INSTITUTO DE QUÍMICA
VERÔNICA LEITE QUEIROZ
CARACTERIZAÇÃO DE CELULASE RECOMBINANTE DE XANTHOMONAS AXONOPODIS PV. CITRI PARA APLICAÇÃO À HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO
BAGAÇO DE LARANJA
CAMPINAS 2017
VERÔNICA LEITE QUEIROZ
CARACTERIZAÇÃO DE CELULASE RECOMBINANTE DE XANTHOMONAS AXONOPODIS PV. CITRI PARA APLICAÇÃO À HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO
BAGAÇO DE LARANJA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Orgânica
Orientadora: Profa. Dra. Ljubica Tasic
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA VERÔNICA LEITE QUEIROZ, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. LJUBICA TASIC.
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Ljubica Tasic (Orientadora)
Profa. Dra. Anete Pereira de Souza (IB-UNICAMP)
Profa. Dra. Luciana Gonzaga de Oliveira (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno VERÔNICA LEITE QUEIROZ, aprovada pela Comissão Julgadora em 22 de junho de 2017.
AGRADECIMENTOS
Eu agradeço primeiramente à minha orientadora, Profª. Drª. Ljubica Tasic, pela oportunidade de realizar esse trabalho, pela sua orientação e ensinamentos, pela amizade e paciência, que permitiram a realização e conclusão dessa tarefa. Tenho orgulho de ter feito parte desse grupo de pesquisa diversificado, que possibilitou que eu ampliasse minha visão com relação a bioquímica e suas aplicações e que enriqueceu o meu aprendizado.
Agradeço à minha família que me incentivou e me apoiou durante o desenvolvimento desse trabalho. Ao meu pai por sempre ter me encorajado a continuar com a minha formação, e a minha mãe por todo o amor e carinho. À minha irmã Giovanna, pelas conversas sempre cheias de atenção e amor. Agradeço ao meu marido Gabriel, por fazer parte da minha vida, por todo o amor, compreensão, paciência e por nunca me deixar desistir. Todos vocês são muito importantes na minha vida!
Aos meus líderes e colegas da Braskem, muito obrigada pelas sugestões, discussões e apoio no desenvolvimento desse trabalho. Agradeço especialmente a minha colega de trabalho e amiga Débora, que tive a sorte de conhecer na Braskem, obrigada por toda a ajuda, ensinamentos e apoio.
Agradeço também às minhas melhores amigas, Isabela, Carol, Marilene e Thaís, vocês fazem minha vida melhor e mais divertida, além de serem exemplos para mim.
Agradeço a minha banca de qualificação pelas sugestões e comentários.
Aos meus colegas do grupo do Laboratório de Química Biológica, obrigada pelas contribuições, participações e apoio.
Agradeço também aos funcionários do Instituto de Química da Unicamp por todo o auxílio e dedicação.
“Dans la vie rien n’est à craindre, tous est à comprendre” Marie Curie
RESUMO
Palavras-chave: bagaço de laranja, Xanthomonas axonopodis pv. citri, hidrólise, enzimas, celulase, etanol-2G.
O bagaço da laranja possui baixo custo, elevados níveis de carboidratos, alta susceptibilidade à hidrólise enzimática, e sua utilização não compete com a produção de alimentos; tais características tornam o bagaço uma promissora fonte de carbono para a produção de etanol de segunda geração. Somam-se a isto o fato do Brasil ser o maior produtor de laranja do mundo, e de apenas 50% da fruta ser utilizada para a produção de suco, o restante (bagaço) é subaproveitado, sendo o principal destino a produção de pellets para alimentação de gado. Nesse projeto foram realizados estudos com três diferentes tipos de biomassa semissólida provenientes do processo de produção do suco de laranja e, também, do bagaço in natura obtido localmente. Com esse projeto buscou-se a melhora do rendimento da hidrólise do bagaço de laranja para a produção de etanol de segunda geração. Como objetivo visou-se a caracterização bioquímica e biofísica de uma celulase recombinante de Xanthomonas
axonopodis pv. citri para sua futura aplicação à hidrólise enzimática do bagaço de laranja. A
celulase de Xanthomonas axonopodis pv. citri teve seus parâmetros cinéticos determinados, mostrando-se ativa frente a hidrólise de carboximetil celulose, além disso foram determinados a temperatura e pH ótimo de atividade. O estudo de sua estrutura secundária através de dicroísmo circular e de estrutura terciária via fluorescência, também, foram conduzidos com sucesso.
ABSTRACT
Key words: orange bagasse, Xanthomonas axonopodis pv. citri, hydrolysis, enzymes, cellulase, ethanol-2G.
Orange bagasse is a low cost agro-industrial residue that possesses high carbohydrate levels, high susceptibility to enzymatic hydrolysis, and it does not compete with food production; such characteristics make bagasse a promising source of carbon for the production of second-generation ethanol. In addition to the fact that Brazil is the greatest orange producer in the world, and that only 50% of the fruit is used in a juice production, orange fruit residue (bagasse) is underutilized, whose main destination is pellets production and use for livestock feed. In this research, we have carried out experiments on three types of semi-solid biomass from the orange juice production process, and on in natura bagasse obtained locally. Our aims were to improve the yields of the hydrolysis of orange bagasse and posterior fermentation to a second-generation ethanol. Our goals also included biochemical and biophysical characterization of a recombinant cellulase from the Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) and its application in enzymatic hydrolysis of orange bagasse. This Xac cellulase had its kinetic parameters determined, and it showed to be active in carboxymethyl cellulose hydrolysis. In addition, its optimum working pH and temperature conditions were determined. Its secondary structure features through circular dichroism and tertiary structure features via fluorescence were also successfully evaluated.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Gráfico construído com os dados obtidos do relatório da USDA de 2017 de produção mundial de laranjas no ano de 20167.
Figura 2: Estrutura morfológica da laranja.
Figura 3: Composição do bagaço de laranja seco14,15.
Figura 4: Representação da estrutura da parede celular e suas subunidades.
Figura 5: Representação esquemática de uma molécula de celulose24.
Figura 6: Representação das ligações de hidrogênio supramolecular da celulose26.
Figura 7: Representação da molécula de hemicelulose29.
Figura 8: Representação de uma estrutura interna de lignina31.
Figura 9: Representação de uma molécula de pectina.
Figura 10: Representação da molécula de (R)-(+)-Limoneno e (S)-(-)-limoneno.
Figura 11: A) Laranja infectada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac). B) Microscopia eletrônica de varredura da Xac (cepa 306).
Figura 12: Representação esquemática da atuação das enzimas envolvidas na hidrólise da celulose.
Figura 13: Representação da luz polarizada circularmente utilizada na técnica de dicroísmo circular.
Figura 14: Exemplo de dados obtidos por dicroísmo circular para diferentes tipos de proteínas. A curva em preto foi obtida da poli-L-lisina em pH 11,1 na conformação de α-hélice; a curva vermelha corresponde ao espectro da mesma proteína, porém na conformação de folha-β antiparalela nas condições de pH 5,7. Na curva em ciano trata-se do colágeno desnaturado em forma de uma proteína randômica, e nas curvas azul e verde o colágeno na conformação estendida (Figura obtida dos espectros fornecidos por Dr. W. C. Johnson58).
Figura 15: Espectro de absorção e emissão dos aminoácidos fenilalanina, tirosina e triptofano em pH 7 61.
Figura 16: Amostra de bagaço de laranja industrial contendo folhas e fibras antes e depois de ser triturado.
Figura 17: Fluxograma do processo de produção da laranja e seus derivados.
Figura 18: A) Amostra de dorna industrial - licor. B) Amostra de pellet de bagaço de laranja (Citrosuco, Matão, SP).
Figura 19: Isolamento de colônias a partir do bagaço da laranja em meio sólido YPD.
Figura 20: Gráfico de crescimento de colônias em YPD líquido contendo 0,5 % de d-limoneno após 24 h a 30 °C com agitação.
Figura 21: Gráfico de crescimento das colônias em 24 h de cultivo a 30 °C com agitação de 200 rpm, medidas realizadas a 600 nm.
Figura 22: Gráfico de consumo de glicose medido ao longo de 24 h por HPLC.
Figura 23: Gráfico de produção de etanol durante 24 h medida realizada por HPLC.
