Polímeros molecularmente impressos com estrutura caroço-casca para extração de ácido ascórbico, cafeína e vanilina

INSTITUTO DE QUÍMICA

RAFAEL DA SILVA FERNANDES

POLÍMEROS MOLECULARMENTE IMPRESSOS COM ESTRUTURA

CAROÇO-CASCA PARA EXTRAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO,

CAFEÍNA E VANILINA

CAMPINAS

2018

POLÍMEROS MOLECULARMENTE IMPRESSOS COM ESTRUTURA

CAROÇO-CASCA PARA EXTRAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO,

CAFEÍNA E VANILINA

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências

Orientador: prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Junior

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO RAFAEL DA SILVA FERNANDES E ORIENTADA PELO PROF. DR. IVO MILTON RAIMUNDO JUNIOR

CAMPINAS

2018

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química

Camila Barleta Fullin - CRB 8462

Fernandes, Rafael da Silva, 1988-

F391p FerPolímeros molecularmente impressos com estrutura caroço-casca para extração de ácido ascórbico, cafeína e vanilina / Rafael da Silva Fernandes. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.

FerOrientador: Ivo Milton Raimundo Junior.

FerTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Química.

Fer1. Polímeros de impressão molecular. 2. Caroço-casca. 3. Microesferas. 4. Extração seletiva. 5. Adsorção. I. Raimundo Júnior, Ivo Milton, 1961-. II.

Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Molecularly imprinted polymers with core-shell structure for extraction of ascorbic acid, caffeine and vanillin Palavras-chave em inglês:

Molecularly imprinted polymer Core-shell

Microspheres

Selectivity extraction Adsorption

Área de concentração: Química Analítica Titulação: Doutor em Ciências

Banca examinadora:

Ivo Milton Raimundo Junior [Orientador] Italo Odone Mazali

Susanne Rath

Claudete Fernandes Pereira

Maria Del Pilar Taboada Sotomayor Data de defesa: 23-02-2018

Prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Junior (Orientador)

Profa. Dra. Maria Del Pilar Taboada Sotomayor (UNESP)

Profa. Dra. Claudete Fernandes Pereira (UFPE)

Prof. Dr. Italo Odone Mazali (IQ-UNICAMP)

Profa. Dra. Susanne Rath (IQ-UNICAMP)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da Tese de Doutorado defendida pelo aluno RAFAEL DA SILVA FERNANDES, aprovada pela Comissão Julgadora em 23 de fevereiro de 2018.

A minha família, por todo amor incondicional, dedicação, carinho e ensinamentos. Em especial aos meus pais (Francisco de Assis e Antônia Maria), a minha esposa (Fernanda Karoline) e ao meu filho (Luiz).

A Deus pela oportunidade de ter chegado onde estou, pelas pessoas que existem na minha vida e pela força e coragem para viver longe da minha família.

Aos meus pais Francisco e Antônia, como também aos meus demais familiares por todo amor, atenção, carinho e incentivo.

A minha esposa e amiga Fernanda, por todo amor, paciência e companheirismo. Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Jr., pela orientação, confiança e oportunidade de desenvolver este trabalho.

Aos professores Jarbas Rohwedder e Celio Pasquini, por suas respectivas contribuições no andamento desse projeto.

Ao Prof. Dr. Boris Mizaikoff e os demais membros do Institut für Analytische und

Bioanalytische Chemie (IABC) da Universidade de Ulm/Alemanha pela orientação,

apoio científico e excelente ambiente de trabalho.

A todos os meus amigos dos grupos GIA, LQA e GEATOM, pelo apoio e amizade ao longo do mestrado e doutorado.

Aos técnicos e demais funcionários do IQ-UNICAMP, por todo empenho, que permitiram o desenvolvimento desse trabalho, em especial ao técnico e amigo Diego Campaci por toda sua dedicação e eficiência no auxílio de algumas etapas.

Às instituições CNPq, INCTAA e IQ-UNICAMP, sem as quais não seria possível desenvolver este trabalho.

Aos professores do IQ-UNICAMP e do IQ-UFRN, que contribuíram imensamente para a minha formação profissional e pessoal.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida.

Ao meu amigo Sergio Ruschi por todo companheirismo criado durante esse período dentro e fora da universidade.

Este trabalho descreve a síntese de três polímeros molecularmente impressos (MIP) com estrutura caroço-casca para extração de ácido ascórbico, cafeína e vanilina por meio de extração em fase sólida e método de incubação. Objetivando identificar, compreender e controlar os parâmetros envolvidos na síntese dos polímeros impressos, foram desenvolvidos diversos MIP a partir de partículas porosas e não porosas, funcionalizadas e não funcionalizadas, em dimensões nano- e micrométricas. Os caroços inorgânicos compostos por nano- e micromateriais foram sintetizados com base nos métodos de Stöber e de macroemulsão de água em óleo, respectivamente. A camada polimérica impressa (casca) foi produzida na superfície das partículas inorgânicas (caroço) de três formas distintas, apresentando em comum o uso de monômero funcional, agente de reticulação, iniciador e solvente porogênico, além da molécula molde. A camada polimérica não impressa (NIP) foi fabricada igualmente ao MIP, mas sem a presença da molécula molde. Além disso, foram realizados cálculos teóricos das condições de espontaneidade de síntese baseado na teoria do funcional da densidade. Os materiais sintetizados foram caracterizados por MIR-ATR, SEM, EDX e isoterma de adsorção-dessorção. As propriedades de ligação foram demonstradas pela capacidade de adsorção e o fator de impressão obtido com base nas medidas de absorção UV-VIS. Além disso, as condições de síntese foram otimizadas de modo que a eficiência de impressão e a capacidade de adsorção fossem maximizadas. Finalmente, foi demonstrado que os métodos propostos geraram microesferas híbridas com estrutura caroço-casca capazes de fornecer rápida adsorção, expressiva capacidade de ligação (até 5,64 mg g-1_{), excelentes} fatores de impressão (até 2,37) e um número significativo de reutilizações (> 20). Dois estudos comparativos envolvendo a extração simultânea de ácido ascórbico e ácido cítrico, vanilina e etilvanilina, permitiram verificar a seletividade dos MIP em soluções padrão, que apresentou um fator de impressão de até 2,27. O MIP desenvolvido para extração de vanilina apresentou um fator de impressão de 1,34 para amostras comerciais contendo vanilina a e etilvanilina.

This work describes the synthesis of three molecularly printed polymers (MIP) with core-shell structure for extraction of ascorbic acid, caffeine and vanillin, by means of solid phase extraction and incubation method. In order to identify, understand and control the parameters involved in the synthesis of the imprinted polymers, several MIP were developed based on porous and porous, functionalized and non-functionalized particles, with nano- and micrometer dimensions. The inorganic core comprised of nano- and micromaterials were synthesized based on the Stöber and water-in-oil macroemulsion methods, respectively. The imprinted polymeric layer (shell) was produced on the surface of the inorganic particles in three distinct ways, exhibiting in common the use of functional monomer, crosslinking agent, initiator and porogenic solvent, besides the template molecule. In addition, theoretical calculation of spontaneity conditions for the synthesis based on the density functional theory was performed. The synthesized materials were characterized by MIR-ATR, SEM, EDX and adsorption-desorption isotherm. The binding properties were demonstrated by the adsorption capacity and the imprinting factor obtained by means of UV-Vis measurements. In addition, the synthesis conditions were optimized so that imprinting efficiency and adsorption capacity were maximized. Finally, it was demonstrated that proposed methods of generating hybrid microspheres with core-shell structure capable of providing fast adsorption, expressive binding capacity (up to 5.64 mg g-1_{), excellent} imprinting factors (up to 2.37) and a significant number of reuse (> 20). Two comparative studies involving the simultaneous extraction of ascorbic acid and citric acid, vanillin and ethylvanillin allowed to verify the excellent selectivity of MIP in standard solutions, which presented imprinting factor of up to 2.27. The MIP developed for vanillin extraction showed imprinting factor of 1.34 for commercial samples containing vanillin and ethylvanillin.

