INSTITUTO DE QUÍMICA
Izabella Venturini Cagliari
Clonagem, expressão, purificação e caracterização da
proteína SGT1 da cana-de-açúcar, uma co-chaperona do
sistema Hsp90
CAMPINAS 2016
IZABELLA VENTURINI CAGLIARI
Clonagem, expressão, purificação e caracterização da
proteína SGT1 da cana-de-açúcar, uma co-chaperona do
sistema Hsp90
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Orgânica
Orientador (a): Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA IZABELLA VENTURINI CAGLIARI, E ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS HENRIQUE INÁCIO RAMOS.
CAMPINAS 2016
Inicialmente gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos, pela orientação excepcional, e por ter transmitido seu conhecimento, que permitiu meu crescimento profissional ao longo desses dois anos, baseado em muito respeito e confiança. Agradecer também pelo espaço cedido em seu laboratório para a realização desse trabalho, e todo o material fornecido para o desenvolvimento desse projeto.
Agradeço à CAPES pela bolsa concedida e pelo apoio financeiro a este projeto. À Fapesp e ao CNPq pelo financiamento do laboratório, permitindo a realização deste trabalho.
Agradeço às minhas antigas orientadoras, Profa. Dra. Ljubica Tasic e Profa. Dra. Maria do Carmo Gonçalves, por constituírem parte da minha formação cientifica e acadêmica, pela orientação e amizade construída ao longo do tempo.
Agradeço a todos os professores que, por meio das disciplinas de pós-graduação, contribuíram para minha formação, assim como todos os professores envolvidos em meu exame de qualificação de mestrado, que ajudaram na construção final deste trabalho com contribuições valiosas.
Agradeço ao Instituto de Química e à Unicamp, por toda a infraestrutura e apoio. Ao pessoal do secretariado de pós-graduação, Bel, Jana e Isa, por todo o apoio e ajuda fornecida. Aos técnicos e demais funcionários do IQ, em especial à técnica do laboratório de espectroscopia Claudia Marteli, e às técnicas do laboratório do prof. Dr. Carlos Ramos, Aline, Jordana, Verônica, Paulo, Ana Flávia e em especial a Annelize, que com seu conhecimento e amizade fortaleceu esse trabalho.
Agradeço a todos os colegas de laboratório, Natália, Josielle, Dev, Regina, Diego, Debora, Vanessa, Juliana, Gabriela, Luis, Leonardo, Fernando e em especial, ao Conrado e à Glaucia, que com seu conhecimento cientifico e sabedoria de vida ajudaram a desenvolver esse trabalho, e a contribuir diretamente em meu desenvolvimento como pessoa.
Agradeço a toda minha família, em especial meu pai Francisco e minha mãe Mirian, que com sabedoria ímpar e amor incondicional, me ajudaram nas horas mais difíceis desse trabalho; agradeço aos meus irmãos Thiago e Pedro, que com companheirismo e amor acreditaram no meu sonho e nos meus planos, e me
Agradeço ao meu pequeno cachorrinho Toddy, que também esteve comigo em todos os momentos de alegria e tristeza, e que me ajudou a não desistir.
As chaperonas moleculares pertencem à classe de proteínas com funções específicas no organismo, responsáveis por evitar agregação proteica e auxiliar o enovelamento de proteínas não enoveladas, ou seja, promovem, portanto, a homeostase proteica. A Hsp90 é uma chaperona bastante conhecida, dimérica e conservada; possui função com caráter auxiliador de enovelamento de proteínas parcial ou totalmente desenoveladas. Para auxiliar as chaperonas e tornar seu funcionamento completo, muitas delas interagem com co-chaperonas, também com papel fundamental no enovelamento proteico e na prevenção da agregação. A co-chaperona SGT1 apresenta estas funções ao cooperar com a HSP90, sendo expressa em diversos organismos, como bactérias, fungos, vegetais e mamíferos, principalmente em condições de estresse térmico, auxiliando na proteção de proteínas contra agregação. Apresentamos, pela primeira vez, a clonagem, expressão e caracterização da SGT1 de cana-de-açúcar, um vegetal de extrema importância econômica para o Brasil. O gene da SGT1 foi clonado em pET28a e a proteína expressa em Escherichia coli (BL21DE3). A proteína recombinante foi purificada por duas etapas cromatográficas (cromatografia de afinidade e exclusão por tamanho) com rendimento médio de 20 mg por litro de indução. A análise por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência mostraram que a proteína foi purificada enovelada e que sua estrutura secundária foi predominantemente do tipo hélice-α (42 ± 5%). A temperatura na média da transição obtida para o desenovelamento térmico foi de 55°C, dados que concordam com o DSC (Calorimetria diferencial de varredura) e DSF (Fluorescência diferencial de varredura), e a concentração média de ureia na média da transição para o desenovelamento químico foi de 3,3 M. A caracterização hidrodinâmica determinou massa molecular igual a 40 ± 3 kDa, raio de Stokes igual a 37,1 ± 2,2 Å e coeficiente
de difusão igual a 3,6 ± 0,2 x 10-7 cm/s, indicando que a proteína foi purificada
enovelada como um monômero e que provavelmente apresenta conformação alongada.
Molecular chaperones belong to a diverse class of proteins with specific functions in
the organism. They are responsible for promoting the proteostasis by assisting the
folding process of a wide range of proteins and preventing aggregation of misfolded proteins. Hsp90 is one of the most important and well-known family of chaperones, normally dimeric and conserved that assist the folding of partially or totally unfolded proteins. To assist chaperones and improve their functioning, many of them interact with co-chaperones. In this context, the co-chaperone SGT1 is present in many organisms such as bacteria, fungi, plants and mammals and cooperate with Hsp90 to function. SGT1 is particularly expressed in conditions of thermal stress, aiding in protection against unfolding protein. This work aims to clone, express and characterize SGT1 from sugarcane (SsSGT1), a plant of great economic importance to Brazil. First, the SGT1 gene was cloned into pET28a and the protein was expressed in Escherichia coli (BL21DE3). The recombinant protein was purified by two chromatographic steps (affinity and size exclusion chromatography) with an average yield of 20 mg per liter of induction. The circular dichroism and fluorescence spectroscopy analysis showed that the purified protein was folded and the global composition of secondary structure was predominantly α-helix (42 ± 5%). Using
thermal unfolding by CD (Circular Dichroism), we obtained the temperature in the
middle of the transition (Tm) of 55 °C, which agrees with the data from DSC (Differential Scanning Calorimetry) and DSF (Differential Scanning Fluorimetry). Chemical unfolding measured by CD presented the concentration of urea in the middle of the transition (Cm) of 3.3 M. The hydrodynamic characterization determined molecular mass of 40 ± 3 kDa, Stokes radius of 37.1 ± 2.2 Å and diffusion coefficient of 3.6 ± 0.2 x 10-7 cm/s, indicating that the protein behaves as a monomer in solution and probably has elongated conformation.
Figura 1A. Estruturas de ressonância da ligação peptídica.
Figura 1B. Ângulos de torção assumidos pelas ligações do grupo amino e
Cα, e entre grupo carbonila e Cα (ligação Cα – N, ângulo (Φ) e a ligação Cα
– C, ângulo (ψ).
Figura 2. Esquema representando a organização hierárquica das
estruturas formadas pelas proteínas ao longo do processo de enovelamento.
Figura 3. Funil termodinâmico do enovelamento proteico.
Figura 4. Representação esquemática do funcionamento global das
chaperonas moleculares para homeostase celular.
Figura 5. Ciclo conformacional da Hsp90 (aberta e fechada). Figura 6. Esquema representando a estrutura primária da SGT1 e a
posição de seus domínios.
Figura 7. Ciclo de conformação da Hsp90 para proteínas NLRs
(considerando-se as co-chaperonas SGT1 e Rar1).
Figura 8. Sequência da região de clonagem/expressão do vetor pET28a. Figura 9. Esquema do equipamento de Sec-Mals. Figura 10. Sequência de nucleotídeos e de aminoácidos da SsSGT1. Figura 11. Alinhamento entre SsSGT1 e proteínas ortólogas. Figura 12A. SDS-PAGE 12% correspondente ao teste de expressão da
SsSGT1 referente ao extrato total da proteína expressa.
