Efeito protetor da N-acetilcisteína na evolução precoce de receptores de transplante renal com doador falecido

Texto

(1)ALEXANDRE DANILOVIC. Efeito protetor da N-acetilcisteína na evolução precoce de receptores de transplante renal com doador falecido. Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Urologia Orientador: Prof. Dr. Antônio Marmo Lucon. São Paulo 2009.

(2) Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. reprodução autorizada pelo autor. Danilovic, Alexandre Efeito protetor da N-acetilcisteína na evolução precoce de receptores de transplante renal com doador falecido / Alexandre Danilovic. -- São Paulo, 2009.. Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Departamento de Cirurgia. Área de concentração: Urologia. Orientador: Antônio Marmo Lucon.. Descritores: 1.Transplante de rim 2.Estresse oxidativo 3.Acetilcisteína 4.Rejeição de enxerto. USP/FM/SBD-479/09.

(3) ii. .. A minha esposa Debora, pelo amor e apoio constante; A minha filha Ana Carolina, pela alegria e inspiração..

(4) iii. AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais, Ana e Nicolau, que me criaram com amor e dedicação, iluminando meu caminho, e que me ensinaram o valor do questionamento e do conhecimento. A Debora, minha esposa, com quem compartilho minha vida, eu agradeço pelo apoio e compreensão nos momentos de ausência durante a confecção desta tese. vida.. Agradeço a Ana Carolina, minha filha, pelo brilho que trouxe a minha. Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Seguro, sou grato pelo exemplo de médico e pesquisador e por co-orientar essa pesquisa. Agradeço o Prof. Dr. Antônio Marmo Lucon por me acompanhar desde meus primeiros passos na urologia e pela orientação nessa pesquisa. Ao Prof. Dr. Miguel Srougi, sou grato pela oportunidade de me desenvolver na urologia e pelo estímulo à pesquisa e à busca do conhecimento. Devo gratidão ao Prof. Dr. Francisco Rafael Laurindo e ao Prof. Dr. Venâncio Avancini Alves Ferreira por me iniciarem na pesquisa científica. A Dra. Maria Heloisa Massola Shimizu, agradeço por me introduzir nas técnicas de laboratório. Agradeço ao Dr. Ioannis Antonopoulos e ao Dr. Davi Machado pelas sugestões durante a qualificação desta tese. Sou grato ao Prof. Dr. Luiz Estevan Ianhez e aos clínicos da UTR pelo apoio durante esse estudo e pelo brilhantismo com que cuidam dos pacientes. Ao Prof. Dr. William Carlos Nahas e cirurgiões da UTR, sou grato pelo apoio durante esse estudo e por me ensinarem o que sei sobre transplante renal. Ao Prof. Dr. Eduardo Mazzucchi, agradeço a amizade e sugestões na redação desta tese. As enfermeiras Eliza Midori Vagyu, Lucia Maria Tributino, Maria Vicencia da Conceição, Solange Tempori, Maria Dantas e Lígia Vitória e corpo de enfermagem da UTR, sou grato pela dedicação constante aos pacientes e pelo carinho com que me tratam..

(5) iv. A enfermeira Fabiana Agena, as farmacêuticas Luciana Mariotti Fadel e Melissa Yatie Sato e ao secretário Rafael Santos Nascimento, que trabalham na pesquisa clínica da urologia, sou grato pelo apoio logístico. Agradeço aos residentes da urologia e da nefrologia pela dedicação aos pacientes transplantados. Agradeço a FAPESP pelo auxílio à pesquisa concedido a este estudo. Agradeço aos pacientes, razão maior desta pesquisa clínica..

(6) v. Esta tese foi financiada pela FAPESP, processo 06/52046-0.

(7) vi. SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO................................................................................ ....................1 2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 4 3. OBJETIVO........................................................................................................ 13 4. CASUÍSTICA E MÉTODO ................................................................................ 15 5. RESULTADOS ................................................................................................. 24 6. DISCUSSÃO .................................................................................................... 35 7. CONCLUSÕES................................................................................................. 47 8. REFERÊNCIAS..................................................................................................49 Apêndice.

(8) vii. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS. ANOVA. análise de variância. CAPES. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. CAPPesq. Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa do HCFMUSP. HLA. Human Leukocyte Antigen. IgA. Imuneglobulina A. NAC. N-acetilcisteína. SPSS. Statistical Package for Social Science. TBARS. Tiobarbituric Acid Reactive Substances.

(9) viii. RESUMO Danilovic, A. Efeito protetor da N-acetilcisteína na evolução precoce de receptores de transplante renal com doador falecido [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2009. INTRODUÇÃO As taxas de sobrevida do enxerto em transplante renal de doador falecido são menores que aquelas de doadores vivos. Acredita-se que metabólitos de estresse oxidativo sejam importantes mediadores de varias formas de lesão renal aguda, como insuficiência renal isquêmica, nefrotoxicidade por contraste e obstrução ureteral. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos terapêuticos do antioxidante N-acetilcisteína na evolução precoce de receptores de transplante renal de doador falecido quanto à função do enxerto e ao estresse oxidativo. MÉTODO Entre abril de 2005 e junho de 2008, 74 receptores adultos de primeiro transplante renal de doador falecido foram distribuídos aleatoriamente em grupo tratado com N-acetilcisteína (n=38) ou controle (n=36) e avaliados prospectivamente por 90 dias. O grupo tratado com N-acetilcisteína (NAC) recebeu 600 mg por via oral, em duas tomadas diárias, por 7 dias, iniciado no dia do trasplante. A rejeição aguda comprovada por biópsia foi avaliada em até 30 dias de pós-operatório (PO). A função renal foi determinada por dosagem de creatinina sérica, cálculo do clearance de creatinina pela fórmula de Cockroft-Gault no 7º, 15º, 30º, 60º e 90º PO e comparação de número de dias em diálise ao longo do tempo após o transplante através de estimativa de Kaplan-Meier. A dosagem de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS), que são marcadores de peroxidação lipídica e estresse oxidativo, foi determinada do 0-7º PO. A análise estatística foi realizada com auxílio do SPSS 16.0 e Qui-quadrado, teste exato de Fisher, teste t de Student, teste Mann-Whitney, ANOVA e teste log rank foram aplicados conforme indicado. RESULTADOS A rejeição aguda comprovada por biópsia foi menos freqüente, embora não significativa (p=0,203), entre os pacientes tratados com NAC (3/38 7,9% vs. 7/36 19,4%). O grupo tratado com NAC apresentou uma menor creatinina média durante o seguimento (p=0,026). A depuração de creatinina calculada foi maior para o grupo NAC (p=0,029). O número de dias em diálise de receptores ao longo do tempo após o transplante foi menor no grupo tratado com NAC (p=0,008). O estresse oxidativo foi significantemente reduzido (p<0,001) com NAC até o 7º PO. CONCLUSÃO A N-acetilcisteína melhorou a evolução precoce dos pacientes submetidos a transplante renal de doador falecido pela recuperação mais rápida e mantida da função renal, através da atenuação do estresse oxidativo. Descritores: 1.Transplante de rim 2. Estresse oxidativo 3. Acetilcisteína 4. Rejeição de enxerto.