Figura 1 - 1. Número de publicações sobre polímeros impressos de 1995 a 2018 de acordo com o mecanismo de busca Web of Science usando o termo "polímero de impressão molecular". ... 23 Figura 1 - 2. Representação esquemática da decomposição do iniciador (AIBN) (I) e passo de adição do monômero (Ácido acrílico) (II). ... 29 Figura 1 - 3. Representação esquemática do passo de propagação do monômero (Ácido acrílico). ... 30 Figura 1 - 4. Representação esquemática do passo de propagação do monômero (Ácido acrílico). ... 31 Figura 1 - 5. Representação esquemática do mecanismo de ativação/desativação por polimerização RAFT. ... 32 Figura 1 - 6. Monômeros funcionais comuns utilizados na síntese de polímeros impressos. ... 34 Figura 1 - 7. Estruturas químicas dos agentes de reticulação. ... 35 Figura 1 - 8. Estrutura química de iniciadores comuns utilizados na impressão molecular não covalente. ... 49 Figura 2 - 1. Ilustração esquemática da preparação do MSF@MIP. O MSF@NIP correspondente foi preparado com a mesma rota de síntese na ausência da molécula molde. ... 57 Figura 2 - 2. Micrografias das (a) MS, (b) MSF, (c) MSF@MIP, (d) MSF@NIP, (e) e (f) MSF@MIP colapsado. ... 63 Figura 2 - 3. Os espectros de IR-ATR das (a) MSF@NIP, (b) MSF@MIP, (c) MS e (d) MSF. ... 64 Figura 2 - 4. Interação das MSF com a ninidrina em solução alcoólica. ... 65 Figura 2 - 5. Capacidade de adsorção do MSF@MIP e do MSF@NIP em função da concentração de AA usando o método (a) SPE e o (b) método incubação. ... 66 Figura 2 - 6. Recuperação de AA usando MSF@MIP reutilizado... 68

Figura 2 - 8. Geometria do AA e dos monômeros otimizadas pelo método B3LYP/6-31G (d,p), no vácuo. Na molécula de AA, quanto mais intenso a cor, menor a carga ... 70 Figura 2 - 9. Cálculo teórico no vácuo dos possíveis sítios de ligação da molécula de AA com diferentes monômeros. ... 71 Figura 2 - 10. Cálculo teórico para avaliação do efeito do solvente sobre a energia envolvida na interação entre molécula molde e monômero.. ... 72 Figura 2 - 11. Relação entre a distância do oxigênio e hidrogênio nos monômeros e a espontaneidade das interações entre monômero e molécula molde...73 Figura 2 - 12. Estimativa energética sobre o efeito causado pela modificação do monômero ácido metacrílico com espécies eletronegativas...74 Figura 3 - 1. Esquema representativo da preparação do MIP e do NIP. ... 79 Figura 3 - 2. Espectros de IR-ATR das (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS1F@MIP e (d) MS1F@NIP. ... 83 Figura 3 - 3. Micrografias de (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS2, (d) MS2F, (e) MS1@MIP, (f) MS1F@MIP, (g) MS2@MIP, (h) MS2F@MIP, (i) MS1@NIP, (j) MS1F@NIP, (l) MS2@NIP e (k) MS2F@NIP. ... 84 Figura 3 - 4. Micrografias de (a) MS1@MIP colapsada e (b MIPs tradicionais sem morfologia definida. ... 85 Figura 3 - 5. Capacidade de adsorção do MS1@MIP em (a) função do tempo e (b) do pH. ... 88 Figura 3 - 6. Capacidade de adsorção do MS1@MIP e MS1@NIP em função da concentração de vanilina usando o (a) método SPE e o (b) método da incubação. . 88 Figura 3 - 7. Capacidade de adsorção do MS2@MIP e MS2F@NIP em função da concentração de vanilina usando o método da incubação. ... 89

da incubação. ... 90 Figura 3 - 9. Estudo da seletividade do MS1F@MIP e do MS1F@NIP para extração de vanilina e etilvanilina. ... 93 Figura 3 - 10. Estudo da seletividade do MS1F@MIP e do MS1F@NIP para extração de vanilina e etilvanilina de amostras reais. ... 94 Figura 4 - 1. Espectro no infravermelho médio das NPSA, NPS, NPSA@MIP e NPSA@NIP. ... 101 Figura 4 - 2. Micrografias das NPS (a), NPSA (b), NPSA@MIP (c) e NPSA@NIP (d). ... 102 Figura 4 - 3. Medidas de tamanho de partícula e potencial zeta das NPS, NPSA, NPSA@MIP e NPSA@NIP em suspensão obtidas por DLS. ... 103 Figura 4 - 4. Avaliação do solvente na capacidade de ligação. (A) 25/75 % v/v H2O/ACN, (B) 50/50 % v/v H2O/ACN, (C) 75/25 % v/v H2O/ACN, (D) 85/15% v/v H2O/ACN, (E) 90/10 % v/v H2O/ACN, (F), 5/95 % v/v H2O/ACN. ... 104 Figura 4 - 5.Capacidade de ligação do NPSA@MIP em função do tempo ... 105 Figura 4 - 6. Capacidade de adsorção do NPSA@MIP e do NPSA@NIP em função da concentração de cafeína usando o método da incubação. ... 106

Tabela 1 - 1. Resumo dos diferentes métodos de preparação dos MIPs. ... 27 Tabela 1 - 2. Lista de isotermas de adsorção com as suas respectivas equações linearizadas e não linearizadas. ... 48 Tabela 2 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial, tamanho e volume de poros e tamanho de partícula obtidas a partir do BET, BJH e MEV, respectivamente. ... 79 Tabela 2 - 2. Parâmetros das isotermas para adsorção de AA utilizando MSF@MIP e MSF@MIP.. ... 81 Tabela 3 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial e de tamanho de partícula. Na determinação da área superficial o método BET foi utilizado. ... 101 Tabela 3 - 2. Parâmetros das isotermas para ajuste dos dados. ... 1048

AA Ácido ascórbico AC Ácido cítrico

AIBN 2,2’-azobisisobutironitrilo AM1 Austin model 1

APTES Aminopropiltrietoxisilano APTMS Aminopropiltrimetoxisilano

ATRP Atom Transfer Radical Polymerization (Polimerização radicalar por transferência de átomos

BET Brunauer, Emmett e Teller BJH Brunauer, Joyner e Halenda

DFT Density Functional Theory (Teoria do funcional da densidade)

EDX Energy-dispersive X-ray spectroscopy (Espectroscopia de Raios X por Dispersão em Energia)

EGDMA Etilenoglicol dimetacrilato

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática)

EMQ Erro Médio Quadrático

HPC Hydroxypropyl Celulose (Hidroxipropilcelulose)

HPLC High performace liquid chromatography (Cromatografia líquida de alta eficiência)

LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (Cromatografia líquida com espectrômetro de massa)

LPE Liquid Phase Extraction (Extração em fase líquida)

MAE Microwave-assisted extraction (Extração assistida por micro-ondas) MIP Molecularly imprinted polymer (Polímero molecularmente impresso)

MISPE Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida Impressa Molecularmente)

MIT Molecularly Imprinted Technology (Tecnologia de Impressão Molecular) NMP Nitrogen-mediated polymerization (Polimerização mediada por

nitróxido)

NMP Nitroxide-mediated polymerization (polimerização mediada por nitróxido) NMR Nuclear magnetic resonance (Ressonância magnética nuclear)

QDs Quantum dots (Pontos quânticos)

RAFT Reversible addition-fragmentation chain transfer (Transferência reversível de cadeia por adição-fragmentação)

SEM Scanning eletronic microscopy (Microscopia eletrônica de varredura) SERS Surface-enhanced Raman spectroscopy (Espectroscopia Raman

amplificada por superfície)

SPE Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida).