Figura 24: Árvore filogenética demonstrando as relações evolutivas entre a sequência parcial da região D1/D2 da amostra CPQBA 1332-16 DRM 01, correspondente a cepa 9, e as sequencias de linhagens de micro-organismos relacionados presentes nas bases de dados CBS e GenBank.
Figura 25: Gel de agarose 1% com marcador 1 kb e amostra de DNA genômico de Xac.
Figura 26: Gel obtido de um dos testes de amplificação. Nele é possível observar a amplificação pouco especifica e também o efeito da temperatura de anelamento, que quanto mais alta mais específica.
Figura 27: Predição de peptídeo sinal obtida através do servidor SignalP 4.1. C-score corresponde a pontuação “raw cleavage site”; S-score a pontuação de peptídeo sinal e Y-score a pontuação combinada de sítio de clivagem.
Figura 29: Mecanismos propostos para glicosil hidrolases com inversão de configuração (A) e com retenção da configuração (B)81.
Figura 30: Foto do gel (12%) de acrilamida contendo as amostras de pET28 sem o gene e de pET28 contendo a celulase em diferentes condições de expressão: 18 °C por 24 h, 28 °C por 4 h e 37 °C por 3 h. As setas indicam a presença da celulase alvo no Gel.
Figura 31: Gel 12% de acrilamida contendo as amostras de pET28 sem o gene e de pET28 contendo a celulase em diferentes concentrações de IPTG durante a expressão: 0,1 mmol L-1, 0,5 mmol L-1 e 1 mmol L-1.
Figura 32: SDS-PAGE das amostras de purificação da celulase recombinante. O gel contém amostra da célula antes da indução com IPTG (não induzido) e após a indução (induzido – ME). Também são mostrados as frações do início da purificação que não correspondem a proteína de interesse (frações de 1 a 12) e as frações contendo a celulase recombinante em alto grau de pureza nas frações de 15 e 16.
Figura 33: Cromatograma da purificação da celulase heteróloga em Origami 2 (DE3). O segundo pico corresponde ao sinal da proteína de interesse.
Figura 34: Curva de calibração do fator k, calculado através da equação I, versus o logaritmo da massa molar. A equação linear também é mostrada abaixo do gráfico.
Figura 35: Cromatograma de filtração em gel analítica da amostra de celulase previamente purificada por afinidade. O pico correspondente a amostra apresenta tempo de eluição em 10,45 mL.
Figura 36: Predição da estrutura terciária da celulase de Xac obtida através da ferramenta I-Tasser e visualizada através da ferramenta PyMol. Na primeira imagem estão as medidas de comprimento e largura aproximados da proteína e na segunda imagem a proteína vista com giros de 90°.
Figura 37: Solução 1% de CMC incubada com 200 nmol L-1 de celulase purificada por 30 min a 35 °C. É possível observar a alteração na viscosidade do tubo contendo a enzima versus o tubo controle.
Figura 38: Produção de açúcares redutores em diferentes tempos de incubação, ensaio realizado com 200 nmol L-1 de enzima, em tampão 50 mmol L-1 Na
2HPO4/ácido cítrico pH 6 e temperatura de 35 °C.
Figura 39: Influência do pH na atividade frente a CMC da celulase recombinante de Xac, ensaio realizado com 200 nmol L-1 de enzima, 35 °C, 30 min de incubação e em diferentes valores de pH do tampão 50 mmol L-1 Na
2HPO4/ácido cítrico.
Figura 40: Influência da temperatura na atividade frente a CMC da celulase recombinante de Xac, ensaio realizado em tampão 5 mmol L-1 Na
2HPO4/ácido cítrico pH 6,5, 30 min de incubação e 200 nmol L-1 de enzima.
Figura 41: Gráfico de velocidade inicial para a celulase recombinante de Xac, ensaio realizado em tampão 50 mmol L-1 Na
2HPO4/ácido cítrico pH 6,5, 30 °C, tempo de incubação de 30 min e 200 nmol L-1 da celulase recombinante de Xac.
Figura 42: Gráfico duplo-recíproco de Lineweaver-Burk. Efeito da concentração de substrato (CMC) na velocidade da reação.
Figura 43: Espectro de dicroísmo circular obtido para a amostra purificada de celulase em tampão 50 mmol L-1 ácido cítrico/Na
2HPO4 pH 6,5 a 25 °C e 200 nmol L-1 de enzima.
Figura 44: Estabilidade térmica monitorada por dicroísmo circular a 222 nm de 20 a 90°C. Os círculos fechados são os pontos referentes a curva de desnaturação e os círculos abertos os pontos referentes a tentativa de enovelamento com diminuição da temperatura. O ensaio foi realizado em tampão 50 mmol L-1 Na
2HPO4/ácido cítrico, pH 6,5 com 200 nmol L-1 da enzima. Figura 45: Estabilidade térmica monitorada por dicroísmo circular a 222 nm de 20 a 60°C. Os círculos fechados são os pontos referentes a curva de desnaturação e os círculos abertos os pontos referentes a tentativa de enovelamento com diminuição da temperatura. O ensaio foi realizado em tampão 50 mmol L-1 Na
2HPO4/ácido cítrico, pH 6,5 com 200 nmol L-1 da enzima. Figura 46: Espectro de dicroísmo circular obtido para a amostra purificada de celulase (200 nmol L-1) em tampão 50 mmol L-1 ácido cítrico/Na
2HPO4 em diferentes valores de pH a 25 °C. Figura 47: Modelagem realizada no I-Tasser para a celulase recombinante de Xac. Em rosa estão destacados os resíduos de triptofano da proteína recombinante de Xac.
Figura 48: Espectro de excitação para a proteína recombinante de Xac no tampão 50 mmol L -1 Na
2HPO4 a 25°C e pH 6,5.
Figura 49: Espectro de emissão para a proteína recombinante de Xac obtido em diferentes valores de pH no tampão 50 mmol L-1 Na
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Tabela contendo os dados obtidos da caracterização do bagaço de laranja comercial e industrial
Tabela 2: Período de colheita por variedade de laranja e percentual da produção, tabela retirada de “O retrato da Citricultura brasileira, 2010” 6
Tabela 3: Tabela contendo os dados obtidos da caracterização da amostra de licor industrial (amostra Citrosuco, Matão, SP)
Tabela 4: Tabela contendo o resumo das informações das proteínas de Xac escolhidas para serem amplificadas e clonadas em E. coli
Tabela 5: Tabela contendo os oligos diretos (primer forward – PF) e oligos reversos (primer
reverse – PR) usados na amplificação de cada sequência
Tabela 6: Valores encontrados para o cálculo da massa molar da celulase recombinante
Tabela 7: Parâmetros cinéticos da celulase recombinante de Xac utilizando CMC como substrato
Tabela 8: Parâmetros cinéticos de celulases de diferentes microrganismos utilizando CMC como substrato
SUMÁRIO
1. Introdução 17 1.3. Fibras Lignocelulósicas 19 1.3.1. Celulose 20 1.3.2. Hemicelulose 21 1.3.3. Lignina 22 1.3.4. Pectina 23 1.4. Óleo Essencial 241.5. Xanthomonas axonopodis pv. citri 24
1.6. Aplicação de enzimas na indústria 26
1.7. Tipos de pré-tratamento para hidrólise de biomassa 26
1.8. Hidrolases 28
1.9. Tipos de hidrólise 28
1.10. Hidrólise enzimática 29
1.10.1. Celulases 29
1.10.2. Pectinases 29
1.12. Caracterização estrutural de proteínas 31
1.12.1. Dicroísmo circular 31
1.12.2. Fluorescência 33
2. Objetivos 35
3. Materiais e métodos 36
3.1. Processamento do bagaço da laranja 36
3.2. Caracterização primária do bagaço de laranja 36 3.2.1. Determinação de sólidos totais e umidade 36
3.2.2. Determinação do conteúdo de cinzas 37
3.3. Determinação de fibras 37
3.3.1. Determinação de fibras em detergente neutro (FDN) 37 3.3.2. Determinação das fibras em detergente ácido (FDA) 38 3.3.3. Determinação de lignina em detergente ácido (LDA) 39
3.4. Determinação de Pectina 40
3.5. Extração do óleo essencial 40
3.6. Determinação de hesperidina 41
3.7. Isolamento de microrganismos do bagaço de laranja 42 3.8. Expressão do gene sintético, lise e purificação 43 3.9. Determinação das condições ótimas de ensaio de atividade 44
3.10. Cinética 44
3.11. Dicroísmo circular 45
3.12. Fluorescência 46
4. Resultados e Discussão 47
4.1. Caracterização do Bagaço de Laranja 47 4.2. Caracterização da amostra de licor e pellet industrial 50 4.3. Isolamento de Colônias de Bagaço de Laranja 52 Parte II – Hidrolase recombinante de Xanthomonas axonopodis pv. citri 57 4.4. Hidrolases de Xanthomonas axonopodis pv. citri 57
4.5. Celulase Q8PJK9 – Gene sintético 60
4.6. Expressão e purificação da celulase recombinante 63
4.6.1. Filtração em gel analítica 67
4.7. Resultados de otimização do ensaio de hidrólise enzimática 70
4.8. Cinética enzimática 73
4.9. Resultados do Dicroísmo Circular 76
4.10. Fluorescência 80 5. Conclusões 83 6. Referências 85 7. Anexos 90 Enzima 1 – Celulase Q8PJK9 90 Enzima 2 – Celulase Q8PPS3 91 Enzima 3 – Beta-Glicosidase Q8PFV3 92
Enzima 4 – Beta-Glicosidase Q8PMI0 93
Enzima 5 – Pectato Liase Q8PGQ4 94
1. Introdução
1.1. MotivaçãoA busca por fontes renováveis de energia se torna cada vez mais importante como alternativa sustentável às oriundas do petróleo, especialmente em um cenário mundial onde as principais potencias e países em desenvolvimento assinaram um acordo, a COP21, no qual se comprometem a um conjunto de ações visando manter o aumento da temperatura limitado a 2 °C até o final deste século1.
