FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
CAIO JORDÃO TEIXEIRA
IMPACTO DA CORTICOTERAPIA GESTACIONAL SOBRE O REMODELAMENTO DA CÉLULA BETA PANCREÁTICA DE RATAS WISTAR DURANTE A LACTAÇÃO
CAMPINAS 2019
IMPACTO DA CORTICOTERAPIA GESTACIONAL SOBRE O REMODELAMENTO DA CÉLULA BETA PANCREÁTICA DE RATAS WISTAR DURANTE A LACTAÇÃO
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Silvana Auxiliadora Bordin da Silva COORIENTADOR: Prof. Dr. Gabriel Forato Anhê
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO DA TESE DE DOUTORADO DEFENDIDA PELO ALUNO CAIO JORDÃO TEIXEIRA, ORIENTADO PELA PROFA. DRA. SILVANA AUXILIADORA BORDIN DA SILVA E COORIENTADO PELO PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ.
CAMPINAS 2019
CAIO JORDÃO TEIXEIRA
ORIENTADORA: PROFa. DRa. SILVANA AUXILIADORA BORDIN DA SILVA
COORIENTADOR: PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ
MEMBROS:
1. PROFa. DRa. SILVANA AUXILIADORA BORDIN DA SILVA
2. PROF. DR. EDSON ANTUNES
3. PROF. DR. ANTONIO CARLOS BOSCHIERO
4. PROFa. DRa. APARECIDA EMIKO HIRATA
5. PROFa. DRa. FERNANDA ORTIS
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Dedico este trabalho aos meus pais, meu alicerce, meu porto seguro.
A Deus, primeiramente, por ter me capacitado em todo o tempo para realização deste trabalho, pois os desafios não foram poucos.
Aos meus pais, Sebastião e Ivete, e ao meu irmão, Ricardo, pelo amor, carinho, palavras de incentivo e investimento. Sem a presença de vocês nesta etapa da minha vida as coisas não teriam o mesmo sentido. Amo vocês!
A minha orientadora, Profa. Dra. Silvana Auxiliadora Bordin da Silva, pela amizade, confiança e momentos de aprendizado que tenho certeza que irão fazer toda diferença em minha vida acadêmica e profissional. Você é uma pessoa inspiradora!
Ao meu coorientador, Prof. Dr. Gabriel Forato Anhê, pela amizade, respeito e credibilidade em mim depositada para execução deste estudo em seu laboratório. Obrigado pelos diversos ensinamentos, “puxões de orelha” e o bom convívio diário.
Aos colegas de laboratório Dailson Nogueira, Rodrigo Lacerda, Vanessa Veronesi, Junia Carolina, Filiphe Mesquita, Mariana Rodrigues, Fernanda Ballerini, Julia Vicente, Priscilla Muniz e Kely Belato pelos momentos de descontração, críticas e ajuda.
Aos funcionários do Departamento de Farmacologia Patricia Panuto, José Ilton e Gláucia Mello pelo suporte técnico.
Às secretárias do Departamento de Farmacologia Cidinha Moreira e Maisa Santos pelos auxílios de assuntos administrativos.
Aos funcionários do biotério do Departamento de Farmacologia Miguel Borges, Ivani Correia e Agnaldo Fernando pelo zelo e atenção com os animais de experimentação.
longo do período de doutorado.
Aos professores Everardo Carneiro e Licio Velloso pelas longas horas de uso do fotomicroscópio em seus laboratórios.
E por fim, a todos aqueles que ajudaram direta ou indiretamente para conclusão deste trabalho. Os meus mais sinceros agradecimentos.
“O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001”.
“Tudo tem o seu tempo determinado. Há tempo de nascer e tempo de morrer. Tempo de plantar e tempo de arrancar o que se plantou. Tempo de chorar e tempo de rir. Tempo de prantear e tempo de saltar de alegria. Tempo de espalhar pedras e tempo de ajuntar pedras. Tempo de abraçar e tempo de afastar-se de abraçar. Tudo fez Deus formoso no seu devido tempo”.
As ilhotas pancreáticas de ratas prenhes apresentam aumento transitório na taxa de proliferação e massa de células β pancreáticas. O aumento da apoptose durante o início da lactação contribui para a rápida reversão dessas alterações morfológicas. Estudos indicam que a exposição a glicocorticoides sintéticos, como a dexametasona (DEX), durante a gestação pode prejudicar a secreção de insulina, mas o seu impacto sobre as alterações morfológicas que ocorrem nas ilhotas pancreáticas durante a gestação e lactação ainda não foram descritos. Neste estudo foram avaliadas as características morfológicas e moleculares das ilhotas pancreáticas de ratas que foram tratadas com veículo (CTL) ou que receberam DEX na água de beber (0,1 mg/kg peso corporal) entre o 15º e 20º dias de gestação. As ilhotas pancreáticas foram analisadas no 20º dia de gestação (P20) e no 3º (L3), 8º (L8), 14º (L14) e 21º (L21) dias de lactação. As ilhotas pancreáticas de ratas CTL exibiram aumentos transitórios na proliferação celular e massa de células β pancreáticas em P20, que foram revertidas logo no início da lactação, em L3. Isto foi seguido pelo aparecimento de características morfológicas de neogênese das ilhotas pancreáticas em L8. Ilhotas de ratas DEX, entretanto, não apresentaram a redução da massa células β em L3, que foi acompanhado pelo aumento a expressão de marcadores de macrófagos M2 em relação aos macrófagos M1 e marcadores de linfócitos T neste mesmo estágio de lactação. Além disso, as ilhotas pancreáticas de ratas DEX também não exibiram as características morfológicas de neogênese em L8. Parâmetros zoométricos, como peso corporal materno e da prole, além da glicemia durante a gestação também foram impactados após a administração do fármaco. O presente estudo demonstrou que as ilhotas pancreáticas de ratas Wistar passam por um processo de renovação celular durante a lactação, que é prejudicada pela exposição à DEX durante a gestação.
Pancreatic islets from pregnant rats develop a transitory increase in the pancreatic β-cell proliferation rate and mass. Increased apoptosis during early lactation contributes to the rapid reversal of those morphological changes. Exposure to synthetic glucocorticoids, such as dexamethasone (DEX), during pregnancy has been previously reported to impair insulin secretion, but its impacts on pancreatic islet morphological changes during pregnancy and lactation have not been described. To address this issue, we assessed the morphological and molecular characteristics of pancreatic islets from rats that underwent undisturbed pregnancy (CTL) or were treated with 0.1 mg/kg body mass dexamethasone via drinking water between the 15th and 20th days of pregnancy (DEX). Pancreatic islets were analyzed on the 20th day of pregnancy (P20) and on the 3rd (L3), 8th (L8), 14th (L14) and 21st (L21) days of lactation. Pancreatic islets from CTL rats exhibited transitory increases in cellular proliferation and pancreatic β-cell mass at P20, which were reversed at L3. This was followed by the appearance of morphological features of pancreatic islet neogenesis at L8. Islets from DEX rats did not demonstrate an increase in apoptosis at L3, which coincided with an increase in the expression of M2 macrophage markers relative to M1 macrophage and T lymphocyte markers. Islets from DEX rats also did not exhibit the morphological characteristics of pancreatic islet neogenesis at L8. Zoometric parameters, such as maternal and offspring body mass, and glycemia during pregnancy were also impacted after steroid administration. Our data demonstrate that pancreatic islets of Wistar rats undergo a renewal process during lactation that is impaired by exposure to DEX during pregnancy.
