Inibição do crescimento de raízes de soja pela mimosina: lignificação e enzimas relacionadas.

Inibição do crescimento de raízes de soja pela mimosina:

lignificação e enzimas relacionadas.

Profª Drª Maria de Lourdes Lucio Ferrarese Orientadora

Inibição do crescimento de raízes de soja pela mimosina:

lignificação e enzimas relacionadas.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (área de

concentração Biologia Celular) da

Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil) Andrade, Aneliz de Bastos

A553i Inibição do crescimento de raízes de soja pela mimosina : lignificação e enzimas relacionadas / Aneliz de Bastos Andrade. -- Maringá : [s.n.], 2006.

38 f. : il. color., figs., tabs.

Orientador : Profª. Drª. Maria de Lourdes Lucio Ferrarese. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá.

Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, 2006. 1. Bioquímica vegetal. 2. Alelopatia. 3. Mimosina. I.

Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. II. Título.

À Deus

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela oportunidade de realização de mais um sonho.

Aos meus pais, José Marcos e Gelta, pelo amor incondicional, paciência, compreensão, por terem investido em minha educação e por torcerem por mim sempre.

Ao meu irmão, Renan, pela amizade e incentivo.

A minha família, em especial aos meus avós, Yolanda, Joel e Vilma, e a prima Eleonora, sempre disponíveis para me estimular com muito carinho e me amparar em todas as formas.

Aos meus orientadores, Maria de Lourdes e Osvaldo, meus sinceros agradecimentos pela orientação firme e segura, pela magnífica forma com que conduzem e se dedicam ao trabalho, pela confiança em meu trabalho e também pela amizade nesses anos de convivência.

Aos professores de todas as épocas por fazerem parte da minha formação pessoal e profissional, pelos conhecimentos compartilhados.

A Cidinha, Gisele e Flausina, técnicas do laboratório, pela amizade e ajuda constante. Aos colegas de laboratório pelas conversas, dicas, ajuda e companheirismo.

A todos os amigos:

Aos amigos inesquecíveis: Aline, Kenza, Viviane e Welza por estarem ao meu lado em todos os momentos.

Aos meus outros grandes amigos: pela torcida, pelos momentos de conversas, viagens, compreensão, auxílio nas dificuldades e principalmente por maravilhosos momentos cheios de alegria que uma amizade pode proporcionar. A todos que direta ou indiretamente participaram deste trabalho.

A Fundação Araucária pela Bolsa que me foi concedida.

A Universidade Estadual de Maringá, através do Laboratório de Bioquímica Vegetal BIOPLAN, pela realização deste trabalho.

A todos que acreditaram em mim e me incentivaram.

“[....] talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor, mas lutamos para que o melhor fosse feito[....] Não somos o que deveríamos ser, mas somos o que iremos ser. Mas Graças a Deus, não somos o que éramos”.

APRESENTAÇÃO

Esta dissertação é composta de uma Revisão Bibliográfica e de um Artigo científico que trata dos efeitos da mimosina na lignificação de raízes de soja. O artigo foi redigido de acordo com as normas da revista Journal of Chemical Ecology.

Aneliz de Bastos Andrade, Maria de Lourdes Lucio Ferrarese, Aline Finger Teixeira and Osvaldo Ferrarese-Filho. Mimosine-inhibited soybean root growth, lignification and related enzymes (a ser submetido).

RESUMO

Plantas superiores regularmente liberam compostos orgânicos no ambiente os quais são adicionados ao solo. Alguns destes compostos têm sido citados como agentes de interações entre plantas, fenômeno conhecido como alelopatia. Estes compostos são liberados por vários mecanismos incluindo a lixiviação pela água pluvial, exsudação pelas raízes, decomposição natural de partes das plantas na superfície ou no próprio solo. A ação primária dos compostos alelopáticos ainda não foi estabelecida, mas alguns efeitos fisiológicos são conhecidos. Tipicamente os aleloquímicos interferem nas plantas superiores suprimindo a germinação, causando injúrias durante o crescimento da raiz e meristemas e, então, inibindo o crescimento das plantas. Plantas de cobertura fornecem valor à colheita quando adicionado em sistemas agronômicos. Entretanto, muitas espécies utilizadas como coberturas são tóxicas devido às altas concentrações de fitoquímicos, que são significantes para alelopatia.

Leucena (Leucaena leucocephala Lam. de Wit) é um exemplo de planta de cobertura bem sucedida com vários produtos naturais altamente ativos biologicamente. Leucena tem sido amplamente cultivada em áreas tropicais como planta enriquecedora do solo e como cobertura vegetal para controle de plantas daninhas. Tem sido relatado que vários agentes químicos secundários são produzidos pela Leucena. Entretanto, a presença de um aminoácido não protéico denominado mimosina (β-(3-hidroxi-4-piridon-1-il)-L-alanina) nas suas sementes e folhas tem sido considerado a maior causa alelopática. Este aminoácido é liberado da Leucena para o solo e inibe o crescimento de espécies de plantas vizinhas. Esta ação alelopática tem sido relatada em um grande número de espécies de plantas, mas o mecanismo de ação de mimosina não está completamente elucidado.

A redução do crescimento das raízes tem sido considerada um dos primeiros efeitos dos aleloquímicos e, em alguns casos, está associado à prematura lignificação da parede celular. A via dos fenilpropenóides é uma das mais importantes vias metabólicas devido ao papel na síntese de compostos fenólicos e de uma ampla série de produtos secundários em plantas, incluindo lignina. Fenilalanina amônia liase (PAL) e peroxidase (POD) têm sido associadas com a polimerização de monolignóis e, consequentemente, na síntese de lignina. Não há relatos, até o presente, sobre os efeitos de mimosina nas raízes de soja. Assim, a questão principal do presente trabalho foi avaliar se mimosina afeta as atividades da PAL e da POD e os conteúdos de lignina nas raízes de soja (Glycine max L. Merr.).

Plântulas obtidas após três dias foram cultivadas em solução nutritiva, pH 6.0, contendo ou não mimosina (0.05 a 1.0 mM). Os experimentos foram realizados em câmara de crescimento (25°C, 12 horas luz / 12 horas escuro, irradiação de 280 µmol m-2 s-1) durante 24 horas. Após a

incubação, os efeitos sobre as atividades enzimáticas, conteúdos de lignina e crescimento da raiz foram avaliados. Os dados foram expressos como médias de três a cinco experimentos independentes ± erro padrão da média. Para testar a significância das diferenças observadas foi realizada a análise de variância. A diferença entre os parâmetros foi observada pelo teste de múltiplas comparações de Dunnet e valores P<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

Em relação aos controles os resultados mostraram que: 1) A média total do comprimento das raízes foram 18,6 a 86,6% menores do que os controles para tratamentos com 0,05 a 1,0 mM, respectivamente. As biomassas frescas das raízes diminuíram 14,8; 19,5 e 20,3% nos tratamentos com 0,25; 0,5 e 1,0 mM, respectivamente. As biomassas secas diminuíram 16,7 a 45,0% (0.05 a 1.0 mM). 2) Mimosina reduziu a atividade da PAL em 49,8 e 65,4%, após os tratamentos com 0,5 e 1,0 mM, respectivamente. As atividades da peroxidase solúvel diminuíram 26,4 e 36,3%, com 0,5 e 1,0 mM de mimosina, respectivamente. As atividades das peroxidases ligadas à parede celular diminuíram (de 24,9 a 61,2%), em todas as concentrações de mimosina. 3) Os conteúdos de lignina diminuíram de 24,1 a 37,8% com 0,25 a 1,0 mM de mimosina.

