Thực tập Hóa sinh (Giáo trình giảng dạy Đại học) - Hoàng Quang

HỌC VIỆN QUÂN Y

BỘ MÔN HÓA SINH

THỰC TẬP

HÓA SINH

GIÁO TRÌNH GIẢNG D Ạ Y ĐẠI H ỌC

(Tái bản ỉần thứ nhất có sửa chữa và bổ sung)

NHÀ XUẤT BẢN QUÂN ĐỘI NHÂN DÂN

HÀ NỘI - 2006

NHÀ XU ẤT B Ả N MONG BẠN ĐỌC ĐÓNG GÓP Ỷ KIẾN PH Ê B ÌN H

HỘI DỒNG DUVệT TỒI uệu, G iá o TAÌNH, G iá o HHOA

củfì HỌC VIỆN ỌURNV

T r u n g tu ứ ttg , GS.TS. PHẠM GIA KHÁNH

G\ám đốc Học viện Quân y - Chủ tịch

Thiều tuớng, BS. NGUYỄN QUANG PHÚC

Phó giám đốc Học viện Quân y - Phó chủ tịch

Thiếu tướng, 6S.TS. v ũ ĐỨC M ố l

Phó giám đốc Học viện Quân y - ủy viên

Thiếu tướng,GS.TS. LÊ BÁCH QUANG

Phó giám đốc Học viện Quân y - ủy viên

Thiếu tướng, PGS.TS. ĐẶNG NGỌC HÙNG

Phó giám đốc Học viện Qưân y

Giám đốc Bệnh viện 103 - ủy viên

Đại tá, PGS.TS. NGUYỄN TIẾN BÌNH

Phó Giám đốc Học viện Quân y - ủy viên

Đại tá, GS.TS. NGUYỄN VĂN MÙI

Phó giám đốc Bệnh viện 103 - ủy viên

Đại tá, PGS.TS. LÊ NĂM

Giám đốc Viện Bỏng Quốc gia - ủy viên

Đại tá, BS. PHẠM Quốc ĐẶNG

Hệ trưởng hệ Đào tạo Trung học - ủy viên

Đại tá, BS. ĐỖ TIẾN LƯỢNG

Trưởng phòng Thông tin Khoa học

Công nghệ Môi trường - ủy viên

Thượng tá, BS NGUYÊN VĂN CHÍNH

Phó trưỏng phòng Thông tin Khoa học

Công nghệ Môi trường - Thư kí

355-611 (N)

Chủ biên:

PGS.TS. HOÀNG QUANG

Tham gia biên soạn:

TS. PHAN HÀJ NAM

BS.CK1. OOÀH THỢM a.PMặ ó r ; ■

LỜI NỐI ĐẦU

Ị\J G À Y nay, Hóa sinh đã phát triển rất mạnh mẽ và được coi như là một ngành khoa học mũi nhọn, đã xâm nhập vào nhiều ngành khoa học khác nhau và được các ngành khoa học này tiếp nhận như là một công cụ sắc bén để giải quyết những nhiệm vụ của ngành mình.

Trong y học, Hóa sinh có một vai trò đặc biệt không ch ỉ trong phạm vi để

mỏ rộng và nâng cao chất lượng đào tạo của ngành mà còn là một công cụ không thể thiếu được trong chẩn đoàn, theo dõi điều trị và tièn lượng bệnh.

Vì vậy, những kiến thức về hóa sinh cần trang bị cho học viên không ch ỉ khi họ còn đang đợc đào tạo trong nhà trường mà còn cần phải bổ túc thường xuyên cho họ trong quá trình công tác.

Đ ể nắm được kiến thức về hóa sinh và vận dụng đợc trong thực tiễn thì phần thực hành hóa sinh là không thể thiếu được. Thực hành hóa sinh không ch ỉ để chứng minh, minh họa cho lý thuyêĩ mà nó còn giúp cho học vièn nắm được nguyên lý và giá trị của các xét nghiệm hóa sinh lâm sàng, rèn luyện kỹ năng tay nghề cho học viên để họ có thể phục vụ được ngay sau khi họ rời khỏi ghế nhà trường. Đó là những mục đích chính của giáo trình "Thực tập hóa sinh" này.

Đối tượng chính của giáo, trình "Thực tập hóa sinh" là học viên đại học đào tạo bác sỹ đa khoa. Tuy nhiên trong khi biên soạn, các tác giả cũng đã chú ý bổ sung những vấn để chuyên sâu, hiện đại và cập nhật để làm tài liệu tham khảo cho học viên sau đại học cũng như cho cán bộ và kỹ thuật viên phục vụ cho công tác giảng dạy hoá sinh và cốc labô hoá sinh làm lâm sàng.

Nội dung chính của 'Thực tập hóa sinh" là 7 bài thực tập của 2 học phần.

Trong đó từ bài 1 đến bài 4 nằm trong chương trình của học phần 1: "Hoá sinh cơ sỏ". Từ bài 5 đến bài 7 nằm trong chương trình của học phần 2: "Hóa sinh chức năng và lâm sàng”. Ngoài ra các tác giả còn biên soạn thêm bài "Mỏ đầu" để giòi thiệu một số phương pháp phân tích hoá sinh chinh và phụ lục để giới thiệu một sổ vấn đề như: Hệ thống đơn vị SI, nồng độ dung dịch, giá trị tham chiếu của các xét nghiệm hoá sinh... để làm tài liệu tham khảo.

Tái bản lần này các tác giả đã sửa chữa và bổ sung một số xét nghiệm mói phù hợp với chương trình đào tạo. Tuy đã có nhiểu cố gắng nhưng có thể còn có những thiếu sót, rất mong được sự đóng góp ý kiến của bạn đọc để giáo trình "Thực tập hoá sinh" được hoàn chỉnh hơn.

Ngày 10 tháng 3 năm 2006 Thay mặt các tác giả PGS.TS. HOÀNG QUANG

MỤC LỤC

Bài mỏ đầu: Một số phương pháp pHân tích bốâ ổính ■ 9

1. Các phương pháp đò quáng... . . . .... V . . . ... 9

2. Phương pháp điện đi... i&./.kii.-.i.-...V . ... ... .. 15

3. Các phương pháp sắc ký...,.,A... 23

4. Hướng dẫn sửdụng một số dụng cụ, phương tiện trang phòng thí nghiệm 40 Bài 1: Hóa học protid, glucid, lipid... 52

1. Phản ứng ninhydrin... ... 52

2. Phản ứng Biurê... ... ... 52

3. Phản ứng kết tủa protein... 54

4. Phản ứng Fehling.... ... :... ... ... 56

5. Phát hiện đường trong nước tiểu (glucose niệu)... ... 57

6. Chiết xuất và xác định thành phần của lecithin... 58

Bài 2: Enzym... ... ... ... 62

1. Tác dụng của catalasé... ... . — ... 62

2. Tác dụng của lipáse tụy... ... ... 63

3. Các yếu tố ảnh hưỗng đến hoạt độ enzyrn... 64

4. Tính đặc hiệu của enzym.... ... ... 67

5. Xác định hoạt độ amylase máu và nước tiểu... ... 68

Bài 3: Chuyển hoá glucid và lipid... 71

1. Định lượng đường máu... ... 71

2. Định lượng triglycerid huyết thanh theo phương pháp enzym... 75

3. Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh... 77

4. Phát hiện ceton niệu... ... 80

5. Phát hiện muối mật trong nước tiểu... 81

Bài 4: Chuyển hoá protid... 82

1. Định lượng protein toàn phần huyết thanh... 82

2. Điện di protein huyết thanh (kiến tập)... 84

3. Định lượng ure trong máu và nước tiểu... 91

4. Định lượng hemoglobin trong máu... 96

5. Phát hiện hemoglobin trong nưâc tiểu... 97

Trang

Bài 5: Một số xét nghiệm đánh giá chức năng gan... 100

1. Xác định hoạt độ GOT, GPT huyết thạnh... 100

2. Định lượng bilirubin toàn phần và trực tiếp trong huyết thanh... 105

3. Phát hiện bilirubin (sắc tố mật) trong nước tiểu... 108

4. Xác định hoạt độ y-glutamyítransferase (y-GT)... 109

5. Định lượng albumin huyết thanh... ... ... 111

6. Định lượng amoniac huyết tương... 112

Bài 6: Một số xét nghiệm về thận và điện giải... 114

1. Định lượng creatinin trong huyết thanh và nước tiểu... 114

2. Định lượng protein nước tiểu... ... 118

3. Xác định 10 thông số nước tiểu bằng que thử (kiến tập)... 120

4. Định lượng N a\ K \ bằng quang kế ngọn lử a ... 123

5. Định lượng Na+, K \ c r , Ca2+, bằng phương pháp điện cực chọn lọc... 125

6. Định lượng canxi toàn phần bằng phương pháp đo màu... 128

Bài 7: Xét nghiệm khí máu, cán bằng acid-base và xét nghiệm các dịch thể. 130 1. Đo khí máu và các thông số cân bằng acid-base (kiến tập)... 130

