVAHARE estudaram a ação do FeCl3 e do

etanohidroxidifosfonato , e concluíram que o efeito sinérgico destes dois compostos foi mais efetivo para inibir a calcificação do pericárdio bovino e da parede da aorta, do que quando usados separadamente.(63,70)

A fixação de tecidos biológicos com GDA é decorrente de ligações cruzadas com os grupos amino de lisina, hidroxilisina e outros aminoácidos com terminações amino presentes nas moléculas protéicas de colágeno. A qualidade dessas reações depende da pureza, concentração, temperatura, pH e tempo de exposição ao GDA, podendo resultar em qualidades distintas dos tecidos fixados.

Entretanto, independentemente das condições de fixação, polímeros aldeídicos de alto peso molecular são formados na matriz extracelular, localizados na superfície das fibras colágenas. Acredita-se que a ligação desses polímeros com elementos estruturais da matriz resultem em unidades funcionais que favoreçam o depósito inicial dos cristais de hidroxi-apatita, iniciando o processo de calcificação.

Além disso, já foi demonstrado que, em tecidos fixados, existe quantidade significativa de grupos aldeídos tóxicos livres e continuamente liberados da matriz extracelular. A interação desses aldeídos tóxicos com as células conectivas do tecido bioprotético e com macrófagos do hospedeiro que invadem o tecido valvar, facilitam a calcificação distrófica. Da mesma forma, a ação desses aldeídos livres nos leucócitos e plaquetas da camada de fibrina que se forma da superfície do tecido valvar, estão implicados na calcificação extrínseca.

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Outra desvantagem da fixação de tecidos com GDA é a sua baixa bio-compatibilidade, impedindo que sejam adequadamente incorporados pelo hospedeiro, o que pode ser demonstrado pela ausência de repopulação celular e/ou reendotelização.

Diferentemente das outras estratégias anticalcificantes, o emprego do ácido glutâmico visa neutralizar os efeitos tóxicos do GDA, tornando o tecido mais biocompatível e menos propenso à calcificação. Postula-se que o ácido L- glutâmico reaja com aldeídos presentes nas fibras colágenas formando ésteres e acetatos. Além disso, o pH ácido durante o tratamento com ácido L- glutâmico favorece a despolimerização do GDA polimérico, facilitando a sua saída do tecido bioprotético.

LEUKAUF analisou os efeitos do tratamento com ácido L-glutâmico em pericárdios bovinos previamente fixados pelo GDA. Observaram que a semeadura “in vitro” de células endoteliais sobre tecidos não tratados resultava em morte dessas células em menos de 48 horas, enquanto que nos tecidos tratados com ácido glutâmico houve adequada proliferação celular, porém, com baixa aderência ao tecido subjacente. No mesmo estudo, os autores fizeram o implante de enxertos tubulares de pericárdio bovino em carótidas de carneiros. Verificaram que, nos tratados somente com GDA, a superfície interna estava recoberta por camada de fibrina com trombos contendo plaquetas e macrófagos, e apenas raras células endoteliais. Já nos enxertos tubulares tratados com ácido L-glutâmico, houve reendotelização parcial, inclusive com produção de matriz extracelular, indicando melhor bio-compatibilidade do tecido tratado.(71)

Em um trabalho subseqüente, GRIMM analisou a efetividade do tratamento com ácido L-glutâmico na prevenção da calcificação de pericárdios bovinos fixados em GDA. Fragmentos de pericárdio implantados na tela subcutânea de ratos Sprague-Dawley por períodos de até 63 dias, evidenciaram significativa redução, não somente da reação

