UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
RENATA MOREIRA ACUNHA
EFEITOS DA FOTOBIOMODULAÇÃO NO ESTRESSE OXIDATIVO E SEU IMPACTO SOBRE A ATROFIA MUSCULAR POR DESNERVAÇÃO.
Campinas 2020
RENATA MOREIRA ACUNHA
EFEITOS DA FOTOBIOMODULAÇÃO NO ESTRESSE OXIDATIVO E SEU IMPACTO SOBRE A ATROFIA MUSCULAR POR DESNERVAÇÃO.
Orientador: Prof. Dr. Humberto Santo Neto
Campinas 2020
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Celular e
Estrutural, na área de Anatomia.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE A VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA RENATA MOREIRA ACUNHA E ORIENTADA PELO HUMBERTO SANTO NETO
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Effects of photobiomodulation in oxidative stress and its impact on muscle atrophy by denervation Palavras-chave em inglês:
Muscle atrophy Oxidative stress
Área de concentração: Anatomia
Titulação: Mestra em Biologia Celular e Estrutural Banca examinadora:
Humberto Santo Neto [Orientador] Fabio Montico
Adriana Pertille
Data de defesa: 29-05-2020
Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-0466-1669 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/4151760462976107
Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Acunha, Renata Moreira, 1994-
Ac93e Acu Efeitos da fotobiomodulação no estresse oxidativo e seu impacto sobre a atrofia muscular por desnervação / Renata Moreira Acunha. – Campinas, SP : [ s.n.], 2020.
Acu Orientador: Humberto Santo Neto.
Acu Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Acu . Atrofia muscular. 2. Estresse oxidativo. I. Santo Neto, Humberto, 1953-. 1 II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Campinas, 29 de maio de 2020.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Humberto Santo Neto (Orientador) Prof. Dr. Fabio Montico
Prof. Dra. Adriana Pertille
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia da Unicamp.
Dedico este trabalho aos meus pais, que nunca mediram esforços para me apoiar na realização deste sonho.
AGRADECIMENTOS
A minha felicidade em concluir esta etapa é do tamanho da gratidão que eu sinto pelas pessoas que estiveram ao meu lado, sem as quais essa realização não seria possível. Afinal, ninguém caminha sozinho.
Agradeço primeiro à Deus, a força maior sempre presente em minha vida, que me mantém firme em busca do meu propósito, que me permite ir em busca dos meus sonhos e me acolhe quando eu preciso. A minha fé e as minhas conversas com Ele foram essenciais nesta conquista.
Aos meus pais, Daniel Rios Acunha e Fatima Moreira Acunha, a minha eterna gratidão. Por não hesitarem em me apoiar na minha caminhada longe de casa, por sempre transformarem a saudade em força, por todo o empenho, todo suporte, por todas as vezes em que eu pensei em desistir e vocês me mantiveram firme. Obrigada meus pais, pelo grande amor e pelas lições de vida. Amo-os infinitamente.
Ao meu companheiro e amigo, Ettore Vanzetti, pelo amor, carinho, suporte e compreensão. Obrigada por sempre me lembrar que “tudo vai dar certo” e pelo incentivo constante. Este é apenas o começo de uma longa caminhada. Que venham muitas conquistas em nossas vidas!
Ao meu orientador, prof. Dr. Humberto Santo Neto, pelas lições, pela confiança, por sempre acreditar em mim e me permitir viver os desafios que me foram propostos nestes dois anos. Pela EMPATIA, conselhos e pela orientação sem a qual este trabalho não teria sentido. Muito obrigada!
À profa. Dra. Maria Julia Marques, por ser uma inspiração, pelo suporte e auxílio durante a realização deste trabalho.
À Jéssica Silva Ferreira Bertin, por dedicar dias e dias a me ensinar, compartilhar e ajudar. São poucas as pessoas que estendem a mão, são poucas as que se dedicam a ajudar o próximo. Pela dedicação, inspiração, paciência, apoio e pela amizade, muito obrigada.
“..Meu precioso filho. Eu te amo e jamais te deixaria nas horas da tua prova e do teu sofrimento. Quando vistes na areia, apenas um par de pegadas, foi exatamente aí, que eu te carreguei nos meus braços”. (Autor desconhecido)
Aos amigos e colegas Marcos Maciel Júnior e Catharina Nucci Martins, pelo companheirismo e pela troca de experiências, pelo suporte e pela amizade. Vocês foram (e são) essenciais!
À Prof. Dra. Samara Camaçari de Carvalho, obrigada pela paciência, ensinamentos e auxílio na execução deste trabalho.
Ao Prof. Dr. João Cleber Theodoro de Andrade, por ser a minha inspiração, sem a qual eu não estaria realizando este sonho.
À Prof. Dra. Elaine Minatel pela confiança, pelo exemplo e pelos ensinamentos durante o Programa de Estágio Docente.
A todos os Docentes do Departamento de Anatomia da UNICAMP, pelo empenho e responsabilidade nas disciplinas da pós-graduação, pelo suporte na formação dos alunos e pela confiança.
Aos técnicos do departamento de Anatomia Paulo Afonso Bernardes,
Walter Ferreira e Roberto Narciso Basso, pela disposição e suporte nas
aulas e estudos.
À banca examinadora Prof. Dr. Fabio Montico e Adriana Pertille por aceitarem o convite e pela colaboração.
À empresa IBRAMED pela parceria neste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural da
Unicamp, pelo comprometimento e excelência na formação de seus alunos.
Ao programa PED da instituição, pela oportunidade de vivenciar experiências únicas e construir aprendizado, compartilhando-o com docentes e alunos de graduação.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
“O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhada. Caminhando e semeando, no fim, terás o que colher”.
RESUMO
Fotobiomodulação (FTBM) baseia-se na utilização de luz vermelha ou infravermelha de baixa intensidade para induzir reações fotoquímicas a nível celular. O emprego da FTBM tem se mostrado eficaz em melhorar algumas condições adversas do músculo esquelético, dentre as quais a atrofia muscular causada por desnervação total. Os mecanismos moleculares envolvidos na atrofia muscular não são completamente elucidados, mas sabe-se que o estresse oxidativo desempenha algum papel na mesma. Sabe-se também que a FTBM diminui o estresse e, desta forma, restaura o balanço oxidativo em outras condições biológicas. Esse estudo teve como objetivo examinar: i) os efeitos da FTBM sobre a atrofia muscular decorrente de desnervação parcial e ii) a correlação entre a atenuação da atrofia muscular pela FTBM e estresse oxidativo. Para isto, camundongos da linhagem C57BL/10 foram anestesiados e tiveram o músculo tibial anterior direito parcial ou totalmente desnervado através de, respectivamente, esmagamento ou secção total do nervo isquiático. Os animais foram divididos em 5 grupos, sendo cada grupo subdividido em 2 grupos de 7 e 14 dias. Grupo ST: animais submetidos a secção total do nervo isquiático direito sem tratamento (n=20); Grupo E: animais submetidos ao esmagamento do nervo isquiático direito sem tratamento (n=20); Grupo STL: animais submetidos a secção total do nervo isquiático direito e tratados com FTBM (n=20); Grupo EL: animais submetidos ao esmagamento do nervo isquiático direito e tratados com FTBM (n=20); Grupo CT: sem lesão ou tratamento algum (n=10). A aplicação do laser foi realizada através do aparelho de diodo GaAlAs (comprimento de onda de 830 nm/ 4 J/cm2) diariamente por 16 segundos durante 7 ou 14 dias. Ao final, os animais sofreram eutanásia através de superdosagem de anestesia e o músculo tibial anterior direito foi retirado. A atrofia muscular foi avaliada por histomorfometria em cortes histológicos e o estresse oxidativo (iNOS e 4-HNE) por imunoblotting. Os resultados mostram que a FTBM atenuou a atrofia muscular em músculos parcialmente desnervados e que esse efeito da FTBM parece não se fazer via estresse oxidativo. Sugere-se que a FTBM seja empregada como método adjunto no tratamento de atrofia muscular decorrente de desnervação parcial.
