Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia – CDTec
Dissertação
Desenvolvimento de vacina recombinante contra a leptospirose: produção e avaliação do potencial imunoprotetor de quatro lipoproteínas
Ivânia Deliberalli
Ivânia Deliberalli
Desenvolvimento de vacina recombinante contra a leptospirose:
produção e avaliação do potencial imunoprotetor de quatro lipoproteínas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Centro de Desenvolvimento Tecnológico da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Éverton Fagonde da Silva Co-Orientadora: Dra. Flávia Aleixo Vasconcellos
Dados de catalogação na fonte:
Maria Beatriz Vaghetti Vieira – CRB-10/1032 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
D353d Deliberalli, Ivânia
Desenvolvimento de vacina recombinante contra a
leptospirose: produção e avaliação do potencial imunoprotetor de quatro lipoproteínas / Ivânia Deliberalli. – 70f. : Il. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2014. – Orientador Éverton Fagonde da Silva.
1.Biotecnologia. 2. Vacina recombinante. 3.
Leptospirose. 4.Lipoproteínas. 5.Resposta humoral. I.Silva, Éverton Fagonde da. II. Título.
Banca examinadora
Prof. Dr. Éverton Fagonde da Silva - Presidente Prof. Dr. Geferson Fischer
Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin Dr. Samuel Rodrigues Félix
Aos meus pais pelo exemplo de caráter, força e amor dedicados à minha formação e pelo incentivo de uma vida inteira. À minha irmã Suelen, por toda cumplicidade e apoio incondicional. .
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Pelotas e ao Núcleo de Biotecnologia do CDTec, pela oportunidade de realizar um curso de pós - graduação de qualidade, do qual me orgulho de ter feito parte e à CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado.
Ao meu orientador Prof. Dr. Éverton Fagonde da Silva, pela oportunidade e confiança no desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus pais e à minha irmã Suelen pelos laços de amor e respeito construídos durante toda a vida, por estarem do meu lado nos momentos de alegria e tristeza, vibrando com minhas vitórias e me consolando nas derrotas, sempre com palavras de apoio. Meu mais sincero muito obrigada!
Ao Wallace, por todo o amor, carinho, dedicação, incentivo e paciência. Por ter sido muito mais do que um namorado, por ter sido meu amigo, companheiro e colega de profissão, por acreditar em mim sempre antes de tudo. Muito obrigada!
À minha primeira orientadora Profa. Dra. Dulce por toda a dedicação, por acreditar em mim sempre e me apoiar diante de todas as dificuldades, pela amizade construída ao longo de quatro anos de trabalho e pelo exemplo para uma vida inteira. Muito Obrigada por tudo, Du!
Ao Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin por manter sempre as portas abertas para novas ideias e por acreditar no potencial individual de cada um.
Ao Prof. Dr. Alan McBride, pela confiança e incentivo sempre, mas principalmente pela amizade construída ao longo desses dois anos.
A todos os amigos e colegas especiais do laboratório de Vacinologia e do LPDI, sem exceções. Em especial ao André, pela paciência e parceria incondicionais, pelos incansáveis ensinamentos mesmo à milhas distante. Ao Samuel, por estar sempre disposto pra tirar uma dúvida ou pra encher a cabeça delas. Ao Amilton pela ajuda incansável e pelo incentivo sempre. Ao Tom, meu único estagiário preferido, pela lealdade e parceria.
A todos que de uma forma ou outra auxiliaram no desenvolvimento deste projeto, fazendo parte dessa etapa de minha vida, muito obrigada!
“Uma geração vai, e outra geração vem; porém a terra para sempre permanece. E nasce o sol, e põe-se o sol, e volta ao seu lugar donde nasceu. O vento vai para o sul, e faz o seu giro para o norte; continuamente vai girando o vento, e volta fazendo seus circuitos.”
RESUMO
DELIBERALLI, Ivânia Desenvolvimento de vacina recombinante contra a
leptospirose: produção e avaliação do potencial imunoprotetor de quatro lipoproteínas. 2014. 70f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação
em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A leptospirose é uma doença causada por espiroquetas do gênero Leptospira. É uma zoonose de ampla distribuição geográfica, sendo um problema de saúde pública e veterinária, principalmente em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento de clima tropical e subtropical. Em medicina veterinária, a leptospirose é uma doença importante tanto para a clínica quanto para a produção, devido ao risco à saúde pública, perdas reprodutivas e óbitos. A vacinação animal é realizada como medida de prevenção da enfermidade, entretanto, a proteção conferida pelas vacinas comerciais é limitada e não evita a condição de portador. Os antígenos protéicos da membrana externa parecem ser a melhor alternativa para substituir as vacinas atualmente disponíveis, porém, após diversos estudos, nenhum apresentou resultados satisfatórios. O objetivo deste trabalho foi avaliar antígenos recombinantes e preparações vacinais, capazes de conferir proteção de amplo espectro, em hamsters (Mesocricetus auratus). Neste estudo, quatro novas proteínas recombinantes de Leptospira spp foram obtidas e testadas no modelo de leptospirose aguda em hamster para avaliar vacinas experimentais. A análise in silico do genoma de L. interrogans sorogrupo Icterohaemorrhagie sorovar Copenhageni cepa FIOCRUZ L1-130 foi realizada para identificar genes alvo potenciais para o desenvolvimento de vacinas de subunidade. Quatro genes foram selecionados para expressão de proteínas recombinantes em sistema de expressão heteróloga em Escherichia coli: lic10260, lic10365, lic11207 e lic11360, que codificam para prováveis lipoproteína de membrana externa. Os genes foram amplificados a partir do DNA genômico de L. borgpeterseni sorogrupo Ballum cepa 4E. Os procedimentos de clonagem resultaram nos vetores recombinantes pAE/lic10260, pAE/lic10365, pAE/lic11207 e pAE/lic11360. As proteínas recombinantes foram eficientemente expressas nesse sistema de expressão e posteriormente, utilizadas na imunização de hamsters que foram subsequentemente desafiados com dose letal de L. borgpeterseni sorovar Ballum 4E. A resposta imune humoral induzida pelas proteínas foi avaliada por ensaio imunoenzimático (ELISA) e verificou-se que, pelo menos uma das formulações vacinais para cada proteína produziu resposta humoral significativa estatisticamente (p < 0,05). As proteínas rLIC10260, rLIC10365, rLIC11207 e rLIC11360 mostraram-se imunogênicas, tornando promissora sua utilização como vacinas contra leptospirose.
Palavras chave: Leptospirose; vacinas recombinantes; lipoproteínas; resposta
ABSTRACT
DELIBERALLI, Ivânia. Development of a recombinant vaccine against
leptospirosis: immunological potential of putative lipoproteins. 2014. 70p.
Dissertation (Master degree) – Biotechnology Post-Graduate Program – Federal University of Pelotas.
Leptospirosis is a widespread zoonosis caused by spirochetes from genus Leptospira. The disease is considered a problem in both public health and veterinary areas, affecting mainly tropical and subtropical developing countries. In veterinarian medicine, leptospirosis is an important disease for both clinic and production sectors due to the public health risks, reproductive failures and death, culminating in considerable economic losses for the area. Animal vaccination is taken as a prevention measure, however the acquired protection by the vaccines is, in most cases, weak and allows the spreading of the disease. The outer membrane antigens seems to be the best alternative to substitute the currently available vaccines, however, after several studies, none of them presented satisfactory results. The aim of the present work was the production and evaluation of four recombinant antigens in order to elicit broad spectrum protection in hamster, the susceptible experimental model (Mesocricetus auratus). An in silico analysis in L. interrogans serogroup icterohaemorrhagie serovar Copenhageni strain FIOCRUZ L1-130 was run in order to identify potential genes for subunit vaccine development. Four genes were selected, amplified, cloned into vectors and expressed in Escherichia coli: lic10260, lic10365, lic11207, lic11360. These gene products are potential outer membrane lipoproteins and were amplified from L. borgpeterseni serugroup Ballum strain 4E. The cloning procedures resulted in the recombinant vectors pAE/LIC10260, pAE/LIC10365, pAE/LIC11207 and pAE/LIC11360 and its purified products were inoculated in hamsters and their humoral response was evaluated per Enzyme-linked Immunossorbent Assay (ELISA). It was possible to verify that at least one of the vaccinal preparations for each protein was able to induce statistically significant humoral response (p < 0.05). The four obtained proteins showed immunogenic response, making them promising recombinant antigens for use against leptospirosis.