TEM Transmission eletronic microscopy (Microscopia eletrônica de transmissão)

TEOS Tetraetoxissilano

UAE Ultrasonic Assisted Extraction (Extração Assistida por Ultrassom) UV/VIS Ultravioleta/Visível

PREFÁCIO ... 19

CAPÍTULO 1 ... 21

1. Polímero Molecularmente Impresso ... 21

1.1. Introdução ... 22

1.2. Métodos de Impressão Molecular ... 25

1.2.1. Síntese dos MIPs ... 25

1.2.2. Mecanismo de Polimerização ... 28

1.2.2.1. Polimerização por Radicais Livres ... 28

1.2.2.1.1. Iniciação ... 29

1.2.2.1.2. Propagação ... 29

1.2.2.1.3. Término ... 30

1.2.2.2. Polimerização Radicalar Controlada... 31

1.2.3. Reagentes e Condições Utilizados em Impressão Molecular... 33

1.2.3.1. Molécula Molde ... 33

1.2.3.2. Monômero Funcional ... 34

1.2.3.3. Agente de Reticulação ... 35

1.2.3.4. Iniciador ... 36

1.2.3.5. Solvente Porogênico ... 37

1.2.4. Caracterização dos MIPs ... 37

1.2.4.1. Caracterização Química ... 38

1.2.4.2. Caracterização Morfológica ... 39

1.2.4.3. Caracterização dos Sítios de Ligação ... 39

1.2.4.3.1. Método de Incubação ... 40

1.2.4.3.2. Método MISPE ... 40

1.2.5. Adsorção ... 41

1.2.5.1. Cinética de Adsorção ... 42

1.2.5.1.1. Modelo de Pseudo–Primeira Ordem ... 42

1.2.5.1.2. Modelo de Pseudo–Segunda Ordem ... 43

1.2.5.2.2. Modelo de Scatchard ... 46

1.2.5.2.3. Modelo de Freundlich ... 46

1.2.5.2.4. Modelo de Sips ... 47

1.2.6. Funções de erro ... 47

1.2.6.1. Coeficiente de Determinação (R2_{) ... 48}

1.2.6.2. Erro Médio Quadrático (EMQ) ... 49

1.2.7. Aplicações ... 49

1.3. Objetivos ... 51

CAPÍTULO 2 ... 52

2. Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico ... 52

2.1. Introdução ... 53

2.2. Parte Experimental ... 55

2.2.1. Reagentes ... 55

2.2.2. Fabricação do MIP na Superfície das Partículas ... 55

2.2.2.1. Síntese de Microesferas de Sílica (MS) ... 55

2.2.2.2. Funcionalização das MS (MSF) ... 56

2.2.2.3. Preparação do MIP para AA ... 56

2.2.3. Caracterização ... 58

2.2.4. Avaliação das Características de Ligação e Capacidade de Adsorção .. 58

2.2.4.1. Estudo de Incubação ... 58

2.2.4.2. Estudo de SPE ... 59

2.2.4.3. Reconhecimento Específico do MSF@MIP e MSF@NIP ... 60

2.2.5. Método de Cálculo ... 60

2.3. Resultados e Discussão... 61

2.3.1. Síntese das MS e do MIP com Estrutura Caroço-Casca ... 61

2.3.2. Caracterização ... 62

2.3.3. Estudo de Adsorção ... 66

2.3.4. Otimização Estrutural do Monômero e Molécula Molde ... 69

Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina ... 75

3.1. Introdução ... 76

3.2. Parte Experimental ... 78

3.2.1. Reagentes ... 78

3.2.2. Preparação do MIP para Extração de Vanilina ... 78

3.2.2.1. Síntese das MS ... 78

3.2.2.2. Fabricação do MIP ... 78

3.2.3. Avaliação das Características e da Capacidade de Adsorção ... 79

3.2.3.1. Estudo de Adsorção – Método da Incubação ... 79

3.2.3.2. Estudo de Adsorção – SPE ... 80

3.2.3.3. Reconhecimento Específico ... 81

3.2.3.4. Aplicação em Amostras Reais ... 81

3.3. Resultados e Discussão... 81

3.3.1. Síntese das Partículas de Sílica e do MIP com Estrutura Caroço-Casca .. ... 81

3.3.2. Caracterização ... 82

3.3.3. Estudo de Adsorção ... 87

3.3.3.1. Estudo de Recuperação ... 92

3.3.3.2. Estudo de Seletividade e Aplicação em Amostra Real ... 92

CAPÍTULO 4 ... 95

4. Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína ... 95

4.1. Introdução ... 96

4.2. Parte Experimental ... 97

4.2.1. Reagentes ... 97

4.2.2. Síntese de Nanopartículas de Sílica Amino-Funcionalizadas (NPSA) ... 97

4.2.3. Síntese do MIP de Superfície em Nanopartículas de Sílica Amino-Funcionalizadas (NPSA) ... 98

4.2.4. Caracterização ... 98

4.2.5. Estudo de Adsorção ... 99

4.3.3. Estudo da Capacidade de Adsorção ... 103

CAPÍTULO 5 ... 107

5. Conclusões e Perspectivas ... 107

Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP

PREFÁCIO

Este trabalho tem como propósito descrever a síntese e aplicação de três polímeros impressos, com estrutura caroço-casca, para extração seletiva de ácido ascórbico, cafeína e vanilina. Essa tecnologia foi desenvolvida em parceria com o Instituto de Analítica e Bioanalítica da Universidade de Ulm, Alemanha, sob a supervisão do professor Dr. Boris Mizaikoff.

Para melhor entendimento, essa Tese foi dividida em 5 capítulos visando facilitar a compreensão das metodologias utilizadas, bem como os resultados obtidos, seguindo uma ordem cronológica.

O capítulo 1 contém uma introdução geral sobre polímeros impressos, convencionais e com estrutura caroço-casca, abordando aspectos relevantes, cujo objetivo é apresentar informações básicas relevantes, para facilitar a interpretação dos resultados obtidos.

Nos capítulos 2 e 3 são descritas a síntese, a caracterização e a aplicação dos polímeros impressos para ácido ascórbico e vanilina, respectivamente, a partir de microesferas de sílica funcionalizadas, porosas e não-porosas, produzidas pelo método da macroemulsão. Ainda nesses capítulos, são descritos o estudo comparativo entre o método de extração em fase sólida e o método de incubação, ambos avaliados através da espectrofotometria UV/VIS. A tecnologia de impressão molecular descrita no capítulo 2 apresenta alguns aspectos científicos inéditos que foram fundamentais para o desenvolvimento dos demais capítulos. O capítulo 2 é descrito também o uso de cálculo teórico baseado na teoria do funcional da densidade envolvendo o polímero impresso para ácido ascórbico. Os cálculos teóricos permitem identificar a espontaneidade da interação monômero-molécula molde em diferentes solventes, sendo possível selecionar o melhor sistema para o desenvolvimento do polímero impresso. Além disso, o estudo teórico auxilia na compreensão de alguns resultados experimentais obtidos

Semelhantemente aos capítulos 2 e 3, o capítulo 4 apresenta o desenvolvimento de um polímero impresso para cafeína, a partir de nanoesferas de sílica funcionalizada, sintetizadas com base no método de Stöber. O objetivo principal deste

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capítulo 4 foi comprovar que a tecnologia utilizada para fabricação dos polímeros impressos a partir de micropartículas (capítulos 2 e 3) é igualmente eficiente em nanoescala. Os resultados preliminares apresentados neste capítulo indicam aspectos promissores para este polímero em nanoescala.