ABSTRACT
Photobiomodulation (FTBM) is a therapy in which low intensity red or infrared light is used to induce photochemical reactions at the cellular level. FTBM has been shown to be effective in improving some adverse conditions of skeletal muscle, including muscle atrophy caused by total denervation. Although the molecular mechanisms involved in muscle atrophy are not completely elucidated, the oxidative stress has been shown to play some role in that. FTBM is also known to decrease stress and, therefore, restore the oxidative balance in other biological conditions. Hence, this study aimed to examine: i) the effects of FTBM on muscle atrophy induced by partial denervation and ii) whether oxidative stress is modified by FTBM during prevention of atrophy by partial and total denervation. Mice of the C57BL / 10 strain were anesthetized and had the right anterior tibial muscle partially or totally denervated through, respectively, crushing or total section of the sciatic nerve. The animals were divided into 5 groups, each group being subdivided into 2 groups of 7 and 14 days. ST Group: animals submitted to total section of the right sciatic nerve without treatment (n = 20); Group E: animals submitted to right sciatic nerve crush without treatment (n = 20); STL group: animals subjected to full section of the right sciatic nerve and laser-treated (n = 20); EL group: animals subjected to right sciatic nerve crush and laser-treated (n = 20); Group CT: no injury or treatment (n = 10). The laser application was performed through the GaAlAs diode device (wavelength 830 nm / 4 J / cm2) daily for 16 seconds for 7 or 14 days. At the end, animals were euthanized through an overdose of anesthesia and the right anterior tibial muscle was excised. Muscle atrophy was assessed by histomorphometry in histological sections and oxidative stress (iNOS and 4-HNE) by immunoblotting. The results show that FTBM partially attenuated muscle atrophy in denervated muscles. Oxidative stress does not seem to be related to the attenuation of muscle atrophy. It is suggested that FTBM could be used as an adjunct method in the treatment of muscular atrophy resulting from partial denervation.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Posicionamento do animal durante aplicação do laser...23 FIGURA 2 – Área de secção transversal das fibras musculares do músculo tibial anterior direito após 7 dias de desnervação...27 FIGURA 3 – Área de secção transversal das fibras musculares do músculo tibial anterior direito após 14 dias de desnervação...29 FIGURA 4 – Western Blot do músculo tibial anterior após desnervação parcial e total (4-HNE)...31 FIGURA 5 – Western Blot do músculo tibial anterior após desnervação parcial e total (iNOS) 7 dias...32 FIGURA 6 – Western Blot do músculo tibial anterior após desnervação parcial e total (iNOS) 14 dias...33
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP – Trifosfato de adenosina CT – Grupo Controle
E – Grupo Esmagamento
EL – Grupo Esmagamento tratado com Laser FTBM - Fotobiomodulação
GaAlAs - Arseneto de Gálio e Alumínio
GAPDH - Gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase HE – Hematoxilina e Eosina
IL-1β - Interleucina-1 Beta IL-6 - Interleucina-6
iNOS – Óxido Nítrico Sintase Indutível kDa – Kilodalton
MyoD - Fator de Diferenciação Miogênica NM – Nanômetros
NO – Óxido Nítrico
NOS – Óxido Nítrico Sintase ONOO- - Peroxidonitrito
PGC-1α - Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha RNA – Ácido Ribonucleico
ST – Grupo Secção Total
STL – Grupo Secção Total tratado com Laser TGF-β- Fator de Crescimento Transformador Beta TNF-α- Fator de Necrose Tumoral Alfa
SUMÁRIO
1INTRODUÇÃO ... 14
1.1 FOTOBIOMODULAÇÃO: efeitos sobre tecidos orgânicos ... 14
1.2 ATROFIA MUSCULAR: Aspectos Biológicos e Clínicos. ... 15
1.3 ATROFIA MUSCULAR E ESTRESSE OXIDATIVO ... 16
1.4 FOTOBIOMODULAÇÃO E ESTRESSE OXIDATIVO ... 19
2 OBJETIVO ... 20
3 MATERIAIS E MÉTODOS... 21
3.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 21
3.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO PARA INDUÇÃO DA ATROFIA ... 21
3.3 APLICAÇÃO DO LASER ... 22
3.4 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS E OBTENÇÃO DO MÚSCULO TIBIAL ANTERIOR ... 23
3.5 AVALIAÇÃO DA ATROFIA MUSCULAR ... 24
3.6 AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO (IMMUNOBLOTTING 4-HNE E INOS) ... 24 3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 25 4RESULTADOS ... 26 4.1 ATROFIA MUSCULAR ... 26 4.1.1 Análise histomorfométrica ... 26 4.2 ESTRESSE OXIDATIVO ... 30
4.2.1 Quantificação de peroxidação lipídica (4-HNE) por Immunoblotting ... 30
4.2.2 Quantificação de iNOS por Immunoblotting ... 32
5 DISCUSSÃO ... 34
5.1 SOBRE O PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 34
5.2 SOBRE OS RESULTADOS ... 35
5.2.1 Mitigação da atrofia por desnervação parcial do músculo tibial anterior: relevância biológica e clínica. ... 35
5.2.2 Mitigação da atrofia pela modulação do estresse oxidativo ... 37
6 CONCLUSÃO ... 40
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 41
ANEXO A ... 48
1 INTRODUÇÃO
1.1 FOTOBIOMODULAÇÃO: efeitos sobre tecidos orgânicos
Entende-se por fotobiomodulação (FTBM), a utilização de luz vermelha ou infravermelha de baixa intensidade para induzir uma reação fotoquímica a nível celular, com finalidade terapêutica. Também conhecida por terapia com luz de baixo nível, laserterapia de baixa intensidade ou terapia de fotobioestimulação, utiliza-se de luz com comprimentos de onda entre 600-1200 nm (DODD et al., 2018; HENNESSY e HAMBLIN, 2016).
O exato mecanismo de ação da FTBM sobre o tecido biológico não está completamente elucidado. Sabe-se, contudo, que o feixe de luz promove interação com o tecido alvo através da fotoexcitação de cromóforos, sendo que o citocromo c oxidase é o principal fotorreceptor de luz vermelha e infravermelha, presente na mitocôndria. A interação entre a luz e o citocromo c oxidase resulta no aumento do fluxo de elétrons dessa molécula, culminando em aumento na síntese de ATP (KARU, 1989; HUANG et al., 2011; WU et al., 2014; DE FREITAS et al., 2015).
Pesquisas acerca dos efeitos da FTMB sobre tecidos biológicos, bem como sua utilização na prática médica e fisioterápica são numerosas. Seus efeitos incluem analgesia, recuperação de lesão nervosa periférica, redução da resposta inflamatória, aceleração do processo de cicatrização em lesões cutâneas e reparação do tecido muscular esquelético. Admite-se que tais efeitos decorrem da ação do laser sobre a expressão de citocinas pró-inflamatórias tais como, interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-a). Há também observações de que o laser atua na proliferação, diferenciação e maturação de osteoblastos e de células tronco mesenquimais, células cardíacas e síntese de colágeno (STEIN et al., 2008; HENRIQUES; CAZAL; CASTRO, 2010; DE ALMEIDA et al., 2013; MARCOLINO et al., 2013; HAN et al., 2019).
O primeiro estudo da FTBM sobre tecido muscular esquelético foi efetuado por Mester e colaboradores. Deve-se a eles as observações inicias de que a FTBM atua positivamente sobre a fibra muscular esquelética, facilitando a regeneração das mesmas (MESTER et al., 1975). Ao longo das últimas 4 décadas, os efeitos da FTBM sobre o tecido muscular esquelético foram analisados em diversas situações experimentais. Conjuntamente, há demonstração de que a FTBM modula positivamente a atividade de enzimas antioxidantes e reduz o nível de estresse oxidativo durante o processo de reparo muscular, independente da causa da lesão.Há indícios de que a otimização da regeneração muscular pela FTBM se faz através de ativação de células
satélites, as células quiescentes da fibra muscular e precursoras destas e que a FTBM possui efeito anti-inflamatório superior a agentes farmacológicos. De fato, admite-se que o efeito mais proeminente da FTBM sobre o tecido muscular esquelético refere-se à atenuação da resposta inflamatória. É nesse aspecto que se concentra a maior parte das pesquisas bem como a utilização na prática fisioterápica (MESTER et al., 1971; CURY et al., 2013; DE ALMEIDA et al., 2014; SILVEIRA et al., 2016).
Sob o ponto de vista clínico, a FTBM tem sido amplamente utilizada em situações como fibromialgia, fadiga muscular, atenuação da espasticidade muscular, redução de fibrose após lesão muscular e prevenção de danos musculares (DE BRITO VIEIRA et al., 2014; MIRANDA et al., 2014; FERRARESI et al., 2015; KHALIGHI et al., 2016; BUBLITZ et al., 2016; SANTOS et al., 2016; HAN et al., 2019).
Portanto, encontra-se consolidado o emprego da FTBM em diversas situações biológicas.
1.2 ATROFIA MUSCULAR: Aspectos Biológicos e Clínicos.
O músculo estriado esquelético é o tecido mais abundante no corpo humano, sendo responsável por cerca de 50% da massa corporal. É o maior reservatório de proteína do corpo, portanto, fonte de aminoácidos. Trata-se de um tecido plástico com grande capacidade de adaptação, ou seja, responde rapidamente à estímulos que lhes sejam positivos ou negativos (POWERS et al., 2012; BONALDO e SANDRI, 2013; FRONTERA e OCHALA, 2015).