Lista de Figuras
Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1%. dos produtos da amplificação por
PCR...44
Figura 2 Digestão dos produtos de amplificação e do vetor pAE com enzimas
de restrição BamHI e HindIII...45
Figura 3 Extração dos vetores recombinantes...46 Figura 4 Caracterização das rLICs através de Western blot. com anticorpo
anti-6xHis...47
Figura 5 Avaliação da resposta imune humoral das vacinas de subunidade em ELISA indireto...49
Lista de Tabelas
Tabela 1 Sequência dos primers utilizados nas amplificações por PCR e
tamanho do gene esperado...37
Tabela 2 Delineamento para a imunização com vacinas de subunidade e
controles...42
Lista de Símbolos e Abreviações μg – micrograma °C – graus Celsius μL – microlitro μm – micrômetro adj. – adjuvante
Al(OH)3 – hidróxido de alumínio
AN – número de acesso das proteínas no GenBank BSA – albumina sérica bovina
CAMs - células de adesão molecular CIP – enzima fosfatase alcalina cm – centímetro
CPqMG – Centro de Pesquisas Gonçalo Monis DNA – ácido desoxirribonucléico
DO – densidade óptica
dNTP – 2’ - desoxinucleotídeo 5’ – trifosfatos ELISA – Enzime-linked immunossorbent assay
EMJH – Meio Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris Fg - fibrinogênio
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz g – força da gravidade
HUVECS - células endoteliais da veia umbilical humana ICAM-1 - moléculas de adesão intracelular 1
IM – intramuscular IP – intraperitonial
IPTG – isopropil β-D-tiogalactosídeo kDa – kilodalton
kHz – kilohertz kV – kilovolts L – litros
LB – Meio Luria - Bertani
M – molar
MAT – teste de aglutinação microscópica MgCl2 – cloreto de magnésio
min – minutos mL – mililitro mm - milímetros mM – milimolar
NaCl – cloreto de sódio
NaH2PO4 – dihidrogenofosfato de sódio ng – nanograma
Ni+2 – níquel nm – nanômetro
OM – membrana externa
OMPs – proteínas da membrana externa ORFs – fase aberta de leitura
PBS – tampão fosfato salino
PBS -T – tampão fosfato salino acrescido de 0,05% de Tween 20 PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
PLG - plaminigênio PLA - plasmina
pH – potencial de hidrogênio
rDNA – ácido desoxirribonucléico ribossomal rpm – rotações por minuto
S – segundos
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS uFD – microfarad
Sumário 1 INTRODUÇÃO...14 2 REVISÃO DE LITERATURA...14 2.1 Microbiologia e genômica...16 2.2 Aspectos históricos...18
2.3 Ciclo de transmissão e epidemiologia...20
2.4 Mecanismos de patogênese...22
2.5 Manifestações clínicas...24
2.6 Leptospirose bovina...25
2.7 Imunidade e vacinas...26
2.8 Controle, diagnóstico e tratamento...29
2.9 Alvos vacinais...31
3 METODOLOGIA...36
3.1 Cepas, condições de cultivo, extração de DNA e bacterina...36
3.2 Escolha de LICs e desenho dos primers...36
3.3 Amplificação dos genes por reação em cadeia da polimerase (PCR)...37
3.4 Análise da presença dos genes em Leptospira spp...38
3.5 Clonagem dos genes no vetor pAE...38
3.6 Transformação de E. coli por eletroporação...38
3.7 Expressão heteróloga...39
3.8 Purificação de proteínas recombinantes...39
3.9 Caracterização das proteínas recombinates através de Western blot...40
3.10 Reconhecimento das proteínas pelo soro convalescente de pacientes com leptospirose...40
3.11 Modelo animal...41
3.12 Imunizações...42
3.13 Desafio...42
3.14 Avaliação da resposta imune humoral por ELISA...43
4 RESULTADOS...44
4.1 Escolha dos alvos vacinais potenciais...44
4.2 Amplificação dos genes por reação em cadeia da polimerase (PCR)...44
4.3 Análise da presença das LICs em Leptospira spp...45
4.4 Clonagem dos genes no vetor pAE e caracterização dos vetores recombinantes...45
4.5 Expressão, purificação e caracterização das proteínas recombinantes...46
4.6 Reconhecimento das proteínas pelo soro convalescente...47
4.7 Ensaios de imunoproteção...47
4.8 Avaliação da resposta imune humoral induzida pelas vacinas...48
5 DISCUSSÃO...50
6 CONCLUSÕES...56
1 Introdução
A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Atualmente, estão descritas 13 espécies patogênicas de leptospiras e mais de 260 sorovares. Os sorovares antigenicamente relacionados são classificados em sorogrupos, compreendendo 29 sorogrupos distintos (ADLER; DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). A variedade sorológica é consequência da diversidade antigênica causada, principalmente, pela variabilidade estrutural do lipopolissacarídeo (LPS) dentro da própria espécie, o qual é estruturalmente distinto do encontrado em bactérias Gram-negativas. As leptospiras possuem estrutura de dupla membrana, com grande quantidade de proteínas expostas na superfície da bactéria (ADLER; DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). O sequenciamento de genomas de leptospiras proporcionou o conhecimento de genes, que apesar de as proteínas correspondentes ainda não possuírem função conhecida ou comprovada, estão anotadas como prováveis proteínas de membrana externa ou lipoproteínas (NASCIMENTO et al., 2004).
A leptospirose bovina é caracterizada por altos índices de abortos, natimortos, infertilidade e redução na produção de leite. Desta forma, a indústria agropecuária sofre grande impacto econômico, com prejuízos para os produtores e, consequentemente, para a economia dos países acometidos (ADLER; DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). Ainda são escassos os dados oficiais referentes à ocorrência da enfermidade em animais no Brasil. A prevalência sorológica em animais é estimada em torno de 35%, com mais de 80% das propriedades rurais apresentando casos da doença (LILENBAUM; DOS SANTOS, 1995; MARTINS et al., 2011). Além do importante impacto econômico, a doença nos bovinos é considerada um fator de risco ocupacional para veterinários, magarefes e produtores rurais (FAINE et al., 1999; LEVETT, 2001).
A vacinação contra leptospirose bovina é realizada com bacterinas dos sorovares endêmicos na região (DELLAGOSTIN et al., 2011). Esta vacinação apresenta uma série de limitações, onde destacam-se: reações adversas à vacina; proteção apenas contra os sorovares incluídos na vacinação; necessidade de estudos epidemiológicos continuados para levantamento dos sorovares endêmicos e incluí-los na vacinação; resposta imune de curta duração, necessitando de múltiplas doses para manutenção da imunidade (DELLAGOSTIN et al., 2011). Além disso, a resposta imune gerada é pouco compreendida. Na maioria das espécies a vacinação parece induzir resposta humoral com predomínio de anticorpos anti-LPS. Em bovinos, bacterinas que induzem altos títulos de anticorpos anti-LPS não são protetoras, enquanto bacterinas que induzem respostas celulares apresentam maior proteção (ZUERNER et al., 2011). Frente a esses problemas, destaca-se a importância do desenvolvimento de uma vacina protetora contra a leptospirose bovina, que tenha amplo espectro e que confira imunidade de longa duração. Nas últimas décadas, o rápido progresso das pesquisas, em particular nas áreas de Imunologia e Biologia Molecular, lançou bases para avanços na tecnologia de produção de vacinas. Isto permitiu a introdução de novas estratégias para a obtenção e produção de antígenos, assim como foram desenvolvidos novos protocolos de administração e apresentação desses antígenos para as células do sistema imune. Nesse contexto, este estudo teve por objetivo realizar a clonagem, expressão, purificação e caracterização de quatro lipoproteínas de membrana de Leptospira borgpetersenii sorovar Ballum 4E: LIC10260, LIC10365, LIC11207 e LIC11360, as quais serão avaliadas quanto ao seu potencial para o desenvolvimento de vacinas recombinantes para o controle da leptospirose.
