Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador - Bahia 2013
ESTUDO DA RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM POPULAÇÕES DE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE
CAPRINOS DO MUNICÍPIO DE CANSANÇÃO, BAHIA
SIMONE LOPES BORGES
ESTUDO DA RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM POPULAÇÕES DE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE CAPRINOS DO MUNICÍPIO DE
CANSANÇÃO, BAHIA
Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal.
Área de Concentração: Parasitologia veterinária
Orientadora: Prof. Dra. Maria Angela Ornelas de Almeida Co-Orientadora: Prof. Dra. Mariana Borges Botura
Salvador – Bahia 2013
SIMONE LOPES BORGES
ESTUDO DA RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM POPULAÇÕES DE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE CAPRINOS DO MUNICÍPIO DE
CANSANÇÃO, BAHIA
Dissertação defendida e aprovada pela comissão examinadora em 19 de fevereiro de 2013.
Comissão Examinadora:
___________________________________________ Profª. Drª Maria Angela Ornelas de Almeida-
Universidade Federal da Bahia Orientadora
___________________________________________ Prof. Dr. George Rêgo Albuquerque
Universidade Estadual da Santa Cruz
____________________________________________ Profª. Drª Silvia Lima Costa
Universidade Federal da Bahia
SALVADOR-BA FEVEREIRO - 2013
BIOGRAFIA DO AUTOR
SIMONE LOPES BORGES - filha de Sostenes Carvalho Borges e Maria Suzana Lopes
Borges nasceu em 01 de outubro de 1981, na cidade de Conceição do Coité, no estado da Bahia. Iniciou o curso de graduação em Medicina Veterinária 01 de março de 2005 e em 05 de agosto de 2010 concluiu a graduação. Em 01 de março de 2011, ingressou na Pós-graduação em Ciência Animal nos Trópicos pela Universidade Federal da Bahia, sob orientação da professora Dra. Maria Angela Ornelas de Almeida, defendendo a dissertação de mestrado em 19 de Fevereiro de 2013.
Este trabalho é dedicado a minha mãe Maria Suzana Lopes Borges por exercer fundamental apoio em todas as etapas de minha formação profissional, propiciando coragem e determinação para continuar e superar os obstáculos impostos.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me proporcionado força e coragem para conclusão de mais uma etapa da vida. A meus pais, Sóstenes Carvalho Borges e Maria Suzana Lopes Borges, meus irmãos Rodrigo Lopes Borges, Malena Lopes Borges e Mary Jose Lopes Carneiro, e demais familiares por todo carinho, confiança, assim como, a compreensão da necessidade da ausência nas diversas datas comemorativas.
A minha orientadora, Professora Maria Angela Ornelas de Almeida pela confiança, amizade e paciência desde a época de iniciação cientifica.
A minha Co-orientadora Mariana Borges Botura, por estar sempre disponível nos momentos de necessidade, assim como sugestões relevantes nesse trabalho desenvolvido.
Aos colegas de profissão e amigos formados durante essa trajetória, Sabrina Lambert, Sandra Nishi, Barbara Paraná, Lívia Ribeiro, Carlos José Souza Filho, Hélimar Lima e Natalia pela ajuda na execução das etapas do experimento e paciência de conviver durante esses momentos estressantes.
Ao laboratório de Toxicologia (LATOX) da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, pela concessão dos equipamentos necessários para desenvolvimento da pesquisa.
A coordenação Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos.
LISTA DE FIGURAS
REFERENCIAL TEÓRICO Página
Figura 1. Distribuição da população caprina no Brasil (FAO, 2010) 04 Figura 2. Situação da resistência anti-helmíntica no Nordeste Brasileiro 18
LISTA DE GRÁFICOS
CAPÍTULO 1 Página
Gráfico 1. Média e desvio padrão do percentual de inibição, por 36 tiabendazole, da eclosão de ovos de nematódeos
gastrintestinais de caprinos entre as áreas Alto Lindo, Morada Nova, Nova Vida e Belo Monte
Gráfico 2. Média e desvio padrão do percentual de migração de 37 larvas de nematódeos gastrintestinais de caprinos após
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1 Página
Tabela 1. Médias das contagens de ovos nas fezes (OPG) de caprinos 31 e percentuais de eficácia de anti-helmínticos por áreas do
município de Cansanção
Tabela 2. Médias das contagens de ovos nas fezes (OPG) de caprinos 33 e percentuais de eficácia da moxidectina e closantel na área
de Belo Monte do município de Cansanção.
Tabela 3. Eficácia (%) do albendazole, levamisole, ivermectina para 34 os gêneros Haemonchus e Trichostrongylus de caprinos
Tabela 4. Percentuais de eficácia da ivermectina pelo Teste de 38 Migração Larvar, por áreas do município de Cansanção
Tabela 5. Concentração efetiva (CE50) de thiabendazole para o Teste 39 de Eclosão de Ovos e CE50 e coeficiente de determinação
BORGES, S.L. Estudo da resistência anti-helmíntica em populações de nematoides
gastrintestinais de caprinos do município de Cansanção, Bahia. Salvador, Bahia, 2013,
73pg. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia.
RESUMO
A produção de caprinos, no nordeste brasileiro, apresenta uma importante função social e econômica, sendo responsável por geração de emprego e renda para os pequenos produtores. No entanto, os rebanhos caprinos são acometidos por helmintos gastrintestinais que afetam o desempenho desses sistemas pecuários, necessitando de medidas de controle das parasitoses para evitar as perdas econômicas, decorrentes da morbidade e mortalidade dos animais. O controle das verminoses gastrintestinais tem sido realizado com antiparasitários de amplo aspecto e poder residual. Contudo, a dosificação inadequada e a frequência constante de tratamentos têm causado a seleção de populações de parasitos geneticamente resistentes aos anti-helmínticos. A resistência parasitária é observada quando há perda de eficácia de composto químico contra os parasitos, após sucessivos tratamentos. Esse estudo foi promovido com objetivo de estimar a resistência anti-helmíntica aos benzimidazois e avermectinas através dos testes de Eclosão de ovos, de migração larvar em ágar modificado e de Redução da Contagem de Ovos nas Fezes em caprinos no município Cansanção no estado da Bahia. Nematódeos resistentes aos benzimidazois, lactonas macrociclicas, levamisole e closantel foram encontrados em rebanhos caprinos em região semiárida em teste in vivo e in vitro, e a alta frequência de resistência foi registrada em diferentes áreas de estudo.
Palavras chaves: BZs, lactonas macrocíclicas, pequenos ruminantes, resistência, testes in vivo,
BORGES, S.L. Study of anthelmintic resistance in populations of goat gastrointestinal
nematodes in the municipality of Cansanção, Bahia. Salvador, Bahia, 2013, 73pg.
Dissertation (Master's degree of Animal Science in Tropics) – School of Veterinary Medicine and Livestock, Federal University of Bahia, 2013
SUMMARY
In the northeastern Brazil, goat production has an important social and economic function, generating employment and income for small farmers. However, goat herds are affected by gastrointestinal helminths that reduce the performance of these livestock systems, requiring control measures to prevent parasitic economic losses, arising from the morbidity and mortality of animals. The control of gastrointestinal worms have been conducted by using broad spectrum antiparasitic drugs and residual power. However, inadequate dosage and constant treatments have caused the selection of populations of genetically resistant parasites to anthelmintics. The parasitic resistance is observed when there is a loss of efficacy of a chemical compound against the parasite, after successive treatments. This study was promoted with the objective of estimate anthelmintic resistance to benzimidazoles and avermectins through Egg Hatch Inhibition, Larval Migration inhibition and Faecal egg count reduction test in goats in Cansanção municipality in the state of Bahia . Nematodes resistant to benzimidazoles, macrocyclic lactones, levamisole and closantel were found in goat herds in semiarid region by in vivo and in vitro tests, and high frequency of resistance was recorded in different areas of study.