É bem conhecido que a lignificação possui importante papel no crescimento das plantas. PAL e POD têm sido implicadas nesta via metabólica e, por conseguinte, na produção de lignina. Neste contexto, é provável que mimosina iniba a síntese de proteínas ou compete com L-fenilalanina, o substrato da PAL. Como um forte quelador de ferro, é possível que mimosina modifique a ação da POD, reduzindo sua atividade. Os resultados mostraram que os teores de lignina diminuíram concomitantemente às reduções nas atividades da PAL e POD e o crescimento das raízes, sob ação de mimosina. Assim, parece razoável supor que, na presença de mimosina, a diminuição na atividade da PAL possa reduzir a produção de ácidos fenólicos. Isto é plausível visto que a diminuição na atividade desta enzima é sugerida como um mecanismo regulador na produção de ácidos fenólicos, na via de fenilpropenóides. Levando em conta que estes compostos não estão disponíveis para a ação polimerizadora da POD, uma posterior redução na síntese de lignina das paredes celulares está associada à restrição no crescimento das raízes.

Em resumo, os resultados obtidos evidenciaram a suscetibilidade da soja a mimosina e reforçaram o papel deste aminoácido não-protéico como um forte aleloquímico. Além disso, os resultados indicam que, pelo menos para a soja, PAL e POD são sensíveis a mimosina, dados estes que sugerem um papel regulador para estas enzimas como responsáveis pela ação do aleloquímico.

GENERAL ABSTRACT

Higher plants regularly release organic compounds into the environment; their decay products are often added to the soil matrix and some of them have been reported as plant-plant interaction agents, a characteristic of the well-known phenomenon called allelopathy. These compounds are released by a number of mechanisms, which include release in soil by rainwater, excretion or exudation from roots, and by natural decay of parts of plants lying above or below the ground. The primary mode of action has not been established for any allelopathic compound, albeit some physiological actions are known. Allelochemicals, active against higher plants, typically suppress seed germination, causing injury to the root growth and other meristems, or inhibiting seedling growth. Cover crops provide an added crop value in the agronomic system. However, many cover-crop species are too toxic because of high concentrations of phytochemicals, which are significant to allelopathy.

Leucaena (Leucaena leucocephala Lam. de Wit) is an example of a successful cover crop with several highly biologically active natural products. Leucaena has long been cultivated in tropical areas as soil-improving crops and cover crops to control weeds. It has been reported that several secondary chemical agents are produced by Leucaena. However, the presence of a non-protein amino acid named mimosine (β-(3-hydroxy-4-pyridon-1-yl)-L-alanine) in its leaves and seeds has been considered the main cause of allelopathy. This compound is released from the Leucaena to soils and inhibits the growth of nearby plant species. This allelopathic action has been reported in a great number of plant species but the knowledge on the mechanism of mimosine is scanty.

Reduction of growing roots has been considered as one of first effects of allelochemicals and, in some cases, it is associated with premature lignification of the cell walls. Phenylpropenoid pathway is one of the most important metabolic routes due to its responsibility for the synthesis of phenolic compounds and of a large range of secondary plant products, including lignin. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and peroxidase (POD) have been shown to be associated with monolignol polymerization and, consequently, with lignification. At present, no reports on the effects of exogenous mimosine on soybean roots are available. Thus, the main question of the present work was whether mimosine affects PAL and POD activities and lignin contents of soybean (Glycine max) roots.

Three-day-old seedlings were cultivated in nutrient solution, pH 6.0, containing or not 0.05 to 1.0 mM of mimosine. Experiments were carried out in a growth chamber (25°C, 12-h light/12-h dark cycle, irradiance of 280 µmol m-2 s-1) during 24 hours. After incubation, the effects on enzymatic activities, lignin contents and root growth were evaluated. Data are expressed as

means of three to five independent experiments ± S.E. Analysis of variance to test the significance of the differences observed was performed. The difference between parameters was evaluated by Dunnet´s multiple comparison test and P values <0.05 were considered to be statistically significant.

In comparison to control conditions, the results showed that: 1) mean total root lengths were 18.6 to 86.67% less than controls for 0.05 to 1.0 mM treatments, respectively. Roots fresh weight decreased 14.8; 19.5 and 20.3% at 0.25; 0.5 and 1.0 mM treatments, respectively. Roots dry weights decreased from 16.7 to 45.0% (from 0.05 to 1.0 mM) less than those of controls. 2) Mimosine decreased PAL activities by 49.8% and 65.4% after 0.5 and 1.0 mM treatments. Soluble POD activities decreased 26.4 and 36.3% with 0.5 and 1.0 mM of mimosine, respectively, in comparison to controls. Cell wall-bound POD activities decreased from 24.9% to 61.2% regardless of mimosine concentrations. 3) Lignin content decreased from 24.1 a37.8% after 0.25 to 1.0 mM of mimosine.

It is well known that lignification plays important roles in plant growth. PAL and POD have been implicated in this metabolism pathway and, consequently, in the lignification. Then, it is probably that mimosine inhibits the protein biosynthesis or competes with L-phenylalanine, the substrate of PAL. As a strong iron chelator, mimosine may disturb the action of POD by reducing its activity. Results showed that the lignin content decreased concomitant to PAL and POD activities and root growth under the action of mimosine. Thus, it seems reasonable to suppose that, in the presence of mimosine, the reduction on PAL activity may decrease the production of phenolic acids. This is plausible since a decrease on the PAL activity is suggested as a regulatory mechanism for the production of phenolic acids. Taking into account that these compounds are not available for POD, a further reduction in the lignin synthesis of cell walls has been associated with restricted root growth.

In short, the current results showed the susceptibility of soybean to mimosine and reinforced the role that this non-proteic amino acid plays as a strong allelochemical. Furthermore, the results also indicate that, at least for soybean, the PAL and POD activities of the roots are sensitive to mimosine and data suggest a regulatory role for these enzymes as responsible for the allelochemical action.