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inflamatória, como também da calcificação distrófica. Nos explantes tardios, com mais de 60 dias, o nível de cálcio nos pericárdios convencionais foi de 1,69 µg/mg de tecido, enquanto naqueles tratados com ácido L-glutâmico foi de apenas 0,13 µg/mg de tecido.(23) Esses valores são semelhantes aos encontrados neste estudo, nos quais os pericárdios do grupo controle apresentaram 1,93 µg de cálcio/mg de tecido, enquanto que nos pericárdios dos grupos IV e VI, onde o tratamento com ácido L-glutâmico se mostrou mais efetivo, os níveis de cálcio foram de 0,066 e 0,063 µg/mg de tecido nos enxertos explantados com 60 dias. Nos grupos III e IV, o ácido L-glutâmico foi empregado em concentrações idênticas, ou seja 0,8%, mas com pH diferente, observando-se que os resultados do grupo IV foram melhores (pH ácido).

Quando se avaliaram os resultados obtidos com a utilização de ácido L-glutâmico a 8% e pH 7,4 (grupo V), pode-se observar que com 60 dias, neste grupo ocorreu maior grau de calcificação do que nos grupos IV e VI, pH 3,5; porém o grupo V apresentou resultados melhores do que os obtidos no grupo III, no qual a concentração do ácido foi dez vezes menor (0,8%).

GRIMM, em seus experimentos, também testaram o ácido L-glutâmico em solução tamponada e em pH ácido (3,5), e concluiu que as valvas preparadas em pH fisiológico (7,4) favorecem a incorporação significativa de polímeros de glutaraldeído no tecido. Estes polímeros são moléculas grandes e pesadas e que podem se decompor e servir como uma reserva contínua de aldeídos tóxicos. Sendo assim, o ácido glutâmico no pH fisiológico compromete o seu potencial anticalcificante, pois a ligação química ácido-base é instável.(23)

O benefício observado com o emprego de um pH mais ácido (3,5), provavelmente resulta de dois mecanismos independentes: a) o meio ácido durante a exposição ao ácido L-glutâmico favorece a formação de aldeídos monoméricos, que são moléculas menores e mais leves, facilitando a lavagem e remoção do tecido; b) quando ocorre a ligação química entre o

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ácido e o aldeído há transformação em éster e acetato, evitando que aldeído tóxico livre seja liberado no tecido. Neste estudo, quando se compararam os grupos para analisar a calcificação distrófica de acordo com os diferentes tratamentos do pericárdio, observou-se diferença estatisticamente significativa entre eles (p = 0,003).

Quando se compararam todos os grupos, com o objetivo de analisar a calcificação distrófica de acordo com os diferentes tratamentos dados ao pericárdio, observou-se que houve diferença estatisticamente significativa entre eles (p < 0,003).

Observou-se que os grupos I, II e III apresentaram comportamento semelhante enquanto o mesmo ocorreu com os grupos IV, V e VI. Nos grupos I, II e III, houve aumento dos níveis de calcificação de acordo com o dia de sacrifício dos animais enquanto nos grupos IV, V e VI estes níveis permaneceram praticamente inalterados. Nos três primeiros grupos verificou-se aumento dos níveis de calcificação de acordo com o tempo de sacrifício dos animais, mais notadamente nos grupos I e II, embora sem diferença estatisticamente significativa entre eles (p = 0,34). Nos grupos IV, V e VI este fato não ocorreu e os níveis de calcificação permaneceram praticamente inalterados em relação ao tempo de sacrifício dos animais. Neste estudo, ficou evidente a redução significativa dos níveis de calcificação obtido com o tratamento do segmento pericárdico com ácido L-glutâmico a 8% com pH = 3,5.

Estudos devem ser feitos para evidenciar se a ação anticalcificante do ácido L- glutâmico mantêm-se em biopróteses de pericárdio bovino, implantadas no sistema circulatório.

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O uso do ácido L-glutâmico em segmentos de pericárdio bovino, fixados pelo GDA, foi efetivo na prevenção da calcificação quando implantados no tecido celular subcutâneo de ratos jovens, por até 60 dias.

Apesar de ser efetivo nas concentrações de 0,8% e 8%, sua ação foi mais evidente em pH ácido (pH=3,5).

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