SUMÁRIO
Estudo da resistência anti-helmíntica em populações de nematoides ... Página gastrintestinais de caprinos do município de Cansanção, Bahia
Introdução ... 14
Referencial Teórico ... 17
1. Caprinocultura no Brasil e no Nordeste ... 17
2.Nematódeos gastrintestinais ... 19
3. Fatores que influenciam o parasitismo dos caprinos ... 20
4. Anti-helmínticos ... 25
4.1. Mecanismo de ação e desenvolvimento da resistência ... 25
5. Resistência anti-helmíntica ... 29
5.1. Problemática da Resistência ... 29
5.2. Detecção da Resistência anti-helmíntica por ensaios in vivo ... 30
5.3. Detecção da Resistência anti-helmíntica por ensaios in vitro ... 32
Objetivo ... 37
Capítulo 1 Resistência anti-helmíntica múltipla em rebanhos caprinos no bioma caatinga Resumo ... 38
Abstract ... 38
Introdução ... 39
Resultado ... 44 Discussão ... 44 Conclusão ... 54 Referências Bibliográficas ... 55 Considerações Finais ... 59 Referências Bibliográficas ... 60
INTRODUÇÃO
A produção de caprinos, no nordeste brasileiro, apresenta uma importante função social e econômica, sendo responsável por geração de emprego e renda para os pequenos produtores.
A caprinocultura é uma atividade estratégica para o desenvolvimento da região Nordeste, apesar de apresentar ainda níveis muito pobres de desempenho. O centro geral do efetivo caprino encontra-se nesta região (98% da população), sendo a Bahia o maior estado produtor, seguido de Pernambuco, Piauí, Ceará e Paraíba (IBGE, 2010). Porém, quando se analisa a evolução da população caprina, verifica-se uma assimetria, com queda expressiva nos últimos anos, em virtude da substituição de caprinos pelos ovinos em algumas regiões e a introdução e desenvolvimento da agricultura irrigada, principalmente nos polos de fruticultura.
Associados a estes fatores, o sistema de produção de caprinos sofre com a deficiência alimentar e o elevado parasitismo dos animais, dois grandes entraves para a sustentabilidade desta atividade. Outro problema em potencial para caprinocultura é a fragilidade do bioma caatinga, pela degradação dos seus recursos físicos e bióticos, especialmente o déficit hídrico. O produtor convive com ambientes completamente opostos, no período das chuvas ou de seca prolongados, com alto índice de morbidade e mortalidade dos animais.
Sem dúvida alguma a infecção por nematoides gastrintestinais (NGIs) é um dos grandes gargalos para exploração caprina. Os rebanhos caprinos são acometidos por helmintos gastrintestinais que afetam o desempenho desses sistemas pecuários, necessitando de medidas de controle das parasitoses para evitar as perdas econômicas (JACKSON e MILLER, 2006). No estudo de diagnóstico da Situação de Saúde da População Caprina do Município de Cansanção, Bahia, 99% dos 100 pecuaristas familiares questionados,
indicaram a verminose como principal problema de saúde dos animais (dados não publicados).
As nematodeoses gastrintestinais constituem uma dos principais problemas sanitários a pecuária, e são causadas especialmente pelos gêneros Haemonchus, Trichostrongylus,
Strongyloides e Oesopagostomum. As infecções são geralmente mistas e os animais
podem apresentar perda de peso, diarreia, desidratação, anemia, redução da produção de leite e alterações reprodutivas (VIEIRA, 2005).
Diante destes fatos o controle de parasitos é uma das estratégias para garantir a sustentabilidade da cadeia produtiva caprina e para isto dispomos de tecnologias básicas, sociais e inovadoras. Contudo, a pesquisa sobre parasitoses de caprino é muito pobre quando comparada a espécie ovina e nem sempre o modelo ovino é apropriado para caprinos. Por outro lado, as diretrizes do Programa Nacional de Sanidade dos Caprinos e Ovinos sobre a forma de intervenção no processo Saúde-doença, tratam as parasitoses como doença de manejo, portanto não é necessário o controle sanitário oficial, pois não impõem restrições ao comércio de animais e seus produtos, ficando este controle a cargo do produtor.
Um dos grandes desafios para o controle de nematoides é a escolha de critérios de seleção de caprinos, para o tratamento anti-helmíntico. Vários indicadores como os parasitológicos, patofisiológicos e de desempenho produtivo, vem sendo estudado, objetivando dificultar o desenvolvimento da resistência anti-helmíntica, em virtude da ocorrência da resistência múltipla em vários rebanhos caprinos no Brasil (BARRETO et al. 2005; LIMA, M. et al. 2010; VIEIRA e CAVALCANTE, 1999; MELO et al. 2009)
O anti-helmíntico é um componente indispensável nos programas de controle de NGIs, contudo poucos registros de medicamentos anti-helmínticos discrimina o caprino (RINALDI et al., 2012) e a alta frequência de tratamentos e uso de subdoses (KUMSA e
ABEBE, 2009) e a rotação contínua de bases químicas tem favorecido o surgimento da resistência (BARNES e DOBSON, 1990).
A resistência parasitária é observada quando há perda de eficácia de composto químico contra os parasitos, após sucessivos tratamentos (CONDER e CAMPBELL, 1995), com redução da carga parasitária inferior a 95% (MOLENTO et al., 2004). No tratamento das nematodeoses são empregados principalmente os três grupos de anti-helmínticos: benzimidazóis, que se ligam à β-tubulina e evitam a polimerização dos dímeros de tubulina em microtúbulos, e também inibem a fumarato-redutase e o transporte de glicose; imidazotiazóis que são agonistas de receptores de acetilcolina e provocam contração muscular e paralisia e as lactonas macrocíclicas e milbemicinas, que abrem canais de cloro direcionados por glutamato e ocasionam paralisia da neuromusculatura, inclusive da faringe (AYRES e ALMEIDA, 1996; COLES et al., 2006).
Apesar da complexidade destes mecanismos de ação, o tratamento anti-helmíntico não elimina todos os nematoides adultos suscetíveis do hospedeiro (LEIGNEL e HUMBERT, 2001). Assim sendo, os helmintos que sobrevivem à utilização constante desses medicamentos passam esta característica a sua progênie, assegurando o desenvolvimento progressivo de populações resistentes (PAPADOPOULOS, 2008; PRICHARD, 2001)
Diante deste panorama, várias metodologias vêm sendo aplicadas para o diagnóstico da resistência parasitária aos anti-helmínticos, pois o conhecimento da distribuição da resistência é necessário para redução do impacto da infecção parasitária nas criações de caprinos, por melhoria do manejo e racionalização da pecuária. Por este motivo, no presente estudo testamos a eficácia de benzimidazois, lactonas macrocíclicas, levamisole e closantel para nematoides de caprinos em região semiárida.
REFERENCIAL TEÓRICO
1. Caprinocultura no Brasil e no Nordeste
A caprinocultura é uma das atividades econômica explorada mundialmente, com um rebanho estimado de 745 milhões de cabeças (FAO, 2010). O Brasil possui aproximadamente 9,3 milhões, distribuídos em todas as regiões do país, mas com maior concentração na região Nordeste (98%) (Fig. 01), com destaque para o Estado da Bahia que possui o maior rebanho do país, com cerca de 2,8 milhões, o que representa 30,6% do efetivo nacional, seguida de Pernambuco (18,6%), Piauí (14,9%) e Ceará (11%) (IBGE, 2010).
Figura 1: Distribuição da população caprina no Brasil (FAO, 2010).
Uma série de aspectos justifica esse número de caprinos no nordeste brasileiro, entre estes se destacam a capacidade de adaptação ao ambiente semiárido e a função socioeconômica por consistir em uma fonte de renda complementar de subsistência dos criadores, oportunidades de emprego e fixação do homem no campo (MORAES NETO et al., 2003). Além disso, esta atividade não exige altos investimentos em infraestrutura
e na aquisição de animais, além de apresentar rápido retorno do capital investido (NOGUEIRA FILHO; ALVES, 2002).
No estado da Bahia, 80% dos rebanhos de caprino concentram-se na região do semiárido, sendo as principais regiões produtoras são Remanso, Casa Nova, Curaçá, Juazeiro, Uauá e Monte Santo. O município de Cansanção possui o segundo maior rebanho de caprinos do território do sisal, com 36.127 cabeças, estando em primeiro lugar o município de Monte Santo (87 mil) (SEI, 2010).