REVISÃO DE LITERATURA

Aspectos Gerais da planta

Leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit) é uma leguminosa originária do México, sendo encontrada em toda a região tropical e dispersa para outras partes do mundo devido sua versatilidade de utilização. A planta (Fig.01), cuja altura varia de 5 a 30m dependendo da espécie, apresenta um sistema radicular profundo, com poucas raízes laterais, que ocorrem em pequeno número, próximas à superfície do solo e que portam nódulos fixadores de nitrogênio com 2,5 a 15 mm de diâmetro e com formato freqüentemente multilobado. As folhas são bipinadas, com 15 a 20 cm de comprimento, apresentando quatro a dez pares de pinas, cada uma com cinco a vinte pares de folíolos em cada pina. Cada folíolo apresenta 7 a 15 cm de comprimento e 3 a 4 mm de largura. A inflorescência é globosa e solitária, sobre um pedúnculo com mais de 5 cm de comprimento, apresentando numerosas flores brancas. As flores da leucena formam inflorescências brancas, redondas e geralmente são de auto polinização, que resultam em cachos de vagens. As vagens são estreitas e achatadas, com 20 cm de comprimento e 2 cm de largura, acuminadas, portando 13 a 20 sementes. As sementes (Fig. 01- detalhe) são elípticas, comprimidas e de cor marrom (SKERMAN, 1977).

Leucena é amplamente utilizada na agricultura devido à alta velocidade de crescimento, a importância econômica como madeira e combustível e a habilidade em fixar nitrogênio, o que a torna de grande importância em termos de produtividade (CHOU; WALLER, 1989; NAIR, 1989; LANTICAN; TAYLOR, 1991). É muito empregada no reflorestamento de áreas degradadas, uma vez que melhora as qualidades físico-químicas e biológicas do solo e como fonte de proteína para a alimentação animal (EL - BEDAWY et al. 1999), mas nesse caso com restrições devido à presença de substâncias tóxicas nas folhas. O uso de leucena como cobertura de solo (utilizando-a com 1,5m de comprimento) controla plantas daninhas, sendo esse efeito devido à presença de compostos secundários na parte aérea da planta (BUDELMAN, 1988).

A fitotoxicidade de extratos de leucena sobre várias plantas tem sido atribuída à diversidade de compostos secundários presentes nas folhas e sementes (CHOU; KUO, 1986). Segundo Kuo et al. (1983) e Souza Filho et al. (1997) o uso do extrato aquoso de leucena tem apresentado efeito alelopático sobre várias plantas cultivadas como alface (Lactuca sativa) e arroz (Oryza sativa) e plantas daninhas como desmódio (Desmodium adscendens), guanxuma (Sida rhombifolia) e assa-peixe (Vernonia polyanthes) inibindo a germinação e afetando o crescimento radicular das plantas. Entre os vários compostos secundários presentes na leucena se destacam a quercetina e os ácidos gálico, protecatecuico, hidroxibenzóico, p-hidroxifenilacético, vanílico, ferúlico, caféico e p-cumárico. Entretanto a presença de um aminoácido não-protéico denominado mimosina é uma das causas de interesse dos ecologistas, em especial dos estudiosos da alelopatia.

Alelopatia

Interações químicas ou alelopáticas entre inúmeras espécies de plantas superiores têm sido alvo de grande interesse. A interação alelopática entre plantas requer a produção e liberação de composto(s) aleloquímico(s) pela planta doadora, captação desse composto pela planta receptora e resposta detectável dessa planta (SHANN; BLUM, 1987).

Grande parte dos estudos no campo de alelopatia estão voltados ao isolamento e identificação de estruturas de compostos que causam efeito alelopático. São inúmeras as informações relatadas sobre as estruturas químicas, sobre a importância na interação planta – ambiente e, ainda, o fato de afetarem o desenvolvimento da planta por influenciarem a absorção de nutrientes. Apesar disso, investigações mais consistentes no que tange à absorção desses

compostos (LEHMAN; BLUM, 1999; FERRARESE et al., 2000; SILVA et al., 2000) são aspectos que, ainda, deverão merecer maior atenção dos pesquisadores da área de bioquímica de plantas.

A alelopatia é definida como a interferência provocada por substâncias químicas produzidas por certos organismos e que, no ambiente, afetam os outros componentes da comunidade. Putnam e Duke (1978) consideram a alelopatia como efeitos prejudiciais de plantas de uma espécie (doadora) na germinação, crescimento ou no desenvolvimento de plantas de outras espécies (receptoras). Para Rice (1984), a alelopatia compreende a liberação, por um dado organismo, de substâncias químicas no ambiente, as quais irão interagir com outro organismo presente no mesmo ambiente, inibindo ou estimulando o seu crescimento, e, ou, desenvolvimento. Ainda, segundo este autor, a alelopatia pode ocorrer entre microorganismos, entre microorganismos e plantas, entre plantas cultivadas, entre plantas daninhas, e entre plantas daninhas e plantas cultivadas.

Whitaker e Fenny (1971) relataram que como muitos compostos secundários podem ser

tóxicos, são combinados com açúcares, na forma de glicosídeos, tornando estas substâncias inócuas dentro da planta. Já outras substâncias ocorrem como polímeros (tanino, resina e latéx) ou como cristais (oxalato de cálcio); pois estes variam desde simples hidrocarbonetos, até compostos complexos, com pesos moleculares bastante elevados (PUTNAM, 1988).

A principal função dos aleloquímicos nas plantas é a proteção ou defesa destas contra o ataque de fitopatógenos e pragas ou invasão de outras plantas (WITTAKER, 1970; LOVETT, 1982). Segundo Putnam e Duke (1974), a atividade biológica destes produtos depende mais da sua concentração e mobilidade do que de sua composição química, pois um composto que é tóxico para uma espécie vegetal pode ser inócuo para outra.

As substâncias alelopáticas são liberadas dos tecidos vegetais por volatilização, lixiviação, exsudação radicular e decomposição de resíduos vegetais (RICE, 1984). Os aleloquímicos liberados pelos resíduos vegetais em decomposição se encontram distribuídos desuniformemente no solo, concentrando-se nas proximidades dos resíduos. Assim, a extensão dos efeitos dos aleloquímicos é dependente do maior ou menor contato entre o sistema radicular e os fragmentos dos resíduos vegetais (PATRICK, 1971).

Com raras exceções, os compostos secundários provêm das vias metabólicas do ácido chiquímico e das que apresentam o acetato como antecessor ou, ainda, de outros esqueletos químicos resultantes de uma combinação de metabólitos primários. A designação de compostos secundários foi proposta quando ainda eram desconhecidas suas funções específicas, e a diversidade de estrururas dos compostos e sua distribuição nos organismos sugeria que se tratava

de resíduos metabólicos ou produtos de reserva, que não sofriam alterações ao longo do desenvolvimento da planta (STRACK, 1997).