(10) ix. SUMMARY Danilovic, A. Protective effect of N-acetylcysteine on early outcomes of deceased renal transplant [thesis]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2009.. INTRODUCTION Deceased renal transplant graft survival rates are worse than those from living donors. Reactive oxygen metabolites are believed to be important mediators of various forms of acute kidney injury, such as ischaemic renal failure, radiocontrast nephrotoxicity and ureteral obstruction. The aim of this study is to investigate the therapeutic effects of the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) on early outcomes of deceased renal transplant patients regarding graft function and oxidative stress. METHOD Between April 2005 and June 2008, 74 adult primary graft recipients of deceased renal donors were randomly assigned to treatment (NAC) (n=38) or control (n=36) group and prospectively evaluated for 90 days. Treatment group received N-acetylcysteine 600 mg bid po from 0 to 7th postoperative day (PO). Renal function was determined by serum creatinine, Cockroft-Gault estimated GFR (eGFR) at 7th, 15th, 30th, 60th and 90th PO and dialysis free Kaplan-Meier estimate curve. Serum levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), which are markers of lipid peroxidation and oxidative stress, were determined using the thiobarbituric acid assay from 0-7th PO. Statistical analysis was performed using SPSS 16.0 and Chi-square test, Fisher´s exact test, Student t test, Mann-Whitney test, ANOVA and log rank test were applied as indicated. RESULTS Biopsy confirmed acute rejection was less frequent, albeit not significant, with NAC (3/38 7.9% vs. 7/36 19.4%, p=0.203). NAC group presented a lower mean serum creatinine during follow-up (p=0.026). NAC group presented a higher mean eGFR (p=0.029). Kaplan-Meier estimate for dialysis free recipients presented less days of dialysis for the NAC group (p=0.008). Oxidative stress was significantly attenuated with NAC (p<0.001). CONCLUSION Our results suggest that N-acetylcysteine enhance deceased renal transplant outcomes by attenuating oxidative stress. Descriptors: 1. Kidney transplantation 2. Oxidative stress 3. Acetylcysteine 4. Graft rejection.

(11) 1. 1. INTRODUÇÃO.

(12) 2. 1. INTRODUÇÃO O transplante renal com doador falecido representa 46% dos transplantes renais realizados em São Paulo1. A sobrevida do enxerto nesses casos é menor quando comparada ao doador vivo, mesmo quando o doador não é relacionado2, 3. Fatores próprios do receptor influenciam a sobrevida do enxerto. A sensibilização do receptor com determinados antígenos4-6 e a presença de anticorpos pré-formados HLA doador-específico7 são fatores conhecidos que determinam um efeito adverso na evolução do enxerto. Como esses fatores são comuns entre receptores de rins de doadores vivos e de falecidos, a diferença de sobrevida é determinada, em parte, pelos efeitos lesivos da isquemia fria sobre o enxerto de doadores falecidos8-10. O paciente com insuficiência renal crônica já apresenta condição clínica grave com estado micro-inflamatório em que há aumento de estresse oxidativo11, a qual se soma o estresse oxidativo gerado no processo de isquemia e reperfusão do transplante12. Por representar um novo alvo para intervenção terapêutica, o estudo do estresse oxidativo tem despertado grande interesse. Embora o uso de antioxidantes tenha se mostrado eficiente na prevenção de insuficiência renal aguda induzida por contraste iodado13-19 e estudos experimentais tenham mostrado atenuação de lesão de isquemia e reperfusão através da administração de N-acetilcisteína20, atualmente é pouco conhecida a influência da administração de antioxidantes em humanos submetidos a transplante renal21, 22..

(13) 3. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da N-acetilcisteína, que é uma das substâncias antioxidantes, na evolução precoce de receptores de transplante renal com doador falecido..

(14) 4. 2. REVISÃO DE LITERATURA.

(15) 5. 2. REVISÃO DE LITERATURA. A evolução do paciente acometido por uma doença grave depende de uma resposta imunológica complexa e organizada. De uma forma geral, uma resposta imunológica disfuncional se apresenta de duas maneiras diferentes: (a) ativação excessiva de resposta celular imune, manifestada clinicamente como síndrome de resposta inflamatória sistêmica, e (b) falha na ativação da resposta imunológica, causando o aumento na susceptibilidade a infecção23. O excesso de produção de radicais livres contribui para uma resposta inflamatória exacerbada e lesão tecidual23. A cadeia respiratória mitocondrial é a principal fonte de radicais livres do organismo, que ocorre via redução univalente de oxigênio molecular pelo sistema da nicotinamida adenina dinucleotídeo-P oxidase (NADPH) ao ânion superóxido (O2.-), fórmula (a), que é instável e é rapidamente convertido a peróxido de hidrogênio (H2O2), fórmula (b). Ambos, ânion superóxido e peróxido de hidrogênio são precursores de oxidantes mais poderosos. O ânion superóxido reage com óxido nítrico (NO) para formar peroxinitrito (NO3-), fórmula (c), enquanto peróxido de hidrogênio produz radical hidroxila (OH-), fórmula (d) e fórmula (e)24, que é responsável pela degradação da membrana celular lipídica e lesão ao DNA25 (Figura 1)..

(16) 6. 2 O2 + NADPH → 2 O2.- + NADP+ + H+. (a). O2.- + e- + 2H+ → H2O2. (b). O2.- + NO → NO3-. (c). H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + OH.. (d). H2O2 + O2.- → OH- + OH. + O2. (e). Figura 1 – Geração de radicais livres.. As células têm diversos mecanismos de defesa antioxidante, que incluem vitaminas C e E, e enzimas como a superóxido dismutase, que através da dismutação de superóxido produz peróxido de hidrogênio, fórmula (f), a catalase, que catalisa o peróxido de hidrogênio em água fórmula (g) e a glutationa peroxidase, que através da conversão de glutationa reduzida (GSH) à glutationa oxidada (GSSG) transforma peróxido de hidrogênio em água, fórmula (h) (Figura 2)26, 27. 2 O2.- + 2 H+ → O2 + H2O2. (f). 2 H2O2 → O2 + 2 H2O. (g). H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GSSG. (h). Figura 2 – Mecanismos de defesa antioxidante.. Os radicais livres servem como sinalizadores de uma variedade de vias de expressão genética. 28, 29. , porém, em excesso, podem modificar ou lesar. macromoléculas nas células, incluindo a oxidação e peroxidação do DNA30. O estresse oxidativo é gerado quando há um desequilíbrio entre os.

(17) 7. mecanismos oxidantes e antioxidantes. O estresse oxidativo produzido durante uma doença grave pode estar relacionado à ativação de fagócitos (neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos), produção de óxido nítrico e produção de metaloproteínas31. Diversos métodos foram desenvolvidos para monitorizar o estresse oxidativo32 e por serem compostos instáveis com meia-vida de segundos33, os métodos indiretos, que medem produtos estáveis do metabolismo do oxigênio,. são. lipoperoxidação. os. mais. como. utilizados.. substâncias. Eles. incluem. reativas. de. os. ácido. produtos. da. tiobarbitúrico,. isoprostanos e LDL oxidado e a medida do dano ao DNA, que é feita com cromatografia líquida de alta performance34. A principal dificuldade na escolha do marcador de estresse oxidativo deriva da complexidade dos métodos. Em pacientes com insuficiência renal crônica, alguns marcadores de estresse oxidativo podem ser positivos in vitro, mas não in vivo, como é o caso do LDL oxidado35. A dosagem de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico tem sido menos complexa para a medida do estresse oxidativo nos laboratórios clínicos. Durante a peroxidação lipídica, hidroxiperóxidos instáveis são transformados em produtos. mais. tiobarbitúrico33.. estáveis Níveis. como. as. substâncias. reativas. de. ácido. elevados. de. substâncias. reativas. de. ácido. tiobarbitúrico são indicativos de estresse oxidativo em pacientes urêmicos36. F2-isoprostano é um produto da oxidação de ácido aracdônico e serve como marcador estável de ataque de radicais livres à membrana fosfolipídica in vivo37. Entretanto, poucos laboratórios possuem os caros aparelhos para dosar o F2-isoprostano38. Alfa glutationa S-transferase é um marcador.