Os principais produtos da caprinocultura na Bahia são a carne e a pele/couro, possuindo um grande diferencial competitivo no mercado de carne, por ser considerada pela comunidade internacional (OIE), zona livre de aftosa, podendo comercializar seus produtos para outros estados e países. Porém, um fator limitante da comercialização está relacionado com a qualidade e a uniformidade dos produtos oferecidos, visto que é estimado que mais de 90% do abate total da carne de caprinos ainda é clandestino, contribuindo inclusive para riscos para a saúde dos consumidores (CONAB, 2006).
Apesar de numericamente expressiva, a caprinocultura baiana tem apresentado níveis reduzidos de desempenho, baixo padrão racial dos animais, difusão tecnológica incipiente, inadequada assistência técnica e gerencial, desarticulação dos atores da cadeia produtiva, inexistência de estudos de mercados, baixo nível de capacitação dos produtores, limitados recursos forrageiros e hídricos, carência de laboratórios especializados e sem falar na baixa qualidade das peles que veem contribuindo significativamente para que os resultados da exploração de caprinos no Nordeste não sejam compensatórios e não apresentem competitividade, considerando as exigências crescentes do mercado globalizado (NOGUEIRA FILHO e ALVES, 2002; ROSANOVA, 2004).
Esses problemas acontecem principalmente, por haver um grande percentual de rebanhos caprino em posse de pequenos produtores, sendo explorados em sistema extensivo onde são adotadas práticas inadequadas de manejos alimentar e sanitário e por deficiência na difusão de tecnologias economicamente viáveis à região para a atividade pecuária. Desta forma, se faz necessário promover o uso de tecnologias adequadas, visando melhorias na produção, sustentabilidade e no desenvolvimento local e regional, gerando excedentes para os subsistemas de produção, processamento e distribuição (NETO et al., 2011; ROSANOVA, 2004).
2. Nematódeos gastrintestinais de caprinos
Em criações extensivas de caprinos, o parasitismo gastrintestinal é um dos maiores obstáculos na obtenção de bons índices zootécnicos (RINALDI et al., 2012) sendo estes responsáveis por perdas econômicas (SILVA et al., 2003). Caprinos da região nordeste do Brasil são mais frequentemente parasitados por Haemonchus contortus,
Trichostrongylus colubriformis, Strongyloides papillosus e Oesophagostomum columbianum (VIEIRA et al., 1997), sendo que o gênero Haemonchus tem maior
ocorrência nos rebanhos caprinos (ALMEIDA, et al. 1997; LIMA, M. et al., 2010; MELO et al., 2003). As alterações fisiológicas e comportamentais mais comuns observadas em ruminantes parasitados com nematódeos relacionam-se a disfunção gástrica, diminuição da ingestão de alimentos e consequentemente perda de peso e mudanças nos metabolismos energético, proteico e mineral levando a diarreias e em alguns casos a morte do animal (FOX et al., 1993; SARGISON et al., 2012).
Haemonchus contortus é também mais prevalente nos caprinos de regiões temperadas
(HOSTE et al., 2010; RINALDI et al., 2007). Este parasito tem ação espoliativa sobre a mucosa do abomaso e devido seu habito hematófago podem causar anemia severa, edema submandibular, ascite e letargia (TAYLOR et al., 2010). Em relação ao gênero
Trichostrongylus, duas espécies acometem os caprinos, T.axei e T. colubriformis que se
localizam, respectivamente, no abomaso e intestino delgado e causam diarreias prolongadas e como consequencia perda rápida de peso (Bizimenyera et al., 2006). Outro nematódeo frequente em caprinos é o genero Oesophagostomum, cuja as larvas migram pela mucosa do intestino, levando a formação de nódulos, em decorrência de reação inflamatória com presença de neutrófilos e macrófagos (NWOSU et al., 2012). A infecção por este nematódeo provoca nesses animais uma diarreia esverdeada, rápida perda de peso e prostração (TAYLOR et al., 2010).
3. Fatores que influenciam o parasitismo dos caprinos
As interações de fatores alimentar, ambiental e imunitário, regulam o complexo sistema da relação hospedeiro-parasita-ambiente nas infecções parasitárias (HOSTE et al., 2008).
Em condições de semiárido nordestino, os caprinos são criados em sua maioria em sistemas extensivos, alimentando-se de vegetações nativas e demonstram um comportamento seletivo quando comparados a ovinos, ingerindo além de gramíneas, espécies arbustivas principalmente em períodos de seca (HOSTE et al., 2001). Por possuírem dietas compostas por forrageiras arbustivas, as espécies caprinas são mais vulneráveis a infecções por nematódeos gastrintestinais (NGI) do que ovinas, provavelmente por não terem sidos expostos durante o processo de domesticação a cargas parasitárias elevadas (COSTA JÚNIOR et al., 2005).
VLASSOFF et al. (1999) afirma que alguns fatores como frequência de exposição e idade dos caprinos quando acometidos por helmintoses levam precocemente a sinais clínicos da infecção. Isso ocorre, devido pequenos ruminantes naturalmente infectados
responderem imunologicamente de maneiras distintas ao parasitismo por NGI ainda que compartilhando o mesmo pasto.
Outro fator que favorece o parasitismo é a gestação. Fêmeas preenhes mostram-se mais susceptíveis às infecções parasitárias em decorrência de uma resposta imunológica menos eficiente para promover condições de crescimento seguro ao feto. No entanto, no terço final de gestação a imunodeficiência favorece a infecção por nematódeos e as fêmeas apresentam maior taxa de excreção de ovos nas fezes, o que aumenta a contaminação das pastagens e, por conseguinte dos neonatos. Conforme relatado por Pinto et al. (2008) que as maiores contagens de OPG foram coincidentes com a maior concentração de partos, existindo uma relação direta entre a eliminação de ovos de nematódeos gastrintestinais em fêmeas da espécie caprina próximo ao parto.
Trabalhos realizados por Hennessy (1993) e Sangster (1991) mostraram que os comportamentos farmacocinéticos de medicamentos anti-helmínticos de amplo espectro são diferenciados entre as espécies de pequenos ruminantes. Caprinos apresentam biotransformação mais acelerada e consequentemente uma menor biodisponibilidade sistêmica dos anti-helmínticos sob os nematódeos em relação aos ovinos, o que explica que a pratica de sub-dosagens induzem parcialmente taxas de eficácia reduzidas aos tratamentos com anti-helmínticos (SILVESTRE et al. 2002a). Hennessy (1997) e Torres-Acosta (2008) sugerem a necessidade de administrar doses mais elevadas em cabras para alcançar uma maior eficácia. No entanto, Hennessy (1997) sugerem dupla aplicação do medicamaneto em caprinos, sendo administrada outra dose, 12 horas após a primeira aplicação garantindo assim que o principio ativo permaneça mais tempo presente no plasma.
Fenômenos relacionados ao parasito podem garantir seu desenvolvimento e sobrevivência, a exemplo da Hipobiose, mecanismo pelo qual NGIs asseguram sua sobrevivência no hospedeiro. Com metabolismo reduzido, larvas podem permanecer inativas por meses, a espera de condições favoráveis de crescimento (COSTA, 2011).
Quando as condições climáticas melhoram, a maturação dessas larvas se normaliza promovendo uma rápida contaminação do pasto (ROMERO e BOERO, 2001). Segundo Vieira et al. (1997) esse mecanismo é comum em regiões tropicais e subtropicais e em períodos secos.
A capacidade de gerar o maior número de indivíduos possíveis ao longo do tempo se caracteriza o potencial biótico de uma espécie de parasita (ARMOUR, 1980). Espécies de nematódeos possuem taxas de posturas que foram moldadas conforme a sua adptações ao ambiente. A exemplo, o gênero Haemonchus apresenta a maior oviposição entre helmintos, entre 5.000 e 10.000 ovos por dia (ROMERO e BOERO, 2001).
As condições climáticas favoráveis ao desenvolvimento e sobrevivência dos NGIs no semiárido nordestino, ocorrem em meados da estação chuvosa e início da estação seca. Desta forma, tratamentos preventivos são capazes de impedir a ocorrência de surtos por reduzir a contaminação das pastagens no período de crescimento das larvas (COSTA et al., 2009). Entre os fatores ambientais que influenciam a atividade de eclosão de ovos e desenvolvimento de larvas infectantes destacam-se a temperatura, umidade e índices pluviométricos (STROMBERG, 1997), sendo estes parâmetros climáticos determinantes no processo de desenvolvimento do ovo e da infectividade das larvas (O'CONNOR et al., 2006).