Atualmente, o biocombustível mais presente no cotidiano é o etanol, que tem 80% de sua produção vinda de fermentação2,3. A produção mundial de biocombustíveis aumentou consideravelmente nos últimos anos passando de 18,2 bilhões de litros em 2000 para 60,6 bilhões de litros em 2007, sendo que desse total 85% corresponde ao bioetanol4. No entanto, a maior parte deste biocombustível é produzida a partir de glicose, sendo nomeado etanol de primeira geração, que compete com a produção de alimentos5. Como alternativa buscam-se soluções através de fermentação de substratos chamados de biomassas para produção de etanol de segunda geração, também conhecidos por substratos lignocelulósicos5.
O bagaço de laranja é uma alternativa para a fermentação e obtenção de etanol de segunda geração, uma vez que essa biomassa tem baixo custo, não é utilizada para alimentação direta de humanos e possui alto teor de carboidratos. Além disso, o Brasil é o maior produtor mundial de laranjas6,7 (Figura 1) com produção em 2016 de aproximadamente 14,3 milhões de toneladas de acordo com o USDA (United States Department of Agriculture – Departamento de Agricultura dos Estados Unidos)7.
Figura 1: Gráfico construído com os dados obtidos do relatório da USDA de 2017 de produção mundial de laranjas no ano de 20167.
Considerando que apenas 50% da laranja é aproveitada através da extração do suco8 e os 50% restantes correspondem a bagaço (casca, sementes e polpa) temos uma produção igualmente grande do resíduo, que atualmente é seco e transformado em pellet para misturar com ração de gado e ovelhas9. Dessa forma, o uso do bagaço de laranja para a produção de etanol torna-se uma solução não apenas ambientalmente interessante, mas também uma alternativa muito atrativa economicamente para os produtores de laranjas.
Trabalhos anteriores no grupo, demonstraram a capacidade do arsenal enzimático da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em hidrolisar o bagaço da laranja possibilitando a sua posterior fermentação10.
1.2. Laranja e Composição do Bagaço
A laranja é o fruto produzido pela laranjeira e é composta morfologicamente pelas seguintes partes (Figura 2):
i) O epicarpo ou flavedo que corresponde à parte externa alaranjada da casca. ii) O mesocarpo ou albedo que corresponde à parte branca mais interior da casca. iii) O endocarpo que é dividido em gomos que contém as vesículas de suco e sementes.
1 4 ,3 2 6 ,9 6 ,2 4 5 ,3 6 4 ,4 2 ,9 3 1 ,8 1 ,5 6 0 ,9 2 5 0 ,8 0 ,5 9 0 ,4 5 5 0 ,3 3 5 0 ,1 6 0 ,1 0 5 0 ,1 9 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 P ro d u çã o d e la ra n ja s (M ilh õ es d e to n el ad as )
Figura 2: Estrutura morfológica da laranja.
Quimicamente o fruto é composto por carboidratos solúveis (glicose, frutose e sacarose), proteínas, carboidratos insolúveis (celulose e hemicelulose) e lignina que está presente em baixo teor8,11, além de óleos essenciais como o d-limoneno8,12,13.
O conhecimento da composição química do bagaço é fundamental para o seu maior aproveitamento. Awan et al. (2013)10 bem como Rivas et al. (2008)14, realizaram um estudo detalhado da composição do bagaço. De maneira geral, o bagaço contém: açúcares solúveis (16,9%), amido (3,75%), fibras, tais com celulose (9,21%), hemicelulose (10,50%), lignina (0,84%) e pectina (42,50%), cinzas (3,5%), gorduras (1,95%) e proteínas (6,50%), considerando-se o peso do bagaço da laranja seco14 (Figura 3).
Figura 3: Composição do bagaço de laranja seco14,15.
1.3. Fibras Lignocelulósicas
A lignocelulose é o material estrutural da parede celular das plantas responsável por conferir força, suporte e rigidez. É composto principalmente por celulose, hemicelulose,
lignina e pectina, tais polissacarídeos não são encontrados de maneira uniforme nas plantas, sendo que sua composição difere de uma região morfológica a outra16,17.
Basicamente a parede celular é composta por uma camada primária (P) mais externa e uma camada secundária (S), que por sua vez é composta por três subunidades que se diferenciam pela orientação das microfibrilas: S1, S2 e S3 e uma camada chamada de lamela mediana (LM) localizada entre células adjacentes17 (Figura 4).
Figura 4: Representação da estrutura da parede celular e suas subunidades (retirada de http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia/cito4.php - acessado no dia 08/05/2016).
A camada primária (P) é composta principalmente por lignina, é a camada mais é fina e flexível, o que permite o crescimento celular. Já a camada secundária é muito mais espessa e rígida e sua composição é basicamente de carboidratos18, formada pelas subunidades S1 e S3 que são normalmente finas e suas microfibrilas de celulose são orientadas em uma hélice plana com relação ao eixo de elongação da célula19, a subunidade S2, por sua vez é mais espessa possui de 75 a 85% das microfibrilas de celulose totais da espessura da parede celular20. É importante ressaltar que hemicelulose e lignina estão presentes em todas as camadas3,20
1.3.1. Celulose
A celulose é o material orgânico mais abundante da terra, já que é o principal componente das plantas, tendo como função dar estrutura a plantas, árvores e gramíneas17,21. Além disso, a celulose é um material biodegradável e renovável, e pode ser aplicada de diversas formas devido a propriedades como hidrofobicidade, quiralidade, atoxicidade, alta
susceptibilidade a modificações químicas, no entanto boa parte da celulose produzida através da agricultura e atividades industriais ainda é vista como descarte. Insolúvel na maioria dos solventes devido as ligações de hidrogênio e cristalinidade22,23, já que é um polímero linear de unidades de D-glicose ligadas através de ligações 1,4-β-glicosídicas (Figura 5). Com a fórmula molecular (C6H10O5)n, duas unidades de glicose formam o dímero conhecido como celobiose as longas cadeias de celulose cristalina fazem ligações de hidrogênio intermoleculares e intramoleculares, o que confere maior rigidez e torna o ataque enzimático mais difícil22,24 (Figura 6), é interessante observar que os grupos hidroxilas das pontas da cadeia de celulose possuem propriedades diferentes, o C1 tem propriedades redutoras, enquanto o C4 da mesma cadeia é não redutor22,25.
Figura 5: Representação esquemática de uma molécula de celulose24.
Figura 6: Representação das ligações de hidrogênio supramolecular da celulose26.