Como os demais tipos celulares, a fibra muscular sofre continuamente processos de síntese e de degradação de proteínas. O equilíbrio entre esses dois processos é fundamental para a homeostasia da fibra muscular. Quando a degradação de proteínas é superior à síntese, ocorre redução no volume da fibra muscular com consequente redução da força de contração. Esta condição é conhecida como atrofia muscular, podendo ser produzida por diversos estímulos externos ou internos. É o que ocorre, por exemplo, na imobilização ou repouso no leito, desnervação, redução da atividade respiratória durante ventilação mecânica, câncer, diabetes, aids, insuficiência renal, entre outras. Embora esteja claro que a atrofia muscular ocorre quando há aumento da degradação de proteínas e redução de síntese proteica, os detalhes dos processos que regulam esse desequilíbrio permanecem desconhecidos (BONALDO e SANDRI, 2012;
QIU et al., 2018).
As alterações moleculares envolvidas no processo atrófico diferem de acordo com a causa da atrofia, podendo variar inclusive, mesmo entre as causas de atrofia neurogênica. Por exemplo, a expressão da proteína MHC e do PGC-1α, reguladores da produção de ATP, decrescem após desnervação total e aumentam após a atrofia induzida por desnervação parcial. Outro exemplo refere-se à produção de radicais livres, elementos importantes no desenvolvimento da atrofia que difere substancialmente entre fibras musculares parcial e totalmente desnervadas (POLLOCK et al., 2017). Essas diferenças podem alterar a absorção dos fótons da FTMB pelo tecido muscular, fazendo com que a reposta à FTBM em atrofia causada por um tipo de agente não seja a mesma em atrofias resultantes de outras causas.
As atrofias musculares resultantes de lesões de nervos espinhais, decorrem usualmente de acidentes automobilísticos e laborais. Dentre elas, as mais importantes são aquelas resultantes de desnervação parcial, representadas por esmagamento de um nervo periférico e que representam cerca de 45% do total das lesões (KOUYOUMDJIAN, 2006). São de grande impacto sócio econômico, uma vez que produzem incapacidade funcional e redução da qualidade de vida, ocupando por isto, destaque na clínica reabilitadora, cujo objetivo é a prevenção ou atenuação da atrofia muscular (ROCHKIND, 2009; BONALDO e SANDRI, 2012; WANG et al., 2014; COHEN; NATHAN; GOLDBERG, 2015).
Em suma: os mecanismos moleculares envolvidos na atrofia dependem da causa desta e a atrofia produzida por desnervação parcial destaca-se pela sua importância clínica.
1.3 ATROFIA MUSCULAR E ESTRESSE OXIDATIVO
A instalação e a progressão da atrofia muscular está associada a uma gama de reações celulares e moleculares dentre as quais está o estresse oxidativo.
Há, nos seres vivos, durante os processos metabólicos, formação contínua e fisiológica de radicais livres, uma categoria de espécie reativa, assim denominada por representarem moléculas ou átomos cujos orbitais externos apresentam um elétron desemparelhado. Os radiais livres são essenciais para reações bioquímicas diversas na medida em que atuam como
mediadores na transferência de elétrons que resulta na formação de ATP. Em condições fisiológicas, a produção contínua de radicais livres é neutralizada por processos intracelulares, resultando em equilíbrio entre a gênese e a neutralização dos mesmos. A manutenção desse equilíbrio é fundamental para o funcionamento celular adequado. O desequilíbrio desse mecanismo, quer por produção excessiva de radicais livres, quer por disfunção na neutralização, resulta em acúmulo intracelular dos mesmos, caracterizando uma condição conhecida como estresse oxidativo (BROCCA et al., 2010; POWERS; NELSON; HUDSON, 2011; BARBIERI e SESTILI, 2012; ENOKI et al., 2016; ÁBRIGO et al., 2018).
Os primeiros estudos propondo que o estresse oxidativo está associado ao desenvolvimento da atrofia muscular foram realizados há quase três décadas (KONDO; MIURA; ITOKAWA, 1991; KONDO et al., 1992). Essa proposta baseou-se na observação de que a administração de vitamina E, um conhecido anti-oxidante, diminuí a atrofia em músculo de contração lenta como o sóleo. Estudos posteriores mostram que o estresse oxidativo induz alterações transcricionais específicas em genes relacionados à atrofia e sugeriram que a oxidação do RNA pode advir da elevação do ferro (HOFER et al., 2008; DALLA LIBERA et al., 2009). Vigora também a ideia de que o estresse oxidativo deprime a síntese proteica reduzindo a fosforilação, dificultando assim, a tradução do mRNA (POWERS; NELSON; HUDSON, 2011).
Um evento importante relacionado ao estresse oxidativo é a peroxidação lipídica, um processo no qual os radicais livres atacam lipídios da membrana celular, em especial aqueles com dupla ligação de carbono como, por exemplo, os ácidos graxos poli-insaturados (AYALA; MUÑOZ; ARGÜELLES, 2014; PHANIENDRA; JESTADI; PERIYASAMY, 2015).
Entre os diversos produtos resultantes da peroxidação lipídica, destaca-se o 4-hidroxilnonenal (4-HNE), cuja concentração celular em condições fisiológicas varia entre 0.1 e 0.3 µM, mas que em condições de estresse oxidativo aumenta para concentrações entre 10µM e 5mM (ESTERBAUER; SCHAUR; ZOLLNER, 1991; UCHIDA, 2003; CHEN e NIKI, 2006).
As evidências de que a peroxidação lipídica desempenha algum papel no desenvolvimento da atrofia muscular provém de estudos com modelos experimentais variados. Estudos iniciais indicaram que enzimas que controlam a síntese de lipídios citosólicos são reguladores negativos do crescimento da fibra muscular, uma vez que a supressão genética dessas enzimas resulta em hipertrofia muscular (HAQ et al., 2003). Posteriormente, observou-se que após a desnervação há, nas mitocôndrias, aumento da peroxidação lipídica e que isto antecede a perda de massa muscular (POLLOCK et al., 2017). A influência da peroxidação lipídica no desenvolvimento da atrofia foi também observada quando esta diminui
significativamente após tratamento com nicorandil, uma droga que diminui a peroxidação através de abertura dos canais de potássio sensitivos ao ATP (SANCHEZ-PEREZ et al., 2017). Outro fato é a observação de que o aumento da peroxidação nos tempos iniciais de desnervação estimulam mecanismos anti-atróficos, mas que com o passar do tempo isto se transformaria em mecanismos pró-atróficos (SCALABRIN et al., 2019).
Outro evento importante na correlação entre estresse oxidativo e atrofia muscular é desempenhado pelo oxido nítrico (NO; nitric oxide), uma molécula gasosa sintetizada a partir da L-arginina,através de uma reação mediada pela enzimaNO-sintase constitutiva (c-NOS) e induzível (i-NOS). Sob certas condições, há aumento na síntese de óxido nítrico, que ao reagir com ânions superóxido (O2-), formam moléculas de peroxidonitrito (ONOO-). A formação de peroxidonitrito resulta em decréscimo específico nos níveis de mRNA de MyoD, um importante fator de transcrição envolvido na diferenciação e manutenção da massa muscular. Além da atuação pela via MyoD, é possível que o NO atue no desenvolvimento da sarcopenia por outras vias moleculares (MATATA e GALIÑANES, 2002; DI MARCO et al., 2005).
Dentre as enzimas relacionadas à síntese de NO, a sintase induzida do óxido nítrico (iNOS; inducible nitric oxide) é a que se relaciona ao desenvolvimento da atrofia, o que tem sido observado em diversos modelos experimentais (HALL et al., 2011). São os casos das atrofias associadas a falência cardíaca e a doença pulmonar obstrutiva crônica, nas quais as citocinas circulantes no sangue levam a um aumento da iNOS em músculos esqueléticos, resultando em atrofia muscular (POWERS et al., 2012). De fato, aumento na expressão de iNOS tem sido observada em pacientes portadores de doença pulmonar obstrutiva crônica com baixa taxa de massa muscular (AGUSTI et al., 2004). Um fato que interessa a este estudo é que a atrofia muscular decorrente de inatividade muscular é mitigada em camundongos transgênicos com deficiência de iNOS (BAE et al., 2012).
Portanto, há evidências de que o estresse oxidativo tem, em alguma medida, papel no desenvolvimento da atrofia muscular.