Smith (1990) mostrou que larvas de H. contortus levaram 16 dias para eclodirem a 10°C e que o aumento da temperatura para 37,8 °C reduziu o tempo de eclosão para 2,5 dias. De acordo com Zajac (2006) faixas de temperaturas variando de 10°C a 36°C e clima quente e úmido são ideais para o desenvolvimento dos estagios larvais de Trichostrongylideos. Conforme este último autor, a depender das espécies de parasitas e das condições climáticas a eles atribuídas, larvas infectantes de NGIs podem sobreviver no pasto por longos períodos, uma vez que a bainha que envolve os estádios infectantes capacitam os parasitas a resistir a condições adversas do ambiente.
Para prolongar a sobrevivência em variações drásticas impostas pelo ambiente, larvas de nematódeos de ruminantes utilizam a anidrobiose como um comportamento adaptativo (CROWE e CROWE, 1992), esses parasitos são capazes de tolerar até sete ciclos de dessecação e reidratação sem influenciar no desenvolvimento de larvas no meio ambiente (LETTINI e SUKHDEO, 2006).
A associação de métodos alternativos e a utilização correta dos anti-helmínticos para controlar as infecções são preconizados, como a menor frequência de tratamentos, sem evitar por completo a exposição dos ruminantes aos parasitas, uma vez que este contato é necessário para o estímulo à resposta imune dos primeiros (CEZAR et al. 2008; FLOATE, 2006; MARTÍNEZ e LUMARET, 2006; VIEIRA e CAVALCANTE, 1999).
Também foi observado que animais em pastejo restrito apresentavam uma curva de reinfestação helmíntica menos ascendente do que em pastejo livre, sendo assim, a restrição do pastejo nos horários de maior teor de umidade no pasto, em função de uma menor ocorrência de larvas infectantes, apesar de não propiciar isoladamente um controle efetivo, pode ser adotada como prática complementar, ao uso de anti-helmínticos, no controle da infecção por helmintos (SANYAL, 1993; RODA et al., 1995; CUNHA et al., 1997). Esses resultados corroboram com os estudos de Herd et al. (1984), Banks et al. (1990) e Reinecke (1994) que obtiveram resultados positivos no controle da infestação helmíntica com a associação de rotação de pastagens e restrição do horário de pastejo, possibilitando a diminuição na frequência de uso de medicamentos anti-helmínticos.
Por outro lado, em sistemas semi-intensivos de produção pode ocorrer um aumento significativo na frequência das helmintoses gastrintestinais em caprinos, pois a introdução de pastagens cultivadas proporcionam sombreamento e evita a dessecação de ovos e larvas, além do aumento das lotações e a inserção de raças importadas com maior produtividade e sensibilidade em relação a raças nativas (COSTA et al. 2011).
Outro método para diminuir o risco de infecção parasitária de caprinos é a integração de animais e culturas em um único sistema, permitindo, por exemplo, que a agricultura reduza o número de larvas no pasto (MOLENTO, 2009) ou alternar o pastoreio de animais ruminantes com não ruminantes, uma vez que, não havendo perigo de infecção cruzada, contribuindo para o que se chama de “diluição de larvas infectantes” na pastagem (MOLENTO, 2004). Outra forma interessante para reduzir a infecção parasitária é a utilização de forrageiras adequadas para corte, obtidas em áreas sem pastoreio, para produção de concentrado, silagem ou feno, nos quais larvas L3 não sobrevivem (TORRES-ACOSTA e HOSTE, 2008).
Dentre as alternativas no controle de verminose gastrintestinal, pode-se destacar o método FAMACHA que proporcionou uma economia de vermífugos da ordem de 40%, em relação ao método estratégico. Além disto, a rotina de avaliação e identificação dos animais do rebanho necessários para correta utilização deste método, possibilitou identificar 10% de animais sensíveis, que necessitaram de vermifugação cinco ou mais vezes durante o período experimental. São esses animais, os principais responsáveis pela contaminação do rebanho e aumento dos gastos com vermífugos (MEDEIROS et al., 2008).
Sob condições de criação intensiva, a ocorrência maciça de endoparasitas obriga o controle da infecção por meio do uso de anti-helmínticos a cada três a quatro semanas (BANKS et al., 1990), exigindo maior atenção na aplicação desses químicos, a fim de evitar o desenvolvimento de resistência anti-helmíntica (RA), a exemplo da rotação anual dos vermífugos; seleção de antiparasitários após realização de testes de RA; determinação correta do peso dos animais a serem tratados; evitar a subdose; restringir o alimento antes do tratamento, pois promove redução da motilidade gastrintestinal permitindo uma melhor absorção e maior permanência do medicamento no organismo animal (CÉZAR et al., 2008; COSTA et al., 2009; MOLENTO, 2005).
4. Anti-helmínticos
Vários princípios ativos de anti-helmínticos vêm sendo utilizados no tratamento das helmintoses gastrintestinais, dentre os quais se pode destacar os grupos químicos: benzimidazóis, avermectinas, imidazotiazoles e salicilanilidas (BORGES, 2003). Produtos anti-helmínticos de diferentes princípios ativos tem sido utilizados e a não eficiência tem evoluído à medida que essas drogas são lançados no mercado (BORGES, 2003). O uso indiscriminado de fármacos tem selecionado populações de parasitas resistentes aos principais grupos químicos.
4.1. Mecanismo de ação e desenvolvimento da resistência
Benzimidazóis (BZs)
Os benzimidazóis (tiabendazol, albendazol, febendazol, mebendazol, oxfendazol, oxibendazol) e pró-benzimidazóis (febantel, tiofanato, netobimim) possuem ação antinematódeo e em geral têm alta eficácia contra estágios adultos e imaturos (em desenvolvimento ou inibido) de nematódeos gastrointestinais e pulmonares de ruminantes e é ovicida (LANCEY, 1988). Seu mecanismo de ação é baseado no impedimento da formação de microtúbulos do parasito. A ligação dos benzimidazóis seletivamente a subunidade tubulina-β do parasito modifica o padrão da sua despolimerização para formação dos microtúbulos, interrompendo processos vitais para a função celular, como a divisão mitótica, transporte de nutrientes e alterações na forma da célula (ALMEIDA e AYRES, 2006 ; MARTIN, 1997).
Oxberry (2001), Martin (1997) e Lacey (1987) relatam que os BZs, agem inibindo a polimerização da tubulina, está responsável pela síntese de microtúbulos do parasita.
Em células eucarioticas, os microtúbulos desempenham uma variedade de funções incluindo de motilidade e secreção celular, absorção de nutrientes e transporte celular, mitoses e meiose (CALVISTON e HOLZBAUR, 2006, SARGISON 2012). O desequilíbrio provocado pelo BZs à tubulina livre no citoplasma das células intestinais, promovem a interrupção na formação de microtubulos, o que ocasiona alterações na homeostasia nas células de nematódeos (BRUCE, 1987; KÖHLER, 2001).
Segundo Prichard (1973), os benzimidazóis também inibem a enzima fumarato redutase e causam uma menor captação da glicose pelas células intestinais dos nematódeos, e como via compensatória, o organismo desses parasitas utiliza de suas reservas energéticas, ocasionando a morte do mesmo por inanição.
Os benzimidazoles são comumente utilizados no controle de infecções por nematódeos gastrintestinais em ruminantes, e como consequência o aparecimento de nematódeos resistente. A resistência aos benzimidazóis está associada à mutação nos genes para β-tubulina; causando a perda de receptores de ligação de alta afinidade para os benzimidazóis e, deste modo, o seu efeito sobre a polimerização da β-tubulina. Diferentes mutações na proteína alvo, a β-tubulina está associada à resistência a este composto, só para o H. contortus são conhecidos três variedades de mutação. A alteração em um único nucleotídeo TTC (fenilalanina) para TAC (tirosina) no aminoácido 200 da β-tubulina; fenilalanina para tirosina ou histidina no aminoácido 167, ou a substituição do ácido glutâmico por alanina na posição 198 (Kwa, et al. 1994).