2 Revisão de Literatura
2.1 Microbiologia e genômica
Leptospiras são bactérias pertencentes ao gênero Leptospira, família Leptospiraceae, ordem Spirochaetales (BHARTI et al., 2003). O gênero Leptospira compreende 20 espécies e 29 sorogrupos, sendo 13 espécies patogênicas, classificadas em mais de 260 sorovares (CERQUEIRA; PICARDEAU, 2009; KO et al., 2009). Essa classificação sorológica é determinada, principalmente, pela diversidade antigênica do lipopolissacarídeo (LPS) presente em sua membrana externa. Sorovares contendo determinantes antigênicos relacionados são agrupados no mesmo sorogrupo (LEVETT, 2001; BHARTI et al., 2003).
O genoma possui dois cromossomos circulares, um com 4279 kb e o outro com 350 kb. A saprofítica Leptospira biflexa possui, ainda, um terceiro replicon, p74, que parece conter genes indispensáveis à sua sobrevivência. Não há descrição de plasmídeos ou mecanismos de transferência gênica (ZUERNER et al., 1993; NASCIMENTO et al., 2004; PICARDEAU et al., 2008; MCBRIDE et al., 2009; ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010).
A comparação genômica de duas espécies patogênicas e uma saprófita identificou a presença de 2052 genes compartilhados, demonstrando o core do genoma leptospiral. Mais de 50% dos genes de Leptospira spp. são de função desconhecida, sugerindo a presença de fatores de virulência e mecanismos de patogenicidade únicos (ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010).
Existem poucas ferramentas genéticas disponíveis para mutagênese em leptospira, entretanto, diversos mutantes já foram obtidos através de mutagênese randômica (BOURHY et al., 2005; RISTOW et al., 2007; MURRAY et al., 2009; MURRAY et al., 2009; MURRAY et al., 2009; MURRAY et al., 2010; LAMBERT et al., 2012;), recombinação homóloga sítio-dirigida (PICARDEAU et al., 2001;
CRODA et al., 2008;) e utilização do vetor shuttle E. coli-L. biflexa (GIRONS et al., 2000; FIGUEIRA et al., 2011).
Morfologicamente todas as leptospiras são indistinguíveis, mas a morfologia de isolados varia com a subcultura in vitro, e a virulência. (HAAKE, 2006).
A elevada motilidade dessas bactérias, assim como em outras espiroquetas, é decorrente da atividade de dois flagelos periplasmáticos, que se estendem no espaço entre a membrana interna e a membrana externa (KO, et al., 2009). As proteínas FlaA e FlaB constituem a bainha e o núcleo do flagelo, respectivamente (PICARDEAU, 2001). Cada flagelo está ancorado numa extremidade, sendo responsáveis pelo formato de gancho único das leptospiras (CHARON, GOLDSTEIN, 2002; LAMBERT et al., 2012; RADDI et al., 2012). Seu formato helicoidal, por outro lado, não está relacionado com a estrutura flagelar (PICARDEAU et al., 2001).
As leptospiras são aeróbias obrigatórias, com temperatura ótima de crescimento de 30 °C e medem cerca de 6-25 μm de comprimento e aproximadamente 0,2 μm de diâmetro, sendo sensíveis aos antibióticos beta-lactâmicos e tetraciclinas (BHARTI et al., 2003; EVANGELISTA, COBURN, 2010). O meio de cultura utilizado para o seu crescimento, Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) é baseado em ácido oleico, albumina sérica bovina e polisorbato 80, geralmente suplementado com soro de coelho ou suplementos comerciais (LEVETT, 2001). Por outro lado, algumas cepas de Leptospira spp. são capazes de sobreviver em ambientes com baixa concentração de nutrientes, o que tem sido atribuído à capacidade de formação de biofilme e à interação com bactérias ambientais (RISTOW et al., 2008; BARRAGAN et al., 2011).
A estrutura de dupla membrana agrega características de bactérias Gram-negativas, porém com a camada de peptideoglicano ancorada à membrana interna, típico de bactérias Gram-positivas (VIJAYACHARI et al., 2008). A membrana externa apresenta LPS e diversas lipoproteínas, as quais tem sido consideradas potenciais alvos vacinais (HAAKE, MATSUNAGA, 2010; DELLAGOSTIN et al., 2011).
Através de técnicas de proteômica, Malmström etal. (2009) determinaram o número de cópias de proteínas por célula, demonstrando que as lipoproteínas são
as proteínas mais abundantes na célula leptospiral. A relação das lipoproteínas em maior quantidade na célula são LipL32 > Loa22 > LipL41 (MALMSTROM et al., 2009).
2.2 Aspectos históricos
Episódios de síndromes similares à causada pela leptospirose são descritas desde as antigas civilizações; porém, o primeiro relato clínico descrevendo a leptospirose nos tempos modernos foi realizado somente em 1886, quando o médico alemão Adolf Weil descreveu a forma grave da doença em humanos (Ko et al., 2009), que ficou conhecida como síndrome ou doença de Weil.
A identificação do agente etiológico, no entanto, ocorreu somente em 1914, quando Inada e colaboradores obtiveram isolados de Leptospira spp. por meio de um estudo e infecção experimental, no qual inocularam em cobaias (Cavia spp.) o sangue de pacientes ictéricos e febris (INADA, 1916; NOGUCHI, 1917). Ao analisarem o tecido hepático dos animais infectados, perceberam a presença de espiroquetas, as quais foram denominadas Spirochaeta icterohaemorrhagiae (INADA, 1916). Foi ainda, pelo trabalho de 1916 do pesquisador japonês Noguchi, que o papel do rato na transmissão da doença para humanos foi elucidado (LEVETT, 2001). Após a publicação do trabalho de Inada, houve a confirmação da ocorrência da leptospirose por toda a Europa (LEVETT, 2001).
Em 1918, Noguchi e colaboradores conseguiram classificar o agente em um novo gênero, o qual foi denominado de Leptospira. Este gênero incluía leptospiras patogênicas, todas denominadas Leptospira (Spirochaeta) icterohaemorrhagiae, e também leptospiras saprófitas (isoladas em 1914, por Wolbach e Binger), devido a similaridades morfológicas. As leptospiras saprófitas foram agrupadas sob a denominação de Spirochaeta biflexa (NOGUCHI, 1918).
A divisão do gênero Leptospira foi feita em duas espécies e contava com uma subdivisão sorológica. As características antigênicas oriundas principalmente de antígenos de natureza lipopolissacarídica (LPS) de sua parede celular permitiram essa classificação, onde a unidade taxonômica do gênero é o sorovar. Os sorovares antigenicamente relacionados estão reunidos em sorogrupos
(KMETY, DIKKEN, 1993). Tanto as espécies patogênicas quanto as saprófitas foram divididas em inúmeros sorogrupos e sorovares, avaliados e diferenciados através de reação de aglutinação cruzada com antígenos homólogos. Assim, duas cepas pertencerão a diferentes sorovares se, após a produção de antissoros e a adsorção cruzada destes com quantidades adequadas do antígeno heterólogo, mais de 10% do título homólogo permanecer regular em pelo menos um dos dois antissoros em testes repetidos (INTERNATIONAL COMMITTEE ON SYSTEMATIC BACTERIOLOGY SUBCOMMITTEE ON THE TAXONOMY OF LEPTOSPIRA, 1987).
Além dos critérios patológicos, a divisão das espécies do gênero também contava com critérios fenotípicos. A L. interrogans adquiria forma esférica quando as células eram colocadas por 2 h em uma solução de NaCl (1 M) a 20-30°C; não cresciam a 13 °C e ou na presença de 8-azaguanina (225 mg.mL-1). Já a L. biflexa não possuía forma esférica quando as células eram colocadas por 2 h na mesma solução e poderiam ser cultivadas a 13° C na presença de 8 - azaguanina (LEVETT, 2001; GOMES, 2012).