CAPÍTULO 1

1.

Polímero Molecularmente Impresso

RESUMO GRÁFICO

Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP

1.1. Introdução

A tecnologia de impressão molecular (MIT, do inglês molelularly imprinted

technology) consiste no planejamento e desenvolvimento de materiais sintéticos, com

cavidades feitas sob medida, que demonstram seletividade comparada à de receptores naturais (Alexander et al., 2006; Poma, Turner e Piletsky, 2010). O conceito de impressão molecular surgiu com base na teoria proposta por Pauling para descrever a formação dos anticorpos (Ye e Mosbach, 2008). Assim, com base neste mecanismo, surgiu a ideia de produzir uma estrutura tridimensional rígida polimérica ao redor de uma molécula molde, que tivesse a capacidade de mimetizar os materiais biológicos, tais como as interações antígeno-anticorpo, as interações enzima-substrato, mantendo a elevada especificidade e seletividade. Nestes sistemas, as macromoléculas biológicas possuem locais de ligação específicos, os quais apresentam capacidade para reterem de forma seletiva uma dada molécula, mesmo em presença de outras com estruturas químicas muito semelhantes (Hansen, 2007). Usualmente, estes materiais são denominados de polímeros molecularmente impressos, ou somente pela sigla MIP que advém do inglês Molecularly Imprinted

Polymers.

Os polímeros de impressão molecular (MIP) são materiais sintéticos com sítios de reconhecimento específicos produzidos em uma síntese polimérica, onde uma molécula alvo é utilizada como molde (Turiel e Martín-Esteban, 2010). Para a produção deste material são necessárias uma molécula molde, um monômero funcional, um solvente porogênico, um iniciador e um agente de reticulação. O processo de fabricação inicial do MIP começa com a formação do complexo entre o monômero, portador de certos grupos funcionais, e a molécula molde, através de interações covalentes ou não-covalentes. Subsequentemente, o agente de reticulação, responsável pela estabilização dos sítios de ligação, e o iniciador, responsável por iniciar a reação de polimerização, são adicionados ao sistema. Após a polimerização, a molécula molde é removida da matriz polimérica, produzindo um polímero com cavidades complementares à molécula molde em termos de tamanho, forma e disposição de grupos funcionais (Roland e Bhawani, 2016). Em outras palavras, as interações entre a molécula molde e a matriz polimérica são memorizadas

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durante a impressão molecular, possibilitando o reconhecimento específico no processo de extração da molécula alvo.

Desde 1930, quando em seu trabalho pioneiro Polyakov produziu um polímero impresso a base de sílica para o reconhecimento específico de benzeno (Polyakov, 1930), os MIPs vêm evoluindo em aspectos relacionados à síntese, caracterização e aplicação, o que demonstra uma maturação gradual da MIT e o amplo interesse da comunidade científica em geral. O número de artigos científicos publicados entre os anos de 1998 a 2017 divulgado pelo site de busca científica Web of Science (Figura 1 - 1) já ultrapassa os 3000, o que reflete diretamente o rápido e contínuo desenvolvimento das tendências e áreas atuais.

Figura 1 - 1. Número de publicações sobre polímeros impressos de 1995 a 2017 de acordo com o mecanismo de busca Web of Science (acesso em 06 jan. 2018) usando o termo "molecularly imprinted polymer" no título.

Em comparação com outros sistemas de reconhecimento, como por exemplo os anticorpos, os MIPs apresentam vantagens em relação à estabilidade, ao baixo custo, ao reconhecimento específico e a universalidade de aplicações, tornando-se atraentes em muitos campos, tais como purificação (Kowalski et al., 2004), separação (Iskierko

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Stephenson, 2010), catálise (Mirata e Resmini, 2015) e entrega de fármacos (Alvarez-Lorenzo e Concheiro, 2004). Outra característica atraente da impressão molecular é a impressão de uma ampla variedade de moléculas ou íons, incluindo cátions e ânions (por exemplo, Ca2+_{, Cu}2+_{, Pb}2+_{, Fe}3+_{, F}- _{e NO3}-_{), moléculas pequenas (por exemplo,} fármacos, pesticidas, aminoácidos, peptídeos, bases nucleotídicas, esteroides e açúcares), moléculas orgânicas grandes e bioanalitos (por exemplo, vírus, imunoglobulinas e eritrócitos). Além disso, os MIPs podem ser usados como materiais feitos sob medida quando os receptores biológicos não estão disponíveis (Menger et

al., 2016).

Na impressão molecular, duas abordagens, covalente e não-covalente, são empregadas para descrever as interações entre molécula molde e os monômeros. A abordagem covalente foi introduzida pela primeira vez por Wulff e Sarhan (1972) (Wulff e Sarhan, 1972), que envolve a formação de ligações covalentes reversíveis entre a molécula molde e o monômero antes da polimerização. A vantagem óbvia deste procedimento é que os sítios de ligação são mais homogêneos e estáveis e, consequentemente, mais seletivos. No entanto, a cinética de ligação é lenta e a remoção da molécula molde da matriz polimérica torna-se mais complexa, pois tanto a formação como a clivagem da ligação covalente devem ocorrer em condições brandas. Em contraste, Arshady e Mosbach (1981) (Arshady e Mosbach, 1981) desenvolveram uma abordagem não-covalente que combina a molécula molde e o monômero por interações não-covalentes, como forças eletrostáticas, forças de van der Waals, interações iônicas ou ligações de hidrogênio. A vantagem de possuir uma rápida cinética de ligação e remoção, além de um grande número de monômeros capazes de interagir com uma ampla variedade de moléculas molde disponíveis no mercado, tem tornado essa abordagem a mais utilizada na preparação dos MIPs (Vasapollo et al., 2011). No entanto, essa abordagem apresenta como desvantagens a baixa seletividade, que ocorre devido a heterogeneidade dos sítios de ligação e uma maior influência da polaridade do solvente utilizado no processo de pré-polimerização. A literatura apresenta uma terceira abordagem, que descreve um duplo modo de ligação, onde a molécula molde e o monômero interagem covalentemente na etapa de pré-polimerização e interagem de forma não covalente na etapa de religação. Essa abordagem é conhecida como semi-covalente (Caro et al., 2002).

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1.2. Métodos de Impressão Molecular

1.2.1. Síntese dos MIPs

Os MIPs podem ser sintetizados empregando-se várias técnicas diferentes, tais como polimerização em massa, em suspensão, de precipitação e sobre a superfície de partículas inorgânicas (Tabela 1 - 1). A seleção do método de impressão depende do tamanho e da forma do MIP desejado (isto é, material denso ou microporoso, filmes finos, nanopartículas, etc.), do tipo de molécula molde e do tipo aplicação. Por exemplo, na preparação de amostras de alimentos, os MIPs são muitas vezes sintetizados empregando-se o método de polimerização em massa antes de serem enxertados em um suporte de fase sólida, enquanto que em biossensores baseados em MIP, os filmes finos são mais comumente enxertados na superfície do sensor (Kriz e Mosbach, 1995; Pillay et al., 2013). Para ambas aplicações, os MIPs com alta área superficial e grande número de locais de ligação são desejáveis, enquanto a quantidade de ligações não específicas deve ser mantida ao mínimo.