Figura 1 – Gráfico temporal das adaptações estruturais das células β ao longo da
gestação e logo após o parto de roedores... 21
Figura 2 – Delineamento experimental…………...………...…. 28
Figura 3 – Organização das secções para as reações imunohistoquímicas... 29
Figura 4 – Passo a passo para determinação da área das ilhotas pancreáticas. 32
Figura 5 – Determinação da área total da secção do pâncreas... 34
Figura 6 – Contagem manual dos núcleos das ilhotas pancreáticas... 36
Figura 7 – Características zoométricas e glicemia de ratas que receberam veículo
(CTL) ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação... 41
Figura 8 – Área média de ilhotas pancreáticas de ratas que receberam veículo (CTL)
ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação... 43
Figura 9 – Massa média de ilhotas pancreáticas de ratas que receberam veículo (CTL)
ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação... 45
Figura 10 – Imagens representativas das seçcões de pâncreas submetidas as
reações de imunoperoxidase para insulina... 47
Figura 11 – Proliferação celular de ilhotas pancreáticas de ratas que receberam
veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação... 48
Figura 12 – Imagens representativas das seçcões de pâncreas submetidas as
reações de imunoperoxidase para Ki-67... 49
Figura 13 – Expressão gênica de marcadores de macrófagos M2 em relação aos
macrófagos M1 e linfócitos T em ilhotas pancreáticas isoladas de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação... 50
Figura 14 – Avaliação de parâmetros de neogênese em ratas que receberam veículo
AMPc Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
BrdU Bromodesoxiuridina
BSA Albumina de soro bovino
CaCl2.2H2O Cloreto de cálcio dihidratado
CD206 Receptor de manose
cDNA DNA complementar
DAB Diaminobenzidina
DEX Dexametasona
DM Diabetes mellitus
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP Desoxirribonucleotídeo fosfatado EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EICs Aglomerados de células positivas para insulina extrailhotas ERKs Quinases reguladas por sinais extracelulares
G6Pase Glicose-6-fosfatase
GCs Glicocorticoides
GR Receptor de glicocorticoide
HPA Eixo hipotálamo-pituitária-adrenal H2O2 Peróxido de hidrogênio
i.p. Via de administração intraperitoneal IFN-γ Interferon-gama
IHQ Reação imunohistoquímica
IL Interleucina
KCl Cloreto de potássio
kg Quilograma
KH2PO4 Fosfato de potássio monobásico
Ki-67 Antígeno nuclear marcador de proliferação celular
Lta Linfotoxina-α
MAPKs Proteínas quinases ativadas por mitógeno
mg Miligrama
MgSO4.7H2O Sulfato de magnésio heptahidratado
mRNA RNA mensageiro (ácido ribonucleico transcrito a partir de uma cadeia de DNA)
Na2HPO4.12H2O Fosfato de sódio bibásico dodecahidratado
NaCl Cloreto de sódio
NaHCO3 Bicarbonato de sódio
ng Nanograma
Ngn3 Neurogenina 3
NK Célula natural killer
nm Nanômetro
NOD Camundongo diabético não obeso PBS Tampão fosfato salino
PCR Reação em cadeia da polimerase PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinase
qPCR PCR em tempo real
RNA Ácido ribonucleico
STAT5 Transdutor de sinal e o ativador de transcrição 5
TBS Tampão tris salino
TGF-β1 Fator de crescimento transformador beta 1 Tnf Fator de necrose tumoral-α
UPR Resposta a proteína mal enovelada (Unfolded Protein Response)
µL Microlitro
µm Micrômetro
1 INTRODUÇÃO ... 17
1.1 Adaptações metabólicas na gestação ... 17
1.2 Alterações na células β pancreáticas na gestação ... 18
1.3 Gestação e glicocorticoides ... 22
1.4 Glicocorticoides e células β pancreáticas ... 24
2 OBJETIVOS ... 26
2.1 Geral ... 26
2.2 Específicos ... 26
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 27
3.1 Animais e delineamento experimental ... 27
3.2 Tratamento com dexametasona ... 27
3.3 Dosagem de glicose no sangue total ... 28
3.4 Abordagens quantitativas no pâncreas endócrino ... 28
3.4.1 Imunohistoquímica para insulina e Ki-67 ... 30
3.4.2 Morfologia do pâncreas endócrino ... 31
3.4.3 Avaliação de neogênese ... 35
3.4.4 Proliferação celular das ilhotas pancreáticas ... 35
3.5 Isolamento das ilhotas pancreáticas ... 37
3.6 Extração de RNA total ... 37
3.7 Obtenção do cDNA ... 38
3.8 qPCR ... 38
3.9 Análise estatística ... 39
4 RESULTADOS ... 40
4.1 Parâmetros zoométricos e glicemia ... 40
4.2 Parâmetros morfométricos das ilhotas pancreáticas ... 42
4.3 Análise da massa média de ilhotas pancreáticas, células β e células não β pancreáticas ... 44
4.4 Proliferação celular das ilhotas pancreáticas ... 48
4.5 Análise da expressão de mRNAs de marcadores de macrófagos M2 em relação aos macrófagos M1 e linfócitos T em ilhotas pancreáticas isoladas em L3 ... 50
4.6 Parâmetros de neogênese em ilhotas pancreáticas ... 51
5 DISCUSSÃO ... 56
Apêndice 1 – Número de ilhotas analisadas em cada ponto de investigação após a
realização das reações de imunoperoxidase para insulina para a avaliação dos aspectos morfológicos do pâncreas endócrino (n = 4). ... 75
Apêndice 2 – Imagem representativa de ilhotas classificadas por faixas de tamanho
após a realização das reações de imunoperoxidase para insulina. ... 76
Apêndice 3 – Imagem representativa de ilhotas pancreáticas associadas com
ductos após a realização das reações de imunoperoxidase para insulina. ... 77
Apêndice 4 – Número de ilhotas analisadas em cada ponto de investigação após a
realização das reações de imunoperoxidase para Ki-67 para a avaliação da proliferação celular do pâncreas endócrino (n = 4). ... 77
Apêndice 5 – Número de núcleos contados manualmente em cada ponto de
investigação após a realização das reações de imunoperoxidase para Ki-67 para a avaliação da proliferação celular do pâncreas endócrino (n = 4). ... 78
Apêndice 6 – Massa total do pâncreas dos animais utilizados para as análises
histológicas em cada ponto de investigação (n = 4). ... 78
ANEXOS ... 79 Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética para realização do estudo. ... 79 Anexo 2 – Artigo publicado no periódico Endocrine Connections referente à tese.
... 80
Anexo 3 – Artigo publicado no periódico Life Sciences paralelo à tese. ... 81 Anexo 4 – Artigo publicado em colaboração no periódico Scientific Reports durante
o doutorado. ... 82
Anexo 5 – Artigo publicado em colaboração no periódico Life Sciences durante o
doutorado. ... 83
Anexo 6 – Artigo aceito para publicação em colaboração no periódico Biological
Research for Nursing durante o doutorado. ... 84
Anexo 7 – Artigo submetido em colaboração no periódico Molecular and Cellular
Endocrinology durante o doutorado. ... 85
Anexo 8 – Artigo submetido em colaboração no periódico Scientific Reports durante
1 INTRODUÇÃO
1.1 Adaptações metabólicas na gestação
A gestação é um estado dinâmico que envolve várias adaptações metabólicas maternas cruciais para o fornecimento contínuo de substratos essenciais para o crescimento e desenvolvimento do feto, que podem ser classificadas em 2 fases: uma fase anabólica e outra catabólica (1, 2). Na fase anabólica, que acontece no início da gestação e cuja a demanda fetal é baixa (caracterizado pelos primeiros dois trimestres em humanos, e os 10 primeiros dias em roedores), os estoques energéticos são formados através da deposição de triacilglicerol (TAG) no tecido adiposo, para hidrólise e utilização no final da gestação (3). Isto se deve pelo aumento progressivo do consumo alimentar materno ao longo da gestação (4) bem como pelo aumento da de novo lipogênese pelo fígado (5), garantindo, portanto, um maior aporte de substratos metabólicos.
O fim da gestação é caracterizado pela fase catabólica, no qual observa-se uma redução dos depósitos de gorduras corporais como consequência de um aumento na atividade lipolítica do tecido adiposo para uso materno, uma vez que demanda energética fetal é alta e a glicose é mobilizada para o crescimento do mesmo (6, 7). Baseado nisso, evidências indicam que este período é acompanhado pelo aumento da taxa de utilização de glicose pelo concepto, que representa 23% do total utilizado pelo organismo materno no estado basal (8).Desta forma, a fase anabólica garante o armazenamento de energia em antecipação à alta demanda fetal que ocorre subsequentemente, enquanto a fase catabólica garante o aumento de substratos que serão direcionados para o crescimento fetal.