Figura 12B. SDS-PAGE 12% correspondente ao teste de expressão da
SsSGT1 referente as frações solúveis e insolúveis após a lise e
centrifugação das amostras coletadas de hora em hora.
Figura 13A. Cromatograma de afinidade ao níquel da SsSGT1. Figura 13B. Análise do cromatograma de afinidade por SDS-PAGE 12%
correspondente às frações eluidas.
Figura 14A. Cromatograma de exclusão molecular da SsSGT1. Figura 14B. Análise do cromatograma de exclusão molecular por
SDS-PAGE 12% correspondente às frações eluidas.
17 17 18 21 24 26 29 31 35 48 51 53 54 54 56 56 57 57
Figura 16. Teste de estabilidade da SsSGT1 a 4°C em função do tempo. Figura 17. Espectro de emissão de fluorescência da proteína SsSGT1. Figura 18. Caracterização da composição de estrutura secundária da
proteína SsSGT1 monitorada por CD.
Figura 19. Desenovelamento e reenovelamento térmico da SsSGT1,
monitorados por CD a 222 nm.
Figura 20. Desenovelamento e reenovelamento químico da proteína
SsSGT1 acompanhado por CD a 222 nm.
Figura 21. Desenovelamento térmico da proteína sSGT1 acompanhado
por DSC.
Figura 22. Derivativa da fluorescência em função da temperatura (C°). Figura 23A. Cromatografia de gel filtração analítica para determinação do
raio de Stokes da SsSGT1.
Figura 23B. Curva de calibração de (-log kav)1/2 versus Raio de Stokes
Figura 24. Caracterização da massa molecular da proteína SsSGT1 em
solução por SEC-MALS.
59 61 63 64 66 67 69 71 71 72
Tabela 1. Proteínas utilizadas para curva de calibração de GFA e suas
características.
Tabela 2. Identidade percentual entre as proteínas ortólogas de SGT1. Tabela 3. Predição do grau de pureza da SsSGT1. Tabela 4. Parâmetros de fluorescência obtidos para a proteína SGT1 a
5uM em diferentes concentrações de ureia.
Tabela 5. Tm e variação de entalpia obtidas por DSC para SsSGT1. Tabela 6. Tm correspondentes das concentrações analisadas com DSF
para SsSGT1.
Tabela 7. Coeficientes de difusão da SsSGT1 em solução em diferentes
concentrações medidos através de DLS.
Tabela 8. Parâmetros hidrodinâmicos para diferentes técnicas para
SsSGT1. 46 54 60 61 68 69 73 74
Å: Angstrom;
Abs: Absorbância;
ATP: adenosina 5, tri-fosfato; CD: dicroísmo circular;
cDNA: DNA complementar;
Cm: concentração de uréia no ponto médio da transição; D: coeficiente de difusão;
Deg: grau (degree);
DLS: Espalhamento dinâmico de luz (Dynamic Light Scattering); DNA: ácido desoxirribonucléico;
EDTA: Ácido etilenodiamino-tetra-acético; EMR: elipticidade molar residual;
ƒ: coeficiente friccional;
ƒ0: coeficiente friccional teórico esperado para uma partícula esférica rígida de volume igual à molécula em estudo;
ƒ0/ƒ: razão friccional ou fator de Perrin; Fi: intensidade de fluorescência;
GF: gel filtração;
GFA: gel filtração analítica;
HSP: proteína de choque térmico (Heat Shock Protein); HSP70: proteína de choque térmico de 70 kDa;
HSP90: proteína de choque térmico de 90 kDa; IPTG: isopropiltiol-β-D-galactosídeo;
Can: canamicina;
l: comprimento do caminho óptico; LB: meio de cultura Luria-Bertani; Liz: lisozima;
n: número de resíduos de aminoácidos da proteína; PDB: banco de dados de proteínas;
PMSF: fluoreto de fenilmetilsulfonila; pI: ponto isoelétrico;
Rs: raio de Stokes;
SDS: dodecil-sulfato de sódio;
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS; SEC-MALS: gel filtração acoplada a espalhamento de luz em multi-ângulos; sHSP: proteína de choque térmico da família das small;
Tm: temperatura no ponto médio de transição; Ve: volume de eluição;
Vc: volume total da coluna cromatográfica; Vo: volume morto da coluna cromatográfica; λ: comprimento de onda;
λ máx .: comprimento de onda máximo de fluorescência; < λ>: centro de massa espectral de fluoresecência; θ: elipticidade;
[θ]: elipticidade molar residual; ε: coeficiente de absortividade molar.
1. Introdução ...16 1.1. Proteínas ... 16 1.2. Enovelamento proteico ... 18 1.3. Chaperonas moleculares ... 22 1.3.1. Hsp90 ... 25 1.4. Co-chaperonas moleculares ... 27 1.4.1. SGT1 ... 28 2. Objetivos ...33 2.1. Objetivo geral ... 33 2.2. Objetivos específicos ... 33 3. Material e métodos ...34
3. 1. Estratégia para obtenção dos clones ... 34
3. 2. Análise por similaridade de sequência ... 36
3. 3. Linhagens bacterianas ... 36
3. 4. Meios de cultura ... 36
3. 5. Transformação e expressão ... 37
3. 6. Lise bacteriana ... 37
3. 7. Purificação ... 38
3. 7. 1. Cromatografia de afinidade ao níquel ... 38
3. 7.2. Cromatografia por gel filtração ... 39
3. 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ... 39
3. 9. Determinação da concentração de proteínas ... 40
3. 10. Medidas de emissão de fluorescência intrínseca ... 41
3. 11. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD) ... 42
3. 12. Calorimetria diferencial de varredura (DSC)... 44
3. 13. Fluorescência diferencial de varredura (DSF) ... 44
3. 14. Caracterização dos parâmetros biofísicos ... 45
3. 14.1. Cromatografia de gel filtração analítica ... 45
3. 14.2. Cromatografia por exclusão molecular (SEC) acoplada a detector multi-ângulo de espalhamento de luz (MALS) ... 46
3. 14.3. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ... 48
3. 15. Análise dos parâmetros hidrodinâmicos ... 49
4. 3. Purificação ... 55
4.4. Fluorescência intrínseca do triptofano ... 60
4.5. Caracterização por dicroísmo circular ... 62
4.5.1. Caracterização da estrutura secundária por dicroísmo circular ... 62
4.5.2. Caracterização da estabilidade térmica por dicroísmo circular ... 64
4.5.3. Caracterização da estabilidade química por dicroísmo circular ... 65
4.6. Caracterização por calorimetria diferencial de varredura (DSC) ... 67
4.7. Caracterização por fluorescência diferencial de varredura (DSF) ... 68
4.8. Caracterização estrutural ... 70
4.8.1. Gel filtração analítica ... 70
4.8.2. Cromatografia de exclusão molecular acoplada a um detector multi-ângulo de espalhamento de luz (SECMALS) ... 72
4.8.3. Espalhamento de luz dinâmico (DLS) ... 73
4.9. Análise dos parâmetros hidrodinâmicos ... 73
5. Discussão ...75
5.1. Clonagem, expressão e purificação ... 75
5.2. Análise de estrutura secundária e terciária ... 75
5.3. Análise da estabilidade térmica e química ... 76
5.4. Análise dos parâmetros hidrodinâmicos ... 78
6. Conclusão ...80
7. Referências ...81
8. Anexos ...88
1. Introdução
1.1. Proteínas
As proteínas são macromoléculas muito importantes, pois desempenham funções vitais em todos os organismos. Elas possuem propriedades físico-químicas bem definidas e dentre as inúmeras funções em diversos processos biológicos encontram-se, entre outras, as funções estruturais, regulatória, carregadora, enzimática, hormonal, imunológica e nutritiva. Na célula, é importante haver constante manutenção da homeostase e, para isso, cada proteína desempenha uma função específica que irá depender da estrutura tridimensional que ela assume; a compreensão dessa estrutura é essencial, uma vez que auxilia na elucidação da função correspondente da proteína (Voet e Voet, 2013).