Cronologicamente, o primeiro método de polimerização empregado para sintetizar o MIP baseou-se na polimerização em massa, seguida de moagem e peneiramento para obter pequenas partículas de tamanho micrométrico adequadas para utilização em aplicações cromatográficas (Zu et al., 2010). Neste processo, o monômero funcional é espacialmente organizado em torno de uma molécula molde na presença de um solvente orgânico. O complexo resultante da interação entre a molécula molde e o monômero é copolimerizado com um excesso de agente de reticulação na presença de um iniciador, sob condições térmicas ou fotoquímicas. O bloco polimérico resultante é então moído e peneirado para produzir partículas de um tamanho apropriado. Por fim, a molécula molde é removida da matriz polimérica deixando sítios de ligação complementares em locais de ligações e em forma. Embora este método seja o mais popular, por ser simples e universal, apresenta algumas desvantagens, tais como preparação demorada e menos locais de reconhecimento específicos, o que, consequentemente, provoca uma cinética de ligação lenta e baixa capacidade de ligação (Wu et al., 2016).

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Outro método aplicado é o da polimerização por suspensão (Mayes e Mosbach, 1996). Neste método, a polimerização ocorre dentro de gotículas de monômeros que funcionam como mini-reatores, permitindo a produção de partículas esféricas em uma ampla faixa de tamanho, começando em alguns micrômetros até milímetros. O processo de síntese inicia-se com a solubilização de todos reagentes em solvente orgânico, seguido da adição de um solvente imiscível, geralmente água ou óleo mineral, contendo um agente tensoativo, formando uma emulsão. O controle do grau de agitação e da quantidade de tensoativo, bem como da temperatura, torna-se fundamental para determinar o tamanho médio e a distribuição de tamanho das partículas. Em comparação com o método de polimerização em massa, as partículas formadas não necessitam de moagem mecânica, apresentam tamanhos mais uniformes e são separadas da fase imiscível com maior facilidade. No entanto, mesmo uma pequena quantidade de água difundida na fase orgânica é suficiente para destruir as ligações de hidrogênio entre os monômeros e as moléculas moldes. Além disso, em situações onde monômeros e moléculas molde possuem elevada solubilidade em água, existe a possibilidade de ocorrer partição dos constituintes reacionais da fase orgânica com a fase aquosa, resultando em um baixo fator de reconhecimento molecular (Martin-Esteban, 2001).

O método de polimerização por precipitação é análogo ao método de polimerização em massa e baseia-se no crescimento de cadeias de polímero, que precipita durante a reação quando um determinado comprimento de cadeia é atingido, tornando-se insolúvel no solvente orgânico, com consequente precipitação. A rigidez proporcionada pelo agente de reticulação é suficiente para impedir a coalescência das partículas, dispensando o uso de tensoativo. As vantagens desse método consistem na obtenção de partículas monodispersas com diâmetros inferiores a 100 nm, não sendo necessária a fase de moagem, além de rendimentos superiores em relação à polimerização em massa. A principal desvantagem consiste no uso de elevadas quantidades de solvente orgânico, chegando a ser 8 vezes maior que o método de polimerização em massa. Além disso, pode ser necessário o uso de centrífugas de alta rotação para recolher as partículas obtidas em nanoescala (Tamayo, Casillas e Martin-Esteban, 2003).

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Tabela 1 - 1. Resumo dos diferentes métodos de preparação dos MIPs.

MIP Vantagens Desvantagens

Polimerização em massa - Simplicidade - Universalidade da polimerização - Procedimentos tediosos de moagem e peneiramento Polimerização em suspensão

- Síntese altamente reprodutível - Partículas esféricas

- Não necessidade de moagem.

- Partição dos constituintes reacionais

- Incompatibilidade com água

Polimerização de precipitação

- Partículas monodispersas - Elevados rendimentos

- Elevadas quantidades de solvente orgânico e molécula molde

Polimerização em superfície

- Morfologia definida

- Alta capacidade de ligação - Rápida transferência de massa

- Processo demorado - Sistema mais complexo

Outro método recente de preparo do MIP consiste na polimerização sobre a superfície de partículas. Neste método, a polimerização é realizada sobre uma partícula inorgânica, geralmente esférica (caroço), de modo que os materiais impressos formem uma camada fina (casca) na superfície das esferas, obtendo-se uma estrutura do tipo caroço-casca. Esse método apresenta algumas vantagens em relação aos MIPs já descritos, tais como morfologia definida, alta capacidade de ligação e rápida transferência de massa. Além disso, as partículas obtidas assumem características uniformes e mecanicamente estáveis (Miao et al., 2015). No entanto, dentre os métodos citados, esse é considerado o mais complexo, isso porque o controle da uniformidade e do tamanho da camada polimérica ainda não está bem estabelecido.

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Os núcleos do MIP com estrutura caroço-casca podem ser compostos de diversos materiais, tais como partículas de sílica (Cheng, Liu e Wang, 2013), partículas magnéticas de óxido de ferro (Fan et al., 2015), partículas metálicas e pontos quânticos (Ren e Chen, 2015). A vantagem de aplicar esferas de sílica na fabricação do MIP com estrutura caroço-casca está associada com a fotoestabilidade, a estabilidade química, a biocompatibilidade, a fácil modificação e ao fato da sílica ser uma matriz inerte. Além disso, as partículas de sílica podem ser desenvolvidas com diferentes tamanhos e porosidade. O método desenvolvido por Stöber, por exemplo, é capaz de produzir partículas monodispersas de até 2 µm (Stöber, Fink e Bohn, 1968). No entanto, quando se objetiva sintetizar partículas em microescala, o método de Stöber geralmente é substituído pelo método da macroemulsão. A macroemulsão produz partículas polidispersas, não aglomeradas, porosas ou não-porosa, e que devido ao tamanho em microescala podem ser facilmente manuseadas e recuperadas (Darbandi, Thomann e Nann, 2005).

1.2.2.

Mecanismo de Polimerização

1.2.2.1. Polimerização por Radicais Livres

A polimerização por radicais livres é o método sintético mais importante disponível hoje para a conversão de monômeros em polímero, sendo amplamente explorada na indústria para a produção, em escala de várias toneladas, de uma série de plásticos comercialmente importantes. Essa polimerização ocorre através da quebra de uma ligação dupla da unidade monomérica, convertendo-a em um radical de propagação ativo (Daoud Attieh et al., 2017). Uma das principais vantagens desse processo consiste no uso de condições brandas de reação, como, por exemplo, temperatura ambiente e pressão atmosférica. Apesar de seus muitos benefícios e uso amplamente difundido, o rápido crescimento da cadeia polimérica e a reação de terminação irreversível impõem algumas limitações sobre o grau de distribuição do peso molecular da estrutura polimérica. Os passos básicos na polimerização por radicais livres são caracterizados por três estágios: iniciação, propagação e término, podendo ser composto por mais estágios dependendo do processo (transferência de cadeia). Em geral, a etapa de propagação é o estágio mais rápido da polimerização,

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sendo o iniciador ativo durante todo o processo da polimerização (George Odian, 2004).

1.2.2.1.1. Iniciação

Esta etapa envolve a criação do centro ativo de radicais livres e geralmente ocorre em duas etapas. A primeira é a formação de radicais livres a partir de uma decomposição do iniciador, que pode ser térmica ou por radiação, e a segunda é a adição de um desses radicais livres a uma molécula de monômero (Figura 1 - 2) (Su, 2013).

Figura 1 - 2. Representação esquemática da decomposição do iniciador 2,2’-azobisisobutironitrilo (AIBN) (I) e passo de adição do monômero (ácido acrílico) (II).

1.2.2.1.2. Propagação

O segundo estágio envolve o crescimento da cadeia polimérica por adição rápida e sequencial do monômero para o centro ativo (Figura 1 - 3). O tempo necessário para cada adição de monômero normalmente de alguns milissegundos e, portanto, milhares de adições podem ocorrer em poucos segundos (Su, 2013).