Waller, et al. 1996 relatam a resistência aos BZN respectivamente no Uruguai, Paraguai e Argentina. Em um estudo realizado por Torres-Acosta et al. (2003) foi demonstrado a resistência aos BZD em fazendas de caprinos no México.
Imidazotiazois e Piramidinas
Conhecidas como medicamentos agonistas colinérgicos, os imidazotiozóis (levamisol, tetramisol) e tetrahidropirimidinas (pirantel, morantel) se ligam aos receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRs) presentes em nervos e superficie dos músculos dos nematódeos (MARTIN et al., 2005; ROBERTSON et al., 2000), causando paralisia espástica nos parasitas (CHARVET et al., 2012; MARTIN et al., 1998). A ligação desses grupos quimicos aos receptores de acetilcolina altera abertura dos canais iônicos, promovendo a entrada exagerada de cálcio para as células musculares dos nematóides (PUTTACHARY et al., 2010). O excesso de cálcio no citoplasma dessas células induzem contrações contínuas (ROBERTSON et al., 2010) facilitando a expulsão do parasita (KOLHER et al., 2001). Segundo Bogan e Armour (1987) são larvicidas, porém perdem eficácia sobre larvas em hipobiose.
A resistência ao levamisol, morantel e pirantel, segundo Prichard (2008) pode ter ocorrido em virtude de modificações nos receptores nicotínicos. Kohler et al. (2001) sugere que cepas resistentes ao levamisol possuem uma menor resposta contrátil que cepas sensíveis, podendo ser explicado por um menor tempo de abertura dos canais iônicos.
Lactonas macrocíclicas
O modo de ação das avermectinas (ivermectina) e milbemicinas (moxidectina) incluem paralisia flácida por aumentar a permeabilidade das células musculares dos nematódeos, mediada pela ligação entre o anti-helmíntico e receptores GABA que promovem a abertura dos canais de cloro (MARTIN et al., 1999). Outro efeito é a inibição da alimentação pelo parasita em decorrencia do bloqueio da bomba faríngea (GEARY et
at.,1993). Em um estudo realizado com H.contortus, Paiement et al., (1999) sugeriram que o bombeamento da faringe é inibido pelo glutamato. Sangster (1996) relata haver diferenças na ingestão de alimentos em resposta a ação da ivermectina entre cepas resistentes e susceptíveis. Os anti-helmínticos dessa classe agem contra nematódeos adultos e em larvas em hipobiose (BOGAN e ARMOUR, 1987).
Os mecanismos de desenvolvimento da resistência as avermectinas, ainda não é completamente entendido, porém sabe-se que essa resistência está associada a vários genes, e estes parecem codificar subunidades especificas presentes no músculo faringeais e não faringeais dos canais de cloro com o portão glutamato (KOHLER et al., 2001).
Os mecanismos pelos quais os parasitos desenvolvem resistência frente à exposição às macrolactonas parecem estar associados à: (a) alteração de conformação dos canais de cloro; e (b) expressão da proteína de membrana conhecida como glicoproteína-P (P-gp). A P-gp atua como uma bomba de efluxo em diversos tipos celulares e está envolvida na regulação da concentração de anti-helmínticos dentro das células. Assim, a P-gp pode reduzir a concentração intracelular destas macrolactonas favorecendo a seleção de nematódeos mutantes. Nas cepas de H. contortus resistentes a ivermectina e moxidectina, se observou a ligação destes medicamentos a P-gp, permitindo maior efluxo destes produtos e, conseqüentemente, diminuição da sua concentração no interior das células do sistema nervoso do parasito (LESPINE et al., 2008; LE JAMBRE et al., 2000; LANUSSE et al., 2008).
Estudo realizado por Xu et al. (1998) mostrou a alta expressão de glicoproteina A em cepas de H. contortus resistentes a ivermectina. Outro estudo realizado por Prichard; Roulet (2007) mostraram que tratamentos com ivermectina e moxidectina selecionaram a expressão de cinco glicoproteinas (A, B, C, D e E) em larvas adultas de Haemonchus sp.
Salicilanilidas
O mecanismo de ação das salicilanilidas inclue paralisia epástica por promover o aumento de íons de cálcio nas celulas musculares dos parasitos. Este grupo quimico atuam sobre parasitas hematófagos, reduzindo as reações mitocondriais envolvidas no transporte de elétrons e assim a sintese de ATP. O meccanismo de resistência ainda não foi bem esclarecido (SPINOSA et al., 2011).
5. Resistência anti-helmíntica (RA)
5.1. Problemática da resistência
Os parasitos gastrintestinais causam grandes perdas econômicas, devido à redução da produtividade, aumento da mortalidade dos animais, além de gastos com anti-helmínticos e mão-de-obra. Desta forma, as infecções por NGIs são as maiores limitações na criação de pequenos ruminantes, e o controle dessas parasitoses e suas consequências representam cerca de 30% com gastos com anti-helmíntico (IFAH Relatório Anual, 2009; http//:www.ifahsec.org).
A utilização inadequada dos anti-helmínticos para a profilaxia de infecções NGIs pode favorecer o estabelecimento de populações de parasitas resistentes (GETACHEW et al. 2007) e de acordo com Conder e Campbell (1995) a RA é entendida como a diminuição de sensibilidade da ação de um medicamento dentro de uma população de parasitas, sobrevivendo apenas os parasitas resistentes ao medicamento.
A manutenção da pressão de seleção levará a morte de parasitas sensíveis, sobrevivência das espécies mais resistentes numa determinada população e consequente contaminação das pastagens com larvas resistentes (PAPADOPOULOS, 2008). No entanto, a resposta dos nematódeos aos tratamentos anti-helminticos está associada à diversidade genética do parasito e algumas espécies, como Haemonchus contortus, apresentam uma alta diversidade genética, permitindo a rápida seleção de parasitos resistentes, que transmite os alelos responsáveis pela resistência à sua progênie (PRICHARD, 2001).
5.2. Detecção da Resistência anti-helmíntica por ensaios in vivo
O teste de redução na contagem de ovos nas fezes (TRCOF) é o teste mais utilizado para o diagnóstico da RA in vivo devido sua fácil aplicabilidade (DEMELER et al., 2010). Este teste se baseia na porcentagem de redução da contagem de ovos nas fezes antes e após tratamento com anti-helmíntico. No mapa é mostrada a situação da resistência antihelmintica em alguns estados do Nordeste Brasileiro.
Figura 2: Situação da resistência anti-helmíntica no Nordeste Brasileiro (Fonte : http://www.redebrasileira.com/mapas/regioes/nordeste.asp).
A resistência de nematódeos aos diversos anti-helmínticos está presente nos rebanhos de caprinos brasileiros. No Estado da Bahia, Barreto et al. (2005) verificaram que os caprinos de corte da região semiárida apresentaram resistência múltipla às principais bases químicas da anti-helmínticos, com variação de eficácia de 17% a 100% para ivermectina, de 0% a 97% para albendazole, de 66% a 100% para levamisole e de 0% a 100% para abamectina.
Lima, M. et al. (2010) avaliaram a eficácia de produtos anti-helmínticos à base de moxidectina, ivermectina, albendazole e levamisole em propriedades de criação caprina em sistemas semi-intensivo e intensivo no estado de Pernambuco, encontrando percentuais eficácia de 11 e 61 %, 14 e 76% e 67 e 89% nos rebanhos tratados com albendazole, ivermectina e levamisole, respectivmente, enquanto a moxidectina a 1% foi a única recomendada por apresentar percentuais indicativos de eficácia.
No levantamento sobre a resistência anti-helmíntica em rebanhos caprinos no Estado do Ceará, Vieira e Cavalcante (1999) constataram que sete (20,6%) apresentaram resistência aos imidazotiazóis, seis (17,6%) aos benzimidazóis e a resistência múltipla foi notada em 12 (35,3%) rebanhos. Neste mesmo Estado, Melo et al. (2003) confirmou a ocorrência de resistência aos anti-helmínticos em propriedades comerciais de criação de caprinos, com 87,5% de nematódeos resistentes ao oxfendazole, 75% ao levamisole e 37,5% à ivermectina.