1.3.2. Hemicelulose
Diferente da celulose, a hemicelulose não é quimicamente homogênea27, além de majoritariamente amorfa e ramificada, trata-se de um heteropolissacarídeo cujo esqueleto é formado por ligações β-1,4 com configuração equatorial em C1 e C428composto por pentoses (β-D-xilose, α-L-arabinose), hexoses (β-D-glicose, β-D-manose, α-L-galactose) e/ou ácidos de
açúcares (ácido glicurônico, ácido metilgalacturônico e ácido galacturônico), além disso, a hemicelulose também pode conter em menores teores outros açúcares como ramnose e fucose, os grupos hidroxílicos dos açucares também podem estar substituídos parcialmente por grupos acetil27 (Figura 7). Além disso, os polissacarídeos de hemicelulose podem ser muito diferentes uns dos outros em termos de estrutura e propriedades físicas e físico-químicas28.
O tipo mais abundante de hemicelulose são as xilanas, sendo a maior componente da parede secundária celular27. Hemicelulose, em geral, representa de 15 a 35% da composição da biomassa27 e pode ser facilmente hidrolisadas com o uso de soluções diluídas de ácidos ou bases e são muito solúveis em álcalis28. Dependendo do processo e condições usadas no tratamento para lise da hemicelulose, os açúcares podem se degradar em ácidos fracos e furanos, que normalmente atuam como inibidores nos processos de fermentação27.
Figura 7: Representação da molécula de hemicelulose29.
1.3.3. Lignina
A lignina é um heteropolímero amorfo altamente ramificado presente na parede celular normalmente encontrado adjacente às fibras de celulose formando o complexo lignocelulósico30. A lignina é composta majoritariamente por três unidades de compostos fenólicos: álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool sinapílico30 – sua função é conferir rigidez, impermeabilidade e resistência aos ataques mecânicos e microbiológicos nos tecidos vegetais (Figura 8).
Figura 8: Representação de uma estrutura interna de lignina31.
1.3.4. Pectina
A pectina é um polissacarídeo heterogêneo28 ramificado constituído principalmente de unidades de ácido galacturônico (Figura 9). A pectina é um dos componentes mais abundantes da parede celular primária de plantas que florescem, a grande exceção é a família Poaceae (cana de açúcar, milho, trigo, arroz, por exemplo) que possuem quantidades bem menores.
1.4. Óleo Essencial
Óleos essências são conhecidos por sua ação antimicrobiana, sendo que a atividade antimicrobiana irá depender da composição do óleo essencial32. Óleos essências são misturas complexas formados por cerca de 400 compostos, mas sua composição irá depender principalmente da forma de cultivo da laranja33. A composição do óleo essencial de laranja é majoritariamente de d-limoneno correspondendo a 97%.
d-limoneno (C10H16) é um hidrocarboneto classificado como terpeno cíclico (Figura 10). É um líquido incolor a temperatura ambiente com um odor muito característico de laranja.
Na laranja o óleo essencial é encontrado do epicardo (flavedo) em glândulas de óleo.
Figura 10: Representação da molécula de (R)-(+)-limoneno e (S)-(-)-limoneno.
1.5. Xanthomonas axonopodis pv. citri
A Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é uma bactéria Gram-negativa34 patógena que infecta frutas cítricas, a doença é conhecida por cancro asiático, cancro tipo A ou cancro cítrico35 (Figura 11) e é responsável por uma das doenças mais sérias que atingem cítricos causando perda significativa na qualidade e produção de laranjas36,37.
Figura 11: A) Laranja infectada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) (Figura obtida de
http://www.fundecitrus.com.br/doencas/cancro/7 - acessado 05/07/2014). B) Microscopia eletrônica de varredura da Xac (cepa 306).
A bactéria entra no tecido hospedeiro através dos estômatos e feridas. A temperatura ótima para a infecção é entre 20 e 30 °C, além disso a bactéria se multiplica de 3-4 unidades log por lesão em condições ótimas37, a forma mais eficiente para conter a dispersão da doença é através da remoção das plantas recentemente infectadas e também daquelas ao seu redor, o que resulta em programas de erradicação em massa36.
O cancro cítrico pode ser causado por outros variantes da bactéria X. axonopodis, os sintomas são similares e a diferenciação é realizada através da análise do hospedeiro e de característica fenotípicas e genotípicas das cepas37. O cancro cítrico tipo A causado pela
Xanthomonas axonopodis pv. citri é a forma mais difundida e severa da doença e por esse
motivo é uma das cepas mais estudadas35,37.
Devido a sua importância econômica a Xac (cepa 306) teve seu genoma sequenciado em 2002 por Silva et al. 38. A bactéria possui um cromossomo circular com 5.175.554 pares de base e dois plasmídeos pXAC 33 (33.699 pares de base) e pXAC64 (64.920 pares de base), que codificam para proteínas em 85,59% das regiões de seu cromossomo, sendo encontrados 2710 genes com função definida, 1272 de região conservada com função hipotética, 331 genes hipotéticos, totalizando 4313 genes que codificam para a expressão de proteínas38.
A Xac também possui um arsenal de genes relacionados à degradação de parede celular, seu genoma possui ao menos seis Orfs (Open Reading Frames – fase de leitura aberta) para enzimas com atividades pectinolíticas, doze Orfs com para enzimas celulolíticas, e doze
Orfs para enzimas hemicelulolíticas, totalizando ao menos 30 enzimas relacionadas à degradação de parede celular38.
1.6. Aplicação de enzimas na indústria
Enzimas catalisam reações com grande especificidade e altas taxas de conversão, sendo assim são ótimas candidatas para indústrias químicas e farmacêuticas preocupadas com sustentabilidade, energia limpa, biomassa e com o meio ambiente39. A aplicação de enzimas na indústria já ocorre em grande extensão e em diferentes áreas como na indústria alimentícia, agricultura, indústria de papel, couro e de tecidos, sendo que seu uso resulta em consideráveis ganhos econômicos39.
Estima-se que a produção de etanol oriundo de primeira geração, fermentação dos açúcares livres que compete com a produção de alimentos, aumente para ao menos 100 bilhões de litros até 20224,40, consequentemente aumentando a necessidade de áreas cultivadas e gerando preocupação com relação a biodiversidade e desmatamento4. Do ponto de vista biotecnológico existe uma grande variedade de recursos de biomassa lignocelulósica para serem convertidos em produtos, como o bioetanol e biocombustíveis41.
Nos últimos anos houve um grande desenvolvimento em biotecnologia para tornar essas tecnologias viáveis, tendo em vista a poluição do meio-ambiente e aquecimento global. Uma das possibilidades de se produzir o bioetanol é através do uso de biomassa lignocelulósica, o processo de produção de bioetanol envolve as etapas de pré-tratamento (mecânico, químico ou biológico), hidrólise (química ou enzimática) e fermentação42. No entanto, o custo dessa produção é relativamente alto baseado nas tecnologias atuais e o principal desafio é diminuir o custo do processo de hidrólise, tanto com o objetivo de otimizar o pré-tratamento para a remoção de lignina e hemicelulose facilitando a hidrólise, quanto na otimização das enzimas e do processo de hidrólise em si43,44.
1.7. Tipos de pré-tratamento para hidrólise de biomassa
A principal função do pré-tratamento do material lignocelulósico é aumentar a acessibilidade das enzimas melhorando assim sua ação na celulose através da quebra da lignina e das estruturas cristalinas de celulose. No entanto, cada tipo de pré-tratamento possui
um efeito na celulose, na hemicelulose e também na lignina, por isso diferentes tipos de pré-tratamento devem ser aplicados dependendo do processo envolvido e também do tipo de biomassa45.
Com relação aos tipos de pré-tratamento podemos dividi-los nos seguintes grupos: mecânicos, físico-químico e químicos.
O mecânico tem por objetivo diminuir o tamanho da partícula aumentando sua área superficial e diminuindo o grau de polimerização. O tratamento pode ser realizado através de trituração ou moagem45.