Estruturalmente, proteínas são compostas por resíduos de aminoácidos, ligados entre si por meio de ligações peptídicas. Cada ligação peptídica consiste, basicamente, de uma ligação entre o grupo amino de um aminoácido e o carboxílico do outro, sendo que a estrutura resultante possui caráter de ressonância (Figura 1A). Devido a esse caráter, a estrutura do grupo peptídico possui uma estrutura planar
rígida, com sobreposição máxima dos orbitais π, sendo que cada Cα assume a
posição trans, para minimizar a interferência estérica entre os grupos, estabilizando a estrutura (Figura 1B). É importante ressaltar que, ao contrário dos átomos que constituem a ligação peptídica em si, outros átomos podem formar ângulos de torção que possibilitam a formação de estruturas secundárias; estes ângulos de torção são também conhecidos por ângulos de rotação ou ângulos diedros; eles consistem nos
ângulos formados nas ligações simples entre o grupo amino e Cα, e entre grupo
carbonila e Cα (ligação Cα – N, ângulo (Φ) e a ligação Cα – C, ângulo (ψ)), para cada
um dos resíduos de aminoácidos ligados (Figura 1B) (Voet e Voet, 2013).
Existem no total 20 tipos de aminoácidos que podem compor as proteínas. A sequência primária da proteína, isto é, a sequência de resíduos dos aminoácidos que a constitui é responsável por determinar sua estrutura tridimensional, e isso é possível devido às interações entre as cadeias laterais destes resíduos (Lehninger e col., 2004). Dessa forma, as proteínas podem ser classificadas de acordo com a organização dos aminoácidos na cadeia polipeptídica, assumindo diferentes estruturas (Figura 2).
Figura 1. (A) Estruturas de ressonância assumidas pela ligação peptídica.
Nesta representação, os elétrons ressonantes estão presentes entre os átomos de oxigênio, carbono e nitrogênio, constituindo uma estrutura planar neste eixo de ligação, como pode ser observado claramente no item B. (B) Ângulos de torção
assumidos pelas ligações do grupo amino e Cα, e entre grupo carbonila e Cα
(ligação Cα – N, ângulo (Φ) e a ligação Cα – C, ângulo (ψ)). Observa-se a
conformação trans formando a ligação peptídica; grupos peptídicos, sob algumas exceções, formam a conformação trans naturalmente, nos quais o Cα de um resíduo está em lado oposto do seguinte, devido ao impedimento estérico. (Modificado de Voet e Voet, 2013).
A estrutura primária de uma proteína consiste na sequência de aminoácidos formada por meio da ligação entre eles, formando uma cadeia polipeptídica. A estrutura secundária consiste em uma organização espacial da cadeia polipeptídica, sem levar em conta as cadeias laterais dos aminoácidos pertencentes à sequência, formando interações locais por meio de seus ângulos de torção; nesta forma, há estruturas classificadas em hélice-α, folha-β e estruturas randômicas. As estruturas tipo hélice-α possuem torção ao redor do eixo, sendo estabelecidas por meio de ligações de hidrogênio formadas entre os grupos NH e CO de um resíduo, com
resíduos subsequentes. As estruturas tipo folha-β também são constituídas por ligações de hidrogênio entre iguais grupamentos, porém com distâncias e organização atômica distintas. Na estrutura terciária, as interações das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos que compõem a proteína são muito importantes, e as interações locais e não-locais podem acontecer para contribuir para a forma nativa (funcional) da proteína. Quando presente, a estrutura quaternária é composta da união de subunidades, isto é, a formação de proteínas com mais de uma cadeia polipeptídica (Stryer, 2004).
Figura 2. Esquema representando a organização hierárquica das estruturas formadas pelas proteínas ao longo do processo de enovelamento (Modificado
de Voet e col., 2011).
1.2. Enovelamento proteico
O enovelamento proteico é um processo de extrema importância, pois é por meio dele que as proteínas atingem seu estado nativo, composto das estruturas primária, secundária, terciária e, em alguns casos, quaternária; as proteínas geralmente irão desempenhar suas funções de forma correta se seu estado enovelado for atingido. A própria sequência de aminoácidos da proteína, ou seja, a sua estrutura primária, fornece a informação necessária para que o processo de enovelamento e estado nativo sejam desenvolvidos (Anfisen, 1973). O processo de enovelamento proteico se dá especialmente devido a um fenômeno denominado colapso hidrofóbico, em que se verifica que no estado nativo das proteínas globulares há a presença de um núcleo hidrofóbico constituído por cadeias laterais
dos aminoácidos caracteristicamente apolares, e as porções polares das cadeias laterais de resíduos polares está exposta ao solvente, localizado na superfície da proteína. Nele, ocorre o sequestro das cadeias hidrofóbicas do ambiente aquoso que envolve a proteína, gerando estabilização dos possíveis intermediários da via de enovelamento que possam vir a surgir ao longo do processo. O colapso hidrofóbico promove uma estabilização da estrutura nativa da proteína, compensando a entropia desfavorável provocada pela formação dessa estrutura. Há revisões sobre enovelamento proteico, como Ramos e Ferreira (2005), Privalov (1996), Baldwin (1989), Hartl e col. (2011).
O processo de enovelamento foi descrito por meio de modelos termodinâmicos através da forma de funil, elucidando as formas pelas quais as proteínas atingem as estruturas nativas, que são as estruturas de menor energia livre (Anfinsen, 1973; Hartl e col., 2011) (Figura 3). Cada caminho a ser percorrido pelas diversas proteínas que existem na natureza é bem definido, e específico para cada biomolécula. O processo é rápido e diversificado, com formação de alguns intermediários até atingir seu estado mínimo de energia (Anfinsen, 1973). O formato do funil é indicador de que a proteína passa por diferentes tipos de estados intermediários, que podem consistir em enovelados, parcialmente enovelados, mal enovelados (o que pode levar à agregação), oligômeros e fibrilas amiloides. Dependendo da concentração de proteínas presentes no meio, pode haver agregação devido ao fato de que algumas conformações proteicas podem estar suscetíveis à exposição de resíduos hidrofóbicos ao solvente. Os intermediários determinam o processo de enovelamento de proteínas que têm forte tendência em sofrer colapso hidrofóbico, formando estruturas globulares compactas (Hartl e col., 2011).
É importante ressaltar que o enovelamento é um fenômeno que considera várias forças de interação, além da energia livre (potencial termodinâmico que mede o trabalho realizado em um meio isotérmico e isobárico), ligações de dissulfeto e alterações pós-traducionais, como por exemplo, glicosilações, adenilações, entre outras (Ruddon e col., 1997).
Muitas vezes, falhas no processo de enovelamento podem levar ao desenvolvimento de doenças degenerativas, como Alzheimer (Agorogiannis e col., 2004), câncer (Thor e col., 1991; Tetu e col., 1992) e outras (Belssinger e Buchner,
1998; Chai e col., 1999; Ruddon e col., 1996). Essas proteínas podem assumir estado de baixa energia, porém com conformações que não favorecem o funcionamento correto da proteína, o que pode dificultar a conversão para estados mais funcionais, devido à alta barreira energética (Hartl e col., 2011). A presença de outras biomoléculas no meio pode dificultar o enovelamento das proteínas, mesmo que o desenvolvimento desse estado esteja diretamente ligado com a informação fornecida pela sequência de aminoácidos da proteína. Nesse contexto, existem também importantes moléculas ligadas à organização e homeostase celular, como por exemplo, algumas proteínas isomerases e as chaperonas moleculares (Frydman e Hartl, 1996; Hartl, 1996).
Figura 3. Funil termodinâmico de enovelamento proteico. A porção superior do
funil representa o estado desenovelado das proteínas, onde a energia livre do sistema é maior. Durante o processo de enovelamento, a energia livre vai diminuindo e muitas conformações vão se definindo; estruturas de proteína nativa, agregados, fibrilas amilóides e oligômeros insolúveis podem ser observados, sendo que os três últimos estão fortemente correlacionados com doenças e mau funcionamento celular. (Modificado de Hartl e col., 2011).