(18) 8. específico de lesão do túbulo proximal39. A terapia antioxidante pode ser feita pela reposição de antioxidantes endógenos,. como. superóxido. dismutase. recombinante32,. pela. suplementação exógena com agentes com propriedades antioxidantes, como N-acetilcisteína40, ou pela administração de drogas que reduzem a produção oxidante, como alopurinol21. Evidências experimentais sugerem a ocorrência de estresse oxidativo após injeção intrarrenal de contraste iodado e sua redução com alopurinol ou superóxido. dismutase,. através. da. diminuição. da. concentração. de. substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico e melhora do ritmo de filtração glomerular41. O antioxidante alopurinol foi investigado em transplante com doador falecido. A adição de alopurinol ao esquema de manutenção de imunossupressão reduziu os episódios de rejeição aguda21. A perda da capacidade antioxidante em uma célula oxidada é devida principalmente a um decréscimo de glutationa, pois é o tiol livre intracelular mais abundante. O estresse oxidativo in vivo é traduzido como deficiência de glutationa ou de seu precursor, cisteína. O antioxidante mais eficaz que vem sendo estudado é a N-acetilcisteína, que é um precursor de glutationa42. Quimicamente, a N-acetilcisteína é similar a cisteína. A presença do meio acetil reduz a reatividade desse tiol comparado a cisteína. A N-acetilcisteína é menos tóxica, menos suscetível a oxidação e dimerização e é mais solúvel em água, fazendo dele uma fonte melhor de cisteína que a própria administração parenteral de cisteína43..

(19) 9. A N-acetilcisteína é um tiol, um agente mucolítico e precursor de Lcisteína e glutationa reduzida. N-acetilcisteína é uma fonte de grupos sulfidril nas células e combate os radicais livres através de sua interação com radical hidroxila e peróxido de hidrogênio44. As propriedades farmacológicas antioxidantes da N-acetilcisteína são a restauração dos estoques reduzidos de glutationa, a vasodilatação pela reposição de óxido nítrico através do aumento de sulfidrilas e a redução da produção de citocinas proinflamatórias como interleucina 8 e fator de necrose tumoral40. Pacientes urêmicos possuem altos níveis de marcadores de estresse oxidativo36,. 45, 46. . Estudos experimentais e clínicos demonstraram que a. aterosclerose é associada à lesão glomerular e intersticial, levando a perda de função renal47. 48, 49. . Um dos estágios mais precoces do desenvolvimento. da aterosclerose é a perda da capacidade de relaxamento vascular endotelial e o aumento da adesão endotelial devido à expressão de moléculas de adesão como molécula de adesão vascular celular 1 (VCAM1), molécula de adesão inter-celular 1 (ICAM-1) e E-selectina, que servem como receptores dos leucócitos que circulam nas artérias50. A relação entre os níveis de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico como indicador de estresse oxidativo e o desenvolvimento de aterosclerose foi demonstrado em pacientes com insuficiência renal crônica51. A propriedade de relaxamento vascular de um vaso é determinada por um equilíbrio entre a geração de superóxido e óxido nítrico no endotélio. Uma vez que o superóxido pode reagir com o vasodilatador óxido nítrico para produzir peroxinitrito, um potente oxidante, a produção exagerada de superóxido pode inibir a propriedade de relaxamento vascular endotelial pela.

(20) 10. diminuição do óxido nítrico disponível. A N-acetilcisteína pode promover as propriedades de relaxamento vascular endotelial pela supressão dos níveis de radicais livres, incluindo superóxido, e dessa forma aumentando a disponibilidade de óxido nítrico50. Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 1 (IL-1) estimulam a expressão de VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina nas células endoteliais. A N-acetilcisteína reduz a expressão de VCAM-1 em 90 % através da inibição da ligação do fator nuclear kappa B (NF-κB) no receptor κB de VCAM-150. A N-acetilcisteína também inibe a expressão de VCAM-1 e E-selectina estimulada pela IL-1 através de mecanismos ainda não elucidados52. A N-acetilcisteína, através do aumento dos níveis de glutationa, promove a indução da transcrição do gene óxido nítrico sintase induzido (iNOS) e a expressão do RNA mensagero (mRNA)42. O peroxinitrito gerado pela interação entre óxido nítrico e ânion superóxido leva a produção de radicais hidroxila, indução de heme-oxigenase e apoptose de células endoteliais. A N-acetilcisteína abole completamente a atividade e o aumento de heme-oxigenase53. Esses estudos sugerem que a N-acetilcisteína pode melhorar a função endotelial e pode atenuar o processo inflamatório vascular através do antagonismo dos efeitos intracelulares da geração de radicais livres, pelo aumento do óxido nítrico biodisponível e pela redução da adesão leucocitária ao endotélio42. A N-acetilcisteína confere uma proteção a ratos submetidos à lesão por isquemia e reperfusão em parte pela inibição de moléculas de adesão, como VCAM-1 e ICAM-154. Ratos submetidos à isquemia renal foram completamente protegidos de insuficiência renal aguda através de.

(21) 11. administração. de. N-acetilcisteína. associada. à. suplementação. de. magnésio17. Estudos experimentais mostraram que N-acetilcisteína melhora a função renal e reduz a inflamação intersticial em ratos submetidos à lesão por isquemia e reperfusão. Esses efeitos são associados ao aumento de glutationa renal, sugerindo que N-acetilcisteína atenua o estresse oxidativo renal e sistêmico neste modelo55. Em modelo experimental de insuficiência renal crônica, a N-acetilcisteína também mostrou um papel protetor atribuído à diminuição de peroxidação lipídica levando a melhora da função renal56. Recentemente, através de estudos experimentais em ratos, demonstrou-se que a administração de N-acetilcisteína também promove uma significante proteção contra o declínio do ritmo de filtração glomerular e da redução do fluxo sanguíneo renal após desobstrução ureteral bilateral, através da supressão de expressão de aquaporinas tipo 2 e óxido nítrico sintase tecidual13.. O uso de N-acetilcisteína associado à hidratação reduz em 56% o risco relativo de nefropatia por contraste iodado em pacientes com insuficiência renal crônica através de supressão do estresse oxidativo mediado por lesão do túbulo proximal57,58,18. N-acetilcisteína protege de modo dose dependente59 pacientes com insuficiência renal crônica não dialítica (depuração de creatinina < 60 ml/min/1,73 m2) contra piora de função renal induzida por contraste após procedimento de angiografia coronária57. A administração de 600 mg de N-acetilcisteína por via oral a cada 12h por 14,5 meses reduziu a ocorrência de infarto do miocárdio, a necessidade de angioplastia e de revascularização miocárdica, acidente.

(22) 12. vascular cerebral e necessidade de amputação de membros de pacientes em hemodiálise45. Estudos clínicos demonstram a atenuação do estresse oxidativo medido por substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico e homocisteína em pacientes com insuficiência renal dialítica, submetidos à administração de N-acetilcisteína46. Há poucos estudos em humanos sobre os efeitos do antioxidante Nacetilcisteína em transplantes. A administração intra-operatória de Nacetilcisteína em receptores de transplante de fígado causou a elevação de interleucinas 4 e 10, que têm papel protetor contra lesão de reperfusão60. Mais recentemente, Ruiz Fuentes e colaboradores relataram que a Nacetilcisteína pode melhorar a depuração de creatinina em receptores de transplante renal sem diabetes, mesmo em uma fase estável do transplante61..

(23) 13. 3. OBJETIVO.

(24) 14. 3. OBJETIVO O objetivo do presente trabalho foi verificar se a administração de 600 mg de N-acetilcisteína por via oral duas vezes ao dia em receptores de transplante renal com doador falecido altera:. 3.1. O estresse oxidativo em até 7 dias após o transplante;. 3.2. A função renal pós-operatória em até 90 dias após o transplante;.

(25) 15. 4. CASUÍSTICA E MÉTODO.

(26) 16. 4. CASUÍSTICA E MÉTODO O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa – CAPPesq da Diretoria Clínica do Hospital das Clínicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo sob o nº 076/05 e está registrado sob número NCT00994305 no endereço eletrônico www.clinicaltrials.gov. Cento e cinquenta e nove pacientes, com idade acima de 18 anos, receptores de primeiro transplante renal de doador falecido foram operados na Unidade de Transplante Renal da Divisão de Clínica Urológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, entre abril de 2005 e junho de 2008. Setenta e cinco pacientes não puderam ser incluídos neste estudo por participarem de outros estudos com drogas imunossupressoras. Oitenta e quatro pacientes foram randomizados através de sorteio realizado previamente à entrada no estudo e distribuídos em grupo controle e grupo tratamento com N-acetilcisteína na dose oral de 600 mg administrada duas vezes ao dia por sete dias consecutivos, iniciando no dia do transplante. Após a randomização, dez pacientes foram excluídos por apresentarem critérios de exclusão previamente estabelecidos: impossibilidade de ingerir a droga estudada e participação em outro estudo clínico. Cinco pacientes (três do grupo controle e dois do grupo tratamento com N-acetilcisteína) permaneceram em unidade de tratamento intensivo no pós-operatório do transplante renal. Quatro pacientes foram submetidos à nova operação no período dos 7 dias iniciais do transplante renal por complicações cirúrgicas,.