2. Định lượng protein toàn phần trong dịch não tuỷ... 135

3. Phản ứng Pandy, Nonne-Appelt... ... 136

4. Phản ứng R ivalta... ... 137

5. Định lượng glucose dịch não tuỷ... 138

Phụ lục ... ... ... 139

1. Bảng trọng iượng nguyên tử các nguyên t ố ...;... 139

2. Đơn vị SI và sử dụng SI trong hóa sinh y học... 141

3. Nồng độ dung d ịc h ... 155

4.Giá trị tham khảo các xét nghiệm hoá sinh... 166

B à i mỏ đầu

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA SINH

1. Phương pháp đo quang (Đo màu định lượng).

Đo quang là một phương pháp phân tích định lượng dựa trên cường độ màu của bản thân chất cần định lượng hoặc được tạo ra bằng các phương pháp thích hợp.

1.1. Cơ sở của phương pháp: Định luật Lambert-Beer. 1.1.1. Cơ sở:

Khi chiếu một tia sáng đơn sắc có cường độ lo qua một dung dịch màu có chiều dày 1, thì một phần ánh sáng bị phản xạ (Ip), một phần bị hấp thụ bởi dung dịch màu (IH), phần còn lại ló ro ngoài (IL).

Hình ỉ: Sự phân bố của tia sáng đơn sắc khi chiếu qua một dung dịch.

Như vậy: I0 = Ip + IH + 1| (1)

Trong các dung địch màu nước thường gặp trong phân tích đo màu thì Ip rất nhỏ, có thể bỏ qua.

Do đó : I(, = IH + IL (2) Từ đó, thấy rằng:

-1[ chính là phần ánh sáng không bị hấp thụ, đi qua dung dịch, đập vào mắt ta, gây ra cảm giác về mắu của dung dịch.

- Vì I() không đổi, nên khi IH càng lớn thì IL càng nhỏ. IH càng lớn nếu trên đường đi ánh sáng gặp nhiều phân tử chất màu hay là khi nồng độ chất màu càng lớn và chiều dày dung dịch càng lớn. Và ngược lại, khi IH càng nhỏ thì IL càng lớn.

Thiết ỉập mối quan hệ giữa I(„ IH, IL là nội dung cơ bản của định ỉuật hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu.

1.1.2. Định luật Lambert - Beer:

Định luật Lamber - Beer phát biểu như sau: Lôgarit của tỷ số giữa cường độ ánh sáng tới (Ifì) và cường độ ánh sáng ló (IL) tỷ lệ thuận với nồng độ phân tử chất màu (C) và với chiều dày của lớp dung dịch (1) mà ánh sáng truyền qua:

10

lg —

= k.c.l

I„

Đại lượng lg ---đặc trưng cho khả năng hấp thụ ánh sáng của dung dịch hay I.

đặc trưng cho nồng dộ chất màu của dung dịch, được gọi là mật độ quang học, ký hiệu là E (hoặc D): _______________________

lo

E/D - lg

--- = k.c.l

k là số tắt, phụ thuộc vào bản chất của chất màu, bước sóng (X) của ánh sáng tới và nhiệt độ, không phụ thuộc vào nồng độ dung dịch.

Khi cố định k và 1, thì E tỷ lệ thuận với nông độ c.

E ~ c

Đây là hệ quả quan trọng của định luật Lambert-Beer để hiểu phương pháp đo màu định lượng: khi nồng độ chất màu càng lớn thì mật độ quang học đo được càng lớn và ngược lại.

1.1.3. Các yếu tố ảnh hưỏng đến màu củâ dung địch và làm sai lệch định íuật Lambert-Beer:

+ Phương pháp đo màu thường được tiến hành như sau:

- Cho chất thử X cần định lượng có trong dung dịch kết hợp với thuốc thử R để tạo thành phức hợp RX có màu:

X + R 2= . - » XR

(không màu) (không màu) (có màu)

- Đo mật độ quang học (E) của dung dịch, xác định nồng độ XR và suy ra nồng độ của X.

Do mật độ quang học E chỉ tỷ lệ thuận với nồng độ XR, nên phải chuyển được toàn bộ X thành XR và màu cua XR phải bền vững, không bị pha tạp bởi màu của các chất khác.

+ Những điểm cơ bản cần chú ý: - Thuốc thử R:

Đối với mỗi một chất cần định lượng X, phải chọn được thuốc thử R thích hợp để phức hợp XR tạo thành có màu bền vững, ít phân ly. Nói một cách khác, XR phải có hàng số không bền khá nhỏ để có thể coi nồng độ phức hợp XR bằng nồng độ chất cần định lượng X.

Trong phần ỉớn ứường hợp. phức hợp XR chỉ được tạo thành sau một khoảng thời gian (quá trình sinh màu), đạt cực đại rồi giảm dần (quá trình phai màu). Sự

đo màu chỉ chính xác và nhạy nhất khi đo trong khoảng thời gian cường độ màu đạt cực đại và ổn định nhất. Do đo, cần xác định trước khoảng thời gian này.

- Pha loãng dung dịch phức hợp màu:

Do phản ứng tạo thành và phân ly của XR là một quá Irình thuận nghịch và cường độ màu của dung dịch phụ thuộc vào tỷ số nồng độ giữa các dạng có màu và khỏng màu, nên khi pha loãng (hay làm giàu) dung dịch sẽ làm sai lệch định ỉuật Lambert-Beer. Vì vậy, khi cường độ màu của dung dịch vượt quá giới hạn đo thì phải pha loãng mẫu thử và làm lại xét nghiệm.

Có thể hạn chế ảnh hưởng này bằng cách dùng chính thuốc thử R khi pha loãng dung dịch màu (chứ không dùng nước cất) để hạn chế sự tăng độ phân ly của XR.

- pH của dung dịch:

Sự thay đổi pH (tăng hay giảm nồng độ H+) của đung dịch làm thay đổi màu

của dung dịch. Do :

. pH ảnh hưởng đến sự tạo thành phức hợp XR và đo đó làm thay đổi màu. Ví dụ, ở pH =l,8-2,5, ion Fe3+ kết hợp với sulfosalicylat tạo thành ion phức monosuỉíosalicylat [Fe(Sal)]2+ có màu đỏ; còn ở pH=8- l l , ion Fe3+ kết hợp với sulfosalicylat tạo thành ion phức sulfosalixylat [Fẽ(Sal)3]2+ có màu vàng.

. pH ảnh hưởng đến sự phân ly và phân huỷ phức hợp màu.

. H+ trực tiếp tham gia vào phản ứng dẫn đến làm đổi màu của dung dịch. Ví dụ, trong phản ứng:

2 C r 0 42' + 2 H + --- *- C r 0 2- + H20

(vàng) (da cam)

Do đó, người ta phải nghiên cứu trước các dung dịch màu chuẩn để tìm ra khoảng pH thích hợp.