1.3. Chaperonas moleculares
As chaperonas moleculares compreendem famílias de proteínas que possuem a propriedade de auxiliar na organização espacial da estrutura das proteínas desenoveladas, levando à formação do seu estado nativo; possuem também a capacidade de evitar a formação de agregados, dando o correto destino às proteínas não-funcionais e inibindo interações não-produtivas. O sistema chaperona, em conjunto com o sistema proteossoma, realiza a correta manutenção da homeostase proteica das células (Hendrick e Hartl, 1993; Ramos, 2008; Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011). Dessa forma, todo o equilíbrio celular garante o equilíbrio entre proteínas corretamente enoveladas e as não enoveladas, o que corrobora para a boa qualidade das funções no organismo e também evita o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011; Ramos, 2011).
A assistência desempenhada pelas chaperonas às demais proteínas não interfere na estrutura terciária final das mesmas, respeitando o conceito já formulado por Anfinsen (Anfinsen, 1973), que afirma que a sequência primária determina a estrutura nativa da proteína. A literatura define chaperona como uma proteína apta a estabilizar uma conformação de outra proteína, dando a ela a possibilidade de cumprir seu papel corretamente, seja no enovelamento, seja na formação oligomérica ou na variação de conformações ativas e inativas (Hendrick e Hartl ,1995).
Inicialmente, as chaperonas foram reconhecidas como proteínas produzidas somente em condições de estresse térmico no organismo, uma vez que sua expressão é aumentada quando há exposição excessiva ao calor. Para prevenir a desnaturação das proteínas nas células devido ao aquecimento e permitir o saudável funcionamento do sistema biológico, essas proteínas de choque-térmico ou ―heat-shock proteins‖ (Hsp) são produzidas e atuam no meio, promovendo reenovelamento e organizando os destinos das proteínas na célula. O excesso de calor é bastante prejudicial à célula, uma vez que inibe ou retarda importantes processos metabólicos como, por exemplo, replicação do DNA, transcrição, processamento do RNAm e síntese proteica; sendo assim, a síntese de chaperonas durante o processo de estresse térmico é de fundamental importância para manutenção do equilíbrio celular (Mosser e Morimoto, 2004). Deve-se ressaltar,
contudo, que nem todas as chaperonas são Hsps e nem todas as Hsps são chaperonas. As chaperonas desempenham funções como transporte de proteínas para as organelas da célula, auxiliam no enovelamento de proteínas desenoveladas e parcialmente desenoveladas, auxiliam no direcionamento dos substratos para proteólise e desagregam agregados proteicos (Hartl e col., 2011). Há também um papel relacionado ao controle hormonal e fatores de transcrição para montagem de complexos proteicos a partir das suas subunidades (Hendrick e col., 1993; Ruddon e col., 1997).
As chaperonas são organizadas em famílias de acordo com a forma de interação com a proteína cliente e a massa molecular do seu monômero, sendo encontradas em cinco grandes famílias: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 e sHsp (s, do inglês small) (Fink, 1999; Borges e Ramos, 2005). Assumem as funções de ―holder‖, foldase e desagregase (Figura 4). As chaperonas do tipo ―holder‖ são proteínas capazes de se ligar em proteínas desenoveladas ou parcialmente enoveladas, sem reenovelá-las ao seu estado nativo; elas mantêm a proteína segura e pronta para participar de qualquer processo químico dentro da célula, sendo independentes de ATP. Há também as foldases, proteínas dependentes de ATP, que se utilizam da hidrólise do mesmo para reenovelar as proteínas entregues a elas pelos holders (Lee e col., 1997). As desagregases são chaperonas também dependentes de ATP, que desfazem o agregado proteico e transferem a proteína parcialmente enovelada a uma holder ou foldase (Glover e Lindquist, 1998). A chaperona Hsp100 tem função de holder e desagregase, Hsp90, Hsp70 e Hsp60 são foldases, as sHsp são holders (Cagliari e col., 2011; Tiroli-Cepeda e col., 2014; Fink, 1999; Borges e Ramos, 2005; Tiroli-Cepeda e Ramos, 2010). A Figura 4 elucida o ciclo conformacional das chaperonas moleculares.
Figura 4. Representação esquemática do funcionamento global das chaperonas moleculares para homeostase celular. Representam-se as
chaperonas por meio de suas funções, que abrangem o direcionamento dos substratos para proteólise, auxílio no enovelamento proteico e direcionamento dos agregados. (Modificado de Hartl e col., 2011)
1.3.1. Hsp90
Dentro da família das chaperonas moleculares, encontramos a Hsp90, uma chaperona homodimérica de 90 kDa. Trata-se de uma chaperona molecular bastante conhecida, sendo conservada e essencial para os organismos. A Hsp90 atua em muitas funções do organismo, interagindo com aproximadamente 10% do proteoma celular (Silva e Ramos, 2012). Entre suas principais funções, a Hsp90 é responsável pela maturação de uma série de proteínas clientes (Li e Buchner, 2013), tendo caráter protetor contra agregação inespecífica das proteínas que estejam parcial ou totalmente desenoveladas (Wiech e col., 1992). Outra função da Hsp90 é regular a indução de alterações conformacionais em proteínas enoveladas ou nativas, que leva à ativação ou estabilização das mesmas (Jakob e col., 1995).
Estruturalmente, a Hsp90 é formada de três domínios flexíveis, um domínio
N-terminal, um domínio intermediário (―M-domain‖) e um domínio C-terminal, onde
encontra-se o motivo MEEVD (terminação que contém 5 resíduos de aminoácidos: metionina, 2 ácidos glutâmicos, valina e ácido aspártico). A função da Hsp90 está diretamente ligada à sua estrutura; a abertura ou fechamento de seus N-terminais promove a interação ou não com substratos, e assim, efetuando sua função.
Estudos estruturais da Hsp90 indicam que essa chaperona adota distintas conformações, em um equilíbrio dinâmico (Shiau e col., 2006; Meyer e col., 2004). A ligação do ATP acarreta uma série de mudanças conformacionais à proteína, incluindo movimentação e rearranjo da região em que se situa a tampa do N-terminal da Hsp90, levando à formação de uma forma mais compacta, que consiste na forma ―fechada‖, e por onde os N-terminais formaram um dímero. Após a ligação com o ATP, a Hsp90 adquire conformações intermediárias que consistem no fechamento do sítio catalítico da chaperona, para a execução da hidrólise desta molécula. Após a realização da hidrólise, os N-terminais se dissociam e a HSP90 assume novamente sua conformação aberta, liberando para o meio o produto da hidrólise do ATP, que consiste em ADP (adenosina trifosfato) e Pi (fosfato inorgânico) (Hessling e col., 2009). A Figura 5 ilustra esse ciclo conformacional realizado pela Hsp90 em função da presença de ATP.
Figura 5. Ciclo conformacional da Hsp90 (fechada e aberta). Após a ligação do
ATP, a Hsp90 atinge seu primeiro intermediário (1), em que a tampa do ATP está fechada, porém o terminal-N está aberto. A dimerização do terminal-N faz com que o intermediário 2 seja formado, em que o terminal-M interage como terminal-N. A Hsp90 atinge então um estado fechado, formando um sítio de ligação do ATP dentro de uma região específica, em que a hidrólise do ATP ocorre. Após a hidrólise do ATP, o domínio-N se dissocia, liberando ADP e Pi, e a Hsp90 retorna à sua conformação aberta, pronta para iniciar um novo ciclo. (Modificado de Li e Buchner, 2013).
Além dos nucleotídeos ATP e ADP, proteínas auxiliares conhecidas como co-chaperonas também podem alterar a conformação da Hsp90, auxiliando-a no processo de hidrólise do ATP; dentre as conhecidas até o momento, 20 co-chaperonas foram identificadas. Essas co-co-chaperonas possuem diversas funções como de inibir ou melhorar o funcionamento da hidrólise de ATP na Hsp90 (Taipale e col., 2010).
O domínio de interação entre essas co-chaperonas e a Hsp90 pode variar. O motivo MEEVD conservado na Hsp90 em seu C-terminal possui capacidade de interagir com o domínio TPR (do inglês, tetracopeptide repeat) (Scheufler e col., 2000) presente nas co-chaperonas. Por exemplo, a co-chaperona HOP/STI1 se liga ao C-terminal da Hsp90 e inibe seu o ciclo da ATPase (Prodromou e col., 1999). No entanto, há co-chaperonas como AHA1, CPR6 e P50/CDC37 que se ligam ao domínio M da Hsp90, regulando a atividade da função ATPásica ou regulando a ligação dos substratos (Prodromou e col., 1999; Siligardi e col., 2002). A SGT1 (do inglês, supressor of G2 allele of skp1) pode desempenhar igual função, sendo responsável pela maturação de proteínas sensores ligadas à imunidade dos organismos, conhecidas por proteínas NLR, que reconhecem agentes patógenos (Takahashi e col., 2003).