(27) 17. dos quais dois pacientes (um em cada grupo) apresentaram fístula urinária e foram submetidos à reconstrução da anastomose ureterovesical e dois pacientes do grupo controle apresentaram hematoma de fossa ilíaca, com necessidade de tratamento cirúrgico. Um paciente do grupo tratamento com N-acetilcisteína recebeu rim que foi perfundido por máquina pulsátil para manutenção do enxerto durante o período de isquemia fria. Setenta e quatro receptores de transplante renal de doador falecido participaram do estudo.. Os dados sobre os doadores falecidos foram fornecidos pela Secretaria Estadual da Saúde – Sistema Estadual de Transplantes, através do formulário denominado Informações sobre o Doador de Múltiplos Órgãos, preenchido pela enfermeira da Organização de Procura de Órgãos local. As características dos doadores estudadas foram: sexo, raça categorizada em branca, parda, negra, e amarela, idade em anos, índice de massa corpórea (IMC) em kg/m², dias de permanência em unidade de terapia intensiva (UTI) antes da doação, antecedente pessoal de diabetes mellitus, antecedente pessoal de hipertensão arterial e dosagem sérica de creatinina terminal (última dosagem antes da doação), em mg/dl. Os doadores falecidos sob o critério de morte encefálica foram alocados em duas categorias: • Doador falecido sem critério expandido. • Doador falecido com critério expandido: doadores com mais de 60 anos ou com idade entre 50 e 60 anos e duas das seguintes características: dosagem de creatinina sérica acima de 1,5 mg/dl, história de hipertensão arterial e acidente vascular cerebral como causa do óbito..

(28) 18. O doador falecido foi heparinizado antes do clampeamento da aorta. Através de uma cânula colocada na aorta distal, os rins foram mantidos resfriados por um fluxo in situ de solução da Universidade de Wisconsin de preservação intracelular. Após a remoção dos órgãos torácicos e do abdômen superior, a aorta e a veia cava acima dos rins foram então seccionadas e ambos os rins foram removidos em bloco e colocados em solução gelada salina. As artérias renais foram re-perfundidas com 250 ml de solução de preservação de Euro-Collins e heparina 2 ml e os rins foram armazenados com essa mesma solução gelada.. Os dados dos receptores foram obtidos pelo pesquisador através de entrevista com o paciente e consulta aos dados da Secretaria do Estado da Saúde – Sistema Estadual de Transplantes. Os receptores do transplante de rim de doador falecido foram estudados quanto as suas características préoperatórias de idade em anos; sexo, raça, categorizada em negra, branca e amarela, índice de massa corpórea (IMC) em kg/m², doença causadora de insuficiência renal terminal, número de comorbidades, definidas como doença com necessidade de tratamento específico, como hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus, doença pulmonar obstrutiva crônica, insuficiência coronariana, lúpus sistêmico, artrite reumatóide, hepatopatia, litíase renal, osteoporose, alcoolismo, tabagismo e politransfusão sanguínea, exceto a doença causadora da insuficiência renal terminal, priorização para transplante renal, diurese pré-operatória, painel de anticorpos HLA classe I ou II mais recente, categorizado em 0 %, 1 a 50 % e > 50 %, número de.

(29) 19. incompatibilidade HLA A, B, DR, presença de HLA DR idêntico e tempo de isquemia fria, avaliada em horas desde a perfusão do enxerto com solução de preservação gelada até perfusão do enxerto pelo sangue do receptor.. Todos. os. pacientes. receberam. no. pré-operatório. imediato. metilprednisolona 500 mg, dissolvido em 250 ml de solução glicosada a 5%62. Todos os receptores tiveram a imunossupressão iniciada com anticorpo policlonal Thymoglobulin® (Genzyme Transplant Cambridge, MA, USA) dose máxima de 6mg/kg intravenoso divididos em 5 a 10 dias ou com anticorpos bloqueadores de receptores de interleucina 2 basiliximab – Simulect® (Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJ, USA) 20 mg intravenoso 2 h antes do transplante e repetido após 4 dias ou daclizumab – Zenapax® (Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, NJ, USA) 2 mg/kg intravenoso iniciado na indução anestésica e repetido 1mg/kg no 7º pósoperatório. No grupo controle, 22% (8/36) dos receptores foram induzidos com ATG, 61% (22/36) com basiliximab, 17% (6/36) com daclizumab. No grupo tratado com N-acetilcisteína, 23% (9/38) dos receptores foram induzidos com ATG, 61% (23/38) com basiliximab e 16% (6/38) com daclizumab.. O enxerto foi transplantado na fossa ilíaca por acesso retroperitoneal. A veia renal foi anastomosada na veia ilíaca externa, de modo término-lateral, com sutura contínua de polipropileno 5-0. A artéria renal foi anastomosada na artéria ilíaca externa, de modo término-lateral, com sutura contínua ou.

(30) 20. pontos separados de polipropileno 6-0. Imediatamente antes do término das anastomoses arteriais, o receptor recebeu furosemida 1mg/Kg e 250 ml de manitol 20%. Após a reperfusão do rim, o ureter foi implantado na bexiga por técnica extravesical com sutura contínua de polidioxanona 5-0, sem o uso de cateter ureteral.. A manutenção da imunossupressão foi feita baseada no regime de três drogas. No grupo de tratamento com N-acetilcisteína todos os pacientes receberam tacrolimo (0,2 mg/kg via oral duas vezes ao dia, ajustado para atingir um nível de 10 a 15 ng/ml no primeiro mês e 5 a 8 ng/ml após), micofenolato de mofetila (1 g via oral duas vezes ao dia) ou micofenolato de sódio (720 mg via oral duas vezes ao dia) e prednisona (1 mg/kg via oral por dia e ajustado semanalmente ate atingir a dose mínima de 0,1 mg/kg ao final do segundo mês). No grupo controle todos os pacientes, exceto três, seguiram esse mesmo regime. Nestes três pacientes, foi administrado ciclosporina Neoral® (Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJ, USA) na dose de 8 mg/kg via oral, divididos em duas vezes por dia, para atingir um pico de C2 de 1200 a 1400 ng/ml e sirolimo - Rapamycin® (A.G. Scientific, Inc., SanDiego, USA) 6 mg em dose de ataque em um dia e a seguir, 2 mg/d, mantendo nível sanguíneo de 10 ng/ml, na substituição do tacrolimo e do micofenolato. No grupo controle, a manutenção da imunossupressão dos receptores foi feita com ciclosporina, sirolimo e prednisona em 8% (3/36), micofenolato de mofetila, tacrolimo e prednisona em 50% (18/36) e micofenolato de sódio, tacrolimo e prednisona em 42% (15/36). No grupo tratado com N-.