- Ảnh hưởng của ion lạ:

lon lạ có thể có màu riêng, có thể kết hợp với R thành một phức hợp có màu làm ảnh hưởng, đến màu của phức hợp XR, có thể tạo với R một phức họp không màu ỉàm hao hụt thuốc thử R gây giảm sự tạo thành phức hợp XR.

Để loại bỏ ảnh hưởng này, có thể:

. Dùng một lượng R vừa đủ để tạo thành phức hợp XR nếu XR bển hơn phức hợp của R với ion lạ hoặc cho thừa nhiều R nếu XR kém bền hơn phức hợp của R với ion lạ.

. Dùng một hợp chất khác để tạo với ion lạ một phức hợp bền vững, gọi là “khoá ion lạ”.

. Thêm vào dung dịch chuẩn một lượng ion lạ bằng lượng ion lạ có trong dung dịch cần định lượng.

. Tách ricng ion lạ bằng các phương pháp thích hợp trước khi định lượng X. . Đo màu ở bước sóng đặc hiệu của XR.

Do tất cả những yếu tố trên, nên trong phân tích so màu phải tuân thủ chặt chẽ thành phần và liều lượng thuốc thử, pH của dung dịch, thời gian đo màu, bước sóng của ánh sáng tới, dung dịch đối chiếu...

1.2. Mảy đo quang:

Có nhiều loại máy đo quang: quang kế (Photometer), quang phổ kế (Spectrophotometer)... với các bước sóng cố định (dùng kính lọc) hoặc có thể thay đổi (dùng cách tử)... Nói chung, cấu tạo của các máy đo quang đều gồm các bộ phận chính sau:

+ Nguồn sáng: dùng đèn thường, đèn thuỷ ngân, đèn halogen, đèn cực tím. + Bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc: kính lọc hoặc cách tử

+ Cóng đo (cuvette): có chiểu dày (l) không đổi (0,5 cm, 1 cm); bằng thạch anh, thuỷ tinh, nhựa.

+ Tế bào quang điên: để biến đổi quang (ánh sáng ló) thành dòng điện. + Bộ phận khuếch đại.

+ Bộ phận đo và hiện kết quả: thang đo hoặc màn hình hiện số. Sơ đổ cấu tạo đơn giản của các máy đo quang như sau:

A

■ 0 ■

—

U LI \

1 2 3 4 5 6

Nguồn sáng Kính lọc Cóng đo T ế bào Khuếch đại Hiện kết

(Đèn) hoặc cách tử quang điện quả

Hình 2: Sơ đồ cấu tạo đơn giản của máy đo quang.

Ngoài các bộ phận chính trên, các máy còn có thể có thêm các phần khác như các bộ phận điều chỉnh, các bộ phận gá lắp thêm...

1.3. Các phương pháp đo màu: 1.3.1. Đo màu bằng mắt:

Dùng khi không có máy đo quang hoặc khi chỉ cần đánh giá tương đối. 1.3.1.1. Phương pháp dùng thang mẩu (hoặc gam màu mẫu):

+ Điều chế một dãy ống dung dịch chuẩn (ống chuẩn) có nồng độ tãng dần đã biết (Cs) đựng trong các ống nghiệm đổng chất.

+ Điều chế một ống dung dịch thử (ống thử) có nồng độ chưa biết (Cj-) theo các điều kiện giống hột như khi điều chế các dung dịch chuẩn và đựng trong ống nghiệm đồng chất với các ống nghiệm của dung địch chuẩn.

+ So màu của ống thử với các ống chuẩn để tìm ống chuẩn có cường độ màu bằng cường độ màu của ống thử.

Nồng độ của ống chuẩn chính là nồng độ của ống thử.

Tuỳ theo từng dung dịch mà người ta có các cách quan sát cường độ màu khác nhau.

1.3.1.2. Phương pháp hoà loãng:

So màu của dung dịch thử chứa chất cần định lượng có nồng độ chưa biết (Cr) với một dung dịch chuẩn cũng chứa chất đó có nồng độ đã biết (Q ). Màu của hai dung dịch được tạo ra trong cùng điều kiện.

+ Lấy ở mỗi ống ra X mi dung dịch cho vào 2 ống nghiệm đồng chất tương ứng. + Cho thêm thuốc thử R (hoặc nước cất) vào ống nào có cường độ màu lớn hơn (thường là ống thử) cho tới khi thấy cường độ màu của 2 ống bằng nhau. Ghi số ml thuốc thử R (hoặc nước cất) cho thêm (y).

+ Tính độ hoà loãng (d): X + y d = ---X + Tính nồng độ của ống thử (CT) theo công thức: Cỵ = d.

c s

+ Điều chế song song một dung dịch chuẩn chứa chất cần xác định có nồng độ đã biết (Cs) và một dung dịch thử chứa chất cần xác định có nồng độ chưa biết (Cy) theo cùng một qui trình.

+ Đo mật độ quang học (E) của ống chuẩn và ống thử trong cùng điều kiện (máy, bước sóng, cóng...), được Es và ET tương ứng. + Tính kết quả theo công thức:

7

ẼT

Cy —

c s

_______

+ Điều chế một dãy dung dịch chuẩn chứa chất cần định lượng có nồng độ đã biết (Cs) tăng dần.

+ Đo mật độ quang học (E) của từng ống, được các Es tương ứng.

+ Biểu diễn sự phụ thuộc của Es theo Q trên trục toạ độ, được một đường thẳng.

Hình 3: Phương pháp xác định nồng độ một dung dịch bằng biểu đồ mẫu.

+ Điều chế một ống thử chứa chất cần định lượng có nồng độ chua biết CT theo cùng một qui trình như đối với ống chuẩn.

+ Đo mật độ quang học của dung dịch thử, được ET. + Từ đồ thị tính được nồng độ Cp.

Chú ý :. Et phải nằm trong khoảng của các Es . Biểu đồ mẫu phải dựng hàng ngày. 1,3.2.3. Phương pháp hệ sô:

+ Điều chế một dãy ống chuẩn có nồng độ c s đã biết và tăng dần. + Đo mật độ quang của các ống chuấn được các Es tương ứng. + Tính hệ số a (hoặc F) theo công thức:

Chú thích:

Trong dung dịch màu có các hợp chất khác (có trong thuốc thử để tạo hợp chất màu) khi đo màu cũng cho một mật độ quang học nhất định. Vi vậy, khi định lượng bằng đo màu, người ta thường đối chiếu ống thử và ống chuẩn với một ống trắng để loại trừ ảnh hưởng này, khi đó E đo được là đo chất màu cần định lượng gây ra.

1.3.2.4. Đo bằng quả cẩu Ulbricht:

Gần đây, trong phương pháp hoá sinh khô, người ta sử dụng các que thử để định lượng các chất trong máu hoặc bán định lượng các chất trong nước tiểu.

+ Điều chế một ống thử có nồng độ chưa biết (Cr). + Đo mật độ quang của ống thử, được Eq.

+ Tính nồng độ ống thử (CT) theo công thức:

Que thử có thể gồm một hoặc nhiều ô thử, mỗi que thử thử một thông số (như máy Refotron) hoăc nhiều thông sô (như máy Clinitek). Trong mỗi ỏ thử có sẵn các chất cần thiết cho phản ứng tạo màu đặc hiệu. Khi ô thử tiếp xúc với huyết thanh hoặc nước tiểu thì phản ứng xảy ra, màu được tạo thành và việc đo màu định lượng được thực hiện trên các máy có quả cầu Ulbricht.

Quả cầu Ưlbricht ]à một quả cầu bằng thuỷ tinh có khe hở, mặt trong được tráng gương. Bên trong quả cầu chứa:

+ Nguồn sáng là đèn diode. Ánh sáng phát ra từ đèn này được chiếu lên thành bên trong quả cầu rồi phản xạ qua khe hở đi tới băng thử (lo) và được băng thử hấp thu một phần, còn một phần thì phản xạ trở lại (Ip).

+ Hai đầu đò (detector): một đầu đò qui chiếu để đo ánh sáng tới (lo), một đầu dò khác để đo ánh sáng phản xạ từ vùng thử (Ip).

Hộ số phản xạ (R) tỷ lệ với tỷ số Io/Ip.