Diante do grande número de compostos secundários ou aleloquímicos conhecidos, várias classificações têm sido propostas. Mais recentemente, Taiz e Zeiger (1998), levando em consideração a biossíntese destes compostos, dividiram-nos em apenas três grupos: compostos fenólicos, terpenos e compostos nitrogenados. De acordo com esta classificação, a mimosina possuindo nitrogênio em sua estrutura (assim como uma grande variedade de metabólitos secundários vegetais) é classificada como um composto nitrogenado.

Mimosina e alelopatia

Plantas e animais incorporam os mesmos 20 aminoácidos nas suas proteínas. Entretanto, muitas plantas contêm aminoácidos pouco comuns, chamados de não-protéicos. Estes não são incorporados em proteínas, mas estão presentes na forma livre e atuam como substância protetora. Muitas vezes são similares aos aminoácidos protéicos (TAIZ; ZEIGER, 1998).

Como relatado anteriormente, mimosina é um aminoácido não–protéico (Fig. 02) encontrado em leucena, e que apresenta importantes efeitos farmacológicos, como antimitótico, antimicrobiano, antifibrótico em fibroblastos cardíacos e inibidor de morte neuronal (VESTENA et al., 2001). Como um típico metabólito secundário, a regulação do seu metabolismo pode ser modulada por variações ambientais e compostos como os fitohormônios. Além disso, sua biossíntese representa um ponto entre metabolismo primário (biossíntese de cisteína para a montagem de proteína) e o metabolismo secundário (acúmulo de mimosina) (VESTENA et al., 2001).

Figura 2 - Estrutura química da mimosina (ácido (S)-amino-β-[1-(3-hydroxi-4-oxipiridina] propiônico).

Mimosina é sintetizada através da ação de uma isoforma da enzima cisteína sintase em duas moléculas: 3,4 diidroxipiridina e O-acetilserina. O anel de piridina da mimosina deriva da

lisina que é sinteziada em plantas pelo ácido diaminopimélico e aspartato. A degradação da mimosina resulta em três substâncias: 3–hidroxi-4-(1H)-piridina (DHP), piruvato e amônia, Vestena et al. (2001). Decorrente da formação destes metabólitos, a biossíntese de mimosina representa um ponto importante entre o metabolismo primário (biossíntese da cisteína para a montagem da proteína) e o metabolismo secundário (acúmulo de mimosina) (LUCCI, FETT-NETO; MAZZAFERA, 2005). NH2 │ NH2 H2S HS ― CH2― CH ― CO2H │ Ac ― CH2 ― CH ― CO2H L - Cisteína O – Acetil – L – Serina 3,4 Diidroxipiridina L - Mimosina

3 – Hidroxi – 4 – (1H) – piridina Piruvato Amônia

Figura 3 - Relações metabólicas entre cisteína, mimosina e 3 – hidroxi – 4 (1H)-piridina.

O acúmulo de mimosina é aumentado por diferentes auxinas e sua cinética é dependente da concentração e estabilidade das auxinas. UV-B (radiação ultravioleta), induz acúmulo de mimosina, possivelmente agindo como um filtro. Gregianini et al. (2003) sugerem que a mimosina pode atuar como um filtro UV ou responder ao estresse oxidativo causado por radiação (irradiação UV), talvez agindo como um eliminador de espécies reativas ao oxigênio (ROS). Certamente, estudos futuros levarão em conta interações entre auxinas, etileno e mimosina e a capacidade deste aminoácido atuar como eliminador de ROS (PAIM; FETT – NETO, 2005).

Vestena et al. (2001) quantificou altos teores de mimosina na parte aérea da planta. Em plântulas estioladas, expostas a luz, ocorreu acúmulo inicial seguido de redução na quantidade deste aminoácido. Plântulas transferidas para o escuro têm grande estabilidade nas concentrações de mimosina. O conteúdo de mimosina aumenta quando há prejuízo mecânico da parte aérea da planta. Além disso, também foi observado que o ácido salicílico estimula o acúmulo de mimosina nas raízes. Durante o início da germinação e ativação axilar durante a formação da planta, há significativa diminuição do conteúdo de mimosina. Os resultados indicam que a acumulação de mimosina é regulada ontogeneticamente e também por fatores ambientais. Isto sugere que mimosina tem um papel adaptativo, como um agente ecoquímico e fonte de reserva nutricional.

Os efeitos alelopáticos de leucena têm sido atribuídos à presença de compostos fenólicos, como os citados anteriormente. O potencial alelopático da leucena é atribuído principalmente à mimosina (WARD; HARRIS, 1976). Existe grande concentração de mimosina nas partes mais novas das plantas de leucena: folíolos, raquís e casca enquanto as mais baixas quantidades se encontram nas raízes primárias (LUCCI et al., 2005). Estudos conduzidos por Prates et al. (1999a, b)revelaram que o uso da parte aérea da leucena, tanto em cobertura quanto incorporada ao solo, reduziu a população de plantas daninhas presentes na cultura do milho, com maior efeito sobre as folhas largas. Isso provavelmente ocorreu devido a liberação de mimosina das folhas, após decomposição (CHOU; KUO, 1986).

Diferentes concentrações de mimosina têm causado inibição quando aplicadas em várias plantas. Por exemplo, os crescimentos das raízes de alface (Lactuca sativa), arroz (Oryza sativa), rabanete (Raphanus sativus) e nabo (Brassica napus) foram inibidos pela mimosina 10 a 20 ppm (KUO et al., 1983; TAWATA; HONGO, 1987). A germinação das sementes e o crescimento das raízes de colza (Brassica campestris), feijão (Phaseolus vulgaris), rabanete, trigo (Triticum aestivum) e feijão-mungo (Vigna radiata) também foram inibidos com mimosina 1 mM. Em estudos realizados com mimosina 1 mM (RIZVI et al., 1990) revelaram que a germinação das sementes e o crescimento das raízes de colza, feijão, rabanete, trigo e feijão – mungo foram inibidos. De acordo com Souza Filho et al. (1997), a interferência no crescimento da radícula é um dos melhores indicadores para estudo de extratos com potencial alelopático.

Suresh e Vinaya Rai (1987, 1988) testaram a influência alelopática de leucena sobre o sorgo (Sorghum bicolor) e o girassol (Helianthus annuus) usando solo coletado das plantações desta leguminosa. Eles constataram que a germinação das sementes, o comprimento das raízes e a produção de matéria seca foram reduzidos. Vários outros autores relataram os efeitos alelopáticos de extratos aquosos de folhas, de lixiviatos de folhas, de exsudatos de sementes e de solo onde foi plantada leucena, em diferentes espécies como Abelmoschus esculentus (quiabo),

Acacia confusa, Ageratum conyzoides (mentrasto), Bidens pilosa (picão–preto), Brassica chinensis (couve da malásia), Brassica juncea (mostarda), Cajanus cajan (feijão – guandu), Cicer arietinum (grão-de-bico), Lactuca sativa (alface), Mimosa pudica (dormideira), Phaseolus vulgari (feijão) entre outras espécies comuns que são negativamente sensíveis aos aleloquímicos de leucena (KUO et al., 1983; CHOU; KUO, 1986; RIZVI; RIZVI, 1987; KUO et al., 1989; CHATURVEDI; JHA, 1992; RIZVI et al., 1990a, b; 1994; NARWAL, 1996; SINHA, 1996).