Em Mossoró, no Rio Grande do Norte, Coelho et al.(2010) demonstraram que os rebanhos caprinos criados extensivamente apresentavam 90% de resistência anti-helmíntica ao albendazole contra 43,3% da ivermectina. A redução na contagem de ovos nas fezes (TRCOF) pós-tratamento mostrou variação na sua eficácia de 43% a 100% para ivermectina e 29% a 100% para albendazole.
A eficiência do albendazole, ivermectina e moxidectina foram avaliadas por meio de coletas de fezes realizadas antes e pós-tratamento em caprinos da zona da mata do Estado de Alagoas, no qual foi verificada variação no 7º, 14º e 21º dia pós-tratamento da eficácia de 97,89%, 71,2% e 80%, para albendazole, respectivamente, 98,74%, 88,3% e 87% para ivermectina e de 83,6%, 96% e 96,3% para moxidectina (AHID et al., 2007).
Chagas et al. (2013) avaliaram o grau de resistência do Haemonchus (isolado Embrapa 2010), por meiodo teste de redução da contagem de ovos nas fezes (TRCOF), constatando que este isolado ovino mostrou-se sensivel ao triclorfon, closantel e levamisole com percentual de redução de ovos nas fezes superiores a 90% apartir do 7º dia pós tratamento, no entanto múltipla resistência foi revelado pela baixa eficácia aos tratamentos com albendazole (-26%), ivermectina (12%) e moxidectina (88%).
Thomaz-Soccol et al. (2004) estimaram uma alta prevalência de resistência aos anti-helmínticos no estado do Paraná de 88,1%, 78,6% e 56,4%, respectivamente, para o benzimidazois, ivermectina e closantel.
5.3. Detecção da Resistência anti-helmíntica por ensaios in vitro
Nos últimos 30 anos, foram produzidos vários testes in vitro para a detecção de resistência (Taylor et al., 2002). Os testes in vitro têm mostrado eficiência para detecção do desenvolvimento de resistência anti-helmíntica (VARADY et al. 1999), isso devido há não interferência do hospedeiro no estabelecimento da infecção pelo parasita. Além disso, apresentam vantagem de facilidade de execução, baixo custo e rapidez (MACEDO et, al 2009). Entre os testes in vitro utilizados para a avaliação da atividade anti-helmíntica destacam-se os testes de inibição da eclosão de ovos, do desenvolvimento larvar e da migração larvar.
Teste de eclosão de ovos (TEO)
Este teste pretende avaliar o desenvolvimento de ovos após a incubação com produtos com ação ovicidas (COLES et al., 1992).
Várady et al. (2007) testaram isolados resistentes e sensíveis de H. contortus aos BZs, constataram que em todos os isolados sensíveis os valores de DE50 foram semelhantes (< 0,05 µg/mL-1) enquanto que isolados resistentes variaram de 0.1 a 0.5 µ g/mL-1.
Em estudo realizado em ovinos na Eslováquia por Várady et al. (2006) buscou-se detectar a presença de resistência dos NGI aos benzimidazois por meio do teste de eclosão de ovos, sendo detectados três rebanhos resistentes (EC50 > 0,1µ g/mL de TBZ) ao BZs sendo EC50 estimado em 0,190 µg/mL de TBZ.
Na Etiópia foi avaliada a susceptibilidade de H. contortus de ovinos aos anti-helmínticos por inibição de eclosão de ovos. Foi observado que na concentração mais alta (0.25µ g/mL) as médias dos percentuais de inibição de ovos foram 84,90%, 78,77%, 76,66%, 78,89%, respectivamente, para ivermectina, albendazole, triclobendazole e tetramisole. Os valores em µg/mL do CE50 variaram de 0,024 para albendazole, 0,039 para triclobendazole, 0,045 para tetramisole e 0,0355 para ivermectina (BELEW et al., 2012).
Demeler et al. (2012) mediram a validação dos testes in vitro TEO e TML, detectando a resistência anti-helmíntica dos NGI em rebanhos de bovinos leiteiros no Norte da Alemanha. Foram comparados os resultados dos TRCOFs mostrados por Demeler et al. (2009) com os resultados previamente obtidos dos Teste de eclosão de ovos e teste de migração larval utilizando respectivamente os anti-helmínticos tiabendazol (TBZ) e a ivermectina (IVM). No TEO foi achado CE50 de 0,027 a 0,038 µg / mL de TBZ, sendo
que no TRCOF com albendazole a eficácia foi de 100% mostrando susceptibilidade dos nematódeos aos benzimidazois. Para a ivermectina a eficácia reduzida em algums rebanhos pós-vermifugação, mostrou grandes variações no CE50 no TML, que apresentaram valores de 124 a 929 nM no 7° e entre 525 e 924 nM no 14° dia para larvas de Cooperia oncophora, o que indicou que o decréscimo na eficácia da ivermectina pelo TRCOF foi correlacionada com o aumento do valor da CE50.
Teste de migração larvar (TML)
Este teste se baseia na exposição de larvas a diferentes concentrações de anti-helmínticos com ação sobre motilidade das larvas (DEMELER et al. 2010).
El-Abdellati et al. (2010) relataram a resistência de nematódeos a lactonas macrociclicas ao acompanharem novilhas durante quatro anos consecutivos. Para isso, utilizaram TRCOF e TML. Larvas de C.oncophora resistentes (CoIVR07 e CoIVR08) a ivermectina e moxidectina foram isoladas após os testes de redução da contagem de ovos nas fezes e posteriormente avaliados pelo TML confirmando o potencial deste testes para diferenciar isolados, nos quais altos valores de CE50 de 542 nM (CoIVR07) e 698 nM (CoIVR08) foram encontrados para os isolados resistentes comparados ao baixo valor (120nM) do isolado susceptivel(CoSusc).
Demeler et al. (2010) avaliou isolados resistentes e susceptíveis de larvas de Ostertagia
ostertagi, C. oncophora e H. contortus obtidos de infecçõoes experimentais de bovinos
e ovinos. Seis diferentes laboratórios distribuídos em cinco países utilizaram o mesmo protocolo de TML para verificar a possibilidade de variações nos resultados. Para os gêneros Cooperia e Haemonchus foi confirmada resistência dos isolados resistentes em todos os laboratórios e estes isolados mostraram os maiores valores de CE50 de 886,4
nM para C.oncophora e de 7679 Nm para H.contortus, enquanto a CE para os susceptíveis foi de 107nM para C.oncophora e de 914 nM para H.Contortus. Para o gênero Ostertagia foram utilizadas apenas isolados susceptíveis que apresentou CE50 equivalente a 307 nM.
No Mato Grosso do Sul, Almeida et al. (2013) obteve a eficácia a ivermectina empregando o TML em isolados de campo de Cooperia spp que infectava bovinos. Os valores de CE50 encontrados variaram de 2,5 a 11,35 nM para os sete isolados de campo resistentes.
Kotze et al. (2006) observou a sensibilidade TML por meio de combinação larvas resistente (HcMOX-R) com larvas suscetíveis (Kirby) em três experimentos com distintas proporções de larvas na detecção de resistência para H. Contortus. TMLs também foram realizados separadamente com populações puras de larvas (sensiveis/resistentes) para servir de comparação as populações mistas. Foram mostrados neste experimento que populações mistas que continham proporções maiores de indivíduos resistentes apresentavam percentuais superiores de migração.
Teste de desenvolvimento larvar (TDL)
Várady et al., (2007) avaliaram pelo teste de Desenvolvimento Larvar (TDL) a resistência com isolados resistentes e susceptíveis de H.contortus aos benzimindazóis, verificando que os isolados resistentes foram de 4,3 a 63,1 vezes mais tolerante ao fármaco do que os isolados sensíveis.
Utilizando isolados BZs resistentes e susceptíveis de H.contortus, Bártiková et al.(2010) compararam o flubendazole nesses isolados pelo TDL, sendo o tiabendazole utilizado como anti-helmíntico de referência. Os valores da concentração letal de 50% da população (CL50) para flubendazole (0,0039) foram menores quando comparados ao tiabendazole (0,0051) para cepa de Haemonchus sensíveis ao BZs. O mesmo fato foi observado nos isolados resistentes a BZs, onde o CL50 foi menor para flubendazole (0,0109) do que para o tiabendazole (0,0190). Nesse estudo, o anti-helmíntico flubendazole, mostrou-se mais eficaz em cepas resistentes de Haemonchus.