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Figura 1 - 3. Representação esquemática do passo de propagação do monômero (ácido acrílico).

1.2.2.1.3. Término

Nesta fase, o centro ativo é destruído de forma irreversível e a propagação cessa. A terminação ocorre através de reações de acoplamento (etapa designada como combinação) ou transferência atômica entre cadeias ativas (etapa designada desproporção). A combinação envolve o acoplamento entre duas cadeias em crescimento para formar uma única molécula de polímero. A desproporção envolve a transferência de um átomo de hidrogênio de uma cadeia polimérica em crescimento para outra, formando diferentes grupos finais sem uma cadeia interligada (Figura 1 - 4) (Su, 2013).

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Figura 1 - 4. Representação esquemática do passo de término da polimerização.

1.2.2.2. Polimerização Radicalar Controlada

A polimerização radicalar controlada tem chamado atenção por possuir potencial para superar as limitações da polimerização por radicais livres. Embora mais flexível em termos de pureza do reagente, condições experimentais e escolha de monômeros, a polimerização por radicais livres apresenta como desvantagem o não controle da massa molar do polímero sintetizado, que ocorre devido à alta reatividade dos radicais produzidos constantemente durante o processo de polimerização.

A polimerização radicalar cessa somente quando não há mais monômeros, podendo continuar após a adição de mais monômero, comprovando que o processo pode ser interrompido e reiniciado a qualquer momento. Diferentemente, a polimerização radicalar controlada (Figura 1 - 5) permite a síntese de polímeros com dispersão e massa molar sob controle e, embora não seja um processo trivial, possibilita no mínimo um controle parcial da massa molar e dispersão (Dragutan et al., 2015). Atualmente, os três métodos mais eficazes de polimerização controlada incluem polimerização mediada por nitróxido (NMP, do inglês nitroxide-mediated

polymerization), polimerização radicalar por transferência de átomos (ATRP, do inglês Atom-transfer radical-polymerization) e transferência reversível de cadeia por

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Figura 1 - 5. Representação esquemática do mecanismo de polimerização via transferência reversível de cadeia por adição-fragmentação (RAFT).

Nos últimos anos, a RAFT tem sido considerada uma das técnicas mais eficientes para o controle da polimerização radicalar, mostrando-se versátil e robusto a diversas condições de síntese, resultando em polímero com estrutura controlada. A versatilidade da polimerização RAFT possibilita o uso de agentes que transportam muitos grupos finais reativos úteis, possibilitando a polimerização de diversos monômeros que são inerentemente problemáticos em outras técnicas de polimerização. A polimerização RAFT assemelha-se à polimerização por radicais livres nos mecanismos básicos, ou seja, na iniciação e propagação. A minimização das reações de terminação e de transferência é uma etapa crítica neste contexto. Na prática, a principal diferença entre os métodos é a adição do agente RAFT (por exemplo, ditiobenzoato) na mistura de reação inicial. A inclusão do agente RAFT garante os passos reversíveis para ativação/desativação do radical, conforme ilustrado na Figura 1 - 5.

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1.2.3.

Reagentes e Condições Utilizados em Impressão

Molecular

A síntese dos MIPs exige uma boa compreensão sobre equilíbrio químico, teoria de reconhecimento molecular, termodinâmica e química de polímeros, a fim de compreender os parâmetros de síntese, incluindo a molécula molde, uma vez que podem influenciar a morfologia, as propriedades e o desempenho dos polímeros. O desafio de projetar e sintetizar um MIP pode ser uma perspectiva desalentadora diante do grande número de variáveis experimentais envolvidas, tais como a molécula molde, monômero funcional, agente de reticulação, iniciador e solvente porogênico. O conhecimento sobre as variáveis de síntese permite prever de forma racional se o polímero será rígido, flexível ou os dois, por exemplo.

1.2.3.1. Molécula Molde

A molécula molde é o composto alvo em um processo analítico, que geralmente é selecionada com base em sua disponibilidade, custo e funcionalidade química. Uma molécula molde ideal deve satisfazer três requisitos: Primeiro, não deve conter grupos envolvidos ou impedindo a reação de polimerização. Segundo, deve ser estável em temperaturas moderadamente elevadas (> 60 °C) ou durante a exposição à luz ultravioleta. Finalmente, deve conter grupos funcionais capazes de interagir fortemente com os monômeros funcionais. Embora a maior parte das publicações envolvendo MIPs utilize uma única molécula molde no sistema, um número crescente de trabalhos que descrevem a síntese de MIP para mais de uma molécula molde tem sido relatado (Sun et al., 2017). Além disso, dependendo do método de síntese, um polímero fabricado usando uma única molécula molde pode extrair mais de uma molécula presente. Geralmente, essas moléculas apresentam uma estrutura análoga a outras estruturas (geralmente compostos de uma mesma classe), variando apenas um grupo funcional ou posição de ligação, através de um efeito conhecido como seletividade cruzada (Barros, Custodio e Rath, 2016). Por exemplo, Esteban e Tamayo desenvolveram um polímero impresso para fenuron, inuron, metoxuron, clortoluron, isoproturon, metobromuron, todos pertencentes à classe dos herbicidas

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de feniluréia, para extração em baixos níveis de concentração diretamente de extratos de amostras de vegetais (Tamayo e Martin-Esteban, 2005).

1.2.3.2. Monômero Funcional

Na Figura 1 - 6 são apresentadas as estruturas químicas moleculares dos monômeros mais comumente usados para fabricação dos polímeros impressos. Observa-se que como característica em comum, a maioria das moléculas possui um grupo vinil e grupo capaz de realizar ligações de hidrogênio. A escolha cuidadosa do monômero funcional é de extrema importância para fornecer grupos funcionais que podem formar um complexo com a molécula molde através de interações covalentes ou não covalentes.

Figura 1 - 6. Monômeros funcionais comumente utilizados na síntese de polímeros impressos.

Normalmente, os monômeros são polimerizados resultando em macromoléculas lineares que são solúveis e quimicamente compatíveis com diferentes solventes. A razão molar entre a quantidade de monômero e de molécula molde é, geralmente, maior que a unidade, favorecendo a formação da cavidade da molécula alvo. A força das interações entre a molécula molde e o monômero afeta a afinidade, a estabilidade e a seletividade. Dependendo do tipo de molécula molde, pode-se utilizar dois ou mais monômeros para formar o complexo, resultando no aumento na capacidade de

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extração e seletividade. No entanto, vale ressaltar que um excesso de monômero pode aumentar a quantidade de sítios de ligação não específicos, promovendo a diminuição da seletividade do MIP (Alenazi, Manthorpe e Lai, 2016).

1.2.3.3. Agente de Reticulação

Durante a síntese dos MIPs, os agentes de reticulação desempenham papéis essenciais, tais como controlar a morfologia da matriz polimérica, estabilizar os sítios de ligação do MIP e dar estabilidade mecânica à matriz polimérica para manter sua capacidade de reconhecimento molecular. Na Figura 1 - 7 são apresentadas as estruturas químicas moleculares de alguns agentes de reticulação mais utilizados. Figura 1 - 7. Estruturas químicas dos agentes de reticulação.

O tipo e a quantidade de agente reticulante têm influências profundas na seletividade e na capacidade de ligação dos MIPs. Geralmente, uma quantidade muito baixa de agente reticulante resultará em propriedades mecânicas instáveis devido ao

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baixo grau de reticulação, e uma quantidade extremamente alta do agente reticulante reduzirá o número de sítios de reconhecimento por unidade de massa de polímero. A literatura apresenta uma série de reticulantes compatíveis com a impressão molecular, alguns dos quais são capazes de complexar simultaneamente a molécula molde e, assim, atuar como monômero funcional (Yan e Ho Row, 2006).