Nồng độ chất thử (C) phụ thuộc R và được tính theo công thức Kubelka-Munk:

c = - (S/s) + <s/2e) + (S/2e)R-1 E- là hệ số hấp thu; S- là hệ số phân tán.

Kết quả được hiển thị trên màn hình.

2. Phương pháp điện di. 2.1. Nguyên lý:

Protein là những phân tử tích điện, khi đặt trong điện trường, sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với chúng.

2.2. Độ di động điện di:

Khi một hạt tích điện Ne được đặt trong điện trường E, nó chịu một lực F được tính theo định luật Coulomb:

F = Ne . E

Hat sẽ di chuyển và đạt tới vận tốc giới hạn V khi lực ma sát bằng lực Coulomb:

f. V = - Ne. E Độ di động điện di của hạt được tính như sau:

n = v/E = Ne/F

Đối với các phân tử đơn giản, được coi là hình cầu, như protein globulin của huyết thanh, hệ số ma sát f có giá trị ỉà:

f = 6. ĩi.TỊ.r

Trong đó r là bán kính của cầu và TỊ là độ nhớt của dung môi.

Thực tế, các phân tử protein được bao bọc bởi một lớp ion và nước, làm biến đổi điện tích thực và bán kính của nó. Vì vậy, để trao đổi ion, pH phải ỉớn và phải xa pH đẳng điện - pHi (ở pHj hạt không di chuyển). Ví dụ như, tất cả protein huyết thanh di chuyển trong điện trường về phía cực dương (anode) khi được đặt

ở pH = 8,6.

2.3. Dòng gây nhiễu:

Trẽn một chất giá rắn, có các hiện tượng khác can thiệp vào độ di động thực của phân tử:

Hình 5: Sơ đồ điện di cổ điển trên giấy hoặc cellulose acetat và dòng gây nhiễu.

+ Dòng điện thẩm thấu (electro-osmose): khi đặt một hiệu điện thế giữa hai đầu của một đoạn chất rắn được thấm ướt bởi chấl điện ly, sẽ có sự di chuyển của

dung môi về một trong các cực, do sự tạo thành một lớp điện tích, thường là âm, ở bề mặt của các kênh của bề mặt lỗ. Khi đó, chất điện ly có thừa điện tích dương và sẽ di chuyển về phía cực âm (cathode). Ảnh hưởng này phụ thuộc vào điện thế cuả lớp kép được tạo ra ở bề mặt của mao quản. Điộn thế này lại phụ thuộc vào bản chất của chất có lỗ được dùng, vào điện trường được đặt, vào lực ion của chất điện ly và độ nhớt của chúng. Có thể hạn chế đáng kể hiện tượng này bằng một số cách, như dùng một màng bán thấm để bọc chất giá ở mức độ điện cực, hoặc dùng một dòng thuỷ động ngược và chất bù trừ.

+ Dòng điện đối lưu (electrorheophorese): là một đòng hơi do sự bốc hơi của dung môi bởi nhiệt. Để hạn chế hiện tượng này, khi chạy điện di điện thế thấp (230 V) dùng trong thực hành lâm sàng hàng ngày, người ta dùng nắp có mái để đậy máy; còn khi chạy điện di điện thế cao (trên 1000 V), người ta phải đặt trong hệ thống làm lạnh.

2.4. Áp dụng:

+ Có nhiều kiểu điện di được dùng trong phòng thí nghiệm cũng như trong công nghiệp, tuỳ theo mục đích và điều kiện phân tích. Trong hoá sinh y học thường ngày, điện di thường được dùng để phân tích các protein huyết thanh, nước tiểu cũng như các dịch sinh học khác. Sự di chuyển của protein phụ thuộc vào bán kính r của nó, vào pH đẳng điện - pHị (pH mà ở đó, protein không mang điện tích hay có tổng điện tích ầm bằng tổng điện tích dương).

+ Để nhận biết các protein đã phân chia, người ta đùng nhiều phương pháp tuv theo kỹ thuậl điện di được sử dụng:

- Thông dụng nhất là dùng các chất nhuộm màu đặc hiệu (đỏ Ponceau, Amido đen, xanh Croomassie...), sau đó định lượng các phần đã phân chia.

- Dùng kỹ thuật miễn dịch nhậy và đặc hiệu.

Các acid nucleic cũng có thể phân chia bằng điện di, nhưng gần đây người ta thường dùng các kỹ thuật sinh học phân tử hơn.

+ Phân tích kết quả: bằng densitometor.

Densítometor cho phép đọc mật độ quang học của các băng và biểu thị theo nguyên lý đo quang phổ. Cấu tạo của densitometor gồm: nguồn sáng, kính lọc (có bước sóng thích hợp với màu của băng), bộ nhân quang, bộ ghi, bộ tính toán và bộ in.

Khi chiếu ánh sáng đơn sắc vào băng màu, một phần ánh phần còn lại bị phản xạ. Phần hấp thụ càng lớn khi mật độ chất càng lớn và do đó phần phản xạ càng nhỏ. Đo ánh sáng thành dòng điện đo được sẽ xác định được mật độ chất màu

Thấu kính

2.5. Các phương pháp điện di:

2.5.1. Điện dỉ trong lòng dịch và điện di giấy:

+ Điện di trong lòng dịch: đã được Tiselius mô tả đầu tiên để phân chia protein huyết thanh. Hiện nay, nó không còn được dùng nữa, nhưng vẫn còn được xem như một qui chiếu để đo độ di động điện di thực, vì không có dòng thuỷ động gây nhiễu và không có sự can thiệp của chất giá.

+ Điện di giấy: giấy là chất giá rắn được dùng lần đầu tiên, nhưng nay ít dùng vì đã eó các chất giá có khả năng giải quyết tốt hơn và thực tế hơn, song nó vẫn có những ưu điểm (ví dụ, trong phân loại rối ỉoạn lipoprotein rnáu Iheo Fredrickson).

2.5.2. Điện di trên màng cellulose acetat:

Màng cellulose acetat Albumìne

Đưởng mẫu

chấm

<n <r>

Albumine

Hình 7: Kết quả phân chia protein trên màng cellulose acetat và định lượng bằng đensitometór.

Ghi chữ. Bên ựái là điện di đồ protein huyết thanh, bên phải là hình ảnh sau khi

đọc trên densitom etor ©

Màng cellulose acetat là chất giá quen thuộc để phân chia protein huyết thanh ữong xét nghiệm hàng ngày. Chấm một lượng nhỏ huyết thanh trên màng cellulose acetat dưới dạng một vạch nhỏ bằng bộ chấm mẫu chuyên dụng. Sau khi chạy điện di (khoảng 30 phút ở 230V) và nhuộm các protein, màng được làm trong bằng sấy khô, rồi đọc kết quả trên máy đo mật độ (densitometor).

2.5.3. Điện di trên gel:

2.5.3.1. Điện di trên gel acrylamid (PAGE):

Phương pháp này sử dụng một gel có lỗ thu được bằng sự copolymer hoá acrylamid và N-N-methylen bis-acrylamid nhờ một phản ứng gốc dưới ánh sáng với sự có mặt của một chất xúc tác như persulfat ammon hoặc riboflavin.

I c h2 I NH • ; ; : V. I co ị I -C H 2-CH~-[-CH2-C H -]n- CH2-C H -]-C H 2-C H -]n-C H 2- I 1 : 1 CO CO CO I I I NH NH2 i CH, c h2 c h2 n h2 II 11 CH CH 1 1 Ánh sáng CO CO n h2 NH j c h2 -C H 2-C H -[-C H 2- CH-]n-Acrylamide 1 1 1 NH 1 CO c o CO 1 1 1 NH NH2 CH 1 c h2 II 1 c h2 NH 1 Bis-acrylamiđe CO NH I CO I CO I NH,

Kích thước của lỗ gel phụ thuộc vào tỷ lệ tương đối giữa hai thành phần trên yỂh rVào tỷ lệ phần trăm acrylamid. Các gel acrylamid dùng đé phân chia protein fc|Ị}fết thanh thường chứa 7-12% acrylamiđ. Có thể tạo ra gradient nồng độ IKrylamid liên tục (ví dụ, từ 4 đến 30%) hoặc không liên tục.