1.4 FOTOBIOMODULAÇÃO E ESTRESSE OXIDATIVO
Admite-se que a FTBM pode diminuir o estresse e, portanto, restaurar o balanço oxidativo em diversas condições biológicas. A restauração do balanço, ao que parece, dar-se-ia pela ação de elevação do potencial da membrana mitocondrial pela FTBM. A elevação do potencial resultaria em aumento da produção de ATP e consequente em redução dos radicais livres (HENNESSY e HAMBLIN, 2016).
Relativo a iNOS, enquanto alguns estudos mostram elevação do nível (TUBY;MALTZ; ORON, 2006; MORIYAMA et al., 2009), outros estudos apontam diminuição da mesma quando o tecido é tratado pela FTBM (MANCHINI et al., 2014). Uma observação particularmente interessante para nosso estudo, uma vez que o mesmo envolve o tecido nervoso, advém da pesquisa de Kim e colaboradores, na qual foi demonstrado que a FTBM reduz significativamente a expressão de iNOS após a transecção da medula espinhal (KIM et al., 2017).
Há evidencias de que a FTBM pode reduzir a peroxidação lipídica, outro elemento importante dentro do quadro de estresse oxidativo, tanto em estados alérgicos do sistema respiratório quanto em músculo esquelético quando submetido a fadiga, assim como em traumas mecânicos e térmicos (GUARALDO et al., 2016; COSTA CARVALHO et al., 2016; RIBEIRO et al., 2015; DE OLIVEIRA et al., 2018).
Portanto, há demonstração de que a FTBM pode diminuir o estresse oxidativo através da modulação da iNOS e da peroxidação lipídica.
2 OBJETIVO
Considerando-se a importância clínica das atrofias decorrentes de desnervação parcial e que a resposta da fibra muscular atrófica à FTBM pode depender da causa da atrofia, este estudo tem como objetivo precípuo:
Examinar os efeitos da FTBM sobre a atrofia muscular provocada por desnervação parcial
Considerando-se ainda que o estresse oxidativo atua no desenvolvimento da atrofia e que o mesmo pode ser alterado pela FTBM:
Outro objetivo deste estudo é de examinar a correlação entre a atenuação da atrofia muscular pela FTBM e estresse oxidativo.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados camundongos com 3 meses de vida, fêmeas e machos, da linhagem C57BL/10, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) – UNICAMP. Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento de Biologia Celular e Estrutural IB/UNICAMP, e acomodados em caixas plásticas padronizadas sob condições ambientais controladas (12 horas de ciclo claro/escuro) com ração e água ad libitum. Todos os experimentos foram realizados em acordo com as diretrizes para experimentação animal de nossa Instituição, sob o protocolo nº 4838-1/2018 da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-IB- UNICAMP).
Foram empregados 90 animais, assim distribuídos: Grupo ST: animais submetidos a secção total do nervo isquiático direito sem tratamento (n=20); Grupo E: animais submetidos ao esmagamento do nervo isquiático direito sem tratamento (n=20); Grupo STL: animais submetidos a secção total do nervo isquiático direito e tratados com FTBM (n=20); Grupo EL: animais submetidos ao esmagamento do nervo isquiático direito e tratados com FTBM (n=20); Grupo CT: sem lesão ou tratamento algum (n=10). Com exceção do grupo Controle, todos os grupos foram subdivididos em dois grupos de 10 animais, cujo tempo de lesão ou tratamento foi de 7 e 14 dias. Para coleta dos músculos tibial anterior direito e esquerdo, os animais foram sacrificados através de aprofundamento anestésico.
3.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO PARA INDUÇÃO DA ATROFIA
Os animais foram anestesiados, com solução de cloridrato de cetamina 2% (Francotar®) e Cloridrato de Xilazina 2% (Virbaxyl®), na proporção de (1:1) diluídos em água bidestilada na proporção de (1:3) e injetado 0,015 ml/g por via intraperitoneal.
Após nos certificarmos de que os animais se encontravam em analgesia profunda, realizamos tricotomia na face posterior do membro pélvico direito e através de incisão cirúrgica foi exposto o nervo isquiático. O nervo foi esmagado com pinça sem ranhuras, três vezes de 20 segundos ou totalmente seccionado com tesoura microcirúrgica sob microscópio cirúrgico (DF Vasconcellos #11991) de acordo com GEARY e colaboradores (2017). Após a secção do nervo,
o coto proximal e distal foi afastado com a pinça. Para fechamento da ferida cirúrgica utilizamos fio de sutura (Mononylon 5-0 ETHICON). Depois de cessado o efeito do anestésico (após 2-3 horas) os camundongos foram levados ao biotério onde permaneceram em gaiolas de polietileno, com ração para roedores, água “ad libitum” e ciclos foto periódico de 12 horas claro e 12 horas escuro em condições ambiente com temperatura 24 ± 1°C.
3.3 APLICAÇÃO DO LASER
Os animais dos grupos tratados anteriormente citados (EL e STL), receberam tratamento com laser de baixa intensidade com os parâmetros descritos abaixo:
Antes da aplicação, o equipamento foi previamente enviado ao fabricante IBRAMED para calibração através de Multímetro digital MD-1700.
A aplicação do laser foi efetuada em um único ponto da superfície da face ântero-lateral da perna direita correspondente à projeção do músculo tibial anterior. A aplicação teve duração de 16 segundos. A caneta emissora de laser foi posicionada perpendicularmente ao ponto de aplicação onde foi realizada previamente a tricotomia (com animal sob efeito de anestesia antes da cirurgia de secção ou esmagamento do nervo isquiático) (FIGURA 1). O tratamento teve início 6 horas após o procedimento cirúrgico e foi realizado uma vez ao dia, durante 7 ou 14 dias consecutivamente. Durante a irradiação com laser, os animais não foram anestesiados, apenas imobilizados.
3.4 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS E OBTENÇÃO DO MÚSCULO TIBIAL ANTERIOR
Após 7 e 14 dias, os animais sofreram eutanásia através de superdosagem de anestesia por via intraperitoneal, de uma mistura de cloridrato de cetamina (130mg/kg Francotar, Virbac, São Paulo, Brasil) e cloridrato de xilazina (6,8mg/kg, 2%, Virbaxyl, Virbac). Os músculos tibiais anterior direito e esquerdo foram isolados e retirados. Os dez animais de cada grupo foram subdivididos em dois grupos com cinco animais para análises. Um grupo de animais (5) teve seus músculos tibiais anterior direito e esquerdo destinados à análise da atrofia muscular, através do método de histomorfometria. Para isto, o músculo foi fixado em suporte de madeira com Tragacanth® imerso em isopentano à -80ºC por 40 segundos e imediatamente colocado em nitrogênio líquido à -159ºC. Os músculos foram retirados do nitrogênio e armazenados à - 80ºC em Biofreezer (BioFreezerJouan, VX380). Estes músculos foram utilizados para obtenção de cortes histológicos que serviram para avaliação da atrofia muscular. O outro grupo de animais (5) teve seus músculos tibiais anterior direito e esquerdo estocados em tubos criogênicos no Biofreezer e foram destinados à análise de expressão de proteínas através de técnica de Immunoblotting. Os mesmos procedimentos foram adotados para os músculos dos animais do Grupo Controle.
3.5 AVALIAÇÃO DA ATROFIA MUSCULAR
Os cortes histológicos foram obtidos através de cortes transversais semi seriados com 8 μm de espessura feitos no terço médio do ventre muscular em criostato (Microm®-HS505E). Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE). Em seguida foram desidratados em séries de etanol, diafanizados em xilol e as lâminas montadas em meio Entellan® para observação em microscopia de luz. A captação de imagens foi realizada utilizando-se o fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400) com objetiva de 10X acoplado a um computador e vídeo-câmera (Nikon Express Series, Shinagawa, Tokyo, Japão). A área de secção transversal das fibras musculares foi avaliada com software Image-Pro Plus® Versão 6.0.0.260. O software Pxper® Versão 0.9.1.0 foi usado para exibir uma grade com medidas fixas sobre a imagem capturada do corte do músculo, onde o critério para seleção da fibra que foi avaliada era estar sob uma intersecção da grade. Para cada músculo, foram examinados 3 cortes sendo que em cada um deles foram avaliadas 100 fibras musculares.