1.4. Co-chaperonas moleculares
As interações entre as chaperonas moleculares como Hsp90 e suas proteínas clientes, comumente envolvem outras proteínas, as co-chaperonas. Dentre as funções que são atribuídas a elas está a regulação da atividade ATPásica da mesma, troca de nucleotídeos no sítio catalítico (Prodromou e Pearl, 2003), recrutamento de chaperonas e co-chaperonas adicionais (Chen e Smith, 1998), direcionamento da proteína cliente para degradação (Hohfeld e col., 2001), tendo em vista o importante auxílio que as co-chaperonas prestam para o trânsito celular de proteínas e organelas citoplasmáticas (Pratt e col., 1999). Nesse contexto, o sistema da Hsp90 pode ser formado por um grande complexo formado por ela, proteína cliente e várias outras chaperonas (como a Hsp70) e co-chaperonas, sendo umas das mais conhecidas a P23, AHA1, HOP/STI1, FKBP, P60 e SGT1 (Prodromou, 1999; Smith e col. 1998). A co-chaperona SGT1 é notadamente uma proteína com
características de co-chaperona e que também interage com a Hsp90, sendo essencial em vários processos.
1.4.1. SGT1
A co-chaperona SGT1 foi inicialmente identificada em leveduras e posteriormente em outros organismos como plantas e mamíferos (Hieter e col., 1999; Filipek e Spiechowicz, 2005). A interação entre SGT1 e Hsp90 foi reconhecida pouco tempo depois, representando a associação entre chaperona e co-chaperona (Shirasu e col., 2003). A associação entre SGT1 e Hsp90 humana foi também elucidada por Lee e col. (2004), por meio da demonstração da ligação entre as duas espécies moleculares in vitro, comprovando o importante papel do domínio CS da SGT1 no mecanismo de ligação. Além disso, há indícios de interação entre a SGT1 com outra chaperona, a Hsp70. Sabe-se também de que a SGT1 possui um domínio não TPR pelo qual ela se liga às chaperonas tanto Hsp90 quanto Hsp70 (Spiechowicz e col., 2007), o que foge do padrão observado para as co-chaperonas TPR.
A SGT1 é constituída de três domínios (Figura 6): domínio TPR (tetratricopeptídeo), CS (CHORD e domínio contido em SGT1) e SGS (específico e conservado de SGT1); há também duas regiões menos conservadas (Vr1 e Vr2). Diferentemente do que é observado para outras co-chaperonas, nas quais o domínio TPR está normalmente interagindo com o domínio MEEVD da Hsp90, verificou-se por meio de estudos de RMN que a SGT1 interage com a chaperona (N terminal) por meio de seu domínio CS, e que também interage com a co-chaperona Rar1 (do inglês, required for Mla12 resistance 1). O domínio TPR em SGT1 possui a função de dimerização, além de interações com moléculas como SRFR1 (Supressor da rps4-RLD1) e Skp1p (Supressor da proteína quinetocore). Para o domínio SGS, tem-se a interação com a Hsp70, obtem-servado por meio de experimentos de co-imunoprecipitação, cromatografia de afinidade e ELISA (do inglês, Enzyme – linked immunosorbent assay) (Spiechowicz e col., 2007); NB-LRR (do inglês, Nucleotide-binding leucine reach repeat) e Cdc35p, também são proteínas do complexo da Hsp90 que interagem com a SGT1 por meio de seu domínio SGS. As funções dos domínios VR1 e VR2 ainda permanecem desconhecidas (Taube e col., 2014).
O complexo formado por SGT1, Hsp90 e Rar1 é constituído através da ligação específica que ocorre entre os resíduos presentes no domínio CS proveniente da SGT1 e no domínio-N presente na Hsp90 (Zhang e col., 2008), sendo que a conexão entre eles também possui a participação do domínio CHORD II (do inglês, cysteine and histidine-rich domain) (Zhang e col., 2010) presente em Rar1. A interação da SGT1 com a Hsp90 ocorre de maneira a não interferir na atividade regulatória da ATPase no sítio ativo da Hsp90 (Lee e col., 2004), sendo que o conjunto Hsp90-SGT1-Rar1 está intimamente relacionado com atividades de defesa contra estresse térmico e doenças do organismo (Takahashi e col., 2003).
Figura 6. Esquema representando a estrutura primária da SGT1 e a posição de seus domínios (Adaptado de Taube e col., 2014).
O domínio mais conservado e também mais estudado da SGT1 é o domínio CS, pelo qual a SGT1 interage com a Hsp90 (Chazin e col., 2004). Este domínio apresenta homologia estrutural com o de outra co-chaperona da Hsp90, a p23, sendo que ambas apresentam também funções parecidas. Isso evidencia características de co-chaperona na SGT1 e não somente uma proteína cliente do complexo Hsp90 (Spiechowicz e col., 2007; Lee e col., 2004). Takahashi e colaboradores (2003) demostraram em seu trabalho que a Hsp90 pode desempenhar funções de proteção contra doenças em plantas através da interação das co-chaperonas SGT1 e Rar1, na qual proteínas clientes ligadas à defesa podem se ligar no complexo. Sabe-se também que a interação do domínio CHORD II da Rar1 e o domínio N da Hsp90 se dá por lados opostos do domínio CS da SGT1, e que análises funcionais deste domínio indicam que a interação da Rar1 e Hsp90 com a SGT1 é essencial para a ligação de proteínas de defesa em plantas, como por exemplo na batata (Solanum tuberosum). Kitagawa e colaboradores (1999)
elucidaram outra função da SGT1, ligada à participação desta proteína na formação e estabilização das proteínas que compõem as fibras do fuso mitótico, no momento de divisão celular, em leveduras; há associação também, segundo o grupo, da SGT1 com o complexo formado pela ubiquitina ligase. Martins e colaboradores (2009) observaram semelhante função para SGT1 proveniente de Drosophila melanogaster. O domínio CS, muito similar estruturalmente a outra co-chaperona da Hsp90, a p23/Sb1 (Catlett e Kaplan, 2006), interage com o domínio N-terminal da Hsp90 e regula sua conformação indiretamente. Outra co-chaperona, a Rar1 interage com a Hsp90 por meio de seu domínio CHORD I, que se liga ao N-terminal da Hsp90 e promove a conformação aberta desta chaperona, evitando que ela se feche. Isso faz com eu outra extremidade da Rar1 fique livre, o domínio CHORD II, que se liga ao domínio CS da SGT1. Ao final, há a formação do complexo ternário Hsp90-Rar1-SGT1, que funcionará como um importante sistema para maturação de proteínas de defesa NLRs. Esse complexo corrobora para que a ―tampa‖ da Hsp90 fique flexível, e permita expor o sítio catalítico contendo o resíduo de Arginina do domínio M para o ATP, permitindo a hidrólise (Kadota e Shirasu, 2012). A Figura 7 mostra esquematicamente o ciclo reativo da Hsp90 com as co-chaperonas SGT1 e Rar1.
Figura 7. Ciclo conformacional da Hsp90 para proteínas NLRs (considerando-se as co-chaperonas SGT1 e Rar1). Inicialmente, a Hsp90 em conformação aberta,
recebe em seu terminal-N o domínio CHORD I da co-chaperona Rar1. A outra extremidade da Rar1 fica livre, e o domínio CHORD II se liga ao domínio CS da SGT1, co-chaperona que carrega em seu outro domínio, o SGS, as proteínas NLR de defesa. Ao final, há a formação do complexo ternário Hsp90-Rar1-SGT1, que funcionará como um importante sistema para maturação de proteínas de defesa NLRs. (Modificado de Li e Buchner, 2013).