De acordo com relatos do Instituto Internacional de Agricultura Tropical (Anon, 1980) o rendimento de milho (Zea mays) e de arroz (Oryza sativa) aumentou quando crescidas juntamente com leucena; fato também observado por Rachie (1983). Entretanto, resultados contrários foram relatados por Karim e colaboradores indicando inibição do crescimento e do rendimento de milho crescido em associação com leucena (KARIM et al., 1991). Corroborando esses resultados, Pires et al. (2001) relataram que plântulas de milho crescidas em soluções contendo extratos de folhas de leucena em diferentes concentrações tiveram as raízes diminuídas.

Apesar dos relatos a respeito dos efeitos alelopáticos de mimosina, informações no tocante ao seu modo de ação são escassas. Neste aspecto, Rizvi e colaboradores observaram que mimosina inibiu vários parâmetros bioquímicos e fisiológicos em feijão. Eles constataram que o aleloquímico inibiu o vigor das plântulas, a solubilização do amido, a atividade da amilase e a degradação de proteínas. Verificaram, ainda, que o composto alterou o balanço hormonal das plântulas levando à inibição do seu crescimento. Ainda neste contexto, Prasad e Subhashini (1994) também confirmaram que os efeitos inibitórios de mimosina na germinação das sementes e no crescimento das plântulas de arroz são mediados pelos seus efeitos sobre nitrato redutase, catalase, IAA-oxidase, peroxidase e suas isoenzimas. Experimentos realizados com o extrato aquoso de leucena sobre plântulas de milho revelaram que a atividade da peroxidase aumentou concomitantemente ao aumento da concentração de extrato aquoso (PIRES et al., 2001). A maior atividade enzimática, nas raízes, foi correlacionada com a presença de isoformas aniônicas (pI 4,99 e 4,86). Para esses autores os aumentos nas atividades das isoformas aniônicas das peroxidases sugerem que o possível mecanismo de ação da mimosina esteja relacionado à lignificação das raízes em decorrência do espessamento e redução do crescimento das mesmas.

O processo de lignificação

O processo de fortalecimento da parede celular, pela deposição de lignina, é conhecido como lignificação, o qual provê força mecânica aos caules protegendo as fibras de celulose da degradação química e biológica. A maioria das células diferenciadas cumpre funções especializadas até que morram, mas no caso do xilema sua função pode ser exercida até mesmo

depois da morte celular. Os elementos do xilema são envoltos inteiramente pela lignina, que confere resistência às forças de tensão provocadas pela coluna d’água, e também controla a permeabilidade da mesma (WHETHEN et al., 1998).

Lignina é um polímero formado a partir de monômeros de álcool cinamílico sendo que ocorrem variações nos seus tipos, dependendo de onde esta foi sintetizada. Nas gimnospermas, a lignina é composta primariamente de unidades de álcool coniferílico, e nas angiospermas, apresenta polímeros onde há igual proporção de álcoois coniferílico e sinapílico. Existe ainda, uma pequena proporção de álcool p–cumarílico em ambos os tipos de lignina. As ligações intermoleculares que formam estes polímeros também são bastante complexas, sendo que se atribui às ligações denominadas de pontes difenil a rigidez característica de paredes celulares em vegetais, em especial, em sua fase de maturação (WHETHEN et al., 1998).

Os precursores monoméricos da lignina são desidrogenados enzimaticamente, na parede, a radicais fenóxidos que se polimerizam espontaneamente rendendo um complexo líquido de ligações cruzadas entre monolignóis, proteínas e polissacarídeos. Peroxidases, presentes na maioria das plantas superiores, catalisa grande número de reações. Devido a diferentes isoformas que participam das reações, o papel definitivo das peroxidases não tem sido descrito. Isoformas aniônicas apresentaram níveis de atividades crescentes em concentrações mais elevadas do extrato. Diversos trabalhos têm sugerido que estas isoformas apresentam maior contribuição para a lignificação dos tecidos (LEWIS; YAMAMOTO, 1990; GASPAR et al., 1991). Uma das possibilidades se refere a afinidade que as peroxidases ligadas á parede celular têm por precursores de lignina. As peroxidases têm sido implicadas nessas ligações cruzadas por duas razões: foram localizadas nas paredes celulares de tecidos lignificantes e, catalisam a produção de moléculas ligadas à lignina, in vitro. A lignificação por peroxidases requer H2O2 como co-substrato, que tem sido localizado, histoquimicamente, em tecidos lignificantes e pode ser formado, in situ, pelas peroxidases atuando como NADH oxidases. Os citados autores verificaram que, em hipocótilos de abeto (Picea abies), a peroxidase foi localizada no xilema durante o espessamento secundário. Diante disso, tem sido sugerido que as reduções no crescimento das raízes estão associados a aumentos nos teores de lignina e aumento nas atividades de peroxidases (SANTOS et al., 2004).

A cinamil álcool desidrogenase (CAD), formadora do coniferil álcool, encontra-se no limite terminal da via de fenilpropenóides, o caminho mais conhecido para a síntese de lignina. Aumentos nas atividades desta enzima; da peroxidase ligada à parede celular — implicada no passo enzimático subseqüente que é a polimerização dos monolignóis — e da fenilalanina amônia liase (PAL) — primeira enzima comprometida com a síntese de compostos fenólicos — estão intimamente associadas com a síntese de lignina nas paredes celulares da maioria das

espécies vegetais (TAIZ; ZIEGER, 1998). Subseqüente aumento na síntese de dímeros de ácidos fenólicos na parede celular ocasionaria o estabelecimento de ligações rígidas de polissacarídeos, aumento da rigidez e síntese de lignina. Decorrente disso ocorreria inibição do crescimento das raízes (SANTOS et al., 2004).

Objetivos

A maioria das pesquisas em alelopatia refere-se apenas aos efeitos do aleloquímico na germinação e no crescimento da planta–teste, não considerando os eventos celulares relacionados às mudanças fisiológicas no sistema da planta. Assim, avaliando os efeitos deste aleloquímico na soja, informações a respeito do seu possível mecanismo de ação, mostrado na Figura 4, poderão ser obtidas.

Diante disto, os objetivos do presente trabalho foram: 1) analisar o crescimento e a biomassa das raízes de soja cultivada em solução nutritiva, sob ação de mimosina em diferentes concentrações; 2) determinar as atividades da fenilalalnina amônia liase e das peroxidases, solúvel e ligada à parede celular e 3) determinar os teores de lignina nas raízes.