1.2.3.4. Iniciador

O iniciador funciona como um gatilho que possibilita o início e a manutenção da reação de polimerização. Normalmente, eles são usados em níveis baixos em comparação com a quantidade de monômero (1% em massa). A grande maioria dos MIPs é comumente preparada por meio de polimerização por radicais livres, fotopolimerização e eletropolimerização, podendo ser iniciado térmica ou fotoquimicamente para uma ampla faixa de grupos funcionais e moléculas molde (Chen et al., 2016). Além do peróxido, os azo-compostos são amplamente utilizados como iniciadores, sendo o 2,2’-azobisisobutironitrilo (AIBN) mais comumente utilizado, podendo iniciar a reação de polimerização via radical livre ou termólise ou fotólise (Figura 1 - 8).

Figura 1 - 8. Estrutura química de iniciadores comuns utilizados na impressão molecular não covalente.

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A utilização da radiação ultravioleta (UV) permite obter tempos de polimerização bastante inferiores em relação à temperaturas moderadas (> 60ºC); no entanto, é necessário conhecer a fotossensibilidade dos demais reagentes envolvidos na reação. Em alguns casos, como na fabricação de MIPs para proteína, utiliza-se um iniciador que desencadeie a reação de polimerização a uma temperatura ambiente e sem fotólise; por exemplo, o persulfato pode produzir radicais livres na presença do ânion bisulfito ou na presença de metais de transição (Fe2+_{). A remoção do oxigênio} presente no ambiente de síntese do polímero, a qual pode ser feita pela saturação usando nitrogênio, é um passo importante para evitar a formação de um excesso de radicais que prejudiquem o processo de polimerização e, consequentemente, a formação dos sítios de ligação.

1.2.3.5. Solvente Porogênico

O solvente porogênico desempenha um papel importante na polimerização, atuando não só como meio de dispersão, mas também como agente formador de poros. O solvente, com a quantidade e a natureza adequada, fornece porosidade à matriz polimérica alterando as propriedades e a morfologia, o que facilita a transferência de massa do analito para os sítios de ligação. Além disso, também influência a força de interação envolvida no complexo formado entre a molécula molde e o monômero, especialmente se a interação for do tipo não covalente. Solventes orgânicos apróticos e de baixa polaridade, tais como tolueno, acetonitrila e clorofórmio são frequentemente utilizados em processos de polimerização não covalentes para obter boas eficiência de impressão e capacidade de adsorção. A literatura apresenta diversos resultados que comprovam que a “memória do solvente” influência o desempenho do MIP, ou seja, um MIP apresenta melhores resultados quando aplicados usando o mesmo solvente de síntese (Chen et al., 2016).

1.2.4.

Caracterização dos MIPs

A caracterização física, química e funcional dos polímeros impressos geralmente envolve uma variedade de técnicas analíticas. Dentre as técnicas mais utilizadas estão a microscopia eletrônica de varredura (SEM, do inglês scanning eletronic

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adsorção-dessorção de nitrogênio, análise termogravimétrica, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR, do inglês nuclear magnetic resonance), espectroscopia no infravermelho médio por refletância total atenuada (MIR-ATR, do

inglês mid-infrared attenuated total reflectance), espectroscopia ultravioleta-visível

(UV-Vis), espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDX, do inglês

energy-dispersive X-ray spectroscopy), dentre outras (Cormack e Elorza, 2004). Os métodos

de caracterização podem ser divididos em três partes complementares: caracterização química, morfológica e de sítios de ligação.

1.2.4.1. Caracterização Química

A etapa de pré-polimerização, onde um complexo é formado entre a molécula molde e o monômero, é determinante para o desempenho analítico do MIP. A NMR de hidrogênio foi introduzida nos processos de caracterização dos polímeros impressos para investigar a extensão da interação envolvendo monômero e molécula molde na solução de pré-polimerização. Assim, a avaliação do deslocamento de um sinal de próton, proveniente da ligação de hidrogênio, pode ser utilizado como critério de seleção do monômero funcional e a da molécula molde.

A espectroscopia MIR-ATR tem sido rotineiramente empregada como técnica de caracterização dos polímeros impressos, seja ele tradicional ou com estrutura caroço-casca. Essa técnica permite identificar uma modificação na superfície das partículas, bem como no produto final da polimerização. Além disso, também é possível monitorar o processo de lavagem do polímero, certificando a remoção por completo da molécula molde. A vantagem do MIR-ATR é ser uma técnica rápida e não destrutiva, o que pode ser extremamente útil, uma vez que algumas sínteses possuem baixo rendimento e a quantidade de material produzida é pequena.

A EDX é uma técnica espectroscópica quantitativa que permite determinar a composição elementar da superfície e da estrutura interna do polímero. A EDX usa raios-X para expulsar elétrons dos orbitais internos que podem ser usados para detectar a composição química de superfícies químicas dentro de uma profundidade de 5 – 100 nm, dependendo da potencia utilizada, dependendo da aceleração e da densidade utiliza. A EDX acoplada em microscópios eletrônicos é ainda mais eficiente,

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uma vez que possui um poder maior de resolução, tornando o mapeamento sobre a camada polimérica e seu núcleo, se existir, mais eficiente, obtendo resultados mais confiáveis.

1.2.4.2. Caracterização Morfológica

A morfologia de um polímero é um aspecto importante que influencia a estabilidade, a capacidade de adsorção e a seletividade. O estudo da morfologia traz informações relacionadas a porosidade, como tamanho e volume dos poros, área superficial e, em sistema caroço-casca, o tamanho e forma do caroço e a espessura da casca polimérica. Os parâmetros relacionados a porosidade geralmente são determinados pela isoterma adsorção-dessorção de nitrogênio, sendo a área superficial e o volume de poros determinados usando o modelo BET (Brunauer, Emmett e Teller) e BJH (Barret, Joyner e Halenda), respectivamente. A microscopia eletrônica permite obter mais detalhes da superfície do polímero, determinar o tamanho das partículas e sua dispersão morfológica. Além disso, através das micrografias é possível estimar se o material produzido possui boa estabilidade mecânica, uma vez que, pode ter ocorrido o colapso de algumas partículas durante o processo de lavagem e peneiramento.

1.2.4.3. Caracterização dos Sítios de Ligação

A quantificação da intensidade e da capacidade de adsorção, bem como a especificidade da matriz polimérica é essencial para uma compreensão do desempenho analítico do MIP. Esses parâmetros são normalmente alcançados pela obtenção de dados de adsorção, usando absorção no UV-VIS de soluções padrão da molécula molde, para um polímero em um intervalo de concentração especificado, onde as concentrações de analito (molécula molde) ligado e livre são medidas. Um dos principais pressupostos para a análise de dados de ligação é que os dados são coletados após o equilíbrio entre a molécula molde e o polímero. Ao caracterizar as propriedades de ligação, existem três propriedades pertinentes: afinidade, seletividade e cinética. A afinidade e a cinética indicam a estabilidade e intensidade das ligações, e se o processo pode ou não ocorrer em um determinado tempo. A especificidade discrimina qualidade dos sítios de ligação, ou seja, se monômero e

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molécula molde interagem de forma adequada para produzir seletividade (Yan et al., 2013). Normalmente, esses estudos são realizados utilizando o método de incubação ou o método da extração em fase sólida (SPE, do inglês Solid Phase Extraction).