O tratamento físico-químico mais utilizado é conhecido como explosão a vapor, nele o material é exposto a vapor de água pressurizada no período que vai de segundos a minutos e então bruscamente despressurizados. Nesse tipo de processo ocorre a auto hidrólise e solubilização do grupo acetila presente na hemicelulose, além disso a variação de pressão resulta na separação das fibras devido a rápida descompressão45. A explosão a vapor
apresenta como vantagem o uso da biomassa sem estar granulada, o baixo impacto ambiental e o fato de não usar aditivos químicos, apesar da adição de ácido ser usada em alguns casos melhorando a hidrólise43,45. É importante ressaltar que nesse tipo de pré-tratamento o
aumento da temperatura melhora a auto hidrólise da hemicelulose, mas também resulta no aumento da degradação de pentoses e hexoses, assim como o uso de ácido em conjunto com a explosão a vapor45.
Já o pré-tratamento químico pode ser ácido ou básico. O tratamento básico é eficiente para a solubilização da lignina, mas apresenta menor solubilização para celulose e hemicelulose do que os tratamentos ácidos ou de explosão a vapor, no entanto a vantagem do tratamento básico é que pode ser feito a temperatura ambiente e aumenta a digestibilidade da celulose, outro ponto favorável é que também resulta em menor degradação de açúcares do que o processo ácido. Como reagentes podem ser usados hidróxidos de sódio, cálcio, potássio e amônio, por exemplo. O pré-tratamento com hidróxido de cálcio apresenta menores custos e menores requisitos de segurança do que NaOH ou KOH, além de ser facilmente removido do hidrolisado através de uma reação com CO245–47.
Com relação ao tratamento ácido, o principal objetivo é remover e solubilizar a hemicelulose tornando a celulose mais acessível ao ataque enzimático. O pré-tratamento pode ser tanto com ácido diluído quanto concentrado, no entanto esse último apresenta como desvantagem a formação de compostos que inibem a fermentação alcoólica, além da
desvantagem de corrosão e recuperação do ácido após a hidrólise, por esses motivos a uso do ácido diluído é mais interessante do ponto de vista industrial. Soluções diluídas de ácidos como sulfúrico, clorídrico, fosfórico e nítrico podem ser utilizadas nesse tipo de pré-tratamento45,47.
1.8. Hidrolases
Antes da etapa de fermentação e após o pré-tratamento, quando já existe a maior exposição das fibras de celulose, a celulose da biomassa precisa ser hidrolisada para então ser fermentada para a produção de etanol. O processo pode ser realizado através de uma hidrólise química ou enzimática. Tratamentos químicos como a hidrólise ácida geram mais resíduos e os subprodutos dessas reações são tóxicos para a levedura prejudicando a etapa seguinte de fermentação. Sendo assim, a hidrólise enzimática torna-se uma alternativa mais verde e branda5,48.
1.9. Tipos de hidrólise
A hidrólise ácida pode ocorrer a partir do uso de ácidos concentrados ou diluídos. Por exemplo, o uso de soluções diluídas (0,7–3,0%) necessita de temperaturas altas (220 – 240°C), enquanto as soluções concentradas apresentam as mesmas desvantagens expostas para pré-tratamento com ácido concentrado. Tanto a hidrólise com soluções diluídas quanto com ácido concentrado podem gerar subprodutos inibitórios para a fermentação49.
Já a hidrólise enzimática utiliza um conjunto de enzimas, tais como celulases, coquetéis enzimáticos, e não produz inibidores de fermentação, além de exigir aplicação de condições brandas de pH e temperatura44,49. As enzimas de fungos ou bactérias ou várias enzimas como celulases, xilanases, ligninases, pectinases entre outras50 são necessárias para a hidrólise completa da biomassa.
A classe de enzimas mais utilizada na hidrólise de polissacarídeos é EC 3.2 das hidrolases, que catalisam a reação de hidrólise de polissacarídeos. As principais hidrolases usadas em biotecnologia para a conversão dos polissacarídeos em monômeros são as celulases, as β-glicosidases e as pectinases51.
1.10. Hidrólise enzimática 1.10.1. Celulases
As celulases são classificadas em três grupos principais: (i) endoglucanases ou 1,4-β-D-glucano-4-glucano-hidrolase (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanases (EC 3.2.1.74) e 1,4-β-D- glucano-celobio-hidrolases (celobio-hidrolases) (EC 3.2.1.91) e (iii) β-glicosidases (EC 3.2.1.21)51,52.
As endoglucanases hidrolisam de maneira randômica os sítios amorfos internos da cadeia de polissacarídeos da celulose, gerando oligossacarídeos de vários tamanhos e com novas extremidades51. Exoglucanases atuam nas extremidades da cadeia de polissacarídeos da celulose liberando glicose ou celobiose como produtos principais (Figura 12).
As β-glicosidases (EC 3.2.1.21) hidrolisam celodextrinas solúveis e celobiose liberando glicoses51. A quebra enzimática de uma ligação 1,4-β-glicosídica na celulose ocorre através de um mecanismo de hidrólise ácida utilizando um doador de prótons e um nucleófilo ou base.
Figura 12: Representação esquemática da atuação das enzimas envolvidas na hidrólise da celulose.
1.10.2. Pectinases
As pectinases, por sua vez, são as responsáveis pela hidrólise da pectina. As pectinases estão entre as enzimas mais amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas. Protopectinases, poligalacturonases, liases e esterases pectina estão entre enzimas
pectinolíticas extensivamente estudadas. Protopectinases catalisam a solubilização de protopectina. Poligalacturonases hidrolisam a cadeia do ácido poligalacturônico por adição de água e as liases catalisam a clivagem trans-eliminativa do polímero de ácido galacturônico53.
1.11. Atividade enzimática – Fatores que afetam a atividade enzimática (pH, temperatura, agitação e inibição por produto)
Vários fatores podem afetar o rendimento de açúcares gerados a partir da hidrólise de biomassa lignocelulósica, como o acesso das enzimas para a hidrólise, concentração de enzima colocada, concentração de substrato, inibição de atividade pelo acúmulo de glicose, e fatores diretamente ligados a atividade enzimática como pH, temperatura e agitação43,44.
A escolha do pré-tratamento é fundamental para diminuir a cristalinidade da celulose e remover a lignina, dessa forma menores concentrações de celulase podem ser utilizadas para a hidrólise, além de um menor tempo de reação44,54.
Além disso, a inibição da atividade por acúmulo de produto é um problema comum na hidrólise enzimática, mas pode ser resolvido através da sacarificação e fermentação simultânea da biomassa54. Outro problema pode ser a alta concentração de substrato, que também pode provocar a inibição enzimática resultando em uma taxa de hidrólise muito lenta inicialmente, esse efeito está relacionado ao ajuste da proporção entre substrato/enzima utilizados no processo43, problemas com a agitação e transferência de massa também estão relacionados a uma alta concentração inicial de substrato54.
Valores ótimos de pH e temperatura dependem da enzima utilizada, do substrato e da duração da hidrólise. Normalmente os valores de pH estão entre 4-5 e de temperatura entre 40 – 50 °C44,54.
1.12. Caracterização estrutural de proteínas
1.12.1. Dicroísmo circular
Dicroísmo circular é uma técnica espectroscópica não destrutiva, amplamente utilizada para o estudo de conformação e estabilidade de proteínas frente a diferentes condições como temperatura, força iônica e presença de solutos ou moléculas pequenas55.
A técnica utiliza uma fonte de luz polarizada circularmente, na qual o vetor rotacional oscila para a direita ou esquerda formando uma hélice ao redor do eixo de propagação (Figura 13). Quando a luz polarizada passa por uma amostra opticamente ativa, a amostra absorve de maneira diferente os componentes de luz polarizada a esquerda e a direita, seguindo a lei de Beer-Lambert55,56.
Figura 13: Representação da luz polarizada circularmente utilizada na técnica de dicroísmo circular (https://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism - acessado em 12/06/2016).
A técnica permite o estudo de estrutura secundária de proteínas, pois as ligações peptídicas são assimétricas e moléculas que não possuem plano de simetria apresentam dicroísmo circular. Os resultados são normalmente expressos como a média da elipticidade molar do resíduo, [θ], dada pela equação abaixo:
100
Onde θ é a elipticidade em graus, l é o caminho ótico em cm, C é a concentração em mg mL-1, M é a massa molecular e n é o número de resíduos da proteína. A unidade de [θ] é deg.cm2.dmol-1, tal unidade permite a comparação de dados obtidos em diferentes bateladas de amostras ou diferentes laboratórios55.