Figura 4 - O suposto modo de ação da mimosina nas raízes de soja.

MIMOSINA

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Mimosine-inhibited soybean root growth, lignification and related enzymes

ANELIZDEBASTOSANDRADE;MARIA DE LOURDESLUCIOFERRARESE;

ALINEFINGERTEIXEIRA AND OSVALDOFERRARESE-FILHO

Correspondence to:

Maria de Lourdes Lucio Ferrarese Laboratory of Plant Biochemistry Department of Biochemistry University of Maringá Av. Colombo, 5790 87020-900, Maringá, PR BRAZIL E-mail: mllferrarese@uem.br Fax: +55 44 2633655

Mimosine-inhibited soybean root growth, lignification and related enzymes

ANELIZDEBASTOSANDRADE;MARIA DE LOURDESLUCIOFERRARESE∗;

ALINEFINGERTEIXEIRA AND OSVALDOFERRARESE-FILHO

Laboratory of Plant Biochemistry, Department of Biochemistry, University of Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringá, PR, Brazil

Abstract – Mimosine, an allelochemical exuded from roots of Leucaena leucocephala

(Lam.) de Wit presents a high inhibitory action to plant growth. To determine the possible phytotoxic mechanism of mimosine, its effects on phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5) and peroxidase (POD, EC 1.11.1.7) activities and lignin contents in soybean (Glycine max (L.) Merr.) roots have been investigated. Seedlings (3-d-old) were cultivated in half-strength Hoagland nutrient solution (pH 6.0), without or with 0.05 to 1.0 mM of mimosine in a growth chamber (25°C, 12L:12D photoperiod, irradiance of 280 µmol m-2 s-1) from 24 hr. In general, length, fresh weight and dry weight of roots decreased under the action of mimosine. Root growth inhibition has been associated to the reduction on the PAL and POD activities and lignin contents. Results showed the susceptibility of soybean to mimosine and reinforced the role that this non-proteic amino acid plays as a strong allelochemical. The present findings suggest that mimosine-induced inhibition in soybean roots may be due to its effects on PAL and POD by indicating a regulatory role for these enzymes as responsible for the allelochemical action.

Key Words – Allelopathy, lignin, mimosine, peroxidase, phenylalanine ammonia-lyase, root

growth, soybean.

INTRODUCTION

Plants are known to release organic compounds into the environment from their aerial or sub-aerial parts as exudates, volatiles, and/or decomposition residues. These secondary plant metabolites may accumulate in the soil environment and affect the growth and development of neighboring plants (Einhellig, 1995). This is called allelopathy, a natural power of plants to protect themselves through natural organic chemicals, and this is the case of Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit (Rizvi et al., 1999; Xuan et al., 2006).

Leucaena is the most productive and versatile multi-purpose legume tree in tropical agriculture (John and Narwal, 2003). It is widely recommended for agroforestry due to its fast growth rate, fodder, fuel and wood value, ability to fix nitrogen, and to improve the overall land productivity (Rizvi et al., 1999). This plant species has been used as cover crop to control weeds due to the presence of potential allelochemicals such as quercetin and gallic, protocatechuic, p-hydroxybenzoic, p-hydroxyphenylacetic, vanillic, ferulic, caffeic and p-coumaric acids (Budelman, 1988; Chou, 1990). However, the presence of a non-protein amino acid named mimosine (β-(3-hydroxy-4-pyridon-1-yl)-L-alanine) in its leaves and seeds (2 to 10% of dry weight) has been considered the main cause of allelopathy (Kuo et al., 1983; Chou and Kuo, 1986; Latitha et al., 1993; John and Narwal, 2003). Mimosine affects the growth of various plants such as lettuce (Lactuca sativa), rice (Oryza sativa), radish (Raphanus sativus), turnip (Brassica rapa), wheat (Triticum aestivum) and maize (Zea mays). In general, mimosine inhibits germination, seedling vigor, radicle growth, food mobilization, starch solubilization, proteins breakdown and enzyme activities (Prasad and Subhashini, 1994; Rizvi et al., 1999; Prates et al., 2000; Pires et al., 2001). Despite these reports, the knowledge on the mechanism action of mimosine is not fully understood.

Reduction on growing roots has been considered as one of the first effects of allelochemicals and, in some cases, it is associated with premature lignification of the cell walls (Sánchez et al., 1996; Santos et al. 2004; Böhm et al., 2006). Phenylpropenoid pathway is one of the most important metabolic routes due to its responsibility for the synthesis of phenolic compounds and of a large range of secondary plant products, including lignin. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) is considered as the primary enzyme of the phenylpropenoid biosynthetic pathway, and peroxidase (POD) within the cell wall, in either free or bound state, has been shown to be associated with monolignol polymerization and, therefore, with the lignin synthesis (Passardi et al., 2005). Up to the present, no reports on the effects of exogenous mimosine on soybean roots are available. Thus, the main question of the present work was whether mimosine affects PAL and POD activities and lignin contents of soybean (Glycine max) roots.

METHODS AND MATERIALS

General Procedures. Soybean (Glycine max (L.) Merr. cv. BRS-184) seeds, surface sterilized with 2% sodium hypochlorite for 5 min and rinsed extensively with deionized water, were dark-germinated (at 25°C) on three sheets of moistened filter paper. Twenty-five 3-day-old seedlings of uniform size were supported on an adjustable acrylic plate and transferred into a glass container (10 × 16 cm) filled with 200 ml of half-strength Hoagland’s solution (pH 6.0), without or with 0.05 to 1.0 mM of mimosine. The container was kept in a growth chamber (25°C, 12L:12D photoperiod, irradiance of 280 µmol m-2 s-1). Roots were measured at the beginning and at the end of experiments (24 hr). Fresh root weight was determined immediately after incubation and dry weight estimated after oven drying at 80°C, for 24 hr. Mimosine was purchased from Sigma Chemical Co. (St Louis, USA) and all other reagents used were of the purest grade available or chromatographic grade.

Enzymatic Assays. After incubation, all treated or untreated seedling roots were detached and enzymes were extracted. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) was extracted, as described by Ferrarese at al. (2000). Fresh roots (2 g) were ground at 4ºC in 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.8). Homogenates were centrifuged (2.200g, 15 min) and the supernatant was used as the enzyme preparation. The reaction mixture (100 µmoles sodium borate buffer, pH 8.7, and a suitable amount of enzyme extract in a final volume of 1.5 ml) was incubated at 40°C, for 5 min, for PAL activity assay. Fifteen µmoles of L-phenylalanine were added to start the reaction, which was stopped after 1 hr of incubation by the addition of 50 µl 5 N HCl. Samples were filtered through a 0.45 µm disposable syringe filter and analyzed (20 µl) with a Shimadzu® Liquid Chromatograph (Tokyo, Japan) equipped with a LC-10AD pump, a Rheodine® injector, a SPD-10A UV detector, a CBM-101 Communications Bus Module, and a Class-CR10 workstation system. A reversed-phase Shimpack® GLC-ODS (M) column (150 × 4.6 mm, 5 µm) was used at room temperature, with an equivalent pre-column (10 × 4.6 mm). The mobile phase was methanol:water (70%:30%) with a flow rate of 0.5 ml min-1. Absorption was measured at 275 nm. Data collection and integration were performed with Class-CR10 software (Shimadzu®, Tokyo, Japan). t-Cinnamate, the product of PAL, was identified by comparing its retention time with standard values. Parallel controls without L-phenylalanine or with t-cinnamate (added as internal standard in the reaction mixture) were performed as described elsewhere (Ferrarese et al., 2000). PAL activity was expressed as µmol t-cinnamate hr-1 g-1 of fresh weight.