(31) 21. acetilcisteína, a manutenção foi feita com tacrolimo, micofenolato de mofetila e prednisona em 95% (36/38) e tacrolimo, micofenolato de sódio e prednisona em 5% (2/38).. Foram estudados as características clínicas dos doadores, as características clínicas dos receptores, o estresse oxidativo, os episódios de rejeição aguda e a função renal pós-operatória.. O estresse oxidativo foi medido pelas taxas de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS)56. A dosagem de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico foi realizada utilizando a seguinte maneira: em 1 ml de plasma. diluído foi acrescentado. 1. ml ácido. tricloroacético. (Acido. Tricloroacético 99% PA ACS Sigma®) a 17,5%, colocando-se em gelo. A seguir foi adicionado 1 ml do ácido tiobarbitúrico numa concentração de 0,6%, pH 2. O homogenato foi colocado em banho de água fervente por 15 minutos e em seguida foi adicionado 1 ml de tricloroacético a 70% à mistura e incubado por 20 minutos. As amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 2000 RPM e a densidade óptica do sobrenadante foi lida num comprimento. de. onda. 534. nm. contra. um. blank,. utilizando-se. espectrofotômetro. A quantidade de TBARS foi calculada utilizando-se coeficiente de extinção 1,56X105 mol/cm. O conteúdo de TBARS foi expresso em nanomoles de TBARS por ml. A avaliação dos resultados foi feita pela curva das médias de TBARS do pré-operatório e diariamente até o sétimo dia de pós-operatório..

(32) 22. A insuficiência renal persistente após o transplante é denominada função retardada do enxerto. No presente estudo definimos função retardada do enxerto como a necessidade de diálise na primeira semana após o transplante63. A função renal foi avaliada através da medida da concentração de creatinina sérica, da depuração de creatinina calculada pela fórmula de Cockroft-Gault64 no 7º, 15º, 30º, 60º e 90º dias de período pós-operatório e a curva de número de dias em que os pacientes permaneceram em diálise no pós-operatório, denominada curva de pacientes livres de diálise. A rejeição aguda foi diagnosticada através de biópsia do enxerto65,. 66. . Não foram. realizadas biópsias protocolares. A biópsia do enxerto foi realizada em caso de anúria até o 15º pós-operatório em pacientes com ultrassom Doppler do enxerto. demonstrando. ausência. de. complicações. cirúrgicas. como. hidronefrose, estenose ou trombose vascular67. A biópsia do enxerto também foi realizada em caso de suspeita clínica por elevação da concentração de creatinina sérica em até 30 dias do transplante renal. A sobrevida do enxerto e a sobrevida do paciente foram avaliadas levando-se em conta que perda do enxerto foi considerada a evolução do paciente para diálise definitiva e que o óbito do paciente com enxerto funcionante não foi considerado perda de enxerto.. Os dados obtidos foram organizados e tabulados em planilhas com auxílio do programa Excel em Windows XP (Microsoft Corporation®, Califórnia, EUA). As análises estatísticas foram feitas com o programa SPSS® versão.

(33) 23. 16.0 (SPSS® Inc; Ilinois, EUA). Os dados foram relatados como média ± desvio padrão. Variáveis categóricas foram analisadas com teste exato de Fisher e teste Qui-quadrado. Variáveis não pareadas foram analisadas com teste t não pareado e teste não-paramétrico de Mann-Whitney. Foi ajustado um modelo de análise de variância (ANOVA) com medida repetida com auxílio do software SAS® para análise das medidas repetidas de TBARS, creatinina e depuração de creatinina ao longo do tempo. A estimativa de Kaplan-Meier foi utilizada para construção de curvas de pacientes livres de diálise ao longo do tempo e a análise estatística utilizada para comparar os grupos foi o teste de log rank (Mantel-Cox). O valor p < 0,05 foi considerado significante..

(34) 24. 5. RESULTADOS.

(35) 25. 5. RESULTADOS As características clínicas dos doadores que foram estudadas estão resumidas na Tabela 1. Não se observou diferença significativa entre as características dos doadores do grupo controle e naquele tratado com Nacetilcisteína (NAC).. Tabela 1 – Características clínicas dos doadores falecidos dos grupos controle e do que recebeu N-acetilcisteína (NAC). Características Sexo (%, Masculino). Controle (n=36) NAC (n=38). p. 55,6. 44,7. 0,352. 23/7/6/0. 24/8/5/1. 0,771. Idade (anos, média ± DP). 50,2 ± 11,5. 49,2 ± 11,1. 0,698. IMC (Kg/m², média ± DP). 25,7 ± 3,2. 26,4 ± 3,2. 0,341. 36,1. 34,2. 0,864. 7,6 ± 6,0. 5,5 ± 4,7. 0,118. Diabetes mellitus (%). 5,6. 10,5. 0,661. Hipertensão arterial sistêmica (%). 38,9. 39,5. 0,959. 1,4 ± 0,7. 1,4 ± 0,9. 0,976. Raça (Branco/Pardo/Negro/Amarelo). Critério expandido (%) Dias de UTI (n, média ±DP). Creatinina (mg/dl, média ± DP). Os receptores dos grupos controle (n = 36) e NAC (n = 38) apresentaram características clínicas similares. Os grupos controle e NAC também não foram diferentes do ponto de vista imunológico, analisado por painel de reatividade de anticorpos (PRA) e número de incompatibilidade de HLA A, B, DR (Tabela 2)..

(36) 26. Tabela 2 - Características clínicas dos receptores de transplante renal dos grupos controle e do que recebeu N-acetilcisteína (NAC). Características Sexo (Masculino, %). Controle (n=36) NAC (n=38). p. 55,6. 34,2. 0,065. 18/17/1. 23/11/4. 0,162. Idade (anos, média ± DP). 48,8 ± 11,1. 50,7 ± 11,8. 0,479. IMC (Kg/m², média ± DP). 25,1 ± 4,4. 25,3 ± 4,7. 0,825. Raça (Branco/Negro/Amarelo). Causa de insuficiência renal (%). 0,163. Nefroesclerose. 50,0. 42,1. Nefropatia diabética. 19,4. 15,8. Glomerulonefrite crônica. 16,7. 5,3. Doença renal policística. 5,6. 18,4. Outras. 8,3. 18,4. 2,0 ± 1,1. 2,2 ± 1,1. 0,281. Diurese pré-operatória (%). 61,1. 39,5. 0,063. Priorização (%). 11,1. 23,7. 0,155. Comorbidades (média ± DP). PRA (%). 0,608. 0%. 66,7. 76,3. 1-50%. 19,4. 15,8. >50%. 13,9. 7,9. 3,3 ± 1,4. 2,9 ± 1,4. 0,280. 50,0. 44,7. 0,583. 22,8 ± 7,5. 25,1 ± 5,4. 0,130. Incompatibilidade HLA (média ± DP) DR idêntico (%) Isquemia fria (h, média ± DP). A medida do estresse oxidativo através da curva das médias de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) revelou valores significativamente menores para o grupo NAC quando comparados ao controle (Figura 3). De acordo com a Figura 3, pode-se observar que os dois grupos no momento pré-transplante apresentam média de TBARS semelhante. A partir do instante 3º PO os grupos passam a apresentar.

(37) 27. comportamento distinto. No grupo NAC ocorre um decréscimo na média de TBARS, observado até o 7º PO. Já o grupo controle apresenta um acréscimo na média de TBARS, observado até o 7º PO. Foi ajustado um modelo de análise de variância (ANOVA) com medida repetida com auxílio do software SAS® que demonstrou um efeito estatisticamente significativo da interação entre grupo e tempo (p < 0,001). Ou seja, os dois grupos não apresentaram comportamento semelhante de TBARS ao longo do tempo. Como houve efeito significativo da interação entre grupo e tempo prosseguiu-se a análise através da construção de contrastes que permitissem avaliar onde se encontram as diferenças entre os dois grupos ao longo do tempo.. 6. Controle. ANOVA P < 0,001. 5 4 TBARS (nmol/ml). 3. N-acetilcisteína. 2 1 0 Pré. 1º PO. 2º PO. 3º PO. 4º PO. 5º PO. 6º PO. 7º PO. Figura 3 – Média ± erro padrão de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) em receptores de transplante renal nos grupos controle e no que recebeu N-acetilcisteína..