Em 1987, os estudos de hibridação de DNA impuseram o surgimento de outro sistema de classificação, pela comprovação de alta heterogeneidade entre os sorovares das espécies. A adoção da classificação baseada em componentes moleculares transformou as duas espécies anteriores em sete, cinco pertencentes à antiga L. interrogans e duas pertencentes à prévia L. biflexa (YASUDA et al., 1987), sendo elas: L. borgpetersenii, L. inadai, L. meyeri, L. noguchii, L. santarosai, L. weilii e L. wolbachii. Atualmente, 20 espécies estão descritas: as patogênicas L. alexanderi, L. alstonii, L. borgpetersenii, L. inadai, L. interrogans, L. fainei, L. kirschneri, L. licerasie, L. weilli, L. noguchi, L. santarosai, L. wolffii, L. broomii, com cerca de 260 sorovares, e as saprofíticass L. kmetyi, L. wolbachii, L. meyeri, L. biflexa, L. vanthielii, L. terpstrae e L. yanagawae com cerca de 60 sorovares (CERQUEIRA, PICARDEAU, 2009).
Apesar da adoção da classificação genética para fins taxonômicos, ela ainda coexiste com a classificação sorológica, principalmente para finalidades epidemiológicas, a qual facilita a correlação com a fonte de infecção, já que os sorovares, na maioria das vezes, estão relacionados com hospedeiros específicos. Desta forma, o sorovar Canicola é comumente encontrado em cães,
Bratislava em cavalos e suínos, Hardjo em bovinos e Australis e Pomona em suínos, Icterohaemorrhagiae em ratos (ELLIS et al., 1983; BERNARD, 1993; BHARTI et al., 2003; FONTAINE, 2006; ADLER, DE LA PENNA MOCTEZUMA, 2010). Porém, dependendo da região geográfica, um mesmo animal pode estar relacionado com mais de um sorovar.
2.3 Ciclo de transmissão e epidemiologia
A leptospirose pode ser classificada como uma zoonose, visto que a transmissão entre humanos é praticamente inexistente, apesar de a pessoa infectada eliminar a bactéria por semanas ou até por anos. Os principais transmissores da leptospirose são os animais infectados, os quais podem manifestar a doença de forma aguda ou crônica, podendo carrear as leptospiras durante longos períodos e de forma assintomática (BHARTI et al., 2003), eliminando-as contínua ou intermitentemente (LEVETT, HAAKE, 2009). Ratos são portadores assintomáticos da doença e também os principais carreadores da espiroqueta, porém, esse caráter de portador crônico já foi reportado em quase todos os mamíferos. Geralmente, a transmissão ocorre por contato direto ou indireto com a urina dos animais carreadores, através de água, solo ou alimentos contaminados (LEVETT, 2001; BHARTI et al., 2003). Quando expostos a estas condições, as leptospiras penetram na corrente sanguínea pelas membranas mucosas ou conjuntivas, mesmo que intactas, ou pela pele com abrasões e cortes (LEVETT, HAAKE, 2009). Após esta etapa, o patógeno é capaz de se alojar em qualquer órgão, e sua apresentação clínica dependerá do sistema ou sistemas envolvidos (RATHINAM, 2002). As leptospiras são albergadas nos túbulos renais proximais dos animais carreadores, domésticos ou silvestres, e excretadas na urina, contaminando solo, água e alimentos (HARTSKEERL et al., 2011).
Estima-se a ocorrência de aproximadamente 500 mil novos casos de leptospirose ao ano (HARTSKEERL et al 2011; WHO, 2011;). Porém, acredita-se que esse número é subestimado em função da precariedade da vigilância sanitária em alguns países, do difícil diagnóstico e dos sintomas pouco específicos na fase inicial da doença (WHO, 1999; HOTEZ et al., 2008; ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010).
Em sua fase inicial, a leptospirose apresenta sintomas como febre, náuseas, dores de cabeça e indisposição, facilmente confundidos com outras doenças tropicais ou gripe (VINETZ, 2001), apresentando taxa de mortalidade em torno de 10%, e em seus estágios mais graves, quando as complicações são sistêmicas, com icterícia e falência renal, a taxa de mortalidade sobe para mais de 50% (MCBRIDE et al., 2005).
Inicialmente, a leptospirose foi relacionada com atividades ocupacionais como a medicina veterinária, trabalhadores de abatedouros, agricultores em plantações de arroz ou atividades em saneamento básico (ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). Com a evolução dos equipamentos de segurança de uso individual, ou até mesmo com a evolução do maquinário agrícola, o risco ocupacional (nos países desenvolvidos) foi reduzindo com o passar dos anos. Entretanto, o processo de ocupação descontrolada dos centros urbanos, aliado a más condições de saneamento básico, sobretudo em países em desenvolvimento, fez com que a leptospirose humana fosse considerada, na última década, como uma zoonose emergente. Além disso, a doença tornou-se um grande problema em áreas rurais e em países tropicais, os quais contam com altos índices pluviométricos aliados a uma grande diversidade de sorovares presentes (BHARTI et al., 2003; ADLER, MOCTEZUMA, 2009; Ko et al., 2009). No ambiente urbano, as medidas profiláticas são de difícil implementação e passam, basicamente, por melhoras nas condições de saneamento básico e desratização (MONAHAN, CALLANAN e NALLY, 2009). Um estudo de 2013 analisou a situação atual do estado endêmico, prevenção e controle de doenças zoonóticas negligenciadas existentes na China, incluindo a raiva, a tuberculose bovina, brucelose, carbúnculo, leptospirose, equinococose, cisticercose, leishmaniose e fasciolose de modo a fornecer as informações básicas para melhor controlar e, até mesmo, eliminar, as zoonoses negligenciadas na China, demonstrou que zoonoses negligenciadas além de ameaçar a saúde do ser humano, apresentam riscos especialmente para os criadores de gado em áreas atingidas pela pobreza e causam grandes perdas econômicas para a criação de animais. (LIU, ZHU, YANG, 2013).
Desta forma, atualmente, em países desenvolvidos, a ocorrência da doença está associada principalmente à atividades recreativas, como esportes
aquáticos. Já nos países em desenvolvimento, a leptospirose é relacionada com as condições precárias de higiene, com a falta de saneamento básico e com o superpovoamento (REIS et al., 2008). Em regiões de clima tropical ou subtropical, a incidência de leptospirose é maior, com ocorrência de surtos, principalmente em períodos de chuva e enchentes, já que essas condições favorecem a disseminação das leptospiras e provocam uma maior exposição à bactéria (VINETZ, 2001; BHARTI et al., 2003). Dopouey e colaboradoses (2014) apresentaram dados de vigilância de toda a Europa, especialmente na França, para ter uma visão geral sobre esta doença negligenciada nos países de clima temperado. Os resultados destacaram o papel importante de roedores silvestres como reservatório da leptospirose e o potencial perigo do ressurgimento desta doença infecciosa nas cidades européias, associado à expansão importante da população de ratos em áreas urbanas.
No Brasil, assim como em outros países, a doença é amplamente negligenciada e a qualidade do controle varia de Estado para Estado. Nos últimos 15 anos, estados como o Piauí e Roraima relataram não mais que 20 casos confirmados de leptospirose humana, enquanto Estados como São Paulo e Rio Grande do Sul chegam a relatar mais de mil em apenas um ano (Ministério da Saúde, 2012). Dados oficiais referentes à ocorrência da enfermidade em animais no Brasil são escassos. A prevalência sorológica média em bovinos no país é de 36,7%, sendo que 84,1% das propriedades rurais apresentam casos da doença (FAVERO et al., 2001). Em outro estudo que abrangeu vários Estados brasileiros, Favero e colaboradores (2002) relataram prevalência média nacional de 17,7%, 29% e 24,5% de soropositivos para caninos, equinos e suínos, respectivamente.
2.4 Mecanismos de patogênese
Na fase inicial da doença, após a entrada das leptospiras no hospedeiro, essas bactérias multiplicam-se rapidamente no sangue (leptospiremia) e migram pelos tecidos até atingirem órgãos-alvo, como rins, pulmões e fígado. Apesar de não serem microrganismos intracelulares, são capazes de atravessar e residir transientemente no interior de células, como demonstrado in vitro, o que parece ser importante para evasão do sistema imune e rápida colonização de órgãos do
hospedeiro (BAROCCHI et al., 2002; Ko et al., 2009). Proteínas de membrana externa com afinidade por componentes da matriz extracelular do hospedeiro também são importantes na invasão e na disseminação da bactéria no organismo (CULLEN et al., 2005; HAAKE, MATSUNAGA, 2010).