É importante mencionar que as adaptações no metabolismo materno descritas acima que acontecem na fase catabólica são acompanhadas por alterações hormonais e metabólicas transitórias (6, 9). Do ponto de vista hormonal, estudos indicam uma redução nos níveis de adiponectina durante a gestação, sugerindo uma relação direta com a sensibilidade à insulina (10). Paralelamente, também foi observado que o aumento da concentração plasmática de hormônios sexuais, corticosteroides e lactogênios, como a prolactina e lactogênio placentário, podem também contribuir para as alterações no metabolismo de carboidratos materno (11).
Ademais, a participação da unidade feto-placentária na produção e secreção de diversos hormônios, fatores de crescimento e marcadores inflamatórios, podem impactar a adaptação materna induzida pela gestação. Hormônios como leptina (12), resistina (13), hormônio do crescimento (14), hormônio liberador de corticotrofina (15), fatores de crescimento semelhante à insulina I e II (16), além de marcadores inflamatórios como receptores do tipo Toll-2 e -4, interleucina (IL)-6 e -8, fator de necrose tumoral (TNF)-α e macrófagos polarizados M1 (12, 17, 18) podem reduzir a sensibilidade à insulina, e fazem com que as origens das alterações na homeostase glicêmica materna sejam extremamente complexas.
Concordante a isso, foi previamente demonstrado que o final da gestação é acompanhado por um estado de resistência à ação da insulina em tecidos metabolicamente ativos, como tecido adiposo (10, 19) e musculatura esquelética (8, 20), o que é crucial para o fluxo de nutrientes para o feto, além do aumento da produção hepática de glicose e sua liberação (7), sendo necessárias adaptações nas células β pancreáticas materna para garantir um adequado aporte de insulina na corrente sanguínea para a regulação da homeostase glicêmica neste período.
1.2 Alterações na células β pancreáticas na gestação
O metabolismo de carboidratos materno durante a gestação é diretamente relacionado com a capacidade secretória das células β pancreáticas. Para isso, tais células passam necessariamente por adaptações funcionais e estruturais.
O aumento da oxidação de glicose bem como o aumento da secreção de insulina induzida pela glicose pelas células β pancreáticas são a base das adaptações funcionais que acontecem no pâncreas endócrino durante a gestação. Isso é atribuído ao aumento da expressão do transportador de glicose GLUT2 e da expressão e atividade enzimática da glicoquinase IV, a principal enzima que fosforila a glicose no interior da célula β, aumentando, portanto, a oxidação da glicose (21). Além disso, foi descrito que estas alterações são acompanhadas pelo aumento do metabolismo de AMPc (22), bem como do acoplamento juncional entre as células β (23). Em conjunto, tais alterações levam a uma redução do limiar de sensibilidade à glicose e permitem que as células β pancreáticas maternas sintetizem e secretem mais insulina na presença de menores valores de glicemia plasmática (24).
Do ponto de vista morfológico, estudos prévios indicam há décadas que o aumento da massa de células β pancreáticas é uma adaptação do pâncreas endócrino resultante do aumento da demanda de insulina característica da gestação humana e de roedores (25-27). Em geral, a massa de células β é determinada pelo número e pelo tamanho destas células no pâncreas, aspectos estes que são regulados por mecanismos celulares dinâmicos, como proliferação celular, apoptose, hipertrofia e neogênese (24).
Em modelos animais, estudos indicam que a magnitude da expansão das células β pancreáticas materna que ocorre no fim da gestação seja de 2 a 4 vezes em relação ao estado não gravídico. Tais observações foram descritas a partir da ocorrência da hipertrofia das ilhotas pancreáticas com paralelo aumento na proliferação celular e redução transitória da apoptose neste período (28-31).
Enquanto muitos destes mecanismos são conservados na gestação humana, algumas características particulares foram observadas. A primeira evidência da plasticidade morfológica do pâncreas endócrino materno humano foi apontada por Van Assche et al. (27). Este estudo demonstrou que o final do período gestacional foi acompanhado por hiperplasia das ilhotas pancreáticas com subsequente aumento na fração de área de células β comparado a mulheres não grávidas, provavelmente por aumento na taxa de proliferação celular. Por outro lado, um recente estudo publicado por Butler et al. (32) observou que mulheres gestantes apresentaram um aumento no número de pequenas ilhotas e células positivas para insulina associadas com ductos, o que impactou positivamente a fração da área de células β em aproximadamente 1,4 vezes. Além disso, este estudo não detectou alterações no tamanho médio das ilhotas pancreáticas, número de células β por ilhotas, taxa de proliferação celular ou apoptose, sugerindo que a neogênese pode ter um papel fundamental sobre a proliferação de células β pré-existentes no aumento da massa de células β que ocorre na gestação humana.
Importante salientar que as adaptações descritas acima que ocorrem durante a gestação dependem da ação de alguns hormônios, como lactogênio placentário, hormônio do crescimento e prolactina (33-35). Concordante a isso, Parsons et al. (28) observou que o pico de incorporação de BrdU, um indicador de proliferação celular, em ilhotas pancreáticas foi temporalmente associado ao aumento nos níveis de lactogênio placentário, sugerindo que este hormônio é de fundamental
importância para aumentar a função e sobrevivência celular pancreática em resposta a gestação.
Logo após o parto, as alterações morfofuncionais ocorridas no pâncreas endócrino materno são revertidas semelhantemente ao estado não gravídico. Embora os mecanismos subjacentes a estes processos ainda não sejam totalmente conhecidos, algumas poucas evidências foram descritas. De acordo com Scaglia et al. (30), o aumento da apoptose e a redução da proliferação celular são responsáveis pela reversão da massa de células β pancreáticas logo aos 3-4 dias após o parto. Além disso, este estudo demonstrou que tais alterações foram relacionadas com o aumento do TGF-β1.
Mais recentemente, um estudo publicado pelo nosso grupo demonstrou que a renovação funcional da massa de células β materna logo após o parto cursa com a ativação transitória da UPR (Unfolded Protein Response), achados que resultaram na primeira descrição na literatura da ativação fisiológica da via do estresse do retículo endoplasmático no remodelamento do pâncreas endócrino (36). Além disso, foi descrito que os efeitos estimulatórios induzidos pela prolactina sobre a função das ilhotas pancreáticas isoladas de roedores foram bloqueadas após o tratamento com dexametasona (DEX). Com isso, este estudo conclui que os aumentos nos níveis plasmáticos de glicocorticoides (GCs) que acontecem no final da gestação podem, portanto, inibir a secreção de insulina, a proliferação celular e estimular a apoptose no pâncreas endócrino materno logo após o parto (37). A figura 1 ilustra as adaptações morfológicas ocorridas no pâncreas endócrino materno de roedores no período perinatal.
Ademais, nos últimos 15 anos, nosso laboratório tem investigado os mecanismos envolvidos nas adaptações do pâncreas endócrino no periparto e sua relevância para fisiologia materna. Inicialmente, foi demonstrado que diversas proteínas associadas ao ganho de função pancreática no final da gestação são reguladas positivamente pela prolactina (38, 39) e negativamente pelos GCs (40-42).
Um painel mais detalhado das ações coordenadas da prolactina e dos GCs foi desenhado a partir do estudo conduzido por Lellis-Santos et al. (42), no qual foi observado que o aumento da expressão da proteína G inibitória Rasd1, que reduz a secreção de insulina e provavelmente a proliferação das células β pancreáticas, depende da associação entre STAT5 - o sinalizador intracelular clássico da prolactina - e o receptor de glicocorticoide (GR). Estes resultados explicaram algumas aparentes
discrepâncias, como a manutenção da função exacerbada do final da gestação mesmo na presença de altos níveis de GCs, e a involução morfofuncional após o parto mesmo na presença de altos níveis de prolactina. Mais importante, estes resultados fundamentaram a hipótese de que o estado de fosforilação, associação e localização intracelular do STAT5 e GR - que em última análise representam a sinalização intracelular da prolactina e da corticosterona - são fatores determinantes do remodelamento tecidual induzido por estes hormônios. Cabe destacar que Rasd1 é um alvo validado do microRNA miR-375 (43), um reconhecido regulador da função endócrina pancreática (44). Por fim, descrevemos que as alterações na atividade das MAPKs ERK1/ERK2 pela regulação da expressão da fosfatase MKP1 por GCs é um mecanismo fisiológico de controle da proliferação das células β pancreáticas no periparto (41).