(38) 28. A Tabela 3 apresenta as médias de TBARS em cada um dos instantes de avaliação de acordo com o grupo. Verifica-se que em ambos os grupos houve efeito significativo de tempo (p < 0,001). Ou seja, a variação na média de TBARS observada na Figura 3 mostrou-se significativa do ponto de vista estatístico. O poder do estudo na análise do TBARS foi de 0,975.. Tabela 3 - Média ± desvio padrão de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) nos 7 primeiros dias após o transplante, nos grupos controle e no que recebeu N-acetilcisteína.. Controle (nmol/ml) NAC (nmol/ml) p. pré. 1º PO. 2º PO. 3º PO. 4º PO. 5º PO. 6º PO. 7º PO. p. 3,8±1,0. 3,9±1,1. 4,4±1,2. 4,9±1,5. 5,0±1,6. 5,2±1,5. 5,1±1,6. 5,4±1,8. <0,001. 3,8±1,4. 3,4±1,4. 3,8±1,5. 4,2±1,4. 4,0±1,7. 3,7±1,5. 3,6±1,5. 3,2±1,3. 0,003. 0,916. 0,079. 0,105. 0,014. 0,012. <0,001. <0,001. <0,001. Não houve diferença significativa quanto à proporção de pacientes que evoluíram com função retardada do enxerto em ambos os grupos (p = 0,084). O grupo controle apresentou uma função retardada do enxerto em 83,3 % dos pacientes (30/36) e o grupo tratado com NAC em 65,8 % dos pacientes (25/38). Entretanto, ao longo de todo o acompanhamento, o grupo controle apresentou média de creatinina maior do que a apresentada pelo grupo.

(39) 29. tratado com NAC (Figura 4). Em ambos os grupos observa-se que do 7º PO ao 30º PO ocorre um decréscimo na média de creatinina. Do 30º PO ao 90º PO observa-se que para o grupo NAC não parece ocorrer variação na média de creatinina. Já para o grupo controle ainda se observa um decréscimo na média de creatinina do 30º PO para o 60º PO, entretanto a média de creatinina do grupo controle ainda é maior do que a do grupo NAC. Foi ajustado um modelo de análise de variância (ANOVA) com medida repetida para avaliar se a creatinina diferencia estatisticamente os dois grupos ao longo do tempo. De acordo com esse ajuste observou-se efeito estatisticamente significante da interação entre grupo e tempo (p = 0,026), ou seja, os dois grupos não apresentaram o mesmo comportamento de creatinina ao longo do tempo.. Figura 4 - Média + erro padrão da creatinina ao longo do tempo nos grupos controle e no que recebeu N-acetilcisteína..

(40) 30. A Tabela 4 apresenta os valores médios de creatinina em cada um dos instantes de avaliação de acordo com o grupo de onde se pode observar que em ambos ocorreu efeito estatisticamente significativo do tempo (p < 0,001), ou seja, a variação observada na média de creatinina da Figura 4 foi significativa do ponto de vista estatístico. Observa-se na Tabela 4 que os dois grupos não se diferenciam em termos de média de creatinina no 7º PO (p = 0,087). A partir do 15º PO o grupo controle apresentou média de creatinina estatisticamente maior do que a apresentada pelo grupo NAC (p < 0,05).. Tabela 4 - Média ± desvio padrão de creatinina ao longo do acompanhamento nos grupos controle e no que recebeu N-acetilcisteína.. Controle (n) (mg/dl) NAC (n) (mg/dl) p. 7º PO. 15º PO. 30º PO. 60º PO. 90º PO. p. 5,6±3,3 (10). 3,2±1,8 (24). 3,0±2,4 (30). 2,2±1,4 (34). 1,9±0,6 (34). <0,001. 5,4±4,0 (21). 2,4±1,4 (28). 1,7±0,6 (37). 1,6±0,7 (38). 1,4±0,5 (36). <0,001. 0,087. 0,004. 0,001. 0,023. 0,004. De acordo com a Figura 5, observa-se que ao longo de todo o acompanhamento o grupo NAC apresentou média de depuração de creatinina maior do que a apresentada pelo grupo controle. No grupo NAC observa-se um acréscimo na média de depuração de creatinina ao longo de todo o período estudado. No intervalo do 30º PO para o 90º PO, este acréscimo foi menor do que o observado até o 30º PO. Para o grupo controle observa-se um acréscimo na média do 7º PO até o 60º PO. Não houve variação na média do 60º PO para o 90º PO..

(41) 31. Foi ajustado um modelo de análise de variância (ANOVA) com medida repetida para avaliar se a depuração de creatinina diferencia estatisticamente os dois grupos ao longo do tempo. De acordo com esse ajuste, observou-se que o grupo com N-acetilcisteína apresentou depuração de creatinina estatisticamente maior do que a apresentada pelo grupo controle (p = 0,029). Além disso, foi observado efeito estatisticamente significante de tempo (p < 0,001).. Figura 5 - Média ± erro padrão de depuração de creatinina calculado de receptores de transplante renal dos grupos controle e do que recebeu Nacetilcisteína.. A Tabela 5 apresenta os valores médios de depuração de creatinina em cada um dos instantes de avaliação de acordo com o grupo. Observa-se.

(42) 32. que em ambos os grupos ocorreu efeito estatisticamente significativo do tempo (p < 0,001). Também se observa na Tabela 5 que os dois grupos não se diferenciam em termos de média de depuração de creatinina no 7º PO (p = 0,554) e no 60º PO (p = 0,221). No 15º PO, no 30º PO e no 90º PO observou-se que o grupo NAC apresentou média estatisticamente maior do que a apresentada pelo grupo controle (p = 0,028, p = 0,037 e p = 0,048, respectivamente).. Tabela 5 - Média ± desvio padrão de depuração de creatinina ao longo do acompanhamento nos grupos controle e no que recebeu N-acetilcisteína (NAC).. Controle(n) (ml/min/1,73m2) NAC(n) (ml/min/1,73m2) p. 7º PO. 15º PO. 30º PO. 60º PO. 90º PO. p. 21,3±15,2 (10). 30,0±17,6 (24). 36,8±19,4 (30). 44,0±19,4 (34). 44,9±14,4 (34). <0,001. 23,7±15,2 (21). 37,7±17,7 (28). 44,8±15,4 (37). 49,6±19,4 (38). 54,6±20,0 (36). <0,001. 0,554. 0,028. 0,037. 0,221. 0,048. A comparação com teste de log rank (Mantel-Cox) entre as curvas da estimativa de Kaplan-Meier de pacientes livres de diálise dos grupos mostrou que os pacientes tratados com NAC necessitaram de diálise por um tempo menor (p = 0,008) (Figura 6). A mediana e o intervalo de confiança (95 %) da estimativa de Kaplan-Meier dos grupos controle e N-acetilcisteína para dias em diálise dos pacientes foram de 13 [10,8 – 15,2] e 3 [0,6 – 5,4], respectivamente..

(43) Log-rank p = 0,008. 20. 40. 60. 80. Controle NAC. 0. Pacientes em diálise (%). 100. 33. 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Dias Figura 6 – Estimativa de Kaplan-Meier de pacientes livres de diálise ao longo do tempo para receptores de transplante renal dos grupos controle e do que recebeu N-acetilcisteína.. No grupo controle, 28 pacientes foram submetidos a biópsias e foram diagnosticados cinco episódios de rejeição celular aguda, dois de rejeição humoral aguda, 16 casos de necrose tubular aguda, um de toxicidade por ciclosporina, um de toxicidade por tacrolimo, um de arterioloesclerose hialina e dois de glomeruloesclerose segmentar e focal. No grupo NAC, 24 pacientes foram submetidos a biópsias com três diagnósticos de rejeição celular aguda e vinte e um de necrose tubular aguda. Houve duas perdas de enxerto no período de 90 dias. Ambas ocorreram no grupo controle e uma.

(44) 34. com diagnóstico de rejeição celular aguda comprovada por biópsia em até 30 dias do transplante. A proporção de rejeição aguda comprovada por biópsia em até 30 dias após o transplante foi menor no grupo tratado com NAC (3/38 7,9%) quando comparado ao grupo controle (7/36 19,4%), embora estatisticamente não significativa (p = 0,203). Não houve diferenças quanto às proporções de sobrevida do enxerto (p = 0,610) e mortalidade (p = 1,000). A sobrevida do enxerto no grupo controle foi de 94,4 % (34/36) e no grupo NAC foi de 97,4 % (37/38). A mortalidade no grupo controle foi de 5,6 % (2/36) e de 5,3 % (2/38) no grupo NAC..