Um mecanismo fundamental para a patogênese da doença é a motilidade da bactéria. A capacidade de deslocamento em meios altamente viscosos e a localização interna do flagelo periplasmático, que além de permitir a proteção contra variações extremas de condições externas, como pH e osmolaridade, também previne a imobilização da bactéria via anticorpos anti-flagelares, sendo então características evolutivamente vantajosas para a espiroqueta (GOLDSTEIN, CHARON, 1988; CHARON, GOLDSTEIN, 2002). Estudos de mutagênese mostraram que as proteínas FlaA e FliY que compõem o flagelo são essenciais para a virulência das leptospiras, e FlaB, essencial para motilidade (PICARDEAU et al., 2001; LIAO et al., 2009; LAMBERT et al., 2012).
Alguns outros mutantes construídos também resultaram em atenuação da virulência, ou seja, sem capacidade de causar doença em modelo animal suscetível. Os fatores de virulência já identificados em Leptospira spp. são Loa22 (RISTOW et al., 2007), HemO (MURRAY et al., 2009), LPS (MURRAY et al., 2010), FlaA (LAMBERT et al., 2012) e FliY (LIAO et al., 2009), indicando a participação dos mesmos na patogênese da Leptospira spp.
Leptospiras patogênicas são capazes de evadir dos mecanismos imunes de defesa do hospedeiro, principalmente no que se refere às estratégias de migração para sítios imunoprivilegiados, como rins e olhos, e evasão do sistema complemento (FRAGA et al., 2011). A resistência ao sistema complemento ocorre em função da habilidade de ligar reguladores negativos da via alternativa e das vias clássica e lectina, como fator H (FH) e proteína ligadora de C4b (C4BP), respectivamente (MERI et al., 2005; BARBOSA et al., 2009; CASTIBLANCO-VALENCIA et al., 2012). A interação desses reguladores com as proteínas Ligs de Leptospira spp. já foi demonstrada, indicando outra importante função dessas proteínas (CASTIBLANCO-VALENCIA et al., 2012).
2.5 Manifestações clínicas
A apresentação clínica da leptospirose é bifásica, com uma fase aguda caracterizada por bacteremia na primeira semana da infecção, seguida de uma fase imune, marcada pela disseminação das bactérias para órgãos-alvo, produção de anticorpos e excreção de leptospiras na urina (Ko et al., 2009). Os sintomas podem variar de uma forma leve ou anictérica até uma forma grave ou ictérica com complicações multissistêmicas, dependendo de vários fatores como: dose infectante, imunidade do hospedeiro e o sorovar em questão (LEVETT, 2001).
Inicialmente, os sintomas são pouco específicos, como febre, mialgia e dores de cabeça, podendo ser facilmente confundidos com outras doenças, tais como gripe, dengue e febre amarela. Somado a isso, são poucos os laboratórios aptos a identificar a doença utilizando a técnica padrão de diagnóstico, o teste de microaglutinação (MAT). Dessa forma, o número de casos é subestimado e a doença acaba sendo negligenciada (WHO, 2003; HOTEZ et al., 2008).
A forma ictérica da leptospirose ocorre em 5-10% dos casos e pode ser dividida em 3 categorias: síndrome de Weil, caracterizada por icterícia, uveíte, falência renal, hemorragia e miocardite; meningite/meningoencefalite; e síndrome hemorrágica pulmonar associada à leptospirose, com falência respiratória. A taxa de mortalidade das formas graves da doença pode ultrapassar 50% (MCBRIDE et al., 2005; RICALDI, VINETZ, 2006; GOUVEIA et al., 2008).
Assim, após as leptospiras entrarem no corpo e passarem por uma fase de multiplicação na corrente sanguínea (leptospiremia), ocorre a invasão das barreiras teciduais, inclusive tendo como alvo o sistema nervoso central e o humor aquoso. A migração transendotelial do patógeno é facilitada por uma vasculite sistêmica, o que ocasiona o amplo espectro clínico da doença, podendo ocorrer lesões vasculares graves, levando à hemorragia pulmonar, isquemia do córtex renal e tubular-epitelial, necrose celular, destruição da arquitetura hepática, levando à icterícia e lesão em nível celular do tecido, com ou sem necrose (AREAN, 1962). Pode haver, também, provavelmente pela ação de endotoxinas, miosites e placentites (ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). Porém a patogênese da leptospirose ainda não é claramente compreendida.
2.6 Leptospirose bovina
A leptospirose bovina é endêmica no Brasil, podendo determinar abortos, distúrbios reprodutivos (retenção de placenta e natimortos), alterações congênitas, ou infecções inaparentes capazes de comprometer a eficiência reprodutiva do animal, levando-o à subfertilidade (LILENBAUM, DOS SANTOS, 1995), além de perdas na produção de leite e problemas com mastites. Desta forma, a indústria agropecuária sofre grande impacto econômico, com prejuízos para os produtores e, consequentemente, para a economia dos países acometidos (ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). Ainda são escassos os dados oficiais referentes à ocorrência da enfermidade em animais no Brasil. A prevalência sorológica em animais é estimada em torno de 35%, com mais de 80% das propriedades rurais apresentando casos da doença (LILENBAUM, DOS SANTOS, 1995; MARTINS et al., 2011). Além do importante impacto econômico, a doença nos bovinos é considerada como um fator de risco ocupacional para veterinários, magarefes e produtores rurais (FAINE et al., 1999; LEVETT, 2001).
Estes problemas normalmente estão associados com o sorovar Hardjo que determina a síndrome da queda do leite ou milk drop syndrome (ELLIS et al., 1976; HIGGINS et al., 1980; MARTINS et al., 2011). Embora a taxa de mortalidade nesta espécie seja baixa (5%), a morbidade geralmente é alta de acordo com as apresentações clínicas (ELLIS et al., 1985). Os bovinos são considerados reservatórios da doença e devido à proximidade com humanos representam também uma importante via de transmissão de leptospirose humana, principalmente para tratadores (ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010).
A vacinação contra leptospirose bovina é realizada com bacterinas dos sorovares endêmicos na região. Esta vacinação apresenta uma série de limitações, onde se destacam: reações adversas à vacina; proteção apenas contra os sorovares incluídos na vacinação; necessidade de estudos epidemiológicos continuados para conhecer todos os sorovares endêmicos e incluí-los na vacinação; resposta imune de curta duração, necessitando de múltiplas doses para manutenção da imunidade (DELLAGOSTIN et al., 2011). Além disso, a resposta imune protetora é pouco compreendida. Na maioria das espécies a vacinação parece induzir resposta humoral com predomínio de
anticorpos protetores anti-LPS. Em bovinos, bacterinas que induzem altos títulos de anticorpos anti-LPS não são protetoras, enquanto bacterinas que induzem potentes respostas celulares apresentam maior proteção (ZUERNER et al., 2011).
2.7 Imunidade e vacinas
As leptospiras são inicialmente detectadas pelo sistema imune do hospedeiro através dos padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs), principalmente o LPS (MOGENSEN, 2009; FRAGA et al., 2011). O LPS leptospiral ativa macrófagos humanos via receptor Toll-like 2 (TLR2), diferentemente do LPS da maioria das Gram-negativas que atua a nível de TLR4 (WERTS et al., 2001).
A ativação do sistema complemento representa um dos principais mecanismos de defesa do sistema imune inato para o reconhecimento e eliminação das leptospiras do organismo, o que pode ser evidenciado pela morte, em poucos minutos, de L. biflexa na presença de soro humano normal (MERI et al., 2005). O papel da resposta imune adquirida, humoral e celular, na leptospirose está relacionado com a produção de anticorpos aglutinantes e opsonizantes, com o recrutamento de células do sistema imune, através da produção de citocinas inflamatórias e, possivelmente, com a proteção contra uma reinfecção (GANOZA et al., 2010; FRAGA et al., 2011).
Alguns quadros clínicos, como uveíte e hemorragia pulmonar, ocorrem, em parte, por complicações autoimunes devido à grande inflamação local. Anticorpos contra as proteínas LruA e LruB de Leptospira spp. também reconhecem proteínas dos olhos de equinos, reforçando a hipótese de autoimunidade (VERMA et al., 2010).