Para a interpretação dos dados obtidos por CD é importante ressaltar que a ausência de sinal está relacionada a ausência de dicroísmo circular, já um sinal negativo significa uma absorção maior de luz polarizada circularmente na esquerda, enquanto o sinal positivo significa uma maior absorção de luz polarizada circularmente na direita. O espectro de uma proteína totalmente α-hélice apresenta duas bandas de magnitude similar na região de 208 e 222 nm e negativas e uma banda positiva em aproximadamente 190 nm. Por sua vez, o espectro de proteínas em folha-β é caracterizado pelo sinal mínimo ao redor de 215 nm e um máximo ao redor de 195 nm, e as folhas-β podem estar presentes de forma paralela, antiparalela ou em configurações mistas. O espectro de uma proteína desenovelada possui uma banda de intensidade baixa e negativa em torno de 200 nm (Figura 14).
Figura 14: Exemplo de dados obtidos por dicroísmo circular para diferentes tipos de proteínas. A curva em preto foi obtida da poli-L-lisina em pH 11,1 na conformação de α-hélice; a curva vermelha corresponde ao espectro da mesma proteína, porém na conformação de folha-β antiparalela nas condições de pH 5,7. Na curva em ciano trata-se do colágeno desnaturado em forma de uma proteína randômica, e nas curvas azul e verde o colágeno na conformação estendida (Figura obtida dos espectros fornecidos por Dr. W. C. Johnson57).
Através da técnica de CD é possível estimar a fração de resíduos na estrutura que estão na forma de α-hélice, folha-β ou randômica, tal informação é muito importante quando a proteína não possui sua estrutura em alta resolução, e mesmo quando essa informação existe, CD nos dá importantes informações a respeito do efeito de temperatura sobre enovelamento da proteína55.
1.12.2. Fluorescência
A espectroscopia de fluorescência é uma técnica de larga aplicação, uma vez que a maioria das proteínas possui fluoróforos naturais (resíduos de tirosina, fenilalanina e triptofano), que possibilita estudos na mudança da conformação da proteína. Por esse motivo, essa é uma das técnicas mais aplicadas ao estudo de enovelamento de proteínas, dinâmica e interações58,59.
A emissão do espectro de uma proteína é dominada pelo triptofano, que possui os maiores comprimentos de onda tanto de absorção quanto de emissão (Figura 15), sendo que sua emissão máxima é em torno de 350 nm e é sensível a polaridade de seu ambiente60.
Figura 15: Espectro de absorção e emissão dos aminoácidos fenilalanina, tirosina e triptofano em pH 7 60.
A tirosina absorve e emite em comprimento de onda menores que o triptofano, com máximo de emissão em 303 nm, e não é sensível a polaridade do ambiente, no entanto, sua emissão depende do pH, pois o grupo hidroxil-fenólico possui pKa em torno de 10 e em pH alcalino é desprotonado, sua desprotonação resulta em um deslocamento de emissão para 340 nm58.
A fenilalanina é o aminoácido que possui o menor comprimento de onda, tanto de absorção quanto de emissão, com máximo de emissão próximo a 282 nm, no entanto quando próximo a tirosina ou ao triptofano pode afetar o rendimento quântico através de transferência de energia58,60.
2. Objetivos
O presente projeto teve por objetivo o estudo e caracterização de uma celulase recombinante de Xanthomonas axonopodis pv. citri para posterior aplicação na hidrólise do bagaço de laranja e produção de etanol de segunda geração.
Como objetivos específicos destacam-se:
• Caracterização de diferentes tipos de biomassa semissólida provenientes do processo de produção do suco de laranja e bagaço in natura obtido localmente;
• Isolamento de microrganismo de bagaço de laranja com melhor rendimento para fermentação de hidrolisados de bagaço;
• Amplificação, expressão e purificação de hidrolases recombinantes de Xac;
• Caracterização bioquímica e biofísica de uma celulase recombinante de Xac através da determinação dos parâmetros cinéticos e estudos de dicroísmo circular e fluorescência;
3. Materiais e métodos
3.1. Processamento do bagaço da laranja
O bagaço in natura da laranja foi recolhido de um restaurante em Campinas (São Paulo, Brasil). Além disso, amostras in natura da empresa Citrosuco (Matão, SP – Brasil) também foram analisadas, as amostras correspondiam ao bagaço logo após a extração do suco (continha não apenas bagaço, mas também folhas e galhos).
Ambas as amostras foram processadas em um multiprocessador de cozinha (Philco multipro, 800W, China), até que o tamanho da partícula ficasse entre 2-33 mm de diâmetro, logo após as amostras foram colocadas em sacos plásticos e armazenadas a -20 °C.
3.2. Caracterização primária do bagaço de laranja
3.2.1. Determinação de sólidos totais e umidade
Para a determinação dos sólidos usou-se o protocolo descrito pelo NREL (Laboratório Nacional de Energia Renovável - National Renewable Energy Laboratory)61.
Três placas de Petri previamente secas em estufa foram pesadas em uma balança analítica e suas massas anotadas. Então colocou-se cerca de 17 g de bagaço de laranja processado e homogeneizado em cada uma das placas que foram novamente pesadas. As placas com bagaço foram levadas a estufa a 105 °C por 5 h. Passadas as 5 h as placas de Petri com bagaço foram resfriadas em um dessecador até que atingissem a temperatura ambiente para serem novamente pesadas.
O cálculo utilizado é mostrado abaixo:
% ó = 3 − 1
2 − 1∙ 100
M1 = Placa de Petri vazia
M2 = Placa de Petri com bagaço de laranja úmido M3 = Placa de Petri com bagaço de laranja seco
Para o cálculo da porcentagem de umidade foi utilizada a equação abaixo:
% = 100 − % ó
3.2.2. Determinação do conteúdo de cinzas
A determinação do conteúdo de cinzas foi realizada com as amostras de bagaço previamente secas conforme descrição do item 2.2.1.
Em seguida, as amostras de bagaço seco foram colocadas em cadinhos de porcelana previamente secos e de massas conhecidas, que foram novamente pesados em balança analítica. Os cadinhos foram levados à mufla a 525 °C por 5 h, então em um dessecador foram deixados resfriar a temperatura ambiente para serem pesados e o conteúdo de cinzas calculado pela equação abaixo:
% = 3 − 1
2 − 1∙ 100
M1 = Cadinho de porcelana vazio
M2 = Cadinho de porcelana com bagaço de laranja seco M3 = Cadinho com cinzas de BL
3.3. Determinação de fibras
3.3.1. Determinação de fibras em detergente neutro (FDN)
Cinco bolsas de filtros (F57, ANKOM Technology) foram pesadas em uma balança analítica. Cerca de 0,50 g de bagaço de laranja previamente seco em estufa a 105 °C por 5 h foi colocado em três das bolsas de filtro, as outras duas foram usadas como fator de correção. Todas as bolsas de filtro foram fechadas selando as extremidades com calor.
A solução detergente foi preparada em um béquer de 1 L contendo: 15 g de dodecil sulfato de sódio, 9,31 g de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), 3,40 g de borato de sódio, 2,28 g de fosfato de sódio bibásico (anidro), 5 mL de trietilenoglicol em 500 mL de
água destilada, para homogeneizar a solução foi aquecida por 5 minutos. Além disso, adicionou-se 5 g de sulfito de sódio e 1 mL de α-amilase.
As bolsas de filtro foram mergulhadas nessa solução e deixadas em agitação por 75 min a 100 °C. Em seguida os filtros foram lavados com água destilada quente (80 °C), o excesso de água foi removido e os filtros foram colocados em um béquer contendo acetona por 5 min.
Posteriormente os filtros foram colocados em estufa a 105 °C até que estivessem completamente secos para serem pesados em uma balança analítica.
A porcentagem de fibras neutras detergentes foi calculada de acordo com a equação abaixo:
% = 3 − ( 1 ∙ 1)
2 ∙ 100
M1 = Massa da bolsa de filtro M2 = Massa do bagaço
M3 = Massa da bolsa de filtro com bagaço após a extração
C1 = Fator de correção (média das bolsas vazias após extração/média das bolsas vazias antes da extração)
3.3.2. Determinação das fibras em detergente ácido (FDA)
Cinco bolsas de filtros (F57, ANKOM Technology) foram pesadas em uma balança analítica. Cerca de 0,50 g de bagaço de laranja previamente seco em estufa a 105 °C por 5 h foi colocado em três das bolsas de filtro, as outras duas foram usadas como fator de correção. Todas as bolsas de filtro foram fechadas selando as extremidades com calor.