Neste trabalho foi estudado o ortólogo da SGT1 da cana-de-açúcar, organismo muito importante no Brasil, o qual é uma das principais agriculturas praticadas no país e de extenso emprego em diversos setores econômicos e agrícolas, além de ser fonte de alimento. Ao explorar esta área da bioquímica da biologia celular é possível gerar conhecimento sobre controle de qualidade protéico celular e, portanto, contribuir em áreas como engenharia de proteínas e biotecnologia aplicada à agricultura da cana por exemplo. O conhecimento sobre a SGT1 de cana pode ajudar a compreender melhor sua função e, assim, os mecanismos de defesa das plantas sob altas temperaturas ou exposição a organismos nocivos.
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Caracterizar a proteína SGT1 de cana-de-açúcar quanto à sua estrutura, ampliando os conhecimentos dessa co-chaperona de planta, por meio de estudos biofísicos e bioquímicos.
2.2. Objetivos específicos
Dentre os objetivos específicos, destaca-se:
1. Estudar estratégia de clonagem dos genes em vetores de expressão. 2. Expressar e purificar a proteína SGT1.
3. Caracterizar a conformação da proteína por meio de técnicas como dicroísmo circular (CD), emissão de fluorescência intrínseca, cromatografia por gel filtração (GF), GF acoplada a espalhamento de luz (SEC-MALS) e espalhamento de luz dinâmico (DLS)
4. Compreender o efeito da temperatura e de agente desnaturante na conformação da proteína.
3. Material e métodos
3. 1. Estratégia para obtenção dos clones
Primeiramente, obteve-se a sequência de nucleotídeos da SGT1 de cana-de-açúcar (Saccharum ssp.) (SsSGT1) por analogia com a sequência de mRNA da SGT1 de Arabidopsis thaliana (GI: 334186855). Utilizando o algoritmo BLASTx no banco de dados NCBI foi possível obter a sequência ortóloga em cana-de-açúcar (GI:261286858) (Altschul e col., 1990).
Para confirmar a identidade da proteína SsSGT1, foi necessário realizar um alinhamento da sequência de aminoácidos da mesma com um banco de dados
(NCBI – National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov) e,
assim, obter a comparação das sequências. Através do programa OPTIMIZER (Puigbò e col., 2007), os códons na sequência que codifica a SsSGT1 que são raros para tradução em E. coli , foram substituídos por códons não-raros. O programa Rare Codon Analysis Tool (GenScript) foi utilizado para verificar a substituição de códons e a quantidade de bases CG.
Com esta nova sequência de nucleotídeos, utilizou-se o programa NEBcutter v2.0 (Vincze et al., 2003) para obter o mapa de enzimas de restrição que putativamente clivassem a sequência. Por meio dos resultados obtidos, verificou-se que não havia sítios de restrição das enzimas NdeI e XhoI, sendo estas então selecionadas estrategicamente na clonagem da SsSGT1 no vetor pET28a. Dessa forma, a clonagem foi realizada pela empresa Epoch Life Science utilizando esta estratégia de clonagem.
O plasmídeo pET28a foi escolhido, entre outros motivos, porque possui uma sequência posicionada antes do sítio de clonagem que codifica 20 resíduos de aminoácidos (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH). Essa sequência, denominada cauda de poli-histidina, é transcrita juntamente com a sequência da proteína de interesse e assim é traduzida fusionada a ela. Os 6 resíduos de histidinas que a cauda contém possibilitam o emprego de cromatografia de afinidade em níquel como um dos passos de purificação da proteína recombinante.
Figura 8. Sequência da região de clonagem/expressão do vetor pET28a. Ênfase
é dada à posição das enzimas de restrição, sequência que codifica a cauda de polihistidina, promotor T7, operador lac e a região de anelamento dos oligonucleotideos para sequenciamento. As regiões em vermelho mostram os sítios das enzimas de restrição usadas para a estratégia de clonagem da proteína SsSGT1 (modificado do manual do plasmídeo da empresa Novagen).
Além disso, a escolha do plasmídeo pET28a (Figura 8) foi feita baseada no funcionamento do sistema pET. Vetores desse sistema possuem sua expressão regulada pelo promotor T7, que controla a transcrição da enzima T7 RNA polimerase; a transcrição do gene de interesse somente ocorrerá quando esta enzima estiver presente (Studier e col., 1990). Tanto o gene que codifica para T7 RNA polimerase como para o gene de interesse encontram-se inibidos pelo repressor lac. Com a adição do indutor IPTG (isopropil β-D-tiogalactosídeo) análogo à lactose, o repressor se desliga do operador, tornando a transcrição da T7 RNA polimerase possível e, consequentemente, torna viável a transcrição do gene alvo (Studier e col., 1990).
O sequenciamento confirmatório da sequência clonada foi realizado com oligonucleotídeos propostos pelo manual do vetor pET28a nos sentidos ‗forward‘ e ‗reverse‘ (T7 promoter primer e T7 terminator primer, respectivamente) como mostrado na Figura 8.
3. 2. Análise por similaridade de sequência
A fim de fazer uma análise de similaridade de sequência, o software ClustalW 2.1 foi utilizado para realizar alinhamentos com as sequencias de aminoácidos das proteínas SGT1 dos organismos Homo sapiens, Ordeum vulgare, Triticum ssp, Oriza sativa, Arabidospsis thaliana, Zea mays e Sorghum bicolor. (Larkin e col., 2007).
3. 3. Linhagens bacterianas
A expressão da proteína recombinante se deu por meio da utilização da cepa BL21 (DE3) (Stratagene), uma vez que ela possui baixos níveis de produção de proteases, minimizando a degradação recorrente na proteína SsSGT1. O gene DE3 existente é ainda responsável pela síntese de T7 RNA polimerase (Studier e Moffatt, 1986).
3. 4. Meios de cultura
O cultivo das cepas bacterianas em suspensão foi feito em meios de cultura LB (Luria-Bertani), que contém: 10 g/L de triptona; 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L de NaCl, preparados em água desmineralizada, com pH 7,0, autoclavados (121ºC, 20 min). O cultivo em meio sólido se deu com suplementação de Agar (1,5%), autoclavado (121°C, 20 min), sendo que cada placa possuía 15 mL de meio líquido distribuído em câmaras com fluxo laminar. Foi necessário o acréscimo de antibióticos específicos para a seleção das bactérias contendo o vetor específico de interesse; a cepa BL21(DE3) não possui naturalmente resistência ao antibiótico, no entanto, o vetor pET28a confere a característica de resistência necessária ao antibiótico canamicina. O antibiótico foi adicionado em uma concentração de 30 µg/mL.
3. 5. Transformação e expressão
Foram obtidas células de bactérias competentes, ou seja, propícias à recepção de um material genético por choque térmico (Sambrook e Russell, 2001). Dessa forma, as células competentes de E. coli da linhagem BL21(DE3) foram transformadas com plasmídeos pET28a-SsSGT1.
Para tal, 1 μL do plasmídeo de interesse adicionado nas células competentes foi incubado por 30 min no gelo. Posteriormente, realizou-se um choque térmico por 1,5 min a 42°C. Após esta etapa, adicionaram-se 800 μL de meio SOC (20 g/L de peptona; 5 g/L de extrato de levedura; 0,5 g/L de NaCl; 2,5 mM de KCl; 0,01 mM de
MgCl2; 0,02 mM de glicose) na solução, a qual foi incubada a 37°C por 1 hora
(método baseado em protocolo do fabricante Micro PulserTM Electroporation
Apparatus - Bio-Rad). Após este tempo, as células foram cultivadas a 37°C por 15-16h em placas de Petri contendo o meio LB sólido acrescido de 30 mg/mL do antibiótico canamicina (can).
O pré-inóculo para indução de expressão proteica nas bactérias foi realizado pela solubilização de uma colônia da placa em meio LB líquido com antibiótico. As bactérias foram cultivadas a 37°C por 16 horas, sob agitação constante (200 rpm). Posteriormente, 25 mL do pré-inóculo foram adicionados a 500 mL de meio de cultura e antibiótico. Este foi cultivado até o momento em que a absorbância atingiu um valor entre 0,6 e 0,8, o que indica um grande número de células. Nesse momento foi feita a adição do IPTG, que induz a produção da SsSGT1. A indução de proteína se deu a 25°C, temperatura ótima estabelecida após ensaios de indução proteica em temperaturas e tempos diferentes. Após o período de indução estabelecido, as células bacterianas foram centrifugadas por 15 minutos, 4000 rpm e 4°C. Os precipitados obtidos foram armazenados à -20°C.