Figura 1 – Gráfico temporal das adaptações estruturais das células β ao longo da
gestação e logo após o parto de roedores.
1.3 Gestação e glicocorticoides
Estudos indicam que, anualmente, são observados mais de 15 milhões de nascimentos prematuros, fato este considerado a principal causa de morte em crianças com idade inferior a 5 anos em todo mundo, além de ser responsável por aproximadamente 35% das mortes em crianças com até 28 dias de vida em 2016 (45, 46). Isto porque a prematuridade predispõe o neonato há diversas morbidades no curto e longo prazo, como a síndrome do desconforto respiratório, displasia broncopulmonar, enterocolite necrosante, sepse, convulsões, hemorragia intraventricular, paralisia cerebral, infecções, dificuldades de alimentação, encefalopatia hipóxico-isquêmica e problemas visuais e auditivos (45, 47-49).
Por outro lado, há várias evidências demonstrando que a administração de corticosteroides in utero é uma das terapias antenatais mais importantes disponíveis para maturação pulmonar do feto, dentre outros benefícios, como drástica redução das mortes neonatais e do risco das complicações acima citadas decorrentes da prematuridade iminente (46, 50, 51). A efetividade de tal conduta clínica foi previamente descrita há décadas em gestações com risco de parto prematuro entre as 24a e 34 a semanas (52, 53), embora atualmente o Comitê de Prática Obstétrica Americano tenha estendido a terapia para as gestantes entre as 34ª e 36a semanas com risco de parto prematuro dentro de sete dias, e que não receberam um curso prévio de corticosteroides antenatais (54).
A síndrome do desconforto respiratório neonatal resulta da diminuição ou atraso da biossíntese de surfactante pulmonar, uma mistura lipoproteica com propriedades tensoativas que reduzem a tensão superficial na interface ar-líquido do alvéolo (55). Sabe-se que o fluido presente entre os espaços alveolares são ricos em íons cloreto, secretados ativamente por transportadores e co-transportadores de íons celulares específicos cuja as expressões encontram-se reduzidas ao final da gestação (56-58). Além disso, o aumento das catecolaminas endógenas que acontece durante o trabalho de parto, como a adrenalina, induzem a absorção dos íons sódio através de canais para sódio e da bomba de sódio e potássio após a ativação de receptores β adrenérgicos (59). Paralelamente, o final da gestação também é marcado pelo aumento dos GCs endógenos que impactam positivamente o número de canais para sódio no epitélio pulmonar (60-62). Em conjunto, estes eventos garantem que o acúmulo de fluido pulmonar fetal seja drasticamente reduzido no nascimento, sendo
que o parto prematuro ou a ausência de trabalho de parto podem resultar na incapacidade de remoção do mesmo, resultando em edema pulmonar e dificuldade respiratória (55).
Atualmente, a betametasona ou dexametasona são os fármacos mais utilizados na prática clínica na promoção do desenvolvimento pulmonar fetal. Estes GCs cruzam a placenta em sua forma ativa e têm atividade biológica quase idêntica, além de apresentarem um tempo de meia vida biológico entre 36 e 72 horas (63). O curso completo da administração do corticosteroide antenatal é definido como 2 doses intramusculares de 12 mg de betametasona com 24 horas de intervalo entre elas ou 4 doses intramusculares de 6 mg de DEX com 12 horas de intervalo em até 7 dias antes do parto (63, 64). Estes fármacos são esteroides sintéticos com alta afinidade para o receptor de GCs, mas com mínima atividade mineralocorticoide (65).
Estima-se que 75% dos receptores de corticosteroides disponíveis no feto sejam ocupados após a exposição exógena, o que deve induzir uma resposta in utero máxima aos receptores corticosteroides presentes nos tecidos fetais (66). Além disso, foi previamente descrito que a bioatividade da 11β-hidroxiesteroide desidrogenase do tipo 2 (11β-HSD2), uma enzima presente na placenta responsável por catalisar a conversão de GGs endógenos ativos (cortisol em humanos e corticosterona em roedores) em metabólitos inativos, é reduzida no final da gestação (67).
Importante ressaltar que a administração de uma dose única de corticosteroides antenatais assemelham-se aos níveis de cortisol endógeno, enquanto repetidas doses cursam com níveis suprafisiológicos de GCs na corrente sanguínea (68). Semelhantemente, diversos insultos metabólicos maternos, como estresse ambiental, desnutrição calórico-proteica, obesidade e diabetes mellitus também são acompanhados por níveis exacerbados de cortisol no final da gestação (69). Todavia, apesar da vasta literatura demonstrando os impactos negativos do excesso de GCs sobre a saúde fetal no curto, médio e longo prazo, como restrição do crescimento intrauterino (70), ativação permanente do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) (71), hipertensão (72) e diabetes (69), muito pouco é discutido sobre a repercussão metabólica causada pela corticoterapia antenatal sobre o bem-estar materno.
1.4 Glicocorticoides e células β pancreáticas
As adaptações morfofuncionais das células β pancreáticas induzidas por GCs em decorrência das alterações no metabolismo, em especial ao metabolismo da glicose, tem sido alvo de vários estudos (73-75). Sabe-se que o aumento da secreção de insulina induzida por glicose (75) e proliferação das células β pancreáticas (74, 76), que levam subsequentemente ao aumento da massa de células β por hipertrofia e hiperplasia, são as adaptações que acontecem no pâncreas endócrino mediante o quadro de resistência à insulina periférica após a exposição à DEX. Além disso, recentemente, foi demonstrado que os GCs podem estimular a neogênese de células β, impactando positivamente no aumento de sua massa (73, 77). Por outro lado, evidências em modelos experimentais sugerem que as alterações morfofuncionais que ocorrem nas ilhotas pancreáticas após a exposição à DEX são revertidas poucos dias após a interrupção do tratamento (78).
No contexto gestacional, estudos observacionais recentes mostraram que a corticoterapia se correlaciona com a hiperglicemia transitória materna em mulheres não diabéticas (79, 80). Tanto a betametasona como a dexametasona aumentam os níveis de glicose plasmáticos por reduzirem a biossíntese de insulina, além de aumentarem a produção hepática de glicose (81, 82). Concordante a isso, ratas tratadas com DEX durante o último período gestacional demostraram uma redução da secreção de insulina induzida por glicose, levando a intolerância à glicose antes do parto (83). Além disso, foi previamente descrito pelo nosso grupo que a administração da DEX em roedores prenhes no final da gestação não foi associado com alterações imediatas na glicemia ou função pancreática. Entretanto, a partir de 3 meses após a gestação, as mães tratadas com DEX na gestação passaram a apresentar intolerância à glicose e perda da função pancreática, aparentemente irreversíveis. Tais observações foram relacionadas à redução de uma proteína essencial no processo de extrusão dos grânulos de insulina, a sintaxina-1a, e o aumento permanente da expressão de um regulador negativo direto desta proteína, o microRNA miR-29a (84). No entanto, não há relatos na literatura atual sobre o impacto da corticoterapia administrada no último período gestacional sobre as adaptações morfológicas que acontecem no pâncreas endócrino materno na gestação. Além disso, sabe-se que logo após o parto todas as alterações morfofuncionais no pâncreas
materno são revertidas. Portanto, estudos são necessários para esclarecer se o remodelamento pancreático materno que acontece durante o período de lactação também é influenciado pela exposição à DEX na gestação.
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar o impacto da corticoterapia administrada no último período gestacional sobre as adaptações morfológicas do pâncreas endócrino materno que ocorrem na gestação e lactação de ratas Wistar.