A maior parte dos anticorpos produzidos durante a infecção é contra o LPS (ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). Imunizações com o LPS, seja ativa ou passivamente (anticorpos anti-LPS), podem ou não ser protetoras contra a doença (JOST et al., 1986; MIDWINTER et al., 1990; SRIKRAM et al., 2011). A resposta imune celular ainda é pouco entendida, mas está envolvida na proteção contra leptospirose em bovinos, com proliferação de linfócitos T αβ e γδ e produção de interferon-gama (INF-y) (NAIMAN et al., 2001; NAIMAN et al., 2002).
Apenas alguns países fazem uso da vacinação em humanos, tais como China, Cuba, França e Japão, ainda assim, somente em épocas endêmicas. Estas preparações, na maior parte dos casos, são compostas por bacterinas, cuja inativação é feita térmica ou quimicamente (SANCHES et al., 2002, MARTINEZ et al., 2004; KOIZUMI, WATANABE, 2005; YANAGINNAHA et al., 2007). No Brasil, não existe vacina contra a leptospirose disponível para humanos. Para animais, as vacinas contra a leptospirose são comercializadas, e, em sua composição, constam os sorovares que mais atingem a espécie à qual se destinam. Assim, vacinas para cães, por exemplo, contém, geralmente, mas não exclusivamente, os sorovares Canícola e Icterohaemorrhagiae (ADLER, DE LA PENA MOCTEZUMA, 2010). Estas vacinas, em sua maior parte, previnem a disseminação renal do patógeno, mas existem relatos de cães imunizados transmitindo a doença para humanos. Ainda, o animal pode ser infectado por um dos sorovares que não está presente na composição da vacina (PRESCOTT, 2008).
Entretanto, em bovinos, a estimulação mostrou-se por via Th1, indicando que a estimulação da resposta imune celular pode desempenhar um importante papel na imunidade contra o patógeno (BALDWIN et al., 2002). Essa hipótese vem sendo cada vez mais aceita diante da descrição do papel da resposta mediada por células contra leptospiras, baseada em Th1 CD4+ com produção de INF-y pelas células gama-delta (γδT) (NAIMAN et al., 2001; KLIMPEL, MATTHIAS e VINETZ, 2003).
As vacinas atualmente disponíveis induzem uma resposta imune humoral predominantemente contra o LPS, sem gerar resposta dependente de células T, sendo necessários reforços anuais. Além disso, fornecem proteção apenas contra os sorovares que compõem a vacina e são altamente reatogênicas em humanos (FAINE et al., 1999; DELLAGOSTIN et al., 2011).
Apesar de estar associada com a redução dos casos e uma eficácia maior que 70%, as vacinas compostas por bacterinas estão associadas a efeitos colaterais, sistêmicos e locais, como dor, febre, e, ainda, pode estar relacionada com doenças autoimunes, como a uveíte (FAINE et al., 1999; SANCHES et al., 2000; KOIZUMI, WATANABE, 2005). Estes foram os motivos que levaram a China a testar uma nova formulação para a vacina, passando a utilizar o envelope
externo, a qual demonstrou menos efeitos colaterais e proteção quando comparado a bacterina (KOIZUMI, WATANABE, 2005). O Japão também utiliza tal formulação (YAN et al., 2003). Entretanto, independente da formulação, a imunização ainda é sorovar-específico, oferecendo uma proteção de curta duração e frequentemente necessita de várias doses. Assim sendo, a procura por uma vacina que ofereça proteção com ausência de efeitos colaterais, efetiva contra a leptospirose aguda e crônica é altamente desejável (KO, GOARANT e PICARDEAU, 2009). Atualmente, o foco está nas vacinas recombinantes, sejam elas de subunidade ou DNA, vetorizadas ou não.
Devido a essas limitações, diversos estudos têm focado no desenvolvimento de vacinas recombinantes contra leptospirose. As proteínas LipL41 e OmpL1 demonstraram proteção parcial quando co-administradas em hamsters (HAAKE et al., 1999). A lipoproteína de membrana externa LipL32, a proteína mais abundante na superfície da bactéria, já foi apresentada ao sistema imune via adenovírus (BRANGER et al., 2001) e BCG recombinante (SEIXAS et al., 2007), e na forma de vacina de DNA (BRANGER et al., 2005) e vacina de subunidade (SEIXAS et al., 2007; GRASSMANN et al., 2012), porém todas as estratégias apresentaram baixa eficácia. O potencial imunoprotetor de formulações vacinais com as proteínas Ligs combinadas a diferentes adjuvantes também já foi avaliado, apresentando os resultados mais promissores encontrados até então (DELLAGOSTIN et al., 2011).
A proteína LigA conferiu proteção esterilizante quando fusionada à glutationa-S-transferase e administrada com hidróxido de alumínio, porém esta não foi significativa (PALANIAPPAN et al., 2006). A porção C-terminal desta proteína (LigAni) protegeu 67-100% dos hamsters de desafio letal com Leptospira interrogans, utilizando adjuvante de Freund, porém não conferiu imunidade esterilizante (SILVA et al., 2007). Como vacina de DNA, este antígeno também foi protetor, mas novamente sem significância estatística. (FAISAL et al., 2008).
A lipoproteína LigB, foi avaliada para utilização no diagnóstico de leptospirose bovina por ELISA, no qual, 49% das amostras foram positivas, apresentando sensibilidade de 100% e especificidade de 97,1%. (SANKAR et al., 2010). A imunização com vacina de DNA codificando LigBrep resultou na sobrevivência de 62,5% dos hamsters contra a infecção letal. A vacina induziu
uma resposta de anticorpos IgG e, além disso , conferiu imunidade esterilizante em 80% dos animais sobreviventes.(FOSTER et al., 2013)
As vacinas de subunidade possuem vantagens como a produção de poucos efeitos colaterais, porém, também estão tradicionalmente ligadas a uma baixa resposta imune. A fim de contornar este problema, adjuvantes moduladores de resposta imune são comumente empregados nas formulações vacinais de vacinas de subunidade (McKEE et al., 2010). O adjuvante mais utilizado atualmente e o único permitido para a vacinação humana são os sais minerais de alumínio, tais como o hidróxido. Apesar de ser considerado um adjuvante pouco potente, o alumínio induz majoritariamente uma resposta Th2 (anticorpos IgG1) (LIU, 2010) e não está relacionada a série de problemas encontrados nos adjuvantes oleosos.
Mais estudos necessitam ser feitos a fim de se conhecer a melhor formulação assim como as características imunes geradas por este tipo de vacina. Atualmente, muitos dos trabalhos sobre vacinas para leptospirose são feitos em Mesocricetus auratus, tradicionalmente conhecido como hamster sírio capa dourada. Embora as cepas patogênicas de leptospira tenham a capacidade de infectar uma grande variedade de animais, o hamster sírio é o preferido por ser suscetível à infecção e também por apresentar resultados com melhor reprodutibilidade (HAAKE, 2006). O curso da infecção é muito parecido com o verificado em humanos, o modelo sofre de infecção aguda, apresentando síndrome pulmonar hemorrágica associada à leptospirose, além de ser bem caracterizado para a doença e aceito por órgãos regulatórios para testes de vacinas comerciais (DELLAGOSTIN et al., 2011).
2.8 Controle, diagnóstico e tratamento
O controle da leptospirose consiste basicamente em interromper a transmissão através da identificação da fonte e melhoramento das condições de higiene da população, bem como a vacinação das espécies acometidas pela doença. A primeira medida é extremamente difícil de ser implementada tendo em vista o grande número de animais reservatórios da bactéria e a extensa população de roedores, principalmente em regiões tropicais e subtropicais de
países em desenvolvimento, onde as condições básicas de higiene e saneamento tendem a ser precárias e o clima favorece a ocorrência de surtos (LEVETT, 2001; WHO, 2003).
Como alternativa para o controle da doença, tem-se as bacterinas, vacinas atualmente disponíveis contra leptospirose. Porém, estas vacinas são sorovares-específicas, sendo necessários estudos epidemiológicos contínuos para que se tenha conhecimento dos sorovares prevalentes numa determinada região e assim incluí-los da preparação da vacina. Além disso, esse tipo de vacina não é indicado para humanos em razão da sua elevada reatogenicidade, justificando o estudo para o desenvolvimento de novas vacinas visando o controle desta zoonose (FAINE et al., 1999; DELLAGOSTIN et al., 2011).