3. 6. Lise bacteriana
O precipitado da cultura contendo as células bacterianas que expressaram a proteína de interesse foi ressuspendido em tampão de lise (20 mM fosfato, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), sendo adicionando a este tampão PMSF (Fluoreto de Fenilmetilsulfonil, inibidor de proteases) (750 µM), lisozima (18 ng/mL) e 2,5 µL de
RQ1 RNase-freeDNase (Promega 1u/µL). Posteriormente, a amostra foi sonicada 10 vezes com auxílio do sonicador (MisonixUltrasonicLiquid Processor) com intervalos de 1:30 min (output 30 Watts). A suspensão resultante foi então centrifugada a 13000 rpm por 1 h a 4°C. As frações correspondentes ao material solúvel e precipitado foram analisadas por gel de poliacrilamida .
3. 7. Purificação
3. 7. 1. Cromatografia de afinidade ao níquel
A cromatografia de afinidade a metais se baseia na interação entre a resina de uma coluna contendo metais coordenados e uma porção específica da proteína contendo um conjunto de aminoácidos capazes de se ligarem ao metal. No caso, as proteínas possuem afinidade diferencial por moléculas específicas (ou íons) imobilizadas em uma matriz sólida da coluna cromatográfica. A técnica de cromatografia de afinidade é muito utilizada pelo fato das proteínas possuírem certos resíduos de aminoácidos específicos, como imidazol da histidina, tiol da cisteína e indol do triptofano, que são doadores de elétrons para o íon metálico que está na resina da matriz da coluna. As proteínas que se ligaram na coluna são eluídas por meio de reagentes químicos competidores com os resíduos de aminoácidos aderidos à coluna através da ligação com o metal (Porath, 1992).
Para este experimento foi utilizada uma coluna cromatográfica contendo metal
Ni2+ imobilizado (HisTrap Affinity Column Sepharose, 5 mL- GE Lifescience), e a
proteína expressa contendo a cauda de poli-histidina. O anel imidazol dessas
histidinas se coordena com o metálico Ni2+ e retém as proteínas na coluna. A eluição
da proteína na coluna se deu por meio de gradiente crescente de imidazol. Nesta etapa, utilizamos os tampões A e B. O tampão A foi composto por: fosfato 20 mM, NaCl 500 mM e EDTA 1 mM, pH 7,5; tampão B: fosfato 20 mM, NaCl 500 mM e EDTA 1 mM, 500 mM de imidazol, pH 7,5.
3. 7.2. Cromatografia por gel filtração
A cromatografia de gel filtração, conhecida também como cromatografia de exclusão molecular, é uma técnica cromatográfica na qual as proteínas são separadas por meio de seus tamanhos e massas moleculares. Para este experimento, foi utilizada uma coluna com uma resina como matriz estacionária, base polimérica (Superdex 200). Este material possui pequenos poros, nos quais moléculas menores podem migrar, enquanto as moléculas maiores passam direto. As moléculas menores terão, portanto, maior tempo/volume para percorrer a coluna e, assim, possuirão maior volume de eluição, ao passo que as moléculas maiores terão menor tempo de eluição resultando na sua saída da coluna mais rapidamente (Barth e col., 1994). A coluna utilizada foi XK 26/60 de 318 mL, resina Superdex 200 (GE Lifesciences), e o tampão utilizado para esta proteína foi o tampão C, composto por fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, 2 mM EDTA, pH 7,5. Vazão utilizado foi de 2 mL/min.
3. 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Esta técnica consiste na separação de proteínas por meio da massa molecular. Tem como princípio que uma molécula com carga elétrica se move em um campo elétrico, porém, a velocidade e a distância de deslocamento na eletroforese dependem da força do campo elétrico, da carga e da forma da molécula. A presença de um agente desnaturante (SDS) torna iguais as cargas, fazendo com que as moléculas percorram o caminho de acordo com o tamanho de cada molécula. O gel em que se realiza essa técnica é composto por duas camadas, gel de empacotamento e gel de resolução; no gel de empacotamento, há menor quantidade de acrilamida, as moléculas estão sob um menor pH (6,6) e conseguem ficar alinhadas para iniciarem a corrida no gel de resolução; neste gel, de maior pH (8,8) e quantidade de acrilamida maior, as moléculas se deslocam por meio das diferenças de massa, possibilitando diferenciar as proteínas de diferentes massas moleculares. (Stryer, 2004; Laemmli, 1970)
Cada amostra foi diluída em tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida, o qual consiste em: Tris-HCl 50 mmol / L pH 6,8; DTT 100 mmol / L;
SDS 2% (m/v); azul de bromofenol 0,1% (m/v) e glicerol 10% (m/v); para comparação de massas, foi adicionado também um padrão de proteínas com massas moleculares já conhecidas. A cuba eletroforética utilizada foi a Mini-Protean (Bio-Rad), contendo o gel de poliacrilamida composto por: gel de empacotamento 5% de acrilamida, gel de separação 12% de acrilamida, voltagem constante de 200 V, por aproximadamente 1,5 h. Os géis foram em média corados por 10 min em solução etanol: ácido acético: água 5: 1: 15 (v: v: v) e Coomassie Brilliant Blue R (Bio-Rad) 0,25% e descorado em ácido acético: etanol: água 3: 2: 35 (v: v: v).
3. 9. Determinação da concentração de proteínas
Para que a concentração da proteína em solução após as etapas de purificação fosse determinada, utilizou-se o Método de Edelhoch (Edelhoch, 1967), que consiste em um método de medidas por meio de espectroscopia de absorbância molecular (A). Para isso, foi necessário obter os coeficientes de absorbância molar da proteína em tampão fosfato 20 mM pH 6,5 e Gdn-Cl 6 M, por meio da equação:
ε
280(λ) (M
-1cm
-1) = nTrp x εTrp + nTyr x εTyr + nCys x εCys
No qual, ε (λ) coeficiente de absortividade molar (M-1
cm-1) da proteína de
interesse em um determinado comprimento de onda (λ); nTrp o número de triptofanos da proteína; nTyr o número de tirosinas e nCys o número de cisteínas; εTrp, εTyr e εCys são os coeficientes de absortividade molar do triptofano, da
tirosina e da cisteína, cujos os valores são 5500, 1490 e 125 M-1cm-1,
respectivamente. De posse do ε280 medido, calcula-se a concentração da proteína
medida, uma vez que a absorbância é uma função linear da concentração (C) medida de acordo com a Lei Beer–Lambert:
A = ε. l. C
Em que A é absorbância (mol / L-1.cm-1); l comprimento do caminho óptico em
em cada comprimento de onda relacionado foram realizadas em triplicata em um espectrofotômetro Jasco V530 UV/VIS.
3. 10. Medidas de emissão de fluorescência intrínseca
A fluorescência é predominantemente um fenômeno no qual ocorre emissão de luz por meio de um processo de excitação eletrônica. É utilizada em compostos que contenham fluoróforos, responsáveis por absorver energia e emitir. Em proteínas, há diferentes resíduos de aminoácidos, como tirosina (Y), fenilalanina (F) e triptofano (W), que são intrinsecamente fluorescentes e podem funcionar como sonda para a técnica (Millar, 1996). A proteína SsSGT1 possui 4 triptofanos, sendo utilizados como sonda para estudo da estrutura da proteína ao excitar as amostras a 295 nm. A adição de ureia foi realizada no experimento por se tratar de um agente desnaturante, que promove a exposição de porções hidrofóbicas da proteína ao solvente, entre elas regiões que contêm triptofano normalmente no interior da proteína, possibilitando a compreensão da estabilidade química da proteína SsSGT1.
Após excitação a 295 nm, quando os resíduos de triptofano estão menos expostos ao solvente, como no interior de proteínas em estado enovelado, o máximo
de emissão de fluorescência ocorre em λ menores (aproximadamente 320 nm);
quando mais exposto, se a proteína esta desenovelada ou devido à presença de agente desnaturantes, os triptofanos têm máximo de emissão de fluorescência em λ maiores (aproximadamente 350 nm). Portanto, a emissão de fluorescência do triptofano pode ser distinta conforme se modifica o ambiente químico que o resíduo deste aminoácido se localiza (Lakowicz, 1999).