Sobre as larvas de C. oncophora e O.ostertagi resistentes e susceptíveis foram aplicados TML e TDL, no qual pôde ser comprovada a capacidade de detectar e confirmar resistência dessas larvas. Foram testados os anti-helmínticos ivermectina e tiabendazole no TDL e ivermectina para TML. Quando utilizado o TBZ observaram que entre os isolados de C. oncophora resistentes e susceptíveis não havia diferença significativa, sendo seus respectivos EC50 de 0,0056 µg/mL e 0,0051 µg/mL no TDL. Utilizando a IVM sob as mesmas larvas, foram observados maiores valores de EC50 (16,3 nM) tanto no TDL quanto para o TML com EC50 de 621nM em larvas C. oncophora resistentes. Todos os anti-helmínticos utilizados (IVM, TBZ e LEV) mostraram ter EC50 maiores em larvas de O.ostertagi susceptíveis do que em C. oncophora susceptível (DEMELER et al. 2010)
OBJETIVO
OBJETIVO GERAL
Testar a eficácia de benzimidazóis, lactonas macrocíclicas, levamisole e closantel para nematoides de caprinos em região semiárida.
CAPÍTULO 1
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Resistência anti-helmíntica múltipla em rebanhos caprinos no bioma caatinga
Multiple anthelmintic resistence in goat herds in the caatinga biome
Simone Lopes Borges1, Mariana Borges Botura2, Hélimar G. de Lima1, Lívia Ribeiro Mendonça1, Sabrina Mota Lambert1, Alex Aguiar de Oliveira1, Bárbara Maria Paraná da Silva Souza1, Juliana Macedo Viana1, Sandra Mayumi Nishi1, Maria Angela Ornelas de Almeida1.
1
Universidade Federal da Bahia (UFBA), Salvador, BA, Brasil; 2Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana, BA, Brasil.
Resumo
A utilização de anti-helmnticos por longos periodos como principal medida de controle das parasitoses gastrintestinais, levou a ineficácia aos benzimidazois e lactonas macrocíclicas. A capacidade de teste de eclodibilidade de ovos (TEO) e do teste de migração Larval (TML) em condições de campo foi avaliada em populações naturais de nematódeos de caprinos criados no bioma caatinga e o teste de redução na contagem de ovos nas fezes (TRCOF). Os resultados indicaram baixa eficácia dos albendazole, levamisole, ivermectina, moxidectina e closantel contra nematódeos gastrintestinais de caprinos, o que caracteriza resistência múltipla.
Palavras-chave: Nematódeos; benzimidazole; avermectina; imidazotiazole; ruminante.
Abstract
The use of anthelmintic drugs for long periods as the main measure control of gastrointestinal parasits has led to the inefficacy of benzimidazoles and macrocyclic lactones. The ability Egg Hatch Inhibition Test (EHT) and Larval Migration inhibition
Test (LMT) were evaluated under field conditions in natural populations of goat nematodes raised at caatinga bioma and the Faecal egg count reduction test (FECRT). The results suggest low efficacy of albendazole, levamisole, ivermectin, moxidectin and closantel against goat GI nematodes characterizing occurrence of multidrug resistance.
Key words: Nematodes; benzimidazole; avermectin; imidazothiazoles; ruminant.
Introdução
O bioma caatinga se distingue por médias de temperaturas elevadas, baixos índices de pluviosidade, sendo a caprinocultura desenvolvida por pequenos e médios produtores, em sistema de manejo extensivo. Como conseqüência verifica-se alteração na estrutura biológica e ecológica da caatinga e interferência no o controle das parasitoses, uma vez que a circulação dos animais favorece mudanças nas populações de parasitos com introdução de cepas resistentes (SILVESTRE et al., 2002a, SILVESTRE et al. 2002b).
A complexidade do controle das helmintoses em pequenos ruminantes é cada vez maior em consequência da resistência de nematódeos gastrintestinais (NGI) aos anti-helmínticos. O alto índice de endemismo de nematódeos resistentes no bioma caatinga tem modificado a dinâmica da produção caprina por maior parasitismo dos animais e ineficiência do controle antiparasitário. No nordeste brasileiro a resistência de nematódeos aos imidazotiazoles, benzimidazois e lactonas macrociclícas vem sendo cada vez mais documentada (LIMA, M. et al., 2010; LIMA,W. et al., 2010; VIEIRA; CAVALCANTE, 1999).
A resistência múltipla ocorre pela exposição dos parasitos aos vários grupos químicos e como uma consequência da habilidade da população de trichostrongilídeos de se adaptar. Os fatores que influenciam a seleção de populações resistentes incluem o uso indiscriminado e excessivo de anti-helmínticos, a falta de biossegurança nas
propriedades, freqüente circulação de animais entre rebanhos e insuficientes procedimentos de quarentena para os recém-chegados (HOWELL et al., 2008).
A resistência anti-helmíntica para caprinos ainda não é bem documentada mundialmente ao contrário dos ovinos. Poucos estudos foram realizados com caprinos criados em condições semiáridas, em pastagens comunais, e um número existentes destes estudos foram desenvolvidos no nordeste brasileiro (LIMA, M. et al., 2010; LIMA,W et al., 2010; PEREIRA et al., 2000; RODRIGUES et al., 2007) e na África (KUMSA;
ABEBE, 2009;WARUIRU et al., 1998).
Nos estudos a campo, o Teste de Redução da Contagem de Ovos nas Fezes (COLES et al., 1992) é o mais amplamente empregado, obtendo-se resultados que indicam a ocorrência de resistência parasitária múltipla em caprinos (ZAJAC; GIPSON, 2000). Os testes de Eclosão de Ovos e de Desenvolvimento Larvar são frequentemente utilizados para a detecção in vitro da resistência anti-helmíntica (VÁRADY et al. 2007), enquanto o Teste de Migração Larvar em Ágar foi mais empregado para avaliação de extratos de plantas em pequenos ruminantes (BOTURA et al., 2013,ALONSO-DÍAZ et al., 2008) e em bovinos (ALMEIDA et al., 2013; DEMELER et al., 2012).
Outros métodos para detecção da resistência têm sido desenvolvidos, mas seu uso para diagnóstico em caprinos a campo ainda não foi empregado, sendo este o primeiro estudo, que avaliou a resistência parasitária de caprinos por meio de testes in vitro. Outro objetivo foi verificar a resistencia pelo Teste de Redução da Contagem de Ovos nas Fezes em rebanhos caprino do semiarido baiano.
Material e Métodos
O município de Cansanção, situado no bioma caatinga, com área de 1.324,9 km², apresenta tipos climático semiárido e árido, e médias anuais de temperatura e
precipitação pluviométrica de 23,6ºC e 477 mm, respectivamente (CPRM – Serviço Geológico do Brasil, 2005).
Teste de Redução da Contagem de Ovos nas Fezes (TRCOF)
Foram entrevistados 100 caprinocultores familiares, sendo selecionados doze, distribuídos em quatro áreas: Alto Lindo (rebanho 1), Morada Nova (rebanho 2), Nova Vida (rebanho 3 a 9) e Belo Monte (rebanho 10 a 12), conforme o número mínimo de animais disponíveis no rebanho para realização dos testes. Participaram do estudo 430 animais, sendo 10,7% machos e 89,3% fêmeas. De cada rebanho foram separados aleatoriamente de 30 a 40 animais, sem raça definida, de seis a 18 meses, mantidos em regime extensivo e infectados naturalmente por nematódeos gastrintestinais. Os animais estavam em estado de higidez adequado e não foram tratados com anti-helmíntico por no mínimo 60 dias antes do teste.
Apenas os animais com contagem de ovos por grama de fezes (OPG) superior a 200, foram incluídos no experimento e distribuídos em grupos de oito a 10 indivíduos, para tratamento com albendazole (ABZ) (5 mg/kg de peso vivo, via oral - Aldazol®/Vallée ); ivermectina (IMV) (0,2 mg/kg, via oral –Ivomec ovino®/Merial); levamisole (LEV) (5 mg/kg, oral - Ripercol®/Fort Dodge); moxidectina (MXD) (0,2 mg/Kg, via oral - Cydectin/Fort Dodge) e closantel (10 mg/Kg-via oral-Diantel®/Irfa). Como não há indicação na bula para tratamento em caprinos, usou-se a dose recomendada para ovinos. Em um grupo de caprinos não se efetuou o tratamento, servindo como controle.