3.6 AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO (IMMUNOBLOTTING 4-HNE E INOS)
Os músculos foram retirados do biofreezer e homogeneizados em tampão (Triton X-100 1%, tris-HCl 100 mM [pH 7,4], pirofosfato de sódio 100mM, fluoreto de sódio 100mM, ETDA 10mM, ortovanadato de sódio 10 mM, PMSF 2 mM) com inibidores de proteases em homogeneizador SONICADOR Sonics vibra-cellTM modelo CV18, operado em Amp1 60% por 30 segundos. Os extratos foram centrifugados a 11000 rpm à 4ºC por 20 minutos e o sobrenadante utilizado para análise por extrato proteico total. Utilizou-se do método Bradford (1976) para determinação da proteína total. As amostras de extrato proteico foram tratadas com tampão Laemmli (Tris 10mM, β-MercaptoEthanol, glicerol 10%, SDS 2% e azul de bromfenol 0,1%) e aquecidas em banho seco por 5 minutos a 95-100 ºC. Em seguida, 60 mg de proteína foi pipetado em gel de 15% SDS-poliacrilamida em aparelho para eletroforese da Bio-Rad (mini-Protean, BioRadLaboratories). A eletrotransferência do gel para a membrana de nitrocelulose (Hybond, AmershamBiosciences) foi realizada em 90 minutos a 120 V em aparelho de transferência (mini-Protean, Bio-RadLaboratories, Richmond, CA, EUA). As membranas foram incubadas com os anticorpos primários iNOS e 4-HNE diluídos em 10ml de
solução basal (Tris 10mM, NaCl 150mM e Tween-20 0,02%) contendo 1% de leite desnatado à 4ºC, durante 12 horas em agitador mecânico (Rocker II, BoekelScientific). As membranas foram lavadas com solução basal 3 vezes, 10 minutos cada lavagem e incubadas com os respectivos anticorpos secundários (Mouse e Rabit) por 90 minutos, em temperatura ambiente. Finalmente, as membranas foram lavadas com solução basal 3 vezes, 10 minutos cada lavagem e para detectar as bandas imunorreativas, as membranas foram expostas à solução de quimioluminescência (SuperSignal West Pico Chemiluminescente, Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, USA) por 5 minutos, seguida de exposição no G-BOX. A detecção das bandas imunofluorescentes e a quantificação foram feitas no aparelho G-Box Chemi através do software de aquisição de imagem GeneSnap (Syngene, Maryland-EUA). As densidades das bandas foram quantificadas pelo software de análise GeneTools (Syngene, Maryland-EUA), em seguida os dados foram transferidos para o programa Excel. Para a normalização dos dados obtidos, utilizou-se o controle interno através da incubação das amostras com o anticorpo Gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH).
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para verificação da normalidade dos dados foi utilizado o teste Shapiro-Wilk. Todos os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão. Todos os grupos experimentais foram comparados usando a análise de variância ANOVA de duas vias (seguido pelo teste de Sidak). Em todas as análises, os valores de P foram considerados estatisticamente significantes, apenas quando inferiores a 0,05 (P<0,05). Para todos os cálculos estatísticos foi utilizado o software GraphPadPrism® versão 6.01 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)
4 RESULTADOS
4.1 ATROFIA MUSCULAR
4.1.1 Análise histomorfométrica
Após 7 dias de desnervação (Figura 2), a área de secção transversal das fibras musculares do grupo cujo nervo foi esmagado (E) e do grupo cujo nervo foi totalmente seccionado (ST), foram respectivamente 56,5% e 60,87% menor (P<0.05) que aquela do grupo controle (CT) (E 855,25±87,36; ST 769,40±53,7; CT 1966,29±53,04). No grupo cujo nervo foi esmagado e o músculo tratado com FTBM (EL), a área de secção transversal das fibras musculares foi significativamente (P<0.05) maior que aquelas do grupo cujo nervo foi esmagado apenas (E) (EL 1633,21±55,32 vs E 855,25±87,36). No grupo em que o nervo foi seccionado e o músculo tratado com FTBM (STL), a área de secção transversal das fibras musculares foi significativamente (P<0.05) maior que aquelas de músculos do grupo cujo nervo foi seccionado e não tratado (ST) (STL 1646,72±171,21 vs ST 769,40±53,70).
FIGURA 2. Área de secção transversal das fibras musculares do músculo tibial anterior direito após 7 dias de desnervação. (A) Cortes histológicos transversais de fibras musculares coradas com
hematoxilina-eosina. Grupos: Controle (CT), Esmagamento (E), Esmagamento tratado com laser (EL), Secção Total (ST), e Secção Total tratado com laser (STL). Barra: 100 μm. (B) Área de secção transversal. Média ± desvio padrão. *** P<0.05 quando comparado os grupos Esmagamento (E), Esmagamento tratado com laser (EL), Secção Total (ST), e Secção Total tratado com laser (STL) com o grupo controle (CT). # P<0.05 quando comparado os grupos E com EL e ST com STL. A significância estatística foi determinada com ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Sidak para múltiplas comparações.
Após 14 dias de desnervação (Figura 3), a área de secção transversal das fibras musculares do grupo cujo nervo foi esmagado (E) e do grupo cujo nervo foi totalmente seccionado (ST), foram respectivamente 65% e 62% menor (P<0.05) que aquela do grupo controle (CT) (E 683,05±59,78; ST 734,33±38,27; CT 1966,29±53,04). No grupo cujo nervo foi esmagado e o músculo tratado com FTBM (EL), a área de secção transversal das fibras musculares foi significativamente maior (P<0.05) que aquelas do grupo cujo nervo foi esmagado apenas (E) (EL 1427,35±214,46 vs E 683,05±59,78). No grupo em que o nervo foi seccionado e o músculo tratado com FTBM (STL), a área de secção transversal das fibras musculares foi significativamente maior (P<0.05) que aquelas de músculos do grupo cujo nervo foi seccionado e não tratado (STL 1307,26±155,78 vs ST 734,33±38,27).
FIGURA 3. Área de secção transversal das fibras musculares do músculo tibial anterior direito após 14 dias de desnervação. (A) Cortes histológicos transversais de fibras musculares
coradas com hematoxilina-eosina. Grupos: Controle (CT), Esmagamento (E), Esmagamento tratado com laser (EL), Secção Total (ST), e Secção Total tratado com laser (STL). Barra: 100 μm. (B) Área de secção transversal. Média ± desvio padrão. *** P<0.05 quando comparado os grupos Esmagamento (E), Esmagamento tratado com laser (EL), Secção Total (ST), e Secção Total tratado com laser (STL) com o grupo controle (CT). # P<0.05 quando comparado os grupos E com EL e ST com STL. A significância estatística foi determinada com ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Sidak para múltiplas comparações.
4.2 ESTRESSE OXIDATIVO
4.2.1 Quantificação de peroxidação lipídica (4-HNE) por Immunoblotting
O nível de 4-HNE não foi significativamente diferente entre os músculos dos animais cujo nervo foi esmagado e os músculos dos animais do grupo controle, tanto aos 7 (3.13±0.09 UA vs 2.85±0.34 UA), quanto aos 14 dias (3.47± 0.81 UA vs 3.38± 0.51 UA). Também não houve diferença significativa no nível de 4-HNE entre os músculos de animais cujos nervos foram totalmente seccionados e aqueles do grupo controle, tanto aos 7 (3.50±0.35 UA vs 2.85±0.34 UA), quanto aos 14 dias (3.88±1.14 UA vs 3.38± 0.51 UA).
O nível de 4-HNE não foi significativamente diferente entre os músculos dos animais cujo nervo foi esmagado e tratado com FTBM e aqueles dos animais cujo nervo foi esmagado e não tratado, tanto aos 7 (2.71±0.23 UA vs 3.13±0.09 UA) quanto aos 14 dias (3.64±1.07 UA vs 3.47± 0.81 UA). No grupo de animais cujos nervos foram seccionados e tratados com FTBM, os níveis de 4-HNE não foram significativamente diferentes daqueles do grupo seccionado não tratado, tanto aos 7 (3.63±0.29 UA vs 3.50±0.35 UA) quanto aos 14 dias (3.98±1.15 UA vs 3.88±1.14 UA) (Figura 4).
FIGURA 4. Western Blot do músculo tibial anterior após desnervação parcial e total. (A) Após 7 dias. (B)
Após 14 dias. Bandas do ácido graxo 4-HNE. Grupos: Controle (CT), Esmagamento (E), Esmagamento tratado com Laser (EL), Secção total (ST), Secção total tratado com Laser (STL). Os números indicados à esquerda representam os pesos moleculares (kDa) das correspondentes proteínas. Não houve diferença significativa entre os grupos. A significância estatística foi determinada com ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Sidak.
4.2.2 Quantificação de iNOS por Immunoblotting
Após 7 dias de desnervação (Figura 5), o nível de iNOS nos músculos que foram desnervados sofreu elevação significativa (P<0.05) tanto naqueles em que houve esmagamento (0.39±0.06 UA vs. 0.69±0.05 UA) quanto nos que tiveram o nervo seccionado (0.39±0.06 UA vs 0.83±0.15 UA). O nível de iNOS não se mostrou significativamente diferente entre: i) os músculos dos animais cujo nervo foi esmagado e o músculo tratado com FTBM e aqueles de animais cujo nervo foi esmagado e não tratado (0.50±0.09 UA vs 0.69±0.05 UA) e ii) os músculos dos animais cujos nervos foram seccionados e os músculos tratados com FTBM, e aqueles dos animais cujo nervo foi seccionado não tratado (0.82±0.16 UA vs 0.83±0.15 UA).