As medidas de fluorescência foram realizadas em fluorímetro Cary Eclypse (Varian), com cubetas de quartzo de caminhos óptico de 0,1 cm e proteína na concentração de 5 µM e também com solução de ureia 6 e 8M. Para tal, os espectros de emissão foram realizados um intervalo de 300 a 400 nm utilizando-se comprimento de onda (λ) de excitação a 295 nm. Os dados de intensidade de fluorescência foram convertidos para valores de centro de massa espectral (<λ>) segundo a equação:
Onde λi representa cada comprimento de onda utilizado e Fi a intensidade de fluorescência em λi. Para o tratamento de dados, foram utilizados os programas SLMAB2 (SLM-AMINCO) e Origin 7.5 (OriginLAB Corporation). A temperatura em que o experimento foi realizado foi de 25°C.
3. 11. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD)
A técnica de CD se baseia na absorção diferencial da luz circularmente polarizada para esquerda ou para direita por uma molécula assimétrica que desvia o plano da luz. A interação resultante gera o sinal do dicroísmo circular. Moléculas sem plano de simetria desviam o plano de luz polarizada, a interação produzida formará o sinal do CD, possibilitando a análise desta molécula pela técnica de dicroísmo circular (Ramos e Correa 2009).
As proteínas podem apresentar diversos tipos de estrutura secundária, principalmente as conformações tipo hélice-α, folha-β e estrutura randômica. Cada tipo de estrutura apresenta uma interação distinta com a luz circularmente polarizada proveniente do dicroísmo circular, o que permite a caracterização da composição global de estrutura secundária predominante na proteína de estudo. O cromóforo amida proveniente da ligação peptídica é responsável pelo sinal que se obtém no CD, e está presente na estrutura do aminoácido; ele predomina na região com absorbância abaixo de 250 nm. Nessa região há duas transições eletrônicas importantes: transição η→π*, que origina as bandas negativas em torno de 222 nm e 217 nm, características de hélice-α e folhas-β, respectivamente; e uma transição π→π*, responsável por bandas positivas em 190 nm e 198 nm, características de hélice-α e folhas-β, respectivamente e também pela banda negativa em 208 nm, característica de hélice-α (Corrêa e Ramos, 2009; Woody, 1995). A técnica possibilitou, portanto, a caracterização da estrutura secundária da proteína SsSGT1, bem como a caracterização de sua estabilidade térmica e química, com a variação da temperatura e adição de agentes desnaturantes, respectivamente.
Para a obtenção dos espectros de estrutura secundária de CD foi utilizado o
espectropolarímetro J-720 (JASCO) sob vazão constante de 10 L/min de N2. As
medidas foram realizadas com a proteína na concentração de 5 µM, em tampão C, utilizando cubetas de quartzo de 1 mm de caminho óptico. Os espectros de CD foram obtidos pela média acumulada de 16 espectros subtraídos da média de acumulações de sinal obtido do tampão da proteína no mesmo intervalo de comprimento de onda, sendo que a varredura de leitura do experimento foi de 202 nm a 260 nm. Na cela, a temperatura foi mantida constante a 20°C através de um sistema de controle do equipamento (Peltier Type Control System PFD 425S- Jasco). Os resultados são medidos a 20 nm / min, com resposta de 1 s, e o branco
correspondente ao tampão da proteína. O valor de elipticidade molar residual ([θ])
foi calculado pela seguinte equação:
Na qual, θ é a elipticidade em graus (mdeg), MM é a massa molecular da
proteína (g/mol), C é a concentração da proteína (mg/mL), l é o comprimento do caminho ótico (cm) e n é o número de resíduos de aminoácidos da respectiva proteína. Os espectros, realizados em triplicata, foram analisados pelo cálculo (fator H), que informa a quantidade de hélices-α.
Para os experimentos de desenovelamento térmico e químico, utilizaram-se as mesmas condições, no entanto, o sinal de dicroísmo foi monitorado a 222 nm, variando a temperatura de 20° a 90°C no experimento térmico, e aumentando a concentração de agente denaturante ureia de 0M a 8M no experimento químico (Bohm e col, 1992). Para o cálculo de porcentagem de estruturas tipo hélice-α, utilizou-se a expressão do fator H, no qual considera:
Nesta expressão, obtém-se a quantidade em porcentagem (%) de hélice-α presente na proteína, sendo 36000 o valor maior de hélice-α que uma proteína pode conter, e [θ] o valor experimental obtido para a amostra.
3. 12. Calorimetria diferencial de varredura (DSC)
O experimento de DSC (Differential Scanning Calorimetry) é baseado em uma técnica que mede a variação da energia livre em uma amostra exposta ao calor. Neste experimento, há transferência de calor para a amostra, que é composta pela solução da proteína, e uma célula de referência contendo o tampão utilizado no experimento. A temperatura aumenta em razão constante ao longo do tempo, e são feitas 4 corridas, 2 variando a temperatura de 20 a 40ºC e 2 variando de 20 a 90ºC; foram feitas também 18 varreduras do tampão, em uma faixa de temperatura que consistia entre 20 e 90ºC. Como a composição de cada cela difere, a quantidade de calor envolvida na cela de referência e na cela de amostra serão distintas, e, portanto, a variação de calor também não será a mesma. Essa diferença pode ser utilizada para calcular a capacidade calorífica da proteína em solução, sendo que o resultado produzido é o perfil da variação da capacidade de calor da proteína em função da temperatura, construindo gráficos que detalham o desenovelamento da proteína quando aquecida. O tampão utilizado foi o tampão C, e as concentrações da proteína foram 25, 50 e 100 µM.
3. 13. Fluorescência diferencial de varredura (DSF)
O experimento de DSF consiste em uma técnica em que se determina a caracterização biofísica da estabilidade da proteína por meio da desnaturação térmica utilizando um ligante cromóforo (Matulis e col., 2009).
O experimento foi realizado por meio do equipamento StepOnePlusTM Real-Time PCR Systems - Applied Biosystems. Para tal, são colocadas várias amostras de proteína em concentrações distintas conhecidas em uma placa de 96 poços, com um reagente cromóforo específico (Orange Dye - Applied Biosystems) diluído em igual tampão da amostra, na proporção de 1:1000. Estas amostras são submetidas a aquecimento, de 25 e 100ºC, e, à medida que a proteína desenovela com a
exposição ao calor, o ligante se liga nas regiões hidrofóbicas da proteína expostas e assim fluoresce (Pantoliano e col. 2001). O experimento com a proteína SsSGT1 foi realizado nas concentrações de 2,5, 5,0 e 10,0 μM de proteína, em tampão C. O volume de cada reação é de 20 µL, e a velocidade de aumento da temperatura é de 1ºC/min. Cada curva foi obtida por meio da média das triplicatas de cada concentração e a análise das curvas de desnaturação da proteína foi feita por meio do programa Origin® 8.1 (OriginLab).
3. 14. Caracterização dos parâmetros biofísicos
Para caracterizar a proteína SsSGT1 quanto aos seus parâmetros hidrodinâmicos, como massa molecular em solução (e, por consequência, estado oligomérico), coeficiente de difusão e raio hidrodinâmico (ou raio de Stokes), foram utilizadas diferentes técnicas. A massa molecular foi determinada por SEC-MALS, o raio de Stokes por gel filtração analítica (GFA) e o coeficiente de difusão por meio do espalhamento de luz dinâmico (DLS).
3. 14.1. Cromatografia de gel filtração analítica
A técnica de cromatografia em gel filtração analítica (GFA) nos fornece informações sobre raio de Stokes (Rs). Nesta técnica através de uma coluna cromatográfica semelhante à de gel filtração, as proteínas são separadas de acordo com sua massa molecular, que assim como o formato das proteínas, influencia o volume de eluição (Ve). Seis proteínas esféricas padrão, (Tabela 1), com massas moleculares e Rs conhecidas foram utilizadas para obter uma curva padrão.