O diagnóstico clínico da doença é dificultado pelas variadas e inespecíficas formas de apresentação dos sintomas. O teste de microaglutinação (MAT - (microscopic agglutination test) é considerado padrão-ouro para diagnosticar a leptospirose. Contudo, este teste possui algumas desvantagens, como por exemplo, a necessidade de amostras de soro pareadas a fim de demonstrar a soroconversão no decorrer da doença, bem como de uma bateria de sorovares de referência a serem usados nas reações de aglutinação (WHO, 2003; MCBRIDE et al., 2005).
Outras técnicas utilizadas no diagnóstico laboratorial da leptospirose incluem: microscopia de campo escuro, imunofluorescência, ELISA, cultura e PCR. Porém, estes métodos também apresentam uma série de problemas, como baixa sensibilidade, visualização das leptospiras apenas no estágio inicial da doença, muito tempo para realização e obtenção do resultado e ineficiência em detectar o sorovar infectante (AHMAD et al., 2005; MCBRIDE et al., 2005). Alguns antígenos recombinantes de Leptospira spp. já foram avaliados quanto sua utilidade no sorodiagnóstico da leptospirose (FLANNERY et al., 2001).
Uma vez diagnosticado, o tratamento se dá através da administração de antibióticos. Casos graves da doença são tratados com penicilina intravenosa, enquanto que manifestações clínicas mais leves podem ser tratadas com antibióticos orais como amoxicilina, ampicilina, doxiciclina ou eritromicina. Leptospiras são sensíveis a um grande espectro de antimicrobianos in vitro,
porém, poucos tem sido avaliados em triagens clínicas in vivo (BHARTI et al., 2003; WHO, 2003).
2.9 Alvos vacinais
As proteínas de membrana externa (OMPs - outer membrane proteins) expostas na superfície das leptospiras são tidas como potenciais imunógenos. Dois tipos de OMPs foram caracterizados; as porinas, que são OMPs transmembrana e as lipoproteínas que estão ancoradas no espaço extracelular ou periplasmático da membrana externa (OM) por ácidos graxos covalentemente ligados a uma cisteína amino-terminal (ZUERNER et al., 2000). Este resíduo de cisteína é precedido por uma sequência sinal, indicando a lipidação das proteínas (HAAKE, 2000).
O fator característico de todas as lipoproteínas bacterianas é a sequência sinal na extremidade N-terminal seguida por uma cisteína (HAYASHI, WU, 1990). A sequência sinal é clivada por uma sinal peptidase II (SPaseII), também chamada lipoproteína sinal peptidase (Lps). Estes peptídeos sinais das lipoproteínas são similares aos peptídeos sinais das proteínas secretadas, que são clivados pela enzima sinal peptidase I (SPase I) (JUNCKER et al., 2003). A biossíntese das lipoproteínas consiste de três etapas: a transferência de um diacilglicerídeo pela diacilgliceril transferase, para o grupo sulfidrila da cisteína de uma prolipoproteína inalterada, clivagem do peptídeo sinal pela SPase II, formando uma apolipoproteína e, por fim, acetilação do grupo α-amino na porção N-terminal da apolipoproteína (SANKARAN, WU, 1994).
A divergência na sequência das lipoproteínas de espiroquetas, em relação às demais bactérias, inclui a região “lipobox” do peptídeo sinal, presente na porção C-terminal. Esta região é reconhecida pela enzima de modificação lipídica (SETUBAL et al., 2006) e modificações nesta sequência “lipobox”, resultam diferenças nas especificidades de sítio ativo das enzimas diacilgliceril transferase e Spase II, que transfere o grupo diacilgliceril para a cisteína e remove o peptídeo sinal, respectivamente (PAETZEL, DALBEY, STRYNADKA, 2002). A região C-terminal ou “lipobox” das espiroquetas possui quatro aminoácidos e compreende
a seguinte sequência: – (Leu, Ala, Ser) 4 – (Leu, Val, Phe, Ile) 3 – (Ile, Val, Gly) -2 – (Ala, Ser, Gly) -1 – Cys +1 – (HAAKE, -2000; SETUBAL et al., -2006).
As lipoproteínas bacterianas constituem um grande grupo de proteínas com várias funções, tanto estruturais como funcionais, como: adesinas, enzimas, proteínas de transporte, proteínas ligantes, toxinas e uma variedade de funções envolvidas com a virulência (MADAN, SANKARAN, 2002). Lipoproteínas de espiroquetas têm demonstrado ser antígenos capazes de induzir uma resposta imune protetora (HAAKE, 2000), confirmando sua importância na patogênese da leptospirose. Nestes microrganismos, as lipoproteínas são, comprovadamente, as mais proeminentes proteínas que compõem sua membrana celular. Exemplos dessa abundância são as proteínas OspA de Borrelia burgdorferi, causador da doença de Lyme, Tpp47 de Treponema pallidum, causador da sífilis e LipL32 componente da OM das espécies patogênicas de Leptospira spp (HOWE, MAYER, BARBOUR, 1985; CHAMBERLAIN et al., 1988; HAAKE et al., 2000).
O sequenciamento do genoma de L. interrogans sorovar Copenhageni, desenvolvido na China (REN et al., 2003) e no Brasil (NASCIMENTO et al., 2004), lançaram a base para a era pós-genoma. Este trabalho relacionou mais de 264 ORFs (open reading frame – fase aberta de leitura), que codificam proteínas associadas à membrana (NASCIMENTO et al., 2004).
No estudo realizado por Hartwig e colaboradores (2011),a análise in silico foi utilizada para identificar lipoproteínas potencialmente protetoras de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. Oito prováveis lipoproteínas foram selecionados, clonados e expressadas em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade. As proteínas recombinantes foram utilizadas para inocular ratinhos, e a subsequente resposta imune humoral foi avaliada por ELISA. Sete das potenciais lipoproteínas induziram uma resposta significativa de IgG. Além disso, todas as proteínas recombinantes foram reconhecidos por anticorpos presentes nos soros de pacientes graves leptospirose. (HARTWIG et al., 2011)
Felix et al (2011) avaliou 27 antígenos recombinantes para determinar seu potencial para induzir uma resposta imune protetora contra a leptospirose no modelo hamster. Treze antígenos induziram respostas imunes protetoras, no entanto, somente as proteínas recombinantes rLIC10325 e rLIC13059 induziram proteção significativa contra a mortalidade.
Em estudo apresentado por Vieira et al (2007) é evidenciado que a proteína LIC10365, é expressa pela L. interrogans dentro dos túbulos renais de cobaias experimentalmente infectados. Além disso, a regulação da expressão de moléculas de adesão intracelular 1 (ICAM-1) e a expressão de E-selectina foi observada após o tratamento de células endoteliais cultivadas com rLIC10365.
O aumento da expressão de moléculas de adesão celular (CAMs) induzida pela proteína recombinante e a detecção da proteína de leptospira em animais infectados experimentalmente são difíceis de comparar de uma maneira oportuna, porém em estudo anterior apresentado por Sellati e colaboradores (1996) apenas a forma lipídica da proteína recombinante de OspA de Borrelia burgdoferi era capaz de promover a regulação positiva de CAMs. No estudo de Vieira et al (2007) o aumento da expressão de ICAM-1 e expressão de E-selectina foi induzido pela proteína não lipídica em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECS), sugerindo que o agrupamento lipídico não está envolvida nesta interação. Estes resultados indicam que LIC10365 desencadeia a ativação das células, promovendo a expressão de ICAM-1 e E-selectina , que são moléculas de adesão essenciais para a interação célula-célula e célula-matriz extracelular, e também, para recrutamento de neutrófilos e migração de células através do endotélio.
É amplamente conhecido que muitas bactérias patogênicas infectam os tecidos do hospedeiro através da sua capacidade de se ligar aos CAMs e exploram estes receptores como um meio de absorção. Com base nestas afirmações e o fato de que LIC10365 é expressa durante a infecção, é possível que a proteína codificada pelo gene lic10365 possa desempenhar um papel importante durante a patogênese, explorando a expressão dos receptores da célula hospedeira e proporcionando assim um possível mecanismo para algumas das características inflamatórias relacionada com o dano endotelial observada na leptospirose.