FIGURA 5. Western Blot do músculo tibial anterior após desnervação parcial e total aos 7 dias.
Bandas da proteína iNOS (linha superior) e GAPDH (linha inferior). Grupos: Controle (CT),
Esmagamento (E), Esmagamento tratado com Laser (EL), Secção total (ST), Secção total tratado com Laser (STL). * P<0.05 quando comparado CT com E e ** P<0.05 quando comparado CT com ST e STL. Gráfico representando os níveis de iNOS normalizados pelo GAPDH. A significância estatística foi determinada com ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Sidak.
Após 14 dias de desnervação (Figura 6), não houve diferença no nível de iNOS entre os músculos do grupo controle e os músculos dos animais cujos nervos foram lesados tanto por esmagamento (0.12±0.02 UA vs 0.16±0.02 UA) quanto por secção total (0.12±0.02 UA vs 0.21±0.11 UA;).
O nível de iNOS não se mostrou significativamente diferente entre: i) os músculos dos animais cujo nervo foi esmagado e o músculo tratado com FTBM e aqueles de animais cujo nervo foi esmagado e não tratado (0.17±0.09 UA vs 0.16±0.02 UA) e ii) os músculos dos animais cujos nervos foram seccionados e o músculo tratado com FTBM, e aqueles dos animais cujo nervo foi seccionado não tratado (0.20±0.06 UA vs 0.21±0.06 UA).
FIGURA 6. Western Blot do músculo tibial anterior após desnervação parcial e total aos 14 dias. Bandas da
proteína iNOS (linha superior) e GAPDH (linha inferior). Grupos: Controle (CT), Esmagamento (E), Esmagamento tratado com Laser (EL), Secção total (ST), Secção total tratado com Laser (STL). Não houve diferença entre os grupos. Gráfico representando os níveis de iNOS normalizados pelo GAPDH. A significância estatística foi determinada com ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Sidak.
5 DISCUSSÃO
5.1 SOBRE O PROTOCOLO EXPERIMENTAL
A FTBM surgiu como tratamento coadjuvante não invasivo, indolor e de baixo custo em diversas situações. Em decorrência disso, inúmeros estudos têm sido feitos e consequente sabe-se que os efeitos fotobioestimulantes do laser são dependentes do comprimento de onda utilizados,presentes em um intervalo que vai de 600 até 1200 nm (KARU 1989; KARU 1999; DE FREITAS et al., 2015).
Tendo em vista o amplo intervalo de intensidade em que o laser atua nos estudos relacionados à aplicação do mesmo, é necessário que se leve em consideração o protocolo aplicado, ou seja, a dosagem, tempo de aplicação, comprimento de onda, tecido utilizado, entre outras variáveis, visto que as respostas biológicas variam amplamente em função destas. Há, na literatura, exemplos de efeitos opostos mesmo em estudos onde foram utilizados tecidos similares.
No presente estudo, utilizamos o comprimento de onda de 830 nm, baseado no fato de que o mesmo está dentro dos parâmetros fotobioestimulantes e é eficiente para produzir efeitos em músculos como tibial anterior, gastrocnêmio, quadríceps e sóleo em estudos experimentais (NAKANO et al., 2009; VATANSEVER et al., 2012; ASSIS et al., 2013; RODRIGUES et al., 2013; MANTINEO; PINHEIRO; MORGADO, 2014; MACEDO et al., 2015; MANDELBAUM et al., 2016).
Estabeleceu-se o tempo de 7 dias baseado no estudo de BAE e colaboradores (2012) e o de 14 dias e frequência de tratamento (aplicação diária) no estudo de Nakano e colaboradores (2009) e no estudo de Mandelbaum e colaboradores (2016), nos quais a atrofia muscular foi examinada. Por sua vez, a densidade de energia (4 J/cm2), baseou-se em um estudo, onde o mesmo foi utilizado para verificar regeneração muscular no músculo tibial anterior de ratos (MACEDO, 2012).
5.2 SOBRE OS RESULTADOS
5.2.1 Mitigação da atrofia por desnervação parcial do músculo tibial anterior: relevância biológica e clínica.
Os efeitos da FTBM sobre a instalação e progressão da atrofia já foram examinados em estudos prévios (NAKANO et al., 2009; LAKYOVA et al., 2010; MONICI et al., 2013; MANDELBAUM et al., 2016). Neles, a atrofia foi examinada em vários tipos de músculo e induzida por diferentes métodos como desuso, isquemia-reperfusão sanguínea e diminuição da força gravitacional, além de desnervação total (FERREIRA, 2017). Em todos os casos, a FTBM mostrou-se, embora em grau variado, capaz de mitigar a atrofia muscular.
Neste estudo observamos que a FTBM também é capaz de mitigar a atrofia muscular produzida por esmagamento de nervo, ou seja, por desnervação parcial do músculo tibial anterior. Julgamos esse resultado como sendo de alguma relevância, tanto do ponto de vista biológico quanto clínico.
Sob o ponto de vista biológico, a relevância assenta-se em dois aspectos. O primeiro relaciona-se ao fato de que algumas propriedades das fibras musculares variam dependendo do tipo das mesmas. Por exemplo, a viscosidade do sarcoplasma em fibras musculares de contração rápida é cerca de 3-4 vezes menor que em músculos de contração lenta e o volume mitocondrial é bem maior nestas últimas quando comparados às primeiras (MISHRA et al., 2015; SOMMER, 2019). Não é impossível que tanto a viscosidade do sarcoplasma quanto o teor de mitocôndrias possam influenciar o índice de absorção dos fótons provenientes da FTBM pelo citocromo c oxidase (SOMMER, 2019). Enquanto a maioria dos estudos anteriores utilizou-se de músculos com predomínio de fibras de contração lenta, como o músculo sóleo, o músculo por nós examinado é composto predominantemente de fibras de contração rápida. Nisto, portanto, nosso resultado apresenta-se de forma inédita.
O segundo aspecto de interesse biológico refere-se a natureza do agente causador da atrofia. Há relatos de que as alterações moleculares nas fibras musculares que acompanham o desenvolvimento da atrofia variam dependendo da causa desta última. As alterações musculares variam mesmo entre as atrofias neurogênica. Por exemplo, a expressão de PGC-1α, regulador da produção de ATP, decresce após desnervação total, mas aumenta durante a atrofia induzida por desnervação parcial. Outro exemplo é o teor de radicais livres, que desempenham papel central no desenvolvimento da atrofia e que diferem substancialmente entre fibras musculares
parcial e totalmente desnervadas (POLLOCK et al., 2017). Em apenas um dos estudos anteriores a atrofia foi induzida por desnervação parcial (MANDELBAUM et al., 2016).
É possível, pois, que na FTBM a interação da luz com os cromóforos e outras moléculas varie dependendo do tipo de fibra muscular e da forma como a atrofia foi induzida. Assim sendo, parece-nos que os efeitos da FTBM descritos nos estudos prévios não podem ser extrapolados para o caso da atrofia produzida por desnervação parcial do músculo tibial anterior, que foi objeto deste estudo, pois dentre aqueles há apenas um estudo referente aos efeitos da FTBM em atrofia do músculo tibial anterior produzida por desnervação parcial (MANDELBAUM et al., 2016). Ao estudar a atrofia decorrente de desnervação parcial, nosso estudo expande o conhecimento da ação da FTBM em atrofia muscular. Assim, novamente nosso estudo apresenta algum ineditismo e relevância.
A relevância clínica desse estudo também se assenta em dois aspectos. O primeiro refere-se ao músculo examinado, o tibial anterior, que está diretamente envolvido no quadro clínico da neuropatia fibular. Esta é a mononeuropatia mais comum do membro inferior e a terceira mais prevalente entre as mononeuropatias por lesão traumática, numa população em geral. A neuropatia fibular resulta do esmagamento do nervo fibular comum junto a cabeça da fíbula, geralmente em acidentes automobilísticos e laborais (CRUZ‐MARTINEZ; ARPA; PALAU, 2000; KATIRJI e WILBOURN, 1988). O esmagamento do nervo fibular produz atrofia importante do músculo tibial anterior, que contribui significativamente para o déficit motor do mesmo, caracterizado clinicamente numa situação conhecida como pé caído (foot drop). Na atrofia do músculo tibial anterior, os músculos antagonistas, que são, por excelência, flexores da planta do pé, exercem suas ações sem a ação antagônica do tibial anterior, resultando disto, uma condição em que o pé permanece em flexão plantar durante a fase de balanço na deambulação. Com isto, o paciente apresenta grande dificuldade na marcha e pode apresentar quedas frequentes afetando negativamente a qualidade de vida do mesmo (STEWART, 2008). Portanto, estudar a atrofia do músculo tibial anterior representa um item relevante no cenário da reabilitação em fisioterapia.