Các gel acrylamid dễ chuẩn bị trong các phòng xét nghiệm, nhưng cần thận trọng vì acrylamid là một chất độc thần kinh.

Có nhiều kỹ thuật được dùng:

Hình 8: Các kỹ thuật điện di.

+ Điện di gel trong ống thuỷ tinh (điện di cột): (a) thường dùng óng dài 5 - 10 cm, đường kính 0,5 - 0,8 mm.

+ Điện đi gel giữa hai tấm thuỷ tinh (b) hoặc điện di phiến gel (slab - gel electrophorese): cho phép so sánh dễ dàng giữa các mẫu thử vì được tiến hành trong cùng điều kiện giống hệt nhau.

Kích thước của tấm có thể thay đổi: Ihường rộng từ 8 - 15 cm, cao 8 - 20 cm. Các gel được dùng để xác định trình tự của acid nucleic thì dài hơn (30 - 40 cm) so với để phân chia protein. Chiều dày của gel thường đùng là 0,75 đến 2,5 cm. Các hố được đục nhờ một que nhựa nhét vào giữa hai tấm thuỷ tinh khi polymer hoá. Trên thị trường có bán các tâm có sẩn để đùng.

+ Điện di gei trên phim nhựa: mẫu thử được đặt trong các hố nằm trong gcl hoặc ở bề mặt gel để khuếch tán trong gel trước khi đặt trong điện trường.

+ Điều kiện điện di: trong lưới gel acrylamid, các phân tử được phân chia theo kích thước (trọng lượng phân tử) và điện tích của chúng. Do đó có hai kiểu điện di được dùng:

- Điện di không biến tính: trong một gel có lỗ hằng định, cả hai thống số kích thước và điện tích đều can thiệp vào sự di chuyển của các protein. Còn trong một gel với gradient của acrylamid ihì chỉ có kích thước là thông số can thiệp: các protein không qua được lỗ do kích thước của chúng lớn hơn kích thước lỗ. Đối với các lipoprotein, người ta dùng một gel với 2 lớp acrvlamid có nồng độ khác nhau (gradient không liên tục): lớp thứ nhất, nồng độ thấp hơn, có lỗ lớn hơn, chí cho các phàn tử lớn (chylomicron) đi qua; lớp thứ hai có nồng độ acrylamid cao hơn, giữ lại các phân tử nhỏ hơn một chút (VLDL) và cho qua các phân tử nhỏ mà khi phân chia theo kích thước và điện tích của chúng sẽ thành LDL và HDL. Như vậy, người ta tách được các lipoprrotein thành 4 lớp có ý nghĩa chẩn đoán và tiên lượng khác nhau. Sự phân chia cũng được thực hiện bằng kv thuật siêu ly tâm nhưng có thể thực hiện với nhiều mẫu thử, tốn ít thời gian và dùng ít mẫu hơn.

- Điện di biến tính: làm biến tính các protein bằng cách đun nóng trong dung dịch chứa các chất khử (như p-mercapto- ẹthanol) đê cắt các cầu disulfua và một chất tẩy, natri dodecyl-sulfal (SDS). SDS gắn với bề mặt protein làm cho chúng tích điện âm. Sự di chuyển của protein trong geì acrylamiđ thực tế chỉ phụ thuộc duy nhất vào trọng lượng phân tử của chúng. Phương pháp này đơn giản, nhanh, chính xác và thực tế được dùng thay cho phần lớn các phương pháp lý học (siêu ly tâm phân tích, khếch tán ánh sáng...) trong xác định trọng lượng protein. Gần đây, cetyl-triammon-bromua (CTAB) đã được đề nghị sử dụng thay cho SDS, vì nó tương đối giữ được hoạt tính sinh học sau khi điện di, còn SDS thì không.

2.5.3.2. Điện di trên các gel khác:

Gel tinh bột và gel agarose thu được bằng đun nóng sau đó làm lạnh là những polymer glucid. Nó không có tác dụng sàng phần tử như acrylamid, nhưng kích thước ỉỗ lớn của gel cho phép nhận biết enzym. Vì so với giấy hoặc màng cellulose acetat, chiều dày của gel cho phép chứa một lượng mẫu thử lớn hơn.

2.5.4. Điện di hội tụ (Electrofocalisafion):

Đó là mộl kiểu điện di thực hiện trong gradient pH. Các thành phần di chuyển theo điểm đẳng điện và dừng lại ở vùng có pH tương ứng với pH đảng điện của

Hình 9: Điện di lipoprotein huyết thanh theo gradient không liên tục của acrylamid.

chúng. Gradient pH được tạo ra trong quá trình điện di bởi một hỗn hợp của một số lớn các hạt aminoacid có pH đẳng điện khác nhau (ampholytes). Tuỳ theo thành phần của hỗn hợp, người ta thu được một thang pH nào đó và như vậy một khả năng giải quyết tốt hơn.

Có thể thực hiện theo 2 cách:

+ Hoặc trong môi trường lỏng, trong cột, gradient được tạo ra bởi gradienl saccharose.

+ Hoặc trong môi trường rắn: trên một gel (agarose hoặc acrylamid).

Anode được tạo bởi acid, còn cathode được tạo bởi một base, sử dụng điện thế rất lớn: 1000 đến 2000 V và cần hệ chống làm lạnh.

Phương pháp này được dùng trong nghiên cứu vì khả năng giải quyết của nó trong hoá sinh protein rất lớn.

2.5.5. Điện di hai chiều (Electrophorese bidimensionnell):

Thực hiện 2 lần điện di theo 2 hướng vuông góc với nhau. Có thể kết hợp điện di acryỉamiđe-agarosse, điện di đơn và điện di hội tụ... Trong thực hành, đầu tiên người ta thực hiện điện di hội tụ theo một hướng, rồi điện đi gel acrylamide-SDS theo hướng thứ hai.

2.5.6. Điện di mao quản (Electrophorese capilỉaire):

Gel acrylamiđe hoặc gel khác bền trong môi trường điện di và hạn chế được độ rộng của băng khi phân chia. Các mao quản (có đường kính trong từ KMOOịim) cho phép phản chia trong một thời gian ngắn và giá rẻ hơn. Dùng mao quán sẽ làm tăng tỷ lệ bề mặt/thể tích làm cho dễ thoát nhiệt được sinh ra khi điện di và hạn chế sự khuếch tán do nhiệt.

Trong điện di mao quản vùng, các nhóm sinanol của mao quản bị khử proton, cho một bé mặt âm tính. Các cation của đệm di chuyển theo bề mặt này: bé mặt của dịch trở nên tích điện dương và di chuyển về phía cathode. Các chất tan trung tính di chuyển với tốc độ của điện thẩm thấu; các chất tan tích điện dương di chuyển nhanh hoặc chậm hơn tuỳ theo điện tích của chúng; các chất tan tích điện âm ngược lại bị hãm ít hoặc nhiều hơn.

Khả năng phân chia phu thuộc vào điện thế, hệ số khuếch tán, độ di động điện d' và dòng thẩm thấu.

Cột mao quản có đường kính 0,05 mm X 50 cm có thể tích bén trong 852 nl: thể tích đặt mẫu có thể vài nl. Sự tích điện cửa thể tích nhỏ này có ỉiên quan với:

+ Sự di chuyển điện: phụ thuộc vào điện tích và độ đi động của chất lan được phân chia.

+ Thủy động:

- Khi đặt một giảm áp ở đầu ra.

- Bằng một siphon: đầu vào của mao quản ngâm trong mẫu.

- Theo lượng được tiêm vào, sự phát hiện phải rất nhạy. Điều này liên quan đến các kỹ thuật kinh điển (hấp phụ, huỳnh quang), vì vậy độ nhậy và độ chính xác có thể được tăng lên:

. ở mức độ cơ chất, bởi sự chênh lệch (trước và sau mao quản).