2.2 Específicos
a) Avaliar os parâmetros zoométricos, como massa corporal materna e da prole, consumo alimentar e ingestão hídrica, bem como a glicemia.
b) Investigar os aspectos morfológicos do pâncreas endócrino de ratas prenhes e lactantes, tais como as áreas de ilhotas, células β e células não β pancreáticas, bem como suas respectivas massas após as reações imunohistoquímicas para insulina.
c) Estimar a taxa de proliferação celular das ilhotas de ratas prenhes e lactantes após as reações imunohistoquímicas para Ki-67.
d) Avaliar a participação de células do sistema imune inato, como macrófagos M1 e M2, e do sistema imune adaptativo, como linfócitos T, infiltrados nas ilhotas pancreáticas de ratas no início do período de lactação por qPCR.
e) Investigar os parâmetros de neogênese de ilhotas pancreáticas nas ratas prenhes e lactantes, evidenciado pela porcentagem de aglomerados de células positivas para insulina extrailhotas (EICs) e ilhotas associadas com ductos.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais e delineamento experimental
Ratas da linhagem Wistar com 4 semanas de vida foram adquiridas do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP e mantidas em gaiolas plásticas no Biotério do Departamento de Farmacologia, com temperatura controlada (22 ± 2°C), ciclo claro-escuro de 12 horas e livre acesso a água e ração padrão para animais de laboratório (Nuvilab® CR-1, Quimtia S.A, Colombo, Paraná, Brasil).
Ao completarem 12 semanas de vida, as fêmeas foram acomodadas duas a duas e um macho foi colocado em cada gaiola durante 3 dias, sendo adotado o primeiro dia de prenhez (P1) o segundo dia de acasalamento. Em seguida, as fêmeas foram pesadas, identificadas, e os machos retirados. Após 15 dias (P15), as ratas foram novamente pesadas e aquelas que obtiveram peso igual ou superior a 30 gramas foram consideradas prenhes. Neste dia, o tratamento com dexametasona (DEX) foi iniciado e cada animal foi alocado isoladamente e permaneceram em contato visual, olfativo e auditivo com os demais animais até o final do protocolo experimental, conforme aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Estadual de Campinas (CEUA/UNICAMP protocolo nº 3973-1) (figura 2).
3.2 Tratamento com dexametasona
Uma vez confirmada a prenhez em P15, as fêmeas foram divididas aleatoriamente em dois grupos experimentais, que receberam veículo (CTL) ou DEX (0,1 mg/kg de peso corporal; Aché Laboratórios Farmacêuticos, Guarulhos, São Paulo, Brasil) diluída na água de beber durante 6 dias. A dose do fármaco foi ajustada diariamente baseada no peso corporal e na ingestão hídrica, conforme previamente descrito (83, 84). Além disso, o consumo alimentar foi avaliado nestes dias, calculado pela diferença entre a massa de ração oferecida e a massa restante no dia seguinte, em um intervalo de 24 horas.
Um dia após o parto, o número de filhotes por mãe foi ajustado para 6. As mães foram utilizadas para os procedimentos experimentais no 20° dia de prenhez
(P20), 3° (L3), 8° (L8), 14° (L14) e 21° (L21) dias de lactação. Ratas virgens com a mesma idade e mantidas nas mesmas condições ambientais também foram utilizadas (figura 2). Em cada ponto avaliado, os animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia com tiopental (80 mg/kg peso corporal; i.p.) seguido por decapitação, o sangue do tronco foi coletado para separação de soro e o pâncreas foi removido.
Figura 2 – Delineamento experimental.
3.3 Dosagem de glicose no sangue total
A glicose plasmática foi determinada com tiras reativas e medidor de glicose Accu-Chek® Active (Roche Diabetes Care Brasil LTDA, São Paulo, São Paulo, Brasil) através de uma gota de sangue obtida após uma pequena secção da cauda.
3.4 Abordagens quantitativas no pâncreas endócrino
Após a eutanásia, o pâncreas intacto de cada animal foi cuidadosamente retirado e a gordura e linfonodos ao redor foram removidos. Em seguida, o mesmo foi pesado e imerso em solução de paraformaldeído 4% por 24 horas em temperatura ambiente, para a fixação. Após este período, cada pâncreas foi lavado em tampão fosfato salino (PBS) 0,1 M (pH 7,4) por 90 minutos (3 ciclos de 30 minutos) e transferidos para o álcool 70%. Os tecidos foram submetidos ao processamento histológico habitual, sendo desidratados por uma sequência de álcoois em concentrações crescentes (80%, 95%, 100%) e posterior diafanização através de uma série de xilóis, antes da inclusão em parafina, a uma temperatura de 60 °C. Secções semi-seriadas de 5 µm de espessura, com um intervalo de 100 µm entre elas, foram
obtidas usando um micrótomo rotativo Leica RM2245 (Leica Biosystems, Nussloch, Baden-Württemberg, Alemanha) e acomodadas em lâminas de vidro silanizadas para realização das reações imunohistoquímicas (IHQ), conforme ilustrado na figura 3.
Figura 3 – Organização das seçcões para as reações imunohistoquímicas.
Após o emblocamento do pâncreas intacto em parafina, as secções foram obtidas em um micrótomo rotativo com 5 µm de espessura. Cada lâmina silanizada acomodou duas secções do tecido com intervalo de 100 µm entre elas. Foram confeccionadas um conjunto de pelo menos 5 lâminas de cada fragmento. Obedecendo os critérios de estereologia, uma secção da lâmina 1 e outra secção da lâmina 3, cujo intervalo entre as secções foram de pelo menos 200 µm, foram analisadas aleatoriamente após as reações de imunoperoxidase com o anticorpo anti-insulina. Da mesma forma, uma secção da lâmina 2 foi analisada aleatoriamente após a reação de imunoperoxidase com o anticorpo anti-Ki-67.
3.4.1 Imunohistoquímica para insulina e Ki-67
As secções foram imersas em xilol para remoção da parafina e reidratadas com uma sequência álcoois em concentrações decrescentes (100%, 95%, 80% e 70%) e água destilada. Posteriormente, os cortes foram contornados com uma caneta hidrofóbica e lavados com tampão tris salino (TBS) 0,05 M (pH 7,4) contendo Tween 20 0,1% por 5 minutos. Logo após, as secções destinadas a avaliação de proliferação celular foram tratadas com tampão Tris-EDTA 0,01 M (pH 9,0) em panela de pressão elétrica Oster® por 24 minutos, para a recuperação antigênica, com exceção das lâminas destinadas a avaliação da morfologia do pâncreas endócrino, em que esta etapa foi omitida.
Em seguida, todas as secções foram lavadas com TBS durante 15 minutos (3 ciclos de 5 minutos), e incubadas com H2O2 0,3% por 30 minutos em temperatura ambiente, para bloqueio da atividade da peroxidase endógena. Logo após, os cortes foram lavados com TBS e permeabilizados com TBS contendo albumina de soro bovino (BSA) 5% e Tween 20 0,1% durante 1 hora em temperatura ambiente, para bloqueio dos sítios inespecíficos. Em seguida, as secções foram lavadas e incubadas com o anticorpo primário anti-insulina (1:400; Dako North America, Inc., Califórnia, Estados Unidos, catálogo #A0564) ou anti-Ki-67 (1:75; Spring Bioscience, Pleasanton, Califórnia, Estados Unidos, catálogo #M3064) diluídos TBS contendo BSA 3%, overnight a 4 ºC.
Posteriormente, as secções foram lavadas com TBS e incubadas anticorpo secundário anti-guinea pig IgG (1:1000; Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos, catálogo #614620) ou anti-rabbit IgG (Nichirei Bioscience, Tóquio, Japão, catálogo #414191F), ambos conjugado com a enzima peroxidase, por 2 horas em temperatura ambiente. Em seguida, os cortes foram lavados com TBS e as células positivas para insulina ou Ki-67 foram detectadas com solução de diaminobenzidina (DAB; Sigma Chemical, St Louis, Missouri, Estados Unidos, catálogo #D4293). Por fim, a contra-coloração nuclear foi realizada com hematoxilina de Ehrlich por 1 minuto e as secções foram novamente desidratadas por uma sequência de álcoois em concentrações crescentes (70%, 80%, 95%, 100%), diafanizadas em xilol e montadas com Entellan® (EMD Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts, Estados Unidos) para observação microscópica.
3.4.2 Morfologia do pâncreas endócrino
Foram avaliadas duas secções independentes de cada animal incubadas com o anticorpo anti-insulina, com distância mínima entre elas de 200 µm, conforme ilustrado na figura 3. Este intervalo garante o pâncreas está sendo analisado em diferentes regiões. Todas as ilhotas presentes nas secções foram capturadas com o aumento final de 20x usando um microscópio óptico de campo claro (BX51TF; Olympus, Tóquio, Japão) acoplado a uma câmera digital (DP72; Olympus, Tóquio, Japão).