No que se refere às características da FTBM, sabe-se que a mesma responde positivamente em várias condições clínicas e já vem sendo utilizada como tratamento coadjuvante em muitas delas. Partindo disto, e considerando que a FTBM atenuou a atrofia muscular, sugerimos que a mesma seja incluída como método adjunto no tratamento da atrofia muscular decorrente de desnervação parcial e total. Outros pontos positivos referem-se ao: i) fácil manuseio desta terapia, que além disso é indolor e passível de ser efetuada em tratamento fisioterápico e ii) ao fato de poder ser implementada em casos onde a eletroestimulação está
contraindicada, como em pacientes que apresentam lesão de raiz nervosa com lesão cutânea aberta.
5.2.2 Mitigação da atrofia pela modulação do estresse oxidativo
A possibilidade do efeito anti-atrófico da FTBM ter sido modulada pela via do estresse oxidativo foi examinada em dois aspectos: i) peroxidação lipídica através da avaliação do 4-HNE e ii) expressão de iNOS.
A peroxidação lipídica representa um processo no qual agentes oxidantes, como radicais livres, reagem bioquimicamente com lipídios da membrana celular, o que resulta na formação de produtos secundários entre os quais se destaca o 4-HNE (AYALA; MUÑOZ; ARGÜELLES, 2014).
A relação entre a expressão de 4-HNE e, portanto, da peroxidação lipídica e a atrofia foi examinada em diversos estudos. Enquanto alguns deles observaram que a atrofia se relaciona diretamente ao aumento do nível de peroxidação lipídica (POLLOCK et al., 2017; SCALABRIN et al., 2019), outros apontam que a peroxidação atuaria como um possível modulador da atrofia, podendo ter efeito anti-atrófico ou pró-atrófico sobre a fibra muscular em diferentes situações (POWERS et al., 2012). Há, entretanto, um estudo a partir da avaliação do 4-HNE, indicando que a atrofia por desnervação não se faz através do aumento da peroxidação lipídica (PIGNA et al., 2017).
Em nosso estudo, o nível de 4-HNE nas fibras do músculo tibial anterior do grupo controle não foi significativamente diferente daquelas cuja desnervação foi produzida por esmagamento aos 7 dias (2.85 ± 0.35 UA vs 3.13± 0.09 UA) e 14 dias (3.38 ± 0.51 UA 3.47± 0.8 UA) e por secção total do nervo isquiático aos 7 dias (2.85 ± 0.35 vs 3.50± 0.35) e 14 dias (3.38± 0.51 vs 3.88 ± 1.14 UA). Portanto, a julgar por essa análise, poder-se-ia concluir que a peroxidação lipídica não teve, neste estudo, papel no desenvolvimento da atrofia por desnervação parcial e total, o que estaria em acordo com o estudo de (PIGNA et al., 2017). Se assim for, não haveria razão para avaliarmos se o efeito anti-atrófico da FTBM foi exercido através da alteração da peroxidação lipídica.
Contudo, três aspectos devem ser observados. O primeiro é que embora inexista diferença significativa nos níveis de 4-HNE, há evidente tendência do aumento da peroxidação lipídica após a desnervação parcial e total. O segundo, é que o grau de atrofia, que como era de se esperar, acentua-se na desnervação total e nos maiores tempos de desnervação, acontece em
certa medida, em paralelo com alterações nos níveis de 4-HNE: note-se que maior aumento no nível de 4-HNE ocorre nos casos de desnervação total (22,8% aos 7 dias e 14.79% aos 14 dias) quando a atrofia apresenta-se também mais acentuada (60.8% e 62%, respectivamente aos 7 e 14 dias). Terceiro, o aumento dos níveis de 4-HNE aos 7 dias após a lesão (9.82% e 22.8% respectivamente para o esmagamento e secção do nervo) decrescem aos 14 dias (2,65% e 14,79% para desnervação parcial e total, respectivamente) achados estes acompanhados, em certa medida, pelo aumento no grau de atrofia. Diante disto, a partir do que seria possível admitir que a peroxidação lipídica desempenha algum papel na atrofia, mas que este pode ser tanto pró-atrófico quanto anti-atrófico. Interessante mencionar que essa ideia não é inédita, uma vez que em outros estudos com distintos modelos experimentais tem sido proposto que a peroxidação lipídica teria efeito protetivo contra o desenvolvimento da atrofia muscular (CHEN e NIKI, 2006). Por isso, demos continuidade à investigação dos níveis de 4-HNE nos músculos dos grupos tratados com FTBM.
Nos grupos lesados e tratados com FTBM, embora sem diferença significativa entre os grupos, observamos que a peroxidação lipídica está ainda mais aumentada, em ambos os tempos experimentais (7 e 14 dias). Contudo, o grupo que sofreu esmagamento do nervo apresentou, aos 7 dias redução no nível de 4-HNE, mas o mesmo não ocorreu aos 14 dias, quando houve acréscimo no nível dessa proteína após FTBM.
Este fato poderia provavelmente estar relacionado com um efeito protetor do 4-HNE sobre o músculo cujo nervo foi esmagado e tratado, tendo em vista que a área de secção transversal das fibras musculares neste grupo, foi recuperada em 90% em relação ao grupo não tratado aos 7 dias, onde o nível de 4-HNE decresceu 13%. No mesmo grupo aos 14 dias, houve recuperação total da área de secção transversal da fibra muscular comparado ao grupo esmagado não tratado, onde observou-se aumento nos níveis de peroxidação lipídica em 4,9%. Portanto, aos 14 dias a peroxidação lipídica aumentou 34%, corroborando com maior atenuação da atrofia muscular.
Pode-se propor também, que o efeito da FTBM sobre a peroxidação lipídica poderia variar em função do tempo e do tipo de lesão e que isto impactaria de forma distinta os efeitos da FTBM sobre a atrofia muscular.
Em conjunto, isto sugere que o aumento da peroxidação lipídica pode ter algum papel na mitigação da atrofia pela FTBM nos tempos mais agudos da desnervação, o que estaria de acordo com a sugestão de que nos tempos iniciais da desnervação o aumento da peroxidação lipídica estimularia mecanismos anti-atróficos e não pró-atróficos (SCALABRIN et al., 2019). Entretanto, outras observações desse estudo não se alinham à essa possibilidade. Assim, não se
pode concluir que o acréscimo no nível de peroxidação lipídica pela FTBM teve algum papel na atenuação da atrofia após o tratamento. Portanto, estudos futuros são necessários para melhor entender esse fato.
Parece estar claro que a iNOS teria algum papel no desenvolvimento da atrofia causada por sarcopenia senil (HALL et al., 2011), doença pulmonar obstrutiva crônica (AGUSTI et al., 2004) e imobilização (BAE et al., 2012). Referente à atrofia por desnervação, alguns autores (POLLOCK et al., 2017; QIU et al., 2018; SCALABRIN et al., 2019) postulam que o estresse oxidativo desempenha algum papel no desenvolvimento da atrofia, enquanto outros sugerem que o aumento do estresse não influenciaria diretamente na gênese da mesma (MULLER et al., 2007; PIGNA et al., 2017) enquanto, ainda, um estudo sugere que a iNOS teria algum papel sobre a atrofia na fase aguda, mas não na fase crônica da desnervação (STAMLER e MEISSNER, 2001).
Neste estudo, o nível de iNOS aumentou significativamente aos 7 dias tanto após o esmagamento do nervo quanto após a secção do mesmo, mas isso não ocorreu aos 14 dias, ainda que neste último tenha havido tendência à elevação. Esse resultado, em certa medida, estaria em acordo com a observação de que apenas nos tempos agudos da atrofia provocada por imobilização há aumento no nível de iNOS (BAE et al., 2012).
A influência da FTBM sobre a expressão de iNOS tem sido observada em diversas condições experimentais, como no infarto agudo do miocárdio e na artrite reumatoide, onde houve elevação dos níveis de iNOS (TUBY; MALTZ; ORON, 2006; MORIYAMA et al., 2009). Há, entretanto, casos onde a FTBM provocou redução nos níveis de iNOS, como observado na regeneração muscular, infarto agudo do miocárdio e recuperação de lesão nervosa (RIZZI et al., 2006; MANCHINI et al., 2014; KIM et al., 2017).