. Ở mức độ nguồn (dùng laser).

. Giới hạn thực tế đạt được trong vùng 10 '8 - 20'2(i mol.

Có thể dùng các gel (điộn di gel mao quản) hoặc các ampholyte (hội tụ điện mao quản).

Sử dụng lượng nhỏ và phân chia nhanh (tối đa vài phút) cho phép thực hiện nhiều thử nghiệm và tối ưu hoá qui trình. Kỹ thuật vi phân tích này được dùng hạn chế trong lâm sàng, ví dụ để phân tích aminoacid huyết thanh.

2.5.7. Điện di miễn dịch:

Điện đi miễn dịch được thực hiện trong gel agarose trên một lam kính hoậc trên phim nhựa, cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu thử. Kỹ thuật này kết hợp 2 giai đoạn kế tiếp:

+ Điện di trong một trường thứ nhất: các protein được phân chia bởi điện di bắt đầu từ một hố nhỏ được đục trong gel agarose. Vì thế, mỗi protein được phán chia có hình ellip kéo dài.

+ Khuếch tán miễn dịch trong một trường thứ hai: trong một máng được đục song song với hướng của giai đoạn một, người ta đặt một kháng huyết thanh vào đó, nó sẽ khuếch tán vuông góc với máng. Các protein đã phân chia cũng khuếch tán bắt đầu từ vết thu được sau điện di. Ở điểm cân bằng, sẽ xuất hiện một cung kết tủa. Cung này dỗ nhận thấy khi nhuộm màu protein.

Đây là một phương pháp phân tích rất hay đùng vì có khả năng phân chia cao. Nó có thể phân chia được gần 30 protein huyết thanh nhờ một kháng huyết thanh cừu kháng protein huyết thanh người. Những bất thường về số lượng và chất ỉượng protein huyết thanh của bệnh nhân có thể phát hiện dễ dàng bằng cách so sánh với một huyết thanh chứng bình thường được đặt đối xứng qua máng và cùng chạy. Để đánh giá chính xác các bất thường, người ta dùng kháng thể monoclon đặc hiệu.

3.

Các phương pháp sắc kỷ.

Sắc ký là một trong những phương pháp quan trọng trong các phương pháp phân tích hoá sinh, sắc ký được áp dụng rất rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như là được sử dụng để định tính, định lượng, điều chế các chất tinh khiết,

xác định các hằng số hoá lý, nghiên cứu các quá trinh động học và xúc tác... Ngoài ra, nó còn được áp dụng ở các ngành có ỉiên quan tới hoá học như y dược, nông nghiệp, thực phẩm, bảo vệ môi trường, luyện kim, dầu mỏ địa chất...

3.1. Những khái niệm chung: 3.1.1. Định nghĩa:

Sắc ký là quá trình tách liên tục các chất từ hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha cố định (pha tĩnh) và pha di động khi cho pha di động đi xuyên qua pha cố định .

3.1.2. Phân loại:

Do tính đa dạng của các phương pháp sắc ký cho nên việc phân loại sắc ký là rất cần thiết. Có các cách phân loại chính sau đây:

+ Phân loại theo pha di động: theo cách này lất cả các phương pháp sắc ký được phân thành 2 loại:

- Sắc ký lỏng. - Sắc ký khí.

+ Phân loại theo pha cố định: dựa vào hình dạng giá tựa của pha cô' định có thể có các loại sắc ký như sau:

- Sác ký cột. - Sắc ký giấy. - Sắc ký lớp mỏng.

Hoặc được phân thành 2 loại: sắc ký cột và sắc ký phẳng.

+ Phân loại theo cơ chế của quá trình tách: phương pháp phân loại này dựa vào sự tương tác của chất được sắc ký với pha cố định và pha di động. Theo cơ chế này có 4 loại sắc ký như sau:

- Sắc ký hấp phụ: sự phân tách các chất là do ái lực khác nhau của chất phân tách đối với chất hấp phụ là chất rắn (pha cố định).

- Sác ký phân bố: sự phân tách các chất là do sự hoà tan khác nhau (hay là sư phân bô' khác nhau) của các chất giữa pha cố định là lỏng (được giữ bởi chất mang rắn) và pha di động. Độ hoà ĩan phụ thuộc vào độ phân cực, do đó độ phân cực của chất được sắc ký cũng như của pha cố định và pha di động có ảnh hưởng đến quá trình tách.

- Sắc ký trao đổi ion: sự phân tách các ion là do các ion được phân tách trong dung dịch có ái lực khác nhau với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn ỉà pha cố định. Các chất đó gọi là các chất trao đổi ion mà thông thường nhất là các nhựa trao đổi ion.

- sắc ký rây phân tử: loại sắc ký này người ta dùng cá c vật rắn có độ xốp lớn, độ xốp đó được tạo ra bởi các. lỗ (mắt lưới) có kích thước cố định để rây chọn lọc các cấu tử. Tuỳ theo kích thước và hình dạng của phân tử mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau. Các chất xốp có thể là các chất xốp vô cơ, hữu cơ, các polymer tổng hợp ưa nước như là các loại sephađex được đùng để tách các chất có hoại tính sinh học.

Ngoài ra còn có các loại sắc ký kết tủa, sắc ký tạo phức, sắc ký oxy hoá - khử... nhưng chúng ít có giá trị trong thực tế.

3.1.3. Sắc đồ, sắc phổ, đường cong xuất: + Sắc đồ và sắc phổ:

Kết quả của quá trình phân tách sắc ký là các cấu tử được phân tách thành các vùng riêng biệt có màu hoặc không có màu trên cột hay trên mặt phẳng được gọi là sắc đồ (.xem hình 10).

Sắc đồ (trên cột) Sắc phổ

■

m\è-Sắc đồ (trên giấy) sắc phổ

Những chất không màu sau khi tách ta ehưa nhìn thấy sắc đồ bằng mắt thường; để hiện sắc đồ phải cho thêm 1 hoặc vài loại thuốc thử tác đụng với chất không màu đó để tạo thành chất có màu.

Bằng các quang phổ kế người ta có thể ghi được sự phân bố nồng độ các cấu tử dọc theo cột (trường hợp sắc ký cột) hoặc trên mặt phẳng (trường hợp sắc ký giấy hay sắc ký lớp mỏng), gọi là sắc phổ.

Trong trường hợp sắc ký cột, nếu biểu diễn bằng đồ thị sự phụ thuộc của nổng độ chất đi ra khỏi cột sắc ký vào thể tích dung môi rửa giải thì sẽ thu được một đường cong xuất hay đường cong rửa giải (còn gọi ỉà đường cong giải hấp).

3.2. Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột: 3.2.1. Nguyên tắc sắc ký hâ'p phụ lỏng:

Phương pháp sắc ký hấp phụ lỏng dựa vào tính chất hấp phụ khác nhau của các chất trong hỗn hợp cần phân tách. Sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ vào nồng độ của nó trong dung dịch ở một nhiệt độ không đổi được đặc trưng bởi đường đẳng nhiệt hấp phụ.

Có thể xem hấp phụ như là sự tập trung các phân tử chất khí hoặc chất lỏng ở ranh giới 2 pha: rắn-khí hay rắn-lỏng. Trong sắc ký hấp phụ lỏng, sự tách xảy ra ở ranh giới rắn-lỏng. Trong đó pha di động là chất lỏng, pha cố định là chất rắn ớ trạng thái xốp, mịn. Các hợp chất phân cực bị hấp phụ mạnh hơn các hợp chất không phân cực bởi các chất hấp phụ phân cực.

3.2.2. Chọn hệ sắc ký hấp phụ lỏng:

Để tách được tốt hỗn hợp các chất bằng sắc ký hấp phụ lỏng cần phải chú V các yếu tố sau: chất hấp phụ; pha di động; lượng mẫu; phương pháp định lượng.