(45) 35. 6. DISCUSSÃO.

(46) 36. 6. DISCUSSÃO. O estudo da intervenção com antioxidante em transplante de rim com doador falecido é importante, pois é uma nova possibilidade terapêutica em um grupo de pacientes que experimentam sofrimento físico e psicológico. Mesmo após o transplante, esses pacientes ainda têm menor sobrevida do enxerto do que pacientes submetidos a transplante de rim com doador vivo. Isso demonstra o valor intrínseco desta pesquisa, bem como um novo roteiro de estudos e descobertas que permitam melhorar a abordagem terapêutica destes doentes e sua qualidade de vida. Este é um estudo prospectivo randomizado controlado. O placebo não foi utilizado, pois as avaliações através da dosagem sérica de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico e creatinina, rejeição aguda, sobrevida do enxerto e mortalidade eram todas de caráter objetivo, o receptor de rim de doador falecido faz uso de inúmeras medicações no pós-operatório e o pesquisador não tinha qualquer influência sobre os dados pesquisados. Foram incluídos no estudo 84 pacientes com idade acima de 18 anos e listados para receptor de rim de doador falecido no HCFMUSP como primeiro transplante. Dessa forma, o grupo estudado tinha um número grande de participantes e era homogêneo, permitindo a comparação de resultados. No entanto, dez pacientes foram excluídos do estudo. Cinco pacientes permaneceram na unidade de terapia intensiva no pós-operatório, um paciente recebeu enxerto perfundido por máquina pulsátil e quatro pacientes foram submetidos à re-operação no período de sete dias de pósoperatório. A permanência na unidade de terapia intensiva poderia.

(47) 37. desequilibrar um dos grupos com pacientes mais graves e com maior estresse oxidativo, além dos pacientes estarem sem condições clínicas para ingerir a droga avaliada. O uso de máquina de perfusão pulsátil poderia alterar os resultados, pois também está sendo investigada para melhorar os resultados do transplante de doador falecido68. Os pacientes submetidos à re-operação permaneceram um período em jejum sem possibilidade de ingerir a droga avaliada e também poderiam apresentar uma evolução desfavorável por motivos técnicos cirúrgicos. A obtenção dos dados dos doadores seguiu um formulário previamente padronizado. Isso favoreceu a uniformidade dos dados. Adicionalmente, os doadores falecidos foram alocados em duas categorias. Doador de critério não expandido e de critério expandido. A sobrevida do enxerto se correlaciona diretamente com a melhor qualidade do rim doado69, que foi equivalente nos dois grupos. A taxa de sobrevida do enxerto proveniente de doador falecido é influenciada pela causa de óbito do doador e pela história de comorbidades, como hipertensão e diabetes9. Dados demonstram que rins de vítimas de acidente vascular cerebral apresentam menor sobrevida de enxerto em 1 ano comparado à taxa dos demais doadores (79 % versus 84 %)70. A taxa de sobrevida do enxerto em 3 meses neste trabalho foi de 94,4 % para o grupo controle e 97,4 % para o grupo N-acetilcisteína (p = 0,610), mesmo com uma expressiva proporção de doadores de critério expandido de 36,1 % no grupo controle e de 34,2 % no grupo Nacetilcisteína (p = 0,864). Os dados analisados dos receptores foram aqueles com impacto em função retardada do enxerto, rejeição aguda e função do enxerto. Os grupos.

(48) 38. se mostraram similares previamente a intervenção com N-acetilcisteína, tornando mais claros os efeitos da intervenção. Anticorpos contra antígenos HLA classe I (A, B, C) ou classe II (DR, DQ) são encontrados em pacientes previamente expostos a essas glicoproteínas na gestação, por transfusão sanguínea, ou em transplante prévio. Pacientes muito sensibilizados apresentam diminuição da chance estatística de serem transplantados devido à maior probabilidade de prova cruzada positiva. A sensibilização a antígenos, mensurado pelo painel de reatividade de anticorpos, aumenta progressivamente o risco de perda do enxerto71. Um maior grau de incompatibilidade HLA é associado a um maior risco de perda crônica de enxerto. O número de incompatibilidades HLA foi similar entre o grupo controle e N-acetilcisteína (3,3 ± 1,4 e 2,9 ± 1,4 p = 0,280, respectivamente). O painel de reatividade de anticorpos também foi similar entre o grupo controle e N-acetilcisteína (p = 0,608). Há maior impacto na incompatibilidade dos antígenos DR quando comparado aos demais antígenos do sistema HLA72. Em nosso estudo, a proporção de pacientes com DR idêntico foi equivalente entre os grupos (50,0% controle e 44,7% N-acetilcisteína, p = 0,583). Quando o órgão é distribuído baseado na compatibilidade HLA, uma preocupação é o efeito do tempo de isquemia fria na sobrevida tardia do enxerto73. Quando o enxerto é exposto a mais de 36 horas de tempo de isquemia fria, o benefício da compatibilidade HLA não é verificado74. Por outro lado, a melhora dos regimes de imunossupressão parece. ter. causado. uma. diminuição. progressiva. do. impacto. da. incompatibilidade HLA na sobrevida do enxerto75. O efeito prejudicial do prolongamento do tempo de isquemia fria é.

(49) 39. evidente em receptores de enxertos com incompatibilidade HLA. Há uma redução progressiva de 1 % a 2 % na sobrevida do enxerto associada com o incremento de 12 horas no tempo de isquemia fria76. O tempo de isquemia fria foi elevado em nosso estudo e equivalente entre os grupos controle e Nacetilcisteína (respectivamente 22,8 ± 7,5 h e 25,1 ± 5,4 h, p = 0,130), o que pode ter contribuído para as altas taxas de função retardada do enxerto. A indução da imunossupressão significativamente reduz os episódios de rejeição aguda62,. 77. . A indução da imunossupressão é utilizada em. pacientes de alto risco para rejeição aguda como indivíduos da raça negra, tempo de isquemia fria prolongada maior que 24 horas e pacientes sensibilizados78,. 79. . Todos os nossos receptores receberam indução de. imunossupressão. A manutenção da imunossupressão é fundamental na prevenção da rejeição aguda e perda do enxerto. A terapia de manutenção ótima ainda não está estabelecida21. Os principais agentes de imunossupressão são corticosteróides, micofenolato mofetil, micofenolato de sódio, ciclosporina, tacrolimo e sirolimo. Nos Estados Unidos da América, os agentes mais utilizados na alta hospitalar são: corticosteróides (74 %), tacrolimo (79 %), ciclosporina (15 %), micofenolato (87 %) e sirolimo (9 %). Os esquemas convencionais de manutenção de imunossupressão consistem em uma combinação de agentes com diferentes mecanismos de ação. Essa estratégia minimiza morbidade e mortalidade associada a cada classe de agentes enquanto maximiza a efetividade geral. Assim como a maioria dos centros transplantadores, utilizamos um regime de terapia tripla consistindo em inibidor de calcineurina (tacrolimo ou ciclosporina), um antimetabólito.