A área das ilhotas pancreáticas foi obtida pelo traçado manual de todas as ilhotas presentes nas secções. A área de células β e de células não β pancreáticas foi determinada pelo traçado manual de células positivas e negativas para insulina, respectivamente, em todas as ilhotas presentes nas secções, através do software de domínio público ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij), conforme ilustrado na figura 4.
Posteriormente, a massa relativa das ilhotas pancreáticas, células β e de células não β foi calculada dividindo suas respectivas áreas totais pela área total da secção pancreática analisada, conforme ilustrado na figura 5. O número total de ilhotas analisadas por grupo foram demonstrados no apêndice 1.
Por fim, a massa das ilhotas pancreáticas, células β e de células não β (mg) foram estimadas multiplicando a respectiva massa relativa pelo peso total do pâncreas, conforme previamente descrito (85).
Figura 4 – Passo a passo para determinação da área das ilhotas pancreáticas.
A B
A imagem da escala com o aumento correspondente ao das aquisições das imagens (20x) foi aberta no software ImageJ (A), a ferramenta “Straight” foi selecionada e a distância em pixels da barra de escala foi medida (B). Em Analyze Set Scale foi informado o tamanho da barra de escala, que neste caso foi de 50 µm (C). Em Analyze Set Measurements (D), foi selecionado apenas a opção “Área”, seguida pela escolha da imagem da barra de escala anteriormente medida em “Redirect to” a título de calibração (E). Após a seleção da ferramenta “Freehand selections”, a área das ilhotas pancreáticas (µm2) foi determinada pelo traçado
manual de todas as ilhotas presentes nas secções (F). Os resultados foram obtidos em Analyze Measure (G e H).
E F
Figura 5 – Determinação da área total da secção do pâncreas.
As secções foram fixadas em uma régua e capturadas com uma câmera digital (D3200; Nikon Corporation, Tóquio, Japão) apoiada em um tripé (A). A imagem foi aberta no software ImageJ
(B), a ferramenta “Straight” foi selecionada e a distância em pixels no intervalo de 1 milímetro
(ou 1000 µm) foi medida (C). Em Analyze Set Scale foi informado o tamanho da barra de escala, que neste caso foi de 1000 µm (D). As etapas subsequentes para a quantificação da área total da secção foram descritas na figura 4.
A B
3.4.3 Avaliação de neogênese
Após a determinação da área, as ilhotas pancreáticas de cada secção foram distribuídas nas seguintes faixas de tamanho: aglomerados de células positivas para insulina extrailhotas (EICs) (< 300 µm2), ilhotas pequenas (300-1999 µm2), médias (2000-9999 µm2), grandes (10.000-40.000 µm2) ou muito grandes (≥ 50.000 µm2), conforme previamente descrito (86). Em seguida, o número de ilhotas observados em cada faixa de tamanho foi transformado em porcentagem em relação ao número total de ilhotas presentes naquela secção. A título de exemplificação, uma secção submetida a reação de imunoperoxidase com o anticorpo anti-insulina e a respectiva classificação das ilhotas de acordo com as faixas de tamanhos foram mostradas no apêndice 2.
Além disso, foi avaliado a porcentagem de ilhotas associadas com ductos, outro parâmetro que indica a formação de novas ilhotas, conforme previamente descrito (87). Um exemplo de ilhotas pancreáticas associadas com ductos avaliadas no presente estudo foram inseridas no apêndice 3.
3.4.4 Proliferação celular das ilhotas pancreáticas
Foi avaliada uma secção independente de cada animal submetida a reação de imunoperoxidade com o anticorpo anti-Ki-67, conforme ilustrado na figura 3. Todas as ilhotas pancreáticas presentes na secção foram capturadas com o aumento final de 20x utilizando o mesmo microscópio óptico de campo claro mencionado anteriormente.
A taxa de proliferação celular das ilhotas pancreáticas foi estimada pela percentagem do número de núcleos positivos para Ki-67 em relação ao número total de núcleos presentes em cada ilhota, de acordo com Rafacho et al. (85). Os resultados foram obtidos através da contagem manual dos núcleos com o auxílio do software de domínio público ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij), conforme demonstrado na figura 6. O número de ilhotas pancreáticas analisadas por grupo, bem como o número total de núcleos contados foram descritos nos apêndices 4 e 5, respectivamente.
Figura 6 – Contagem manual dos núcleos das ilhotas pancreáticas.
A imagem foi aberta no software ImageJ, a ferramenta “Multi-point” foi selecionada e todos os núcleos presentes em cada ilhota foram contados manualmente. Ao final, foi realizada uma proporção entre os núcleos positivos para Ki-67 em relação ao número total de núcleos presentes em cada ilhota pancreática, e os resultados foram expressos em porcentagem (%).
3.5 Isolamento das ilhotas pancreáticas
Após a eutanásia dos animais, foi realizada a laparotomia seguida pela exposição do ducto biliar comum. Na extremidade distal, próximo ao duodeno, o ducto biliar foi clampeado, e um pequeno orifício foi aberto em sua porção proximal, localizada próximo ao fígado. Um cateter acoplado a uma seringa foi introduzido nesta região, e o pâncreas foi perfundido com 10 mL de solução de Hanks (NaCl 137 mM, KCl 5,36 mM, MgSO4.7H2O 0,81 mM, Na2HPO4.12H2O 0,34 mM, KH2PO4 0,44 mM, CaCl2.2H2O 1,26 mM, NaHCO3 4,17 mM; pH 7,4) suplementada com glicose 5,6 mM, BSA 0,1% e colagenase tipo V (Sigma Chemical) 0,08% para a expansão completa do tecido. Em seguida, o tecido foi cuidadosamente retirado, colocado sobre uma placa de Petri e a gordura, linfonodos e vasos sanguíneos ao redor foram removidos. Logo após, o pâncreas foi rapidamente picotado com uma tesoura, colocado em um tubo plástico cônico e um volume de aproximadamente 10 mL de solução de Hanks contendo colagenase foi adicionado. Após 24 minutos em banho-maria à 37 °C, cada tubo foi agitado manualmente para completa dissociação da parte exócrina do pâncreas. Posteriormente, o conteúdo foi transferido para um becker de 100 mL seguido por 3 ciclos de lavagens com solução de Hanks gelada por 2 minutos para ressuspensão do material. Ao final de cada ciclo o sobrenadante era removido com seringa de vidro e desprezado. O material precipitado foi colocado em uma placa de Petri para o isolamento manual das ilhotas pancreáticas com auxílio de uma pipeta de vidro estirada, através de um estereomicroscópio binocular.
3.6 Extração de RNA total
Imediatamente após o isolamento, aproximadamente 500 ilhotas de cada animal foram colocadas em um tubo plástico livre de inibidores de DNA (DNase e RNase) contendo o reagente de lise Qiazol® (QIAGEN Sciences, Germantown, Maryland, Estados Unidos). Após homogeneização, os tubos permaneceram durante 5 minutos em temperatura ambiente para a completa dissociação de complexos nucleoproteicos. A extração do RNA foi obtida através do RNeasy Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha; catálogo #74104) seguindo as especificações do fabricante.
Subsequentemente, uma alíquota de cada amostra foi utilizada para determinação da concentração do RNA total (ng/µL) através do espectrofotômetro NanoDropTM Lite (Thermo Scientific, Wilmington, Delaware, Estados Unidos), nos comprimentos de onda 260 e 280 nm. A pureza da extração do RNA foi observada através da razão 260/280, cujo os valores próximos de 2 foram considerados aceitáveis.