Trong đó việc lựa chọn chất hấp phụ và pha di động là quan trọng nhất. + Chọn chất hấp phụ:

Chất hấp phụ phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

- Yêu cầu chủ yếu là chất hấp phụ không có tương tác hoá học giữa chất hấp phụ và các cấu tử cần tách, không có hoạt tính xúc tác để iránh các phản ứng phụ.

- Có tính chọn lọc, có nghĩa là ái lực hấp phụ của các cấu tử đối vđi chất hấp phụ khác nhau càng nhiều càng tốt.

- Diện tích bề mặt riêng và kích thước hạt (độ mịn) phải thích hợp. Hạt càng bé, cân bằng hấp thụ thiết lập càng nhanh và càng hiệu nghiệm; nhưng mặt khác lại cản trở tốc độ pha di động. Để khắc phục có thể dùng kỹ thuật chân không hay cao áp.

- Chất hấp phụ phải ổn định và được tiêu chuẩn hoá để thu được các kết quá trùng lặp.

Một số chất hấp phụ thường sử dụng là:

. Nhôm oxyt: ỉà hợp chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi nhất để phân tách hỗn hợp các chất phân cực cũng như không phân cực.

. Silicagel: cũng như nhôm oxyt, silicagel được sử dụng rất rộng rãi, là chất hấp phụ tốt nhất để tách các sản phẩm dầu mỏ, các acid béo và ête của chúng, các amin thơm và nhiều hợp chất hữu cơ khác.

, Than hoạt tính: có khả năng hấp phụ rất tốt, nhưng tính chất khống ổn định và màu đen nên khó quan sát các vùng màu của sắc đồ. Than hoạt tính thường dùng để tách các chất cao phân tử hoặc dùng để tách các chất thuộc một dãy đồng đẳng.

+ Chọn dung môi (pha di động):

Trong sắc ký hấp phụ, việc chọn đúng dung môi là rất quan trọng. Khi chọn dung mỏi cần chú ý các yếu tố sau:

- Dung môi hoà tan tốt tất cả các cấu tử phân tích. - Bị hấp phụ tối thiểu trên pha cố định (chất hấp phụ).

- Không phản ứng hoá họe với chất tan cũng như chất hấp phụ.

- Dung môi phải tinh khiết, nhất là khi dùng các dung môi không phân cực, nó khỏng được chứa các dung môi phân cực.

3.2.3. Thiết bị sắc ký:

Chọn đúng kích thước cột cũng có ý nghĩa quan trọng. Nếu chọn ngắn quá thì không đủ khả năng tách, nếu dài quá sẽ kéo dài thời gian tách.

Vật liệu làm cột thường là thuỷ tinh, đôi khi là thép, nhôm, đồng, chất déo... Thường dùng cột dạng hình trụ, hình nón... CỘI có thể dài vài centimét đến 1 0 -2 0 mét. Đường kính có thể vài milimét đến 10 - 20 centimét. Hiện nay, người ta chưa có cơ sở lý thuyết để chọn kích thước cột, phải chọn bằng thực nghiệm. Tỷ lệ chiều dài cột và đường kính tối ưu là từ 40 đến 100.

Có thể dùng phương pháp đi xuống (hình Ị ỉa ) hoặc đi lên {hình lỉb ).

Phương pháp đi lên tách tốt hơn vì hiệu ứng thành nhỏ, nhưng phương pháp đi xuống có thiết bị đơn giản nên được dùng phổ biến hơn.

Để làm tăng tốc dòng có thể dùng biện pháp thay đổi áp suất bàng kỹ thuật cao áp {hình l ỉ c ) hoặc kỹ thuật chân không (hình lỉd ) .

Tuy nhiên rất nhiều trường hợp dùng cột đơn giản (ví dụ: dùng buret chuẩn độ) cho kết quả tách cũng rất tốt. Chỉ cần chú ý phải lắp cột thẳng đứng đé giảm hiệu ứng thành.

'ịĩl ?i

Hình 11: Các loại cột sắc ký.

3.2.4. Lây mẫu và phân tích mẫu:

Có 2 phương pháp để đánh giá kết quả phân tích sắc ký, đó là: xác định trực tiếp các cấu tử ngay trên cột và phân tích dung dịch chảy rá khỏi cột.

+ Phân tích trực tiếp trên cột:

Có thể phân tích định lượng một số chất theo sắc đồ trên cột. Nhưng cách này bị hạn chế đối với chất không màu, trong trường hợp này cần phải nhờ sự phát huỳnh quang của các chất đó hoặc thêm thuốc thử để tạo màu. Có thể áp dụng phân tích trực tiếp trên cột đối với các chất phóng xạ hoặc các chất chứa các nguyên tử đánh dấu.

+ Phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột:

Trong thực tế, người ta hay đùng phương pháp này hơn vì thiết bị và thao tác đơn giản' Có 2 cách: phân tích từng phân đoạn và phân tích liên tực.

- Phân tích từng phân đoạn: có thể lấy từng thể tích xác định dung dịch chảy ra khỏi cột và xác định hàm lượng các chất đó. Phương pháp này đơn giản nhưng tốn nhiều công sức, do đó người ta tạo ra các máy thu phân đoạn tự động, gồm một số lớn ống nghiệm được sắp xếp theo vòng tròn hay hàng dọc. Dung dịch chảy ra khỏi cột được hứng vào ống nghiệm và sau một thể tích xác định máy tự động di chuyển sang ống khác theo dãy đã sắp xếp. •

- Phương pháp phân tích liên tục: người ta hướng dung dịch chảy ra khỏi cột đi vào máy xác định nồng độ.theo nguyên tắc đo chỉ số khúc xạ, độ đẫn điện, mật độ quang, độ phóng xạ... Trong trường hợp này phải dùng các cuvet có cấu trúc đặc biệt đổ có thể đo được liên tạc.

3.2.5. ứng dụng của sắc kỷ hấp phụ lỏng trên cột:

Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột thường được sử dụng để phân tách các hydrocarbon thơm, tách hỗn hợp parafin - naphten, xác định các thành phần dầu mỏ, tinh chế clobenzen, xác định các alcaloid, tách các sắc tố lá cây...

3.3. Sắc ký phân bô trên cột: 3.3.1. Cơ sở lý thuyết:

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký phán bố là dựa trên sự phân bố của các chất tan giữa 2 pha lỏng không trộn lẫn vào nhau, khi một chất lỏng là pha di động chuyển qua pha cố định cũng là một chất lỏng nhưng được hấp phụ trcn bề mặt chất rắn (chất mang). Thông thường pha cố định cũng là nước hoặc dung môi phân cực khác. Đôi khi pha cố định là chất lỏng ít phân cực hơn, khi đó pha di động phải là dung môi phân cực hơn.

Do sự phân bố của các chất tan trong hỗn hợp giữa 2 pha là khác nhau, chất nào tan (phân bố) nhiều trong pha di động hơn pha cố định sẽ di chuyển nhanh, còn chất nào tan nhiều trong pha cố định hơn pha di động sẽ di chuyển chậm hơn. Vì vậy sau một thời gian sắc ký các chất tan sẽ phân tách thành các vùng khác nhau trôn cột.

3.3.2. Tiến hành kỹ thuật: + Chuẩn bị pha cố định:

Người ta sử dụng chất ỉỏng mang (hấp phụ) trên bề mặt chất rắn xốp làm pha cố định. Cách làm như sau: Hoà tan một lượng chất lỏng pha cố định vào dung môi dễ bay hơi, sau đó cho chất mang vào dung địch đó để tẩm trước. Cho dung môi bay hơi. Trong quá trình làm bay hơi trộn đều chất mang, chất lỏng và đung môi để cho chất ỉỏng phân bố đều trên bề mặt chất mang. Đun nóng hoặc hút chân không để đuổi hết dung môi.

Phương pháp chuẩn bị pha cố định liên kết hoá học phức tạp hơn nhiều, phải xử lý các nhóm hydroxyl bề mặt chất mang xốp.

+ Tải năng của pha lỏng và lượng mẫu:

Tải năng của pha lỏng là lượng chất lỏng được giữ trên một đơn vị khối lượng chất mang. Đối với pha lỏng không liên kết hoá học, tải năng khoảng 1 - 40 phần trên 100 phần chất mang.