Peroxidase (POD) was extracted from fresh roots (0.5 g) with 67 mM of phosphate buffer (5 ml, pH 7.0). The extract was centrifuged (2.200g, 5 min, 4°C), and the supernatant was used to determine the activity of soluble POD. For cell wall-bound POD isolation, the pellet was washed

with deionized water until no soluble POD activity was detected in the supernatant. Pellet was then incubated in 1 M of NaCl (2 ml, 1 hr, 4°C), and the homogenate was centrifuged (2.200g, 5 min). The supernatant contained the cell wall-(ionically)-bound POD. Guaiacol-dependent activities of the soluble and cell wall-bound POD were determined according to Cakmak and Horst (1991), with slight modifications. The reaction mixture (3 ml) contained 25 mM of sodium phosphate buffer, pH 6.8, 2.58 mM of guaiacol and 10 mM of H2O2. The reaction started by adding the enzyme extract into the phosphate buffer. The guaiacol oxidation was followed for 5 min at 470 nm, and the enzyme activity was calculated from the extinction coefficient (25.5 mM -1

cm-1) for tetraguaiacol. The blank consisted of a reaction mixture without enzyme extract and which absorbance was subtracted from the mixture with enzyme extract. POD activities were expressed as µmol tetraguaiacol min-1 g-1 fresh weight.

Lignin Quantification. After the incubation period, dry roots (0.3 g) were homogenized in 50 mM of potassium phosphate buffer (7 ml, pH 7.0) with mortar and pestle, and transferred into a centrifuge tube (Ferrarese et al., 2002). The pellet was centrifuged (1.400g, 4 min) and washed by successive stirring and centrifugation as follows: twice with phosphate buffer pH 7.0 (7 ml); × 3 with 1% (v/v) Triton®

X-100 in pH 7.0 buffer (7 ml); × 2 with 1 M of NaCl in pH 7.0 buffer (7 ml); × 2 with distilled water (7 ml); and × 2 with acetone (5 ml). Pellet was dried in an oven (60°C, 24 hr) and cooled down in a vacuum desiccator. The dry matter obtained was defined as a protein-free cell wall fraction. Further, all dry protein-free tissue was placed into a screw-cap centrifuge tube containing the reaction mixture (1.2 ml of thioglycolic acid plus 6 ml of 2 M HCl) and heated (95ºC, 4 hr). After cooling at room temperature, the sample was centrifuged (1.400g, 5 min) and the supernatant was discarded. The pellet was washed × 3 with distilled water (7 ml) and the product extracted by shaking (30ºC, 18 hr, 115 oscillations min-1) in 0.5 M of NaOH (6 ml). After centrifugation (1.400g, 5 min), the supernatant was stored and mixed with the supernatant obtained from the second pellet washed with 0.5 M of NaOH (3 ml). The combined alkali extracts were acidified with concentrated HCl (1.8 ml). The lignothioglycolic acid (LTGA) formed after 4 hr at 0ºC was recovered by centrifugation (1.400g, 5 min) and washed × 2 with distilled water (7 ml). The pellet was dried at 60°C, dissolved in 0.5 M of NaOH and diluted to yield an appropriate absorbance for spectrophotometric determination at 280 nm. Lignin was expressed as mg LTGA g-1 dry weight.

Statistical Design. The experimental design was completely randomized and each plot was represented by one glass container with twenty-five seedlings. Data are expressed as mean of three to five independent experiments ± S.E. Significant differences were verified by the one-way analysis of variance with GraphPad Prism package (Version 2.0, GraphPad Software Inc.,

USA, 1995). Differences between parameters were evaluated by the Dunnet´s multiple comparison test and P values <0.05 were considered as statistically significant.

RESULTS

Root lengths and root fresh weight and dry weight decreased with increasing concentrations in soybean seedlings grown during short-term exposure (24 hr) in nutrient solution containing mimosine (Table 1). The allelochemical inhibited the root lengths from 18.6 to 86.6% after 0.05 to 1.0 mM in comparison to control. Roots fresh weights were 14.8, 19.5 and 20.3% less than control for 0.25, 0.5 and 1.0 mM treatments, respectively. No significant changes in the fresh weight of roots exposed to mimosine at low concentrations (≤0.1 mM) were recorded. Roots dry weights were 16.7 to 45.0% less than control for all treatments.

Mimosine-affected PAL activities were significantly different from control (Figure 1). The enzymatic activities decreased 49.8 and 65.4% at 0.5 and 1.0 mM treatments, respectively. Mimosine at ≤0.25 mM was noninhibitory to PAL activity. A similar behaviour was also evident in soluble POD (Figure 2A). Enzyme activities decreased 26.4 and 36.3% at 0.5 and 1.0 mM of mimosine, respectively, when compared to untreated roots. The cell wall-bound POD activities (Figure 2B) decreased from 24.9 to 61.2% after 0.05 to 1.0 mM treatments, in comparison to control.

The allelochemical decreased significantly the lignin contents of soybean roots (Figure 3). Inhibition to the extent of 24.1 to 37.8% was observed over the control with 0.25 and 1.0 mM of mimosine. No significant changes in the lignin contents of roots exposed to mimosine at ≤0.25 mM were recorded.

DISCUSSION

This study demonstrates that the inhibition of the soybean root growth (Table 1) under mimosine treatment had been related to reductions on the PAL and POD activities and lignin contents (Figures 1 to 3).