A solução detergente ácida foi preparada em um béquer de 1 L contendo: 10 g de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) em 500 mL de solução 1 mol.L-1 de H
2SO4.
As bolsas de filtro foram mergulhadas nessa solução e deixadas em agitação por 1h a 100 °C. Em seguida os filtros foram lavados com água destilada quente (80 °C), o excesso de água foi removido e os filtros foram colocados em um béquer contendo acetona por 5 min.
Posteriormente os filtros foram colocados em estufa a 105 °C até que estivessem completamente secos para serem pesados em uma balança analítica.
A porcentagem de fibras neutras detergentes foi calculada de acordo com a equação abaixo:
% # = 3 − ( 1 ∙ 1)
2 ∙ 100
M1 = Massa da bolsa de filtro M2 = Massa do bagaço
M3 = Massa da bolsa de filtro com bagaço após a extração
C1 = Fator de correção (média das bolsas vazias após extração/média das bolsas vazias antes da extração)
3.3.3. Determinação de lignina em detergente ácido (LDA)
Depois da determinação de fibras em detergente ácido (FDA) descrita no tópico 2.3.2, as bolsas de filtro previamente pesadas foram colocadas em um béquer contendo uma solução 72% de H2SO4, as bolsas de filtro foram mantidas submergidas e agitadas a cada 30 min.
Após 3 h as amostras foram lavadas até que todo o ácido tivesse sido removido, o excesso de água foi removido e os filtros foram colocados em um béquer contendo acetona por 5 min.
Posteriormente os filtros foram colocados em estufa a 105 °C até que estivessem completamente secos para serem pesados em uma balança analítica.
A porcentagem de fibras neutras detergentes foi calculada de acordo com a equação abaixo:
% $ # = 3 − ( 1 ∙ 1)
2 ∙ 100
M1 = Massa da bolsa de filtro M2 = Massa do bagaço
C1 = Fator de correção (média das bolsas vazias após extração/média das bolsas vazias antes da extração).
3.4. Determinação de Pectina
A determinação de pectina foi feita em triplicata. 17 g de bagaço de laranja processado e homogeneizado foram fervidos em 50 mL de uma solução de 0,05 mol.L-1 de HCl por 1 h a 100 °C. Então o extrato foi filtrado com o auxílio de um funil de Büchner, kitassato, bomba a vácuo e papel de filtro. O procedimento de extração e filtração foi repetido para o resíduo retido no papel de filtro. Os dois filtrados foram misturados e deixados resfriar a temperatura ambiente.
A pectina foi precipitada adicionando-se ao filtrado dois volumes de uma solução 95% de etanol acidificada com 0,05 mol.L-1 de HCl. A pectina resultante foi filtrada em papel de filtro previamente pesado e lavada com uma solução de 65% de etanol acidificada e depois com a mesma solução que foi utilizada na precipitação. O papel de filtro contendo a pectina foi seco em estufa a 40 °C até que estivesse completamente seco.
A equação utilizada para o cálculo da porcentagem de pectina segue abaixo.
% % = 2 − 1
3 ∙ 100
M1 = Massa do papel de filtro
M2 = Massa do papel de filtro com pectina seca M3 = Massa do bagaço de laranja
3.5. Extração do óleo essencial
O óleo essencial do bagaço de laranja foi extraído por destilação a vapor. 50 g do bagaço de laranja processado e homogeneizado foi colocado no balão de fundo redondo e o vapor produzido em um frasco de destilação foi passado pelo bagaço por cerca de 40 min. Nessa técnica o óleo é carregado pelo vapor e condensa no condensador caindo em um balão.
O óleo foi extraído com o auxílio de um funil de separação. No funil de separação foi colocado éter dietílico e o destilado, então foi vigorosamente agitado e deixado que as fases se separassem. A fase de aquosa foi removida e a fase orgânica, que contém o óleo, foi coletada. A extração foi repetida, e a fase orgânica resultante das duas extrações foi seca com sulfato de sódio anidro.
No rota-evaporador, todo o éter dietílico foi removido e o frasco contendo o óleo foi pesado.
O teor de óleo essencial presente na amostra foi calculado de acordo com o a equação mostrada abaixo:
% ó = 2 − 1
3 ∙ 100
M1 = Massa do balão de coleta
M2 = Massa do balão de coleta mais óleo M3 = Massa de bagaço de laranja
3.6. Determinação de hesperidina
A hesperidina foi extraída a partir de 20 g do pellet triturado, usando um extrator Soxhlet. Para isso o material triturado foi colocado em uma cápsula de celulose, e o extrator Soxhlet foi acoplado a um balão de 500 mL contendo 250 mL de éter de petróleo como solvente de extração e a um condensador. A mistura foi aquecida por 4 h sob forte refluxo. Então o extrato de éter de petróleo foi removido. O conteúdo da cápsula foi removido do extrator para que todo o éter evaporasse antes de se prosseguir com a extração.
Em seguida, realizou-se uma segunda etapa de extração, dessa vez com 250 mL de metanol. O refluxo de metanol durou cerca de 4 h, até que o solvente, que inicialmente saía de coloração marrom quando em contato com a amostra, passou a sair incolor.
O extrato do pellet em metanol foi evaporado em um rotaevaporador até a consistência de um xarope. Ao xarope foram adicionados 50 mL de solução de ácido acético 6% para a formação de um precipitado. A suspensão foi centrifugada a 5000 rpm e o
sobrenadante descartado. Então o precipitado (hesperidina bruta) foi lavado com solução de ácido acético 6% e seco a 60 °C.
A recristalização da hesperidina foi realizada dissolvendo-a em solução 5% de dimetilsulfóxido sob agitação e aquecimento de 70 °C. Então desligou-se o aquecimento e adicionou-se o mesmo volume de água destilada gota-a-gota sob constante agitação. A solução foi deixada esfriar até atingir a temperatura ambiente quando se formaram os cristais de hesperidina, que foram filtrados e deixados secar a 60 °C.
3.7. Isolamento de microrganismos do bagaço de laranja
O isolamento de culturas a partir do bagaço de laranja industrial foi realizado como descrito por Tsukamoto et al. (2009)8.
Em meio sólido colocando-se pequenos pedaços de bagaço em placas de Petri contendo meio sólido YPD (20 g L-1 de glicose, 10 g L-1 extrato de levedura, 20 g L-1 peptona, 15 g L-1 ágar e 30 mg mL-1 cloranfenicol) as placas foram então incubadas de 24-48 h a 30 °C.
Depois da incubação as colônias que cresceram isoladas foram selecionadas e transferidas para outra placa de Petri contendo meio sólido YPD e novamente incubadas a 30 °C por 24 h. O procedimento foi repetido mais quatro vezes a fim de se garantir que a colônia fosse de apenas um microrganismo.
Após o isolamento as colônias resultantes foram testadas frente ao crescimento em presença de d-limoneno 0,5% em meio líquido de YPD. As colônias que apresentaram maior densidade ótica em 600 nm (DO600) foram selecionadas para fermentação.
Para a fermentação, foi crescido um pré-inóculo a partir de uma colônia em 5 mL de YPD e incubado por 16 h a 30 °C, então a cultura foi utilizada para inocular erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de YPD com DO600 inicial de 0,2. Os inóculos foram incubados a 30 °C por 24 h e amostras foram retiradas nos seguintes tempos: 0, 3,5, 6,5, 8,5 e 24 h para análise por HPLC do consumo de glicose e produção de etanol, já o crescimento foi acompanhado através da leitura da densidade ótica em 600 nm durante 24 h. As melhores culturas foram armazenadas em glicerol 20% para posterior teste com hidrolisado.
3.8. Expressão do gene sintético, lise e purificação
O gene sintético clonado em pET28 foi transformado por protocolo quimiocompetente em células competentes de Origami 2 (DE3), o cultivo cresceu em placa de Petri contendo meio LB e as seleções de canamicina e tetraciclina por 16 h.