3.7 Obtenção do cDNA
Alíquotas contendo 2 µg de RNA total foram submetidas a transcrição reversa usando um kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems, Vilnius, Lituânia, catálogo #4368813). Para cada amostra, esta quantidade de RNA total foi dispensada em um tubo plástico livre de inibidores de DNA e o volume foi ajustado para 10 µL com água ultra pura. Em seguida, foi preparado o mix para a transcrição reversa, que continha 2 µL de tampão, 0,8 µL de dNTP, 2,0 µL de primers randômicos e 1,0 µL da enzima transcriptase reversa MultiScribeTM, sendo o volume completado para 10 µL com água ultra pura. Sendo assim, um volume final de 20 µL foi submetido a diferentes ciclos de temperatura, a saber: 25 °C por 10 minutos, 37 °C por 120 minutos e 85 °C por 5 minutos. Ao final, as amostras foram mantidas a 4 °C e posteriormente congeladas em -20 °C.
3.8 qPCR
Para realização das análises quantitativas da expressão gênica através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, amostras de cDNA contendo 100 ng/µL foram diluídas com água ultra pura para 10 ng/µL. Os ensaios foram realizados em duplicata em uma placa de 96 poços para cada gene avaliado da seguinte maneira: em um tubo plástico livre de inibidores de DNA foi preparado um mix contendo 10 µL de Fast SYBR™ Green (Applied Biosystems, catálogo #4385612), 2 µL de cDNA (10 ng/µL), 6,4 µL de água ultra pura e 1,6 µL do primer que foi investigado, totalizando um volume final de 20 µL. Em seguida, 10 µL desta mistura foi dispensada em cada poço da placa de PCR. Ao final, a placa foi selada e submetida ao StepOnePlus™ Real-Time PCR System 7500 (Applied Biosystems), no qual foram observados 20 segundos a 95 ° C e 40 ciclos de 3 segundos a 95 ° C e 30 segundos
a 60 ° C, conforme as recomendações do fabricante. A especificidade das PCRs foram verificadas pela análise da curva de melting de cada produto amplificado na amostra. As sequências dos primers utilizados para genes de ratos foram descritas na tabela 1.
Tabela 1 – Sequência de primers de ratos utilizados.
Gene Forward primer (5’-3’) Reverse primer (5’-3’)
Cd163 ATGGAGTCACAGCGACTGCG GAGGAAGGCAATGAGAAGGACC Lta TACAAGGACCGTGGGTACGCTC GTGTAAGTGGGAGATGCCGTCTG Cd206 CTGGAAGACATCATACTGCAATG CAGTCTCGATGGAAACCAGG
Tnf CTCTCTGCCATCAAGAGCC CACAGAGCAATGACTCCAAAG
Rpl37a CAAGAAGGTCGGGATCGTCG ACCAGGCAAGTCTCAGGAGGTG
Os valores da expressão de mRNA foram normalizados com o gene de controle interno Rpl37a, e os resultados foram calculados usando o método 2−ΔΔCt.
3.9 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Após a confirmação da normalidade dos dados através dos testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk, os dados paramétricos foram analisados pelo teste t de Student não pareado e através da análise de variância de um fator (one-way ANOVA) seguida pelo post-hoc de Tukey para indicar as diferenças entre os grupos. Para as análises curso-temporais, o tratamento estatístico adotado foi a análise de variância de dois (two-way ANOVA) fatores, considerando (I) o tempo após o cruzamento e (II) tratamento durante a gestação. O post-hoc de Tukey foi utilizado para indicar as diferenças intragrupo em diferentes pontos, enquanto o post-hoc de Sidak foi usado para detectar as diferenças entre os grupos CTL e DEX nos mesmos pontos de avaliação. As análises estatísticas foram realizadas através do programa GraphPad Prism versão 6.01 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, Estados Unidos), e o nível de significância adotado foi de 5% (p < 0,05).
4 RESULTADOS
4.1 Parâmetros zoométricos e glicemia
Quinze dias após o cruzamento, as ratas prenhes tiveram um aumento de 14% na massa corporal comparado as ratas virgens (p < 0,05). Em seguida, estes animais foram distribuídos aleatoriamente, de forma que não houvesse diferença na massa corporal inicial para o início do tratamento. Como esperado, ratas tratadas com dexametasona (DEX) durante a gestação tiveram menor ganho de peso entre o 17° e 20° dia de prenhez comparado as ratas controles (CTL) (p < 0,05) (figura 7A).
Logo após o parto, em L3, ambos os grupos, CTL e DEX, tiveram uma redução da massa corporal, retornando ao peso semelhante aos das ratas virgens. Além disso, ratas CTL apresentaram um segundo aumento na massa corporal de 17% a partir de L8, que foi sustentado até o final da lactação (p < 0,05 vs. ratas virgens). Em ratas DEX, entretanto, este aumento foi observado apenas em L21 (p < 0,05 vs. ratas virgens) (figura 7A).
Ratas prenhes, independente do tratamento, tiveram uma redução de nos níveis de glicose comparado as ratas virgens (25% menor em ratas CTL e 15% em ratas DEX; p < 0,05). O tratamento com DEX, entretanto, levou a um aumento transitório deste parâmetro em P20 (12% maior do que em ratas CTL; p < 0,05), que não foi mais observado em L3. Os níveis glicêmicos das ratas DEX apresentaram uma continua redução durante a lactação, atingindo o menor valor em L14 (16% menor do que em ratas virgens; p < 0,05) (figura 7B).
Além das alterações na massa corporal materna observadas durante a última semana de gestação, a prole de ratas tratadas com DEX tiveram baixo peso ao nascer. O peso médio dos neonatos advindos destes animais foi de 5,20 ± 0,19 gramas em L1, 27% menor do que a prole de ratas CTL (p < 0,0001) (figura 7C).
Ademais, o consumo alimentar médio dos animais durante a gestação, tratados ou não com DEX, foi aproximadamente 26% maior do que em ratas virgens (p < 0,05), enquanto não foram detectadas alterações na ingestão hídrica entre os grupos (figura 7D e E, respectivamente).
Figura 7 – Características zoométricas e glicemia de ratas que receberam veículo
(CTL) ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação.
B A
Evolução ponderal (A) e glicemia (B) de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) durante a última semana de gestação e foram eutanasiadas no 20° dia de prenhez (P20), 3° (L3), 8° (L8), 14° (L14) e 21° (L21) dias de lactação. Ratas virgens também foram eutanasiadas. Peso médio da prole em L1 (C), consumo alimentar (D) e ingestão hídrica média (E) dos animais entre o 15° e 20° dia de prenhez. Os dados foram expressos pela média ± EPM (n = 4-16). *p < 0,05 vs. virgem; **p < 0,01 vs. virgem; ***p < 0,001 vs. virgem; ****p < 0,0001 vs. virgem; #p < 0,05 vs. CTL no mesmo ponto; &p < 0,05 vs. CTL em P20; $p
< 0,05 vs. DEX em P20.
4.2 Parâmetros morfométricos das ilhotas pancreáticas
Foi avaliado a área média de ilhotas pancreáticas, a área média de células β e de células não β pancreáticas durante o período de lactação de ratas que receberam veículo (CTL) ou DEX durante a gestação. Esses parâmetros também foram analisados em pâncreas de ratas virgens e em P20. A área média das ilhotas pancreáticas não foi afetada pela gestação ou lactação em ambos os grupos, CTL e DEX (figura 8A).
A área média de células β pancreáticas também não foi afetada pela gestação ou lactação em ratas CTL. Em ratas DEX, entretanto, a área média de células β pancreáticas exibiu um aumento não significativo em P20 (17% maior do que em ratas virgens; p > 0,05). Além disso, no início da lactação houve um pico seguido subsequentemente por uma queda, em que foi observado uma redução de de 43% em L14 comparado a área de células β vista em L3 (p < 0,05) (figura 8B). Quanto a área média de células não β pancreáticas, não foram detectadas diferenças durante a gestação ou lactação em ratas CTL e DEX.
Figura 8 – Área média de ilhotas pancreáticas de ratas que receberam veículo (CTL)
ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação.
A
Área média de ilhotas pancreáticas (A), células β (B) e de células não β pancreáticas (C) de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) durante a última semana de gestação e foram eutanasiadas no 20° dia de prenhez (P20), 3° (L3), 8° (L8), 14° (L14) e 21° (L21) dias de lactação. Ratas virgens também foram eutanasiadas. Os dados foram expressos pela média ± EPM (n = 4). $p < 0,05 vs. DEX em L3.