Studies using mimosine concentrations ranging from 0.05 to 5.0 mM have shown inhibitory actions on the growth of many plant species. For example, the application of 10 and 20 ppm of mimosine resulted in significant inhibitory effects on the radicle growth of lettuce, radish, rice and turnip (Kuo et al., 1983; Tawata and Hongo, 1987). At 1.0 mM, aqueous solution of mimosine caused significant reduction on seed germination, radicle and plumule length of rape (Brassica campestris), radish, wheat (Triticum aestivum), bean (Phaseolus vulgaris) and mung

bean (Vigna mungo). The two last species were most susceptible (Rizvi et al., 1999). Significant inhibitions in seed germination and in root and shoot lengths and fresh weights of rice seedlings were verified under 0.5 mM of mimosine treatment (Prasad and Subhashini, 1994). As reported by Pires et al. (2001), the inhibition on the maize root growth by mimosine was proportional to the aqueous extract concentration (0.1 to 0.95 mM of allelochemical). More recently, Xuan et al. (2006) demonstrated that mimosine (0.25 to 5.0 mM) strongly suppressed the length of radicles and hypocotyls of bean, turnip, ryegrass (Lolium muliflorum), Bidens pilosa, Leucaena leucocephala and Mimosa pudica. Consistent with the above-quoted reports, mimosine (up to 1.0 mM) also reduced the soybean root growth and fresh and dry weights (Table 1) indicating the susceptibility of this plant species and reinforcing the role this amino acid plays as a strong allelochemical.

In plants, the physiological basis of the phytotoxicity of mimosine is not completely understood. Rizvi et al. (1999) have revealed that mimosine affected the physiological and the biochemical parameters in bean and mung bean. The allelochemical inhibited seedling vigor, food mobilization efficiency, starch solubilization, proteins breakdown, amylase activity and altered the hormonal balance of the seedlings, leading to an inhibition in their growth. It must be remarked that the discovery that mimosine decreased the lignin production (Figure 3) in association with reduction of the soybean root growth (Table 1) is of particular interest. It has been suggested that the lignin biosynthesis involves the polymerization of monolignols primarily derived from the phenylpropenoid pathway. It is also well established that PAL, the primary enzyme of the phenylpropenoid metabolism, regulates the production of phenolic compounds in this pathway (Boerjan et al., 2003). The PAL activity, which is believed to be the critical enzyme controlling the lignin cell wall deposition (Lewis et al., 1999), is lowered by treating soybean roots with high mimosine concentrations, in relation to those corresponding treatments without allelochemical (Figure 1).

A possible explanation for the inhibitory action of mimosine on PAL is that this allelochemical is a structural analog of L-tyrosine (Vickery and Vickery, 1981). It is possible that mimosine acts as L-tyrosine by inhibiting the protein biosynthesis due to its incorporation into polypeptide chains of the new protein (Prasad and Subhashini, 1994) or to competition with L-phenylalanine, the highly specific substrate of PAL (Koukol and Conn, 1961; Young and Neish, 1966). There are some evidences supporting these possibilities. First, mimosine is a pyridoxal antagonist, which inhibits the DNA replication and the protein synthesis (Dai et al., 1994) and blocks mitosis (Pires et al., 2001). Second, PAL is known to accept L-tyrosine as a poor substrate (Langer et al., 2001). The mechanism of the PAL reaction involves the prosthetic MIO (3,5-dihydro-5-methylidene-4H-imidazol-4-one) group in the active site of the enzyme.

This electrophilic group reacts with the amino group of L-phenylalanine, leading to the activation and breaking of the C-H bond and to the leaving-group expulsion. Catalytically active PAL contains the essential Tyr-loop in a loopin conformation, which seems to play an important role in regulation processes (Pilbák et al., 2006). In vitro, exogenous L-tyrosine inhibits the pure PAL activity (Koukol and Conn, 1961). Furthermore, inhibition experiments of PAL with synthetic cinnamic acid derivatives (Sato et al., 1982), phenol inhibitors and phenol/glycine synergistic inhibitors (Alunni et al., 2003) have revealed that the presence of a hydrophobic aromatic ring for binding interactions at the active site is essential for the inhibitory activity. However, further studies are required to elucidate these possible actions of mimosine by using a purified PAL from soybean roots.

As previously cited, PAL catalyzes the first step of the phenylpropenoid pathway that leads to the production of phenolics, such as ferulic, p-coumaric, caffeic and sinapic acids. Subsequent enzymatic steps produce monolignols, which are later polymerized by POD action to complete the lignification process. One of the noteworthy features of POD is its association with the cell elongation processes and with growth-restricting reactions. POD may induce the cell wall loosening and growth by elongation as well as cross-linking of cell wall components (Hawkins and Boudet, 2003; Passardi et al., 2005). As observed here, mimosine decreased the free and cell wall-bound POD activities of soybean roots (Figure 2). These inhibitions were associated to significant decrease on the root length and fresh and dry weights (Table 1) and reduction on the lignin content (Figure 3). The simplest explanation to evaluate the inhibitory mechanism of mimosine on the POD activities may be the fact that this allelochemical is a strong iron chelator (Vickery and Vickery, 1981; Kulp and Vulliet, 1996; Xuan et al., 2006). Structurally, POD contains an iron (III) protoporphyrin IX (protohemin) prosthetic group located at the active site. This metal center is essential for the catalytic activity of the enzyme involving exchanges of electrons and protons (Ros-Barceló et al., 2004; Veitch, 2004). The metal-chelating ability of the 3-hydroxy-4-oxo function of the pyridone ring in mimosine (Ward and Harris, 1976) may possibly disturb the action of POD by reducing its activity. There are evidences supporting this hypothesis. At 0.25 and 0.5 mM, mimosine inhibited significantly the POD activity and suppressed the synthesis of its isoenzymes in rice (Prasad and Subhashini, 1994). Chelation of iron may be the possible mechanism of mimosine since other iron-containing enzymes, such as nitrogenase, nitrate reductase, and catalase have been inhibited (Prasad and Subhashini, 1994; Rizvi et al., 1999).

It is well known that lignification plays important roles in plant growth. Lignin deposition occurs during secondary plant cell wall development. After the stem of a given plant stops growing in length, lignin deposition acts to harden the stem walls. This process creates structural

support, enabling increased growth in height (Rogers and Campbell, 2004). As observed here, the lignin content decreased (Figure 3), concomitant to PAL (Figure 1) and POD activities (Figure 2) and root growth (Table 1) under the action of mimosine. Based on these results, it seems reasonable to suppose that, in the presence of mimosine, decreases on the PAL activity may reduce the production of phenolic acids. This is plausible since decreases on the PAL activity is suggested as a regulatory mechanism for the production of ferulic, p-coumaric, caffeic and sinapic acids in the phenylpropenoid pathway (Matsuki, 1996; Passardi et al., 2005). Taking into account that these compounds are not available for POD in the polymerization steps, a further reduction on the lignin synthesis of cell walls has been associated with restricted root growth. In short, the results obtained in this work indicate that, at least for soybean, the PAL and POD root activities are sensitive to mimosine, which data suggest a regulatory role for these enzymes as responsible for the allelochemical action.

Acknowledgements - This work was financially supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). O. Ferrarese-Filho and M.L.L. Ferrarese are researchers fellows of CNPq. A.B. Andrade would like to thank Araucaria Foundation (PR, Brazil) for providing a scholarship. A.F. Teixeira is the recipient of CNPq. The authors warmly thank Aparecida M. D. Ramos and Gisele A. Bubna for technical assistance.