Então de uma colônia isolada foi realizado um pré-cultivo em 25 mL de meio de cultura LB contendo canamicina e tetraciclina incubado a 37 °C com agitação de 220 rpm. Após o crescimento de aproximadamente 4 h o pré-cultivo foi utilizado para inocular 300 mL de meio LB contendo os mesmos antibióticos de seleção em uma A600 inicial = 0,1, o cultivo foi novamente incubado a 37 °C e 220 rpm, e quando este atingiu A600 de 0,8-1,0 foi induzido adicionando-se IPTG na concentração final de 1 mmol L-1 e incubado por 16 h a 18 °C com agitação de 220 rpm.
A cultura foi centrifugada a 6000 rpm por 15 min e 4 °C. O sobrenadante foi descartado e as células foram armazenadas a -80°C por ao menos 2 h. As mesmas foram suspensas em 20 mL de tampão 50 mmol L-1 Tris-HCl, pH 7,5 e a lise foi realizada por sonicação utilizando-se cinco ciclos de 10 s/10 s (sempre em gelo). Em seguida a amostra foi centrifugada a 6000 rpm por 30 min a 4 °C.
A fração solúvel das proteínas foi filtrada em filtro 0,45 µm e então purificada. A purificação foi realizada utilizando-se uma coluna de afinidade FF Crude 1 mL (GE). Para a purificação utilizou-se um gradiente do tampão A (50 mmol L-1 fosfato de sódio pH 7,5, 300 mmol L-1 cloreto de sódio, PMSF, β-mercaptoetanol, 5 mmol L-1 imidazol) e do tampão B (50 mmol L-1 fosfato de sódio pH 7,5, 300 mmol L-1 cloreto de sódio, PMSF, β-mercaptoetanol, 500 mmol L-1 imidazol). As amostras da purificação foram recolhidas e armazenadas a 4°C.
Para a filtração em gel utilizou-se uma coluna Sephadex 75 (GE) com volume de coluna de 24 mL. Injetou-se 100 µL da padrão BlueDextran para a determinação do volume morto, em seguida foi realizada uma curva de calibração com os padrões de conoalbumina, ovoalbumina, anidrase carbônica, ribonuclease e aprotinina.
Finalmente injetou-se a amostra e através do volume de eluição do pico foi possível a determinação da massa molar da mesma.
3.9. Determinação das condições ótimas de ensaio de atividade
As condições ótimas de atuação da celulase frente a hidrólise de carboximetil celulose (CMC) foram encontradas primeiramente variando o tempo de incubação da proteína com o substrato. O ensaio foi realizado em pH 6 e temperatura de 35 °C. Após determinado essa condição foi feito o teste de pH, no qual o pH foi variado a uma temperatura fixa, e em seguida para se determinar a temperatura ótima do ensaio variou-se a temperatura no melhor pH encontrado62.
Para isso utilizou-se o tampão Na2HPO4/Ácido cítrico a concentração de 50 mmol L-1 que permite uma larga faixa de pH sem alteração da força iônica, os seguintes pHs foram testados: 2,5; 3,5; 4,5; 5,5; 6,5 e 7,5. O ensaio foi realizado com 200 nmol L-1 da enzima purificada em 1 mL do tampão contendo 0,5% de carboximetil celulose. A reação foi incubada por 30 min a 50°C.
Com o objetivo de parar a reação e também quantificar a produção de açúcares redutores adicionou-se 1 mL de reagente de ácido dinitrosalicílico (DNS) que foi então incubado a 100 °C por 5 min. A absorbância a 540 nm foi lida em espectrofotômetro e a concentração determinada a partir de uma curva de calibração de glicose63.
Após determinado o pH ótimo de atuação da enzima variou-se a temperatura. A reação foi preparada conforme descrito anteriormente, porém com o tampão de pH adequado. As temperaturas testadas foram as seguintes: 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 e 80 °C. Da mesma forma a reação foi parada e quantificada por reagente DNS62.
3.10. Cinética
Os ensaios de atividade foram realizados utilizando 200 nmol L-1 de enzima e variando-se a concentração do substrato (CMC) no tampão 50 mmol L-1 ácido citríco/Na
2HPO4 pH 6,5 a 35°C incubada por 30 min. As concentrações utilizadas foram as seguintes: 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 e 4,0% (m/V) de CMC.
A concentração de açúcares redutores gerados foi monitorada pela reação de DNS conforme descrito anteriormente.
Utilizando a equação de Michaelis-Menten64 (equação VII) e a equação de Lineweaver-Burk (equação VIII) foi possível determinar a velocidade inicial (V0) velocidade
máxima (Vmáx), a constante de Michaelis-Menten (Km) e número de renovação (kcat) enzimático. &' = &(á*[+] ,(+ [+] (&..) 1 &'= ,( &(á*[+]+ 1 &(á* (&...) 3.11. Dicroísmo circular
Para o ensaio de dicroísmo circular realizou-se uma troca de tampão da fração da purificação da celulase, para isso utilizou-se uma coluna de dessalinização PD-10 (GE), coluna de gel filtração empacotada com Sephadex G-25. A coluna PD-10 foi equilibrada passando-se 15 mL de tampão 50 mmol L-1 Na
2HPO4/ácido cítrico pH 6,5, então 2,5 mL de amostra foram adicionados à coluna e eluída em 3,5 mL do tampão de equilíbrio65.
A concentração da proteína após a troca do tampão foi medida a 280 nm em cubeta de quartzo de 1 cm. Utilizando-se o coeficiente de extinção molar (valor calculado de 121365 mol-1 L cm-1) foi possível calcular a concentração a partir da lei de Beer.
No equipamento Jasco J-720 foram realizadas medidas do tampão ácido cítrico/Na2HPO4 fosfato 50 mmol L-1 (branco da amostra). As aquisições foram realizadas de 207 a 260 nm, em cubeta de 0,1 cm de caminho óptico, sendo realizadas 8 aquisições da cubeta contendo apenas o tampão no qual a proteína foi eluída e, finalmente, foram realizadas 16 aquisições da amostra no mesmo tampão.
Também foram realizadas leituras aumentando a temperatura da amostra de 25 a 90 °C e então esfriando-se lentamente a amostra de 90 a 25 °C, e uma outra análise aumentando de 25 a 60 °C e depois de 60 a 25 °C.
Por fim, diferentes pH do tampão foram analisados. Para isso a proteína foi eluída em tampão 50 mmol L-1 Na
2HPO4/ácido cítrico nos seguintes pH: 2,5, 4,5, 5,5, 6,5 e 7,5 e incubada por 16 h antes da análise de dicroísmo circular.
3.12. Fluorescência
As análises de fluorescência foram realizadas com as amostras em diferentes valores de pH preparadas para o dicroísmo circular.
Primeiro foi realizado um espectro de excitação de 200 a 450 nm para encontrar o máximo de excitação da amostra. Em seguida, foi realizado o espectro de emissão de 300 a 450 nm da amostra excitada a 278 nm.
4. Resultados e Discussão
Parte I – Caracterização do Bagaço de Laranja e Isolamento de Microrganismo
de Laranja
4.1. Caracterização do Bagaço de Laranja
Com o objetivo de conhecer melhor a natureza da matéria prima, e também facilitar a interpretação dos resultados obtidos com os diferentes tipos de bagaço utilizados, foi feita a caracterização dos mesmos para a determinação dos teores de sólidos totais e umidade, cinzas e determinação de fibras (celulose, hemicelulose e lignina).
No método de determinação de Fibras em Detergente Neutro (FDN), a amostra de bagaço é tratada com uma solução de detergente, após o tratamento, as fibras restantes são compostas predominantemente por celulose, hemicelulose e lignina. No método de Fibras em Detergente Ácido (FDA) o resíduo que sobra da digestão da biomassa com ácido sulfúrico e CTAB é principalmente celulose e lignina. Já no método de Lignina em Detergente Ácido (LDA), após o tratamento com ácido sulfúrico a celulose é removida e o objetivo é calcular a porcentagem de lignina presente na amostra.
A Tabela 1 resume os principais resultados para a caracterização do bagaço de laranja obtido do restaurante local (amostra comercial) e também os resultados obtidos para a caracterização do bagaço industrial obtido da empresa Citrosuco (amostra industrial).