4.3 Análise da massa média de ilhotas pancreáticas, células β e células não β pancreáticas
Foi avaliado a massa média de ilhotas pancreáticas, a massa média de células β e de células não β pancreáticas durante o período de lactação de ratas que receberam veículo (CTL) ou DEX durante a gestação. Esses parâmetros também foram analisados em pâncreas de ratas virgens e em P20. A massa de ilhotas pancreáticas em ratas CTL teve um aumento não significativo em P20 (72% maior do que em ratas virgens; p > 0,05), e permaneceu inalterada ao longo de toda a lactação. Ratas DEX, entretanto, exibiram um aumento na massa de ilhotas pancreáticas observada em P20 e L3 (105% e 121% maior do que em ratas virgens, respectivamente; p < 0,05). Além disso, comparado as ratas CTL em L3, a massa das ilhotas de ratas tratadas com DEX foi 95% maior neste mesmo ponto (p < 0,05) (figura 9A). Este aumento observado na massa de ilhotas pancreáticas não foi acompanhado por um aumento na massa total do pâncreas nos respectivos pontos de avaliação (apêndice 6).
Quanto a avaliação da massa média de células β pancreática, as ratas CTL apresentaram um aumento na massa de células β em P20 (77% maior do que em ratas virgens; p < 0,05), que não foi mais observado poucos dias após o parto e ao
longo da lactação. Ratas tratadas com DEX, por sua vez, exibiram um aumento da massa de células β em P20 e L3 (114% e 140% maior do que em ratas virgens, respectivamente; p < 0,05). Além disso, a massa de células β pancreáticas em L3 foi 124% maior nas ratas DEX quando comparadas as ratas CTL neste mesmo ponto (p < 0,05) (figura 9B).
A massa média de células não β de ratas CTL permaneceu inalterada na gestação e ao longo da lactação. Ratas tratadas com DEX, entretanto, apresentaram um aumento transitório de 86% deste parâmetro em L8 em relação as ratas virgens (p < 0,05) (figura 9C). As imagens representativas das secções de pâncreas submetidas as reações de imunoperoxidase com o anticorpo anti-insulina foram mostradas na figura 10.
Figura 9 – Massa média de ilhotas pancreáticas de ratas que receberam veículo (CTL)
ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação.
Massa média de ilhotas pancreáticas (A), células β (B) e de células não β pancreáticas (C) de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) durante a última semana de gestação e foram eutanasiadas no 20° dia de prenhez (P20), 3° (L3), 8° (L8), 14° (L14) e 21° (L21) dias de lactação. Ratas virgens também foram eutanasiadas. Os dados foram expressos pela média ± EPM (n = 4). *p < 0,05 vs. virgem; **p < 0,01 vs. virgem; ***p < 0,001 vs. virgem; ****p < 0,0001 vs. virgem; ###p < 0,001 vs. CTL no mesmo ponto; ####p < 0,0001 vs. CTL no
mesmo ponto.
B
Figura 10 – Imagens representativas das seçcões de pâncreas submetidas as
reações de imunoperoxidase para insulina.
As secções de pâncreas foram obtidas de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) durante a última semana de gestação e foram eutanasiadas no 20° dia de prenhez (P20), 3° (L3), 8° (L8), 14° (L14) e 21° (L21) dias de lactação. Ratas virgens também foram eutanasiadas. Barras horizontais representam uma escala de 100 µm, objetiva de 5x.
4.4 Proliferação celular das ilhotas pancreáticas
A proliferação celular do pâncreas endócrino foi avaliada utilizando o anticorpo anti-Ki-67 durante o período de lactação de ratas que receberam veículo (CTL) ou DEX durante a gestação. Este parâmetro também foi analisado no pâncreas de ratas virgens e em P20. Durante a gestação, foi observado um aumento de células positivas para Ki-67 de 253% e 387% em ratas CTL e DEX, respectivamente, comparado as ratas virgens (p < 0,05). Além disso, a taxa de proliferação celular em ratas DEX foi 39% maior do que em ratas CTL neste mesmo ponto de avaliação (p < 0,05). Ao longo da lactação, entretanto, não foram detectadas alterações deste parâmetro em ratas CTL e DEX, e os valores retornaram para aqueles observados em ratas virgens (p > 0,05) (figura 11). As imagens representativas das secções de pâncreas submetidas as reações de imunoperoxidase com o anticorpo anti-Ki-67 foram mostradas na figura 12.
Figura 11 – Proliferação celular de ilhotas pancreáticas de ratas que receberam
veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação.
Proliferação celular de ilhotas pancreáticas de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) durante a última semana de gestação e foram eutanasiadas no 20° dia de prenhez (P20), 3° (L3), 8° (L8), 14° (L14) e 21° (L21) dias de lactação. Ratas virgens também foram eutanasiadas. Os dados foram expressos pela média ± EPM (n = 4). ****p < 0,0001 vs. virgem; ###p < 0,001 vs. CTL no mesmo ponto.
Figura 12 – Imagens representativas das seçcões de pâncreas submetidas as
reações de imunoperoxidase para Ki-67.
As secções de pâncreas foram obtidas de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) durante a última semana de gestação e foram eutanasiadas no 20° dia de prenhez (P20), 3° (L3), 8° (L8), 14° (L14) e 21° (L21) dias de lactação. Ratas virgens também foram eutanasiadas. Barras horizontais representam uma escala de 20 µm, objetiva de 40x.
4.5 Análise da expressão de mRNAs de marcadores de macrófagos M2 em relação aos macrófagos M1 e linfócitos T em ilhotas pancreáticas isoladas em L3
Comparado as ratas virgens, a expressão do conteúdo de mRNA de Cd206, também conhecido como receptor de manose e presente na superfície de macrófagos M2, foi aumentada em relação a expressão de Lta (linfotoxina-α) ou Tnf (fator de necrose tumoral-α) em ilhotas isoladas de ratas DEX em L3 (157% e 197%, respectivamente; p < 0,05). Por outro lado, ilhotas de ratas CTL não exibiram tais alterações (figura 13A e B). Além disso, a relação entre a expressão de Cd163, outro marcador presente na superfície de macrófagos M2, e Lta ou Tnf permaneceu inalterada em ilhotas isoladas de ratas CTL e DEX neste mesmo ponto de avaliação (figura 13C e D).
Figura 13 – Expressão gênica de marcadores de macrófagos M2 em relação aos
macrófagos M1 e linfócitos T em ilhotas pancreáticas isoladas de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) na última semana de gestação.
Expressão dos mRNAs Cd206 em relação a Lta (A) ou Tnf (B) e Cd163 em relação a Lta (C) ou Tnf (D) em ilhotas isoladas de ratas que receberam veículo (CTL) ou dexametasona (DEX) durante a última semana de gestação e foram eutanasiadas 3° (L3) dia de lactação. Ratas virgens também foram eutanasiadas. Os dados foram expressos pela média ± EPM (n = 5-7). *p < 0,05 vs. virgem; **p < 0,01 vs. virgem; #p < 0,05 vs. CTL.
4.6 Parâmetros de neogênese em ilhotas pancreáticas
Foram avaliados os parâmetros de neogênse em ilhotas pancreáticas durante o período de lactação de ratas que receberam veículo (CTL) ou DEX durante a gestação. Esses parâmetros também foram analisados em pâncreas de ratas virgens e em P20. A figura 14A demonstra o percentual médio de aglomerados de células positivas para insulina extrailhotas (EICs). Em P20, as ratas CTL apresentaram um aumento de 89% de EICs comparado as ratas virgens (p < 0,05), que não foi mais observado em L3. No entanto, em L8 foi observado um segundo aumento deste parâmetro (77% maior do que em ratas virgens; p < 0,05), que retornou para valores semelhantes aos observados em ratas virgens nos pontos subsequentes de lactação. Da mesma forma, ratas DEX também apresentaram um aumento de 91% de EICs comparado as ratas virgens em P20 (p < 0,05), que não foi mais observado em L3. Todavia, em L8 não houve um segundo aumento significativo da porcentagem de EICs comparado as ratas virgens (p > 0,05). Este parâmetro continuou decaindo ao longo da lactação, atingindo o menor valor em L14, no qual foi detectada uma redução de 61% comparado aos valores de EICs observados em P20 (p < 0,05). Além