Lượng chất lỏng trên pha cố định quyết định lượng mẫu. Nói chung, lượng chất lỏng càng lớn thì lượng mẫu có thể phân tách được càng lớn. Đối với cột có tải năng ỉớn, lượng mẫu có thể lên tới 10 mg. Nếu mẫu quá lớn thì khả năng lách giảm. Nếu cột có tải năng nhỏ, lượng mẫu khoảng lmg.

3.3.3. ứng dụng của sắc ký phân bố:

Sắc ký phân bô' có thể sử đụng để phân tách các acid béo bay hơi như acid formic, acid acetic, acid maloic. Cũng có thể dùng để phân tách các halogenat như là NaClO}, NaBrO}, Naio,...

3.4. Sắc ký rây phân tủ:

Sắc ký rây phân tử (còn gọi là sắc ký lọc gel, sắc ký thẩm thấu gel) có khả năng lớn để tách các hợp chất cao phân tử (như protein, polymer) cũng như nghiên cứu tính chất, kích thước và trọng lượng phân tứ của chúng.

Sắc ký rây phân tử có thể dùng các gel hữu cơ loại dextran mạng (sephadex) với các kích cỡ lỗ khác nhau và hoạt tính hấp thụ không đáng kể. Tuy nhiên gcl hữu cơ bị trương lên trong các dung môi nên gây khó khăn cho kỹ thuật. Dùng các rây phân tử vô cơ không có nhược điểm đó như là thuỷ tinh xốp, silicagel nhưng rây phán tử vô cơ có nhược điểm là khả nãng hấp phụ lớn; do đó phải làm biến tính hoá học bề mặt của chúng.

3.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký rây phân tử:

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký rây phân tử là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa dung môi tự do và dung môi nằm trong các hốc của các vật xốp. Dung môi tự do là pha di động, còn dung mỏi nằm trong các nốc là pha cố định. Mức độ xâm nhập của phân tử chất tan chủ yếu phụ thuộc vào kích thước và hình dạng của chúng. Chất tan nào mà kích thước phân tử lớn hơn kích thước lỗ của rây phân tử thì không thể xằm nhập vào các hốc, chúng chỉ có thể khuếch tán vào kẽ hở giữa các hạt rắn, do đó chúng di chuyển ra khỏi cột nhanh hơn. Còn chất tan có kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ thì chúng có khả năng xâm nhập vào lỗ của hạt; khi pha di động đi qua, các phân tử đó đi ra khỏi lỗ và di chuyển cùng với pha di động ra khỏi cột chậm hơn.

Như vậy, trong sắc ký rây phân tử, các cấu tử được ra khỏi cột theo thứ tự giảm dần kích thước phân tử của chúng. Những chất có cấu tróc không gian gần giống nhau thì thứ tự phân tách theo chiểu giảm trọng lượng phân tử. Điều này chỉ đúng khi hiệu ứng hấp phụ không đáng kể.

3.4.2. Kỹ thuật tiến hành sắc ký rây phân tử:

Thiết bị dùng trong sắc ký rây phân tử thực tế không khác các dạng sắc ký lỏng khác. Có thể sử dụng các cột sắc ký thông thường. Có thể dùng các cột thuỷ tinh

kích thước khác nhau, đài từ 20 - 200 cm, đường kính từ 5 - 50 mm. Nạp chất hấp phụ vào cột phải đồng đều, muốn vậy phải dùng các hạt hình cầu cùng kích thước.

Lượng mẫu cho vào không được quá tải năng của cột. Chú ý khi đưa mẫu polymer đặc vào cột, độ nhớt cao sẽ làm giảm tốc độ dòng.

3.4.3. ứng dụng của sắc kỷ rây phân tử:

Sắc kv rây phân tử được sử dụng để tách các hợp chất cao phân lử cũng như các chất có phân tử lượng nhỏ. sắc ký rây phân tử có thể dùng để xác định phân tử nhanh chóng đối với tất cả các polymer có thể tan được trong dung môi nào đó.

Các rây phân tử có kích thước lỗ gần bằng 5A° thì hấp thụ được các hydrocacbon mạch thẳng, còn các hydrocarbon mạch nhánh không bị hấp phụ. sử dụng tính chất đó người ta có thể tách rời hỗn hợp các hydrocarbon như hỗn hợp octan và isooctan.

3.5. S ắ c ký trao đổi ion:

3.5.1. Định nghĩa và phân loại ionit:

Những chất có khả năng trao đổi ion gọi là ionit. lonit là những đại phân tử acid hoặc base không tan trong nước và các loại dung môi, chúng chứa trên mạng lưới những ion linh động có khả năng trao đổi theo đương lượng và thuận nghịch với các ion cùng dấu trong dung dịch chất điện ly khi tiếp xúc (hình 12). Ionit có thể ở dạng rắn hay dạng lỏng.

Dựa vào đấu điện tích của ion trao đổi, người ta phân chia thành cationit, anionií hay ionit lưỡng tính.

Hỉnh 12'. Các ionit.

a) Trạng thái ban đầu; b) Trạng thái tiếp xúc.

Khi ion trao đổi (gọi là ion linh động) mang điện tích dương (ion cố định của mạng lưới không mang điện tích âm), ionit tương ứng là cationit, chúng có công thức chung là HR, NaR, CaR2, MgR2.

Phản ứng trao đổi của cationit như sau:

2 N a R + C a C l . R 2C a + 2 NaCI

R ắn Dung dịch Rắn Dung dịch

Khi ion trao đổi mang điện tích âm (ion cố định của mạng không mang điện tích dương), ionit tương ứng là anionit, chúng cổ công thức chung: ROH, RCL R X O3, R2SO4... Phản ứng trao đổi của anionit như sau:

2RCI + N a2S 0 4 « R 2S 0 4 + 2 NaCI

Rắn Dung dịch Rắn Dung dịch

Các ionit lưỡng tính có thổ trao đổi cả ion mang điện tích dương lẫn ion mang điện tích âm cùng một lúc.

3.5.2. Kỹ thuật sắc kỷ trao đổi ion:

3.5.2.1. Chọn cột trao đổi ion:

Cột chứa ionit dùng trong phòng thí nghiệm là các cột thuỷ tinh hoặc thuỷ tinh hữu cơ có kích thước khác nhau. Phần dưới của cột để bông thuỷ tinh (3 - 10 mm) để đỡ cho ionit không rơi xuống. Phía trên cùng của cột để hở hoặc đóng bằng phễu nhỏ giọt (hình 13), hoặc bằng dụng cụ đặc biệt để đần đung dịch rửa.

Ionit sau khi được ngâm trong nước, rớt vào cột cùng với nước để tránh bọt khí lẫn trong ionit. Lượng ionit chỉ cho khoảng 2/3 thể tích cột. Trên lớp ionit nên

để lớp bông thuỷ tinh dày 3 - 5 IĨ1IĨ1 và 1 lớp bi thuỷ

tinh dày 1 - 2 cm để giữ cho ionit khỏi bị xáo trộn khi rót dung dịch vào.

3.5.2.2. Các giai đoạn của trao đối ion:

+ Giai đoạn 1: hấp phụ ion của dung dịch phân tích trên cột ionit.

Để giữ toàn bộ ion trong dung dịch phân tích cần sử dụng i lượng ionit lớn hơn lượng tính toán. Nếu sử dạng cationit acid yếu dạng RH hay anionit base yếu dạng ROH thì dung dịch chảy qua lớp ionit sẽ mang tính acid hay base, làm thay đổi pH của dung dịch, dẫn đến sự thay đổi giá trị trao đổi năng của ionit.

+ Giai đoạn 2: giải hấp ion bị hấp thu trên ionit. Trong giai đoạn này ion bị hấp thu được tách ra khỏi ionit bằng những dung dịch thích hợp như bằng acid có nồng độ khác nhau hoặc 1 số chất hữu cơ có khả năng tạo phức với ion cần tách.

ĩ

ềJ