(50) 40. (micofenolato de mofetila) e corticóide (prednisona). Nossos receptores utilizaram predominantemente o esquema triplo com tacrolimo, micofenolato e prednisona, exceto três pacientes do grupo controle que receberam ciclosporina e sirolimo em substituição ao tacrolimo e micofenolato. A maior parte das evidências aponta para uma menor taxa de rejeição aguda em pacientes que recebem tacrolimo ao invés de ciclosporina80, mas no presente estudo nenhum dos três pacientes que recebeu ciclosporina apresentou rejeição aguda. O esquema de manutenção de imunossupressão com três drogas é geralmente associado a uma taxa de rejeição aguda de 20 %81-83. De fato, observamos uma taxa de rejeição aguda de 19,4 % em nosso grupo controle, que foi maior que a taxa de 7,9 % do grupo tratado com N-acetilcisteína, mas não foi estatisticamente significante (p = 0,203). O estado inflamatório dos pacientes renais crônicos tem um papel bem definido na causa do estresse oxidativo. O estresse oxidativo é aumentado em transplantados renais, embora reduzido em comparação a renais crônicos. Há uma coexistência de estado inflamatório sistêmico e elevado estresse oxidativo em transplantados renais84. A inflamação sistêmica pré-transplante, manifestada por nível elevado de proteína C reativa prediz de modo independente o risco de rejeição aguda após o transplante renal e pode ser usada para a estratificação de risco e individualização da imunossupressão85. O estado inflamatório também é um fator de risco para função retardada do enxerto86. Terapias para minimizar os efeitos prejudiciais da isquemia e reperfusão têm sido investigadas87. O uso de albumina intra-operatória em transplante de doador falecido reduz a incidência de função retardada do.

(51) 41. enxerto88. Adicionalmente, albumina intra-operatória em altas doses (1,2 – 1,6 g/kg peso) aumenta a diurese imediata pós-operatória e diminui a creatinina em 7 dias após o transplante em comparação com baixas doses (0 – 0,4 g/kg de peso). As doses intermediárias de albumina intra-operatória apresentam efeitos intermediários, sugerindo uma relação linear88. A administração de albumina intra-operatória em altas doses causa uma expansão do volume intravascular, minimizando a lesão por hipóxia. Outros efeitos da albumina não relacionados ao volume intravascular também podem existir, uma vez que colóides sintéticos não produzem esse mesmo efeito89. Os receptores do nosso estudo receberam albumina endovenosa em altas doses durante o intra-operatório (1,0 g/kg peso). O manitol é um diurético osmótico. Esse diurético é administrado antes do desclampeamento dos vasos durante a cirurgia de transplante renal de doador falecido e é associado com a diminuição de necrose tubular aguda90. Os efeitos benéficos postulados do manitol incluem incremento do volume intravascular com a melhora da pré-carga e débito cardíaco, aumento do fluxo sanguíneo renal secundário a liberação de peptídeo atrial natriurético e prostanóides intrarenais vasodilatadores, aumentando o debito urinário, facilitando a lavagem de detritos dos túbulos renais e diminuindo o edema celular endotelial, o que promove um melhor fluxo sanguíneo intrarenal91. Manitol também é um antioxidante, com efeitos que possivelmente atenuam a lesão pela reperfusão renal92. Todos os pacientes de nosso estudo receberam 250 ml de manitol a 20% antes do desclampeamento dos vasos. Os pacientes transplantados de rim estão sujeitos a lesão por radicais livres, pois apresentam um maior estresse oxidativo, evidenciado por maior.

(52) 42. concentração de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS), quando comparados a controles normais12. Não há a influência de regimes de imunossupressão, duração do transplante, ou concentração de creatinina na concentração de TBARS destes pacientes12. No presente estudo optamos por investigar a ação do antioxidante Nacetilcisteína na função renal precoce de receptores de rim de doador falecido. A N-acetilcisteína foi administrada durante a primeira semana após o transplante, pois outros autores sugeriram que a atenuação de estresse oxidativo gerado no período perioperatório pode prevenir a peroxidação lipídica e vasculopatia93. N-acetilcisteína é um antioxidante bastante estudado e com baixa incidência de efeitos colaterais94,. 95. . Não são. conhecidos efeitos colaterais clinicamente significantes em administração oral de N-acetilcisteína em dose de até 8000 mg/dia96. Recentemente, Hoffmann e colaboradores, sugeriram que. a N-acetilcisteína pudesse. promover uma alteração da creatinina sérica sem afetar a taxa de filtração glomerular97. No entanto, evidências demonstraram que a N-acetilcisteína em dose de até 2400 mg/d não altera creatinina sérica ou dosagem de cistatina C15, 98-100. Nosso estudo apresenta um longo tempo de observação após a administração da N-acetilcisteína, que evidencia os efeitos sustentados da droga no enxerto renal de doador falecido. A via de administração de N-acetilcisteína escolhida foi a via oral pois a via endovenosa não faz a primeira passagem metabólica no fígado e rins, levando a menor produção de glutationa14 e a administração endovenosa de N-acetilcisteína pode provocar reação anafilática101. A administração oral de N-acetilcisteína é rapidamente absorvida no estômago e levada ao fígado.

(53) 43. pela via portal onde é convertida em cisteína102. O fígado incorpora a cisteína em glutationa que é secretada na circulação103, 104. O uso de N-acetilcisteína em transplantes tem sido investigado para diminuir os efeitos prejudiciais da isquemia e reperfusão. O suplemento de N-acetilcisteína em solução de perfusão para enxerto hepático de doador falecido provou ter a melhor preservação de viabilidade celular, capacidade funcional, nível de glutationa e glicogênio105. Em nosso estudo, a administração de N-acetilcisteína em receptores de transplante renal de doador falecido preveniu o aumento do estresse oxidativo, medido por TBARS sérico. O poder do estudo na análise do TBARS foi de 0,975. Isso significa que a probabilidade de rejeitar a hipótese nula quando ela é falsa é de 97,5%, ou em outras palavras, o estudo tem uma probabilidade de 97,5% de detectar uma diferença quando ela existe. A partir do 3º PO até o 7º PO há uma diferença do comportamento do TBARS médio entre o grupo controle e o grupo NAC. No grupo tratado houve uma redução do estresse oxidativo em comparação com o grupo controle (p < 0,001), o que pode explicar uma evolução melhor do enxerto neste grupo quanto à função renal precoce. A presença de função retardada do enxerto tem um efeito adverso sobre sua sobrevida precoce e tardia. Quiroga e colaboradores revelaram ser a função retardada do enxerto o principal fator de perda do enxerto em um ano106. A causa mais comum de disfunção precoce do enxerto é necrose tubular aguda pós-isquêmica107. A incidência aumenta com o aumento do tempo de isquemia fria maior que 24 horas, idade avançada do doador e preservação do enxerto em solução de Euro-Collins108,. 109. . No presente.

(54) 44. estudo a taxa de função retardada do enxerto foi elevada63: 65,8 % para o grupo N-acetilcisteína e 83,3 % para o grupo controle (p = 0,084), embora compatível com as condições do enxerto com idade média elevada dos doadores (50,2 ± 11,5 vs. 49,2 ± 11,1, respectivamente para o grupo Nacetilcisteína e o grupo controle p = 0,698) e prolongado tempo médio de isquemia fria em horas (22,8 ± 7,5 vs. 25,1 ± 5,4, p = 0,130, respectivamente para grupo controle e N-acetilcisteína). Pacientes com história de episódios de rejeição aguda são mais propensos a perda tardia do enxerto110, 111. Apesar da taxa de rejeição aguda ter diminuído com os anos, não houve um aumento na sobrevida do enxerto compatível62,. 112. . Isso nos leva a crer que outros fatores podem estar. envolvidos, como a produção de radicais livres no processo de isquemia e reperfusão. A redução, embora não estatisticamente significativa, dos episódios de rejeição aguda no grupo tratado com N-acetilcisteína (7,9 % vs. 19,4 %, p = 0,203) pode ser um indicativo que a diminuição do estresse oxidativo e dos mecanismos inflamatórios interfere nos mecanismos imunológicos que levam a rejeição aguda. A N-acetilcisteína pode atenuar o processo inflamatório vascular através do antagonismo dos efeitos intracelulares da geração de radicais livres, pelo aumento do óxido nítrico biodisponível e pela redução da adesão leucocitária ao endotélio42. Estudos de modelo de lesão renal por isquemia e reperfusão demonstram a ação da N-acetilcisteína na inibição de moléculas de adesão, como VCAM-1 e ICAM-1 e na redução da inflamação intersticial. Esses efeitos são associados ao aumento de glutationa renal, sugerindo que.