1.2.4.3.1. Método de Incubação

O método de incubação consiste na dispersão do polímero em uma solução (em um tubo de centrifuga, por exemplo), orgânica ou aquosa, contendo a molécula molde ou similar, sob agitação moderada durante um determinado período de tempo. O tempo de incubação para a maioria dos ensaios é o tempo necessário para que 90% da quantidade de molécula molde em solução se ligue ao polímero. Uma vez que o equilíbrio é alcançado, o polímero é separado por filtração ou centrifugação, e o sobrenadante é cuidadosamente removido para determinar a quantidade de molécula molde livre e, consequentemente, a quantidade adsorvida ao polímero (Fernandes et

al., 2017). Para tal determinação, é necessário a construção de uma curva de

calibração da concentração de molécula molde versus absorção no UV-VIS, utilizando o mesmo solvente da etapa de incubação.

1.2.4.3.2. Método MISPE

No método MISPE, os analitos contidos numa matriz aquosa são extraídos, juntamente com os compostos interferentes, após passarem por um cartucho ou uma coluna contendo entre 100 e 1000 mg de sorvente, que pode ser um polímero impresso, com tamanho de partícula variando de 20 a 60 µm, fixado no tubo por meio de dois filtros de tamanho de poros de 20 µm (Fernandes et al., 2017). As etapas envolvidas na SPE são: o condicionamento, necessário para ativar a fase extratora, a extração, onde analitos semi-voláteis e não voláteis são extraídos de amostras líquidas, a limpeza (clean-up), para retirar os interferentes menos retidos que o analito, e a eluição, que recupera o analito de interesse (Ötles e Kartal, 2016). Apesar da SPE apresentar vantagens com relação aos métodos mais clássicos, tais como praticidade e maior sensibilidade, esta técnica tem algumas limitações. Uma delas refere-se à etapa de eluição do analito retido no cartucho de SPE que necessitam geralmente do uso de solventes tóxicos. Além disso, apresenta altos custos dos cartuchos e dos dispositivos comerciais multivias (manifolds). O método SPE quando utiliza como

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sorvente um polímero impresso recebe a denominação de MISPE (do inglês,

Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction).

1.2.5.

Adsorção

A adsorção é um fenômeno superficial, presente em processos físicos, químicos e biológicos, que surge devido a interações entre átomos, íons ou moléculas de um adsorbato e os presentes na superfície do adsorvente. A adsorção é um processo que ocorre quando um componente em uma fase gasosa ou líquida (adsorbato) se acumula na superfície de um sólido ou líquido (adsorvente), formando uma película molecular ou atômica. O processo envolve uma série de fenômenos que podem alterar a distribuição do soluto entre as fases constituintes e nas interfaces (Weber, McGinley e Katz, 1991). O processo é acompanhado por separação do soluto de uma fase para outra após sua acumulação na superfície do último. Dependendo dos tipos de fases em contato, podemos considerar este processo nos seguintes sistemas: gás-líquido, líquido-líquido, sólido-líquido e sólido-gás.

A adsorção pode ocorrer com dois processos diferentes, nominalmente conhecidos como quimissorção (adsorção química) e fisissorção (adsorção física). Os dois processos são facilmente distinguíveis na maioria dos casos devido às diferenças tanto na escala de energia de interação quanto na escala de tempo de dessorção. A adsorção química envolve fortes interações adsorbato-adsorvente, resultando numa alteração na forma química adsorvente. Por exemplo, as moléculas ou átomos de gás são mantidos na superfície sólida por ligações químicas como uma monocamada. Na quimissorção a ligação resultante é geralmente mais forte que forças de van der Waals e é muito similar em intensidade a uma ligação covalente (Calvi et al., 2016). Além disso, é altamente específica e ocorre apenas se houver alguma possibilidade de ligação química entre o adsorbato e o adsorvente. Na fisissorção, a molécula adsorvida fisicamente mantém sua identidade, pois a energia é insuficiente para romper a ligação, embora possam ocorrer mudanças conformacionais. Como regra geral, é um processo reversível que ocorre a uma temperatura inferior ou próxima da temperatura crítica de uma substância adsorvida. Este tipo de adsorção não é específica, isto é, o adsorvente não tem preferência por nenhuma molécula em particular (Calvi et al., 2016). Termodinamicamente, na adsorção, forças atrativas

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atuam de modo a permitir a adsorção sobre uma dada superfície (adsorvente), de modo a haver sempre liberação de energia. Assim, sempre que a uma dada temperatura a variação da energia de Gibbs relativa ao processo de adsorção for negativa, o processo ocorrerá espontaneamente, embora nada se possa prever sobre a cinética do processo (Ferreira et al., 2014).

1.2.5.1. Cinética de Adsorção

Quando se trata de adsorção, os aspectos termodinâmicos e cinéticos devem ser considerados para se obter mais detalhes sobre seu desempenho e mecanismos. A partir da análise cinética, pode-se estabelecer a taxa de adsorção do soluto e, portanto, alcançar o equilíbrio em um período razoável. Os estudos cinéticos produzem informações sobre o possível mecanismo de adsorção e os diferentes estados de transição no caminho para a formação do equilíbrio adsorbato-adsorvente e ajudam a desenvolver modelos matemáticos adequados para descrever as interações. Para isso, são sugeridos modelos cinéticos como o de pseudo-primeira ordem, pseudo-segunda ordem, difusão, entre outros (Liu e Shen, 2008). Uma vez que os fatores que influenciam a cinética de adsorção são, inequivocamente, conhecidos, é possível calcular a velocidade de adsorção, capacidade de adsorção de um adsorvente, além de descrever o tempo necessário para adsorção.

1.2.5.1.1. Modelo de Pseudo–Primeira Ordem

A equação de Lagergren (1898) (Equação 1) é provavelmente o primeiro exemplo conhecido descrevendo o processo cinético de adsorção em superfícies sólidas em um sistema sólido/líquido (Tseng, Wu e Juang, 2010). Essa equação tem sido uma das mais usadas, especialmente para cinética de pseudo-primeira ordem:

dq

dt

= k

(q

− q

) Equação (1)

onde qe e qt (mg g-1_{) são as capacidades de adsorção em equilíbrio e em um tempo t} (min), respectivamente, k1 (min-1_{) é a constante de velocidade de adsorção de} pseudo-primeira ordem. Integrando a Equação 1 com as condições limite de qt = 0 em t = 0 e qt = qt em t = t, obtém-se a Equação 2:

Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP

ln (

q

q

− q

) = k

t Equação (2)

a qual pode ser rearranjada para Equação 3:

log (q

− q

) = log q

−

k

2,303

t Equação (3)

Os valores de k1 podem ser determinados a partir da inclinação do gráfico linear obtido da regressão de log (qe – qt) vs t. Em alguns casos, o modelo de pseudo-primeira ordem não se ajusta a toda faixa de tempo, sendo considerado adequado somente para os 20 a 30 minutos iniciais de interação. O teste de validade do modelo decorre de uma comparação entre os valores qe determinados experimentalmente e aqueles obtidos a partir do gráfico linear de log (qe – qt) vs t. Caso haja uma discrepância nos valores de qe, então um modelo cinético de ordem maior é necessário para explicar a cinética de adsorção.

1.2.5.1.2. Modelo de Pseudo–Segunda Ordem

Quando a aplicabilidade do modelo de pseudo-primeira ordem torna-se insustentável, a adsorção pode seguir a cinética de pseudo-segunda ordem (Equação 4). Esse modelo também é baseado na capacidade de adsorção e descreve a relação do adsorbato com adsorvente em uma ampla faixa de tempo (Ho e McKay, 1999). A cinética de pseudo-segunda ordem pode ser testada com base na equação:

dq

dt

= k

(q

− q

)

Equação (4)

Onde k2 (g mg-1 _min-1_{) é o coeficiente de velocidade de adsorção. A separação das} variáveis seguida pela integração e aplicação das condições de contorno (qt = 0 em t = 0 e qt = qt em t = t) produz a seguinte expressão linear:

t

q

=

1

k

𝑞

+

1

q

t Equação (5)