As amostras de fezes foram coletadas de cada animal no dia do tratamento e 14 dias após, sendo processadas para contagem de ovos e de larvas de 3º estádio obtidas de coproculturas (UENO; GONCALVES, 1998). A população de nematódeos é considerada resistente quando a redução da contagem de ovos após o tratamento for inferior ou igual a 90% (VERCRUYSSE et al., 2001)
Teste de Eclosão de Ovos (TEO), Coles et al. (1992) modificado por Chagas et al.
(2008)
Para a avaliação in vitro foram realizadas pool das amostras de fezes dos caprinos por áreas.
As fezes obtidas diretamente da ampola retal de caprinos foram estocadas anaerobicamente no período máximo de 24 h. A suspensão de ovos foi obtida por homogeneização das amostras das fezes com água destilada e filtrada em tamis de 1 mm, 100, 55 e 25 µm e os ovos coletados na última malha e centrifugados a 1500 xg durante cinco minutos (HUBERT; KERBOEUF, 1984). Ao sedimento adicionou-se solução saturada de cloreto de sódio para centrifugação nas condições anteriores. O sobrenadante foi filtrado no tamis de 25µm, lavado em água destilada para recuperação dos ovos, e 2 mL da suspensão foi ajustada para 100 ovos/ 20µL.
As concentrações do tiabendazole foram avaliadas por experimentos pilotos, usando o protocolo de von Samson-Himmelstjerna et al. (2009) modificado. Nos testes foram usadas as concentrações de 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 e 0,8 µg tiabendazole (TBZ)/mL e como controles água destilada e solução aquoso de dimetilsulfóxido (DMSO).
Para realização do teste foram utilizados 100 ovos/poço, sendo adicionado uma solução de 0.5% de TBZ e 7% de meio nutritivo em um volume total de 2 mL. A preparação do meio nutritivo foi baseado em Hubert; Kerbouef, (1992) e modificado por Bizimenyera et al. (2006) com Escherichia coli liofilizada (ATCC 9637 Sigma). Foram feitas 10 repetições para cada concentração do TBZ e controles. Após a incubação das placas a 26 ºC em B.O.D., por 48 horas, foi acrescido gotas de lugol e os ovos e larvas de 1º estádio foram contados de cada poço, utilizando o microscópio invertido.
A resistência é demonstrada quando a concentração efetiva (CE) para 50% de inibição da eclosão (CE50) é superior a 0,1 µg/mL de TBZ (COLES et al., 1992).
Teste de Migração Larvar em Ágar modificado (TML), Molento; Prichard (2001)
As larvas 3º estádio (L3) obtidas das coproculturas do TRCOF foram desembainhadas com solução de hipoclorito de sódio a 1,5%, durante 30 minutos, e em seguida lavadas três vezes com solução aquosa centrifugando em 1500 xg por cinco minutos. As larvas foram resuspendidas em solução tampão fosfato (PBS) 0,2M (pH7,4) e então distribuídas em microplacas de 24 poços (400 larvas/0,5 mL/poço). A cada poço foi adicionado o mesmo volume das diferentes concentrações de IVM ( 1; 5; 10; 50; 100; 500 e 1000 nM) (DEMELER et al., 2010), e como controle foi utilizado uma solução de PBS com DMSO a 0,1%. A placa foi incubada a 26ºC em estufa B.O.D por seis horas e após este período acrescido 1 mL de solução de ágar (1,4%) a 35ºC, sendo a solução final (2mL) transferida para uma placa de Petri com um cilindro sobreposto a duas telas de nylon, sendo que a menor tela possui abertura de 38 µm contendo água destilada congelada. As placas foram novamente incubadas a 26°C, expostas a uma fonte de luz incandescente (60 Watts) por 18 horas. As larvas que migraram do ágar para a porção aquosa foram transferidas para um tubo tipo Falcon, centrifugadas a 1500 xg por cinco minutos. O sobrenadante foi descartado, mantendo-se um volume final de 2 mL da solução com as larvas. Para quantificação usou-se uma alíquota homogênea de 200 µL, sendo o número de larvas multiplicado por 10. Para cada concentração e controle foram realizadas 10 replicatas.
Análise dos dados
Os resultados do OPG e do percentual de larvas obtidos no TRCOF foram analisados pelo programa RESO 2.01 (CSIRO), para determinação dos percentuais de eficácia dos anti-helmínticos.
O percentual de eficácia do TML foi calculado pela fórmula: E = [(Mc – Mtr)/Mc] x 100, onde Mc corresponde a média aritmética do número de larvas contada no grupo controle, e Mtr é a média aritmética do número de larvas contadas no grupo tratado, utilizando o Microsoft Excel software.
Os resultados in vitro (TEO e TML) foram comparados pelo teste ANOVA seguido Tukey (5%). A CE50 (concentração efetiva), para ambos os testes, foi calculada por análise de regressão não linear pelo programa GraphPrism, versão 5.0
Resultados e Discussão
Analisando o questionário respondido pelos produtores, verificou-se que a frequência anual de desparasitação variou de um a quatro, que em 77 % dos rebanhos o vermífugo é aplicado a todos os animais na mesma ocasião, e para isto, o peso dos animais é estimado visualmente para cálculo da dosagem do medicamento por 100% dos criadores. Também se constatou o uso mais frequente das avermectinas (72,7%), e posteriormente os imidotiazóis e benzimidazois (54,5%).
Teste In Vivo
A resistência múltipla anti-helmíntica foi demonstrada em rebanhos caprinos do município de Cansanção, Bahia. Os valores do OPG variaram de 560 a 1455 no grupo controle, com média de 897,4, indicando, em geral, uma infecção moderada (Tabela 1). As médias dos percentuais de eficácia dos rebanhos foram 33,3%, 29,6% e 54,6% para ABZ, IVM e LEV respectivamente. Não houve diferença estatística entre as médias de OPG dos animais dos grupos controle e tratado, e os diferentes anti-helmínticos e as áreas.
Tabela 1. Médias das contagens de ovos nas fezes (OPG) de caprinos e percentuais de eficácia de anti-helmínticos por áreas do município de Cansanção.
Albendazole Ivermectina Levamisole Áreas Rebanho OPG
Controle OPG Eficácia
(%) OPG Eficácia (%) OPG Eficácia (%) Alto Lindo 1 1411 664 53 968 31 - - Morada Nova 2 815 517 37 400 51 - - 3 685 461 33 360 47 61 91 4 831 750 0 1219 0 286 66 5 785 67 92 195 75 312 60 6 830 842 0 619 25 2233 0 7 1320 1028 22 737 44 422 68 8 1455 1100 24 2185 0 600 59 Nova Vida 9 595 1413 0 1046 0 450 24 10 851 317 63 730 14 747 12 11 631 356 44 444 30 143 77 Belo Monte 12 560 389 31 345 38 560 89 Média 897,4 658,7 33,3 770,7 29,6 581,4 54,6
A resistência de NGI ao ABZ foi observada em todas as áreas, e apenas um rebanho apresentou redução da contagem de ovos de 92%, porém, o limite inferior do intervalo de confiança a 95% foi 55%, o que indicou resistência. A ineficácia do anti-helmíntico albendazole ocorrido nesse estudo foi condizente com os resultados de Lima, W. et al. (2010), onde rebanhos caprinos da região do Cariri Paraibano, obtiveram baixas eficácias pós-tratamento durante o período seco. Quando Melo et al. (2009) utilizou a dose duplicada do produto obteve uma média de eficácia de 68,4 % para oxfendazole, diferindo da eficácia obtida do TRCOF em Cansanção (33,3%). Este resultado também diverge de estudo prévio de Ahid et al. (2007) na Zona da Mata em Alagoas, no qual, encontraram sensibilidade para o ABZ no 7° dia pós vermifugação. Embora os estudos tenham sido desenvolvidos em rebanhos na região nordeste, deve-se considerar que a