O tratamento com FTBM não alterou o nível de iNOS em nenhum dos grupos examinados. Exceção feita ao tratamento por 14 dias em músculos com o esmagamento do nervo, no qual houve tendência de aumento no nível de iNOS, nos demais grupos observou-se tendência à redução do nível de iNOS. Essa última observação, qual seja a de tendência à diminuição, estaria, de certa maneira de acordo com os estudos a respeito dos efeitos da FTMB sobre a iNOS em outros tecidos (RIZZI et al., 2006; MANCHINI et al., 2014; KIM et al., 2017.). A tendência ao aumento da iNOS, provocado pela FTBM no grupo de nervos esmagados e tratados por 14 dias não pode ser justificado por razões biológicas, tampouco por diferenças entre a interação luz-tecido muscular, pois identificamos neste grupo uma discrepância entre os valores dos níveis de iNOS. Nossos resultados, portanto, não permitem afirmar que a mitigação da atrofia pela FTBM far-se-ia através da modulação da síntese iNOS.
6 CONCLUSÃO
A FTBM atenuou atrofia muscular produzida por desnervação parcial, mas provavelmente isto não foi mediado por alterações do estresse oxidativo, em especial da peroxidação lipídica e produção de iNOS.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ÁBRIGO, J. et al. Role of oxidative stress as key regulator of muscle wasting during cachexia. Oxidative
Medicine and Cellular Longevity, v. 2018, 2018.
AGUSTI, A. et al. NF-κB activation and iNOS upregulation in skeletal muscle of patients with COPD and low body weight. Thorax, v. 59, n. 6, p. 483-487, 2004.
ASSIS, L. et al. Low-level laser therapy (808 nm) contributes to muscle regeneration and prevents fibrosis in rat tibialis anterior muscle after cryolesion. Lasers in Medical Science, v. 28, n. 3, p. 947-55, May 2013.
AYALA, A.; MUÑOZ, M. F.; ARGÜELLES, S. Lipid peroxidation: production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2014, 2014.
BAE, S. K. et al. Deficiency of inducible nitric oxide synthase attenuates immobilization-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Applied Physiology, v. 113, n.1, p. 114-23, Jul 2012.
BARBIERI, E.; SESTILI, P. Reactive oxygen species in skeletal muscle signaling. Journal of Signal
Transduction, v. 2012, 2012.
BONALDO, P.; SANDRI, M. Cellular and molecular mechanisms of muscle atrophy.
Disease Models Mechanisms, v. 6, n. 1, p. 25-39, Jan 2013.
BROCCA, L. et al. Is oxidative stress a cause or consequence of disuse muscle atrophy in mice? A proteomic approach in hindlimb‐unloaded mice. Experimental Physiology, v. 95, n. 2, p. 331-350, 2010.
BUBLITZ, C. et al. Acute effects of low-level laser therapy irradiation on blood lactate and muscle fatigue perception in hospitalized patients with heart failure-a pilot study. Lasers in Medical Science, v. 31, n. 6, p. 1203-9, Aug 2016.
CHEN, Z. H; NIKI, E. 4‐Hydroxynonenal (4‐HNE) has been widely accepted as an inducer of oxidative stress. Is this the whole truth about it or can 4‐HNE also exert protective effects?. Iubmb Life, v. 58, n. 5‐6, p. 372-373, 2006.
COHEN, S.; NATHAN, J. A.; GOLDBERG, A. L. Muscle wasting in disease: molecular mechanisms and promising therapies. Nature Reviews Drug Discovery, v. 14, n. 1, p. 58, 2015.
therapy in allergic lung inflammation. Journal of Biophotonics, v. 9, n. 11-12, p. 1208-1221, 2016.
CRUZ‐MARTINEZ, A.; ARPA, J.; PALAU, F. Peroneal neuropathy after weight loss. Journal of the Peripheral
Nervous System, v. 5, n. 2, p. 101-105, 2000.
CURY, V. et al. Low level laser therapy increases angiogenesis in a model of ischemic skin flap in rats mediated by VEGF, HIF-1alpha and MMP-2. Journal of Photochemistry Photobiology B, v. 125, p. 164-70, Aug 5 2013.
DALLA LIBERA, L. et al. A transient antioxidant stress response accompanies the onset of disuse atrophy in human skeletal muscle. Journal of Applied Physiology, v. 107, n. 2, p. 549-557, 2009.
DE ALMEIDA, P. et al. Low-level laser therapy and sodium diclofenac in acute inflammatory response induced by skeletal muscle trauma: effects in muscle morphology and mRNA gene expression of inflammatory markers.
Photochemistry and Photobiology, v. 89, n. 2, p. 501- 7, Mar-Apr 2013.
DE ALMEIDA, P. et al. What is the best treatment to decrease pro-inflammatory cytokine release in acute skeletal muscle injury induced by trauma in rats: low-level laser therapy, diclofenac, or cryotherapy? Lasers in Medical
Science, v. 29, n. 2, p. 653-8, Mar 2014.
DE BRITO VIEIRA, W. H. et al. Use of low-level laser therapy (808 nm) to muscle fatigue resistance: a randomized double-blind crossover trial. Photomedicine and Laser Surgery, v. 32, n. 12, p. 678-85, Dec 2014.
DE FREITAS, C. E. A. et al. High final energy of low‐level gallium arsenide laser therapy enhances skeletal muscle recovery without a positive effect on collagen remodeling. Photochemistry and Photobiology, v. 91, n. 4, p. 957-965, 2015.
DE OLIVEIRA, H. A. et al. Photobiomodulation leads to reduced oxidative stress in rats submitted to high-intensity resistive exercise. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2018, 2018.
DI MARCO, S. et al. NF-κB-mediated MyoD decay during muscle wasting requires nitric oxide synthase mRNA stabilization, HuR protein, and nitric oxide release. Molecular and Cellular Biology, v. 25, n. 15, p. 6533-6545, 2005.
DODD, E. M. et al. Photobiomodulation therapy for androgenetic alopecia: a clinician’s guide to home-use devices cleared by the Federal Drug Administration. Journal of Cosmetic and Laser Therapy, v. 20, n. 3, p. 159-167, 2018.
ENOKI, Y. et al. Indoxyl sulfate potentiates skeletal muscle atrophy by inducing the oxidative stress-mediated expression of myostatin and atrogin-1. Scientific Reports, v. 6, p. 32084, 2016.
ESTERBAUER, H.; SCHAUR, R. J.; ZOLLNER, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology and Medicine, v. 11, n. 1, p. 81-128, 1991.
FERRARESI, C. et al. Light-emitting diode therapy (LEDT) before matches prevents increase in creatine kinase with a light dose response in volleyball players. Lasers in Medical Science, v. 30, n. 4, p. 1281-7, May 2015.
FRONTERA, W. R.; OCHALA, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue
International, v. 96, n. 3, p. 183-95, Mar 2015.
FERREIRA, S. J. 2017. Efeito do Laser de Baixa Intensidade Sobre a Autofagia em Fibras Musculares
Atróficas. Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Campinas, 2017.
GEARY, M. B. et al. Erythropoietin accelerates functional recovery after moderate sciatic nerve crush injury. Muscle & Nerve, v. 56, n. 1, p. 143-151, 2017.
GUARALDO, S. A. et al. The effect of low-level laser therapy on oxidative stress and functional fitness in aged rats subjected to swimming: an aerobic exercise. Lasers in Medical Science, v. 31, n. 5, p. 833-840, 2016.
HALL, D. T. et al. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in muscle wasting syndrome, sarcopenia, and cachexia.
Aging (Albany NY), v. 3, n. 8, p. 702-15, Aug 2011.
HAN, D. S. et al. Involvement of Substance P in the Analgesic Effect of Low-Level Laser Therapy in a Mouse Model of Chronic Widespread Muscle Pain. Pain Medicine, 2019.
HAQ, S. et al. Deletion of cytosolic phospholipase A 2 promotes striated muscle growth. Nature Medicine, v. 9, n. 7, p. 944, 2003.
HENNESSY, M.; HAMBLIN, M. R. Photobiomodulation and the brain: a new paradigm. Journal of Optics, v. 19, n. 1, p. 013003, 2016.
HENRIQUES, Á. C. G.; CAZAL, C.; CASTRO, J. F. L. D. et al. Ação da laserterapia no processo de proliferação e diferenciação celular: revisão da literatura. Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões, v. 37, n. 4, p. 295-302, 2010.
HOFER, T. et al. Increased iron content and RNA oxidative damage in skeletal muscle with aging and disuse atrophy. Experimental Gerontology, v. 43, n. 6, p. 563-570, 2008.
HUANG, Y. Y. et al. Biphasic dose response in low level light therapy–an update. Dose-Response, v. 9, n. 4, p. dose-response. 11-009. Hamblin, 2011.