Pretre et al (2012) demonstrou que tal como observado para outros antígenos de leptospiras (GOMEZ et al., 2008; ATZINGEN et al., 2008, 2009; HAAKE et al., 2000), o antígeno LIC11207 foi identificado no lúmen tubular e associado com células inflamatórias infiltradas em rins de hamsters infectados experimentalmente, indicando que esta proteína é expressa durante a infecção
nesse modelo experimental. Neste mesmo estudo, observou-se que os soros convalescentes de pacientes com leptospirose apresentaram uma resposta moderada, porém significativa a rLIC11207, sugerindo que esta proteína é expressa durante a infecção em seres humanos.
Além disso, rLIC11207 parece ter um efeito anti-apoptótico específico nos leucócitos polimorfonucleares. Uma vez que o papel de neutrófilos durante a leptospirose ainda é desconhecido, o significado fisiopatológico de um prolongamento de sua vida útil continua a ser investigado (PRETRE et al., 2012). Pode ser especulado que o atraso na apoptose de neutrófilos desencadeada pelo patógeno no hospedeiro infectando células pode modular a replicação dos microrganismos e a persistência da infecção. A este respeito, uma sobrevivência de neutrófilos aumentada poderia contribuir para a quebra de barreiras de tecido, resultando em uma maior disseminação do patógeno no hospedeiro (HILBI et al., 1998; HERSH et al., 1999) . No entanto, mais experimentos são necessários para esclarecer se LIC11207 tem um papel durante a infecção in vivo.
O fibrinogênio (Fg) é a principal proteína de coagulação presente no plasma sanguíneo com um importante papel na coagulação. Vários estudos têm sugerido o papel do Fg e do plaminigênio (PLG) diante das interações bacterianas com o hospedeiro (LAHTEENMAKI et al., 2001). O sistema fibrinolítico gerado a partir de plasmina (PLA) e PLG decompõe o coágulo através da degradação de fibrina (WEISEL, 2005). Este sistema é regulado negativamente por inibidores do ativador PLG. O equilíbrio entre o sistema de coagulação e anticoagulação é necessária para evitar condições fisiopatológicas, tais como, hemorragia e trombose (SUN, 2006).
Estudo realizado por Oliveira et al (2013) sugeriu que a adesão de L. interrogans ao Fg demonstrou ser induzida por osmolaridade fisiológica, mas o efeito desta ligação na formação do coágulo de fibrina não foi avaliada. Este mesmo trabalho relatou que L. interrogans sorovar Copenhageni é capaz de ligar Fg humano na sua superfície. Além disso, também demonstrou que a proteína rLIC 11360 vinculada ao PLG tem capacidade de se ligar ao Fg e inibir a formação do coagulo de fibrina. O estudo mostrou que a interação da proteína com Fg, promoveu uma inibição sobre a formação de coágulos de fibrina induzida pela trombina. Este efeito inibidor sobre a formação de fibrina foi parcial,
semelhante ao efeito de LigB, fragmento 7-12, empregado no trabalho como controle positivo, e que também já foi relatado por Choy et al (2011) usando LigB, fragmento 9-11.
Os dados de Oliveira et al (2013) sugerem que a interação de leptospiras com o sistema fibrinolítico ocorre com virulência atenuada e cepas saprófitas de Leptospira spp. in vitro. Além disso, demonstrou-se que esta associação torna as bactérias com atividade proteolítica capazes de degradar os componentes da membrana celular externa.
Várias proteínas de membrana foram identificadas como receptores de PLG capazes de gerar PLA na presença de ativador, sugerindo que a interação com o sistema fibrinolítico pode ser importante durante a leptospirose (VIEIRA et al., 2010; VERMA et al., 2010; MENDES et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011). Tem sido sugerido que estes resultados estão possivelmente associados ao dano tecidual grave, lesão endotelial vascular ou uma produção de compensação hepática em resposta à utilização de Fg aumentada.
Além disso, pacientes de leptospirose com sangramento clínico apresentam contagens de plaquetas baixas, quando comparado com outros pacientes (CHIERAKUL et al., 2008) uma condição que ajudaria a diminuir a trombose, facilitaria o sangramento e ajudaria a disseminação bacteriana.
Estes dados fornecem evidências moleculares dos mecanismos que as leptospiras podem vir a empregar para interagir com os componentes da cascata de coagulação e com o sistema fibrinolítico. Estes resultados devem contribuir para a compreensão da coagulopatia, observado durante a leptospirose.
3 Metodologia
3.1 Cepas, condições de cultivo, extração de DNA e bacterina
A cepa patogênica utilizada neste estudo foi Leptospira borgpetersenii sorovar Ballum 4E. As leptospiras foram cultivadas em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco®) enriquecido com 10% de suplemento comercial (Difco®) e mantidas a 29 °C em estufa bacteriológica (B.O.D) sob condições aeróbicas. Foram realizados repiques semanais da cultura, acompanhados de contagem de células bacterianas em câmara de Petroff-Hausser (Thomas Scientific®), onde 108 células foram centrifugadas e utilizadas para extração de DNA genômico utilizando o kit comercial illustraTM bacteria genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare®).
As cepas utilizadas para clonagem e expressão foram Escherichia. coli TOP10 (Invitrogen®) e E. coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen®). Estas cepas foram cultivadas a 37 °C em meio Luria-Bertani (LB) (1% triptona, 0,5% extrato de levedura, 0,5% NaCl e 1,5% agar) sob agitação de 200 rpm ou acrescido de 1,5% de ágar e, quando necessário, suplementado com 100 μg.mL-1
de ampicilina. A fim de obter bacterinas para a vacinação dos animais, 1x108 células de L. borgpetersenii sorovar Ballum 4E foram inativadas por calor, 56 °C por 30 min, centrifugadas a 10000 g por 10 min, lavadas duas vezes com tampão fosfato salino (PBS) estéril e ressuspendidas em 200 μL de PBS estéril.
3.2 Escolha de LICs e desenho dos primers
A partir das informações genômicas disponíveis no banco de dados GenBank (NCBI) foram selecionadas 4 sequências codificadoras. A escolha foi feita a partir de informações sobre as proteínas correspondentes, obtidas em análises no banco de dados UniProt Knowledgebase (UniProtKB). Os requisitos
desejáveis para inclusão de uma sequência codificadora no trabalho foram: proteínas de membrana externa expostas na superfície, prováveis lipoproteínas, cuja função esteja relacionada a algum processo patogênico e que ainda não foram avaliadas quanto à imunoproteção.
Uma vez escolhida a sequência, foram desenhados primers com o auxílio do software Vector NTI 11 (Invitrogen®). Cada primer adicionou a uma extremidade da sequência alvo um sítio para enzima de restrição que permitiu a clonagem no vetor pAE de expressão heteróloga em E. coli. Quando presente, a sequência para o peptídeo sinal não foi incluída na porção do gene amplificada. Na Tabela 1 encontra-se a relação das sequências dos primers e o tamanho da sequência esperada, além do tamanho em kDa da proteína codificada.
Tabela 1 - Sequência dos primers utilizados nas amplificações por PCR, tamanho do gene esperado.
Genes Sequencia dos primers Tamanho do gene (pb)
lic10260 F CGGGATCCCAAAATGTAAAACGAATCTC 350 R GGGAAGCTTTTAAGGAGATGATTGAACCG lic10365 F CGGGATCCAGCGGCGAAACAGT 1080 R GGGAAGCTTTTATTTACAAGCGTTTGGAGC lic11207 F CGGGATCCAATGAAGGAGGAAATGAAAAT 1015 R GGGAAGCTTTTAGTTACAAGCTCCCGAAGC lic11360 F CGGGATCCTTGATTTTTTTGTTAAGCGG 596 R GGGAAGCTTTTATTTTTCCAAATAGAAGGAATCT
3.3 Amplificação dos genes por reação em cadeia da polimerase (PCR)
As sequências codificadoras dos genes selecionados foram amplificadas pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como molde o DNA genômico de Leptospira borgpetersenii sorovar Ballum 4E e a enzima Taq DNA Polimerase (kit GoTaq Coloress Master Mix - ProMega®), num volume final de 25 μl de reação. As reações de PCR foram realizadas usando 35 ciclos de desnaturação (95 °C), anelamento (56 °C) e extensão (72 °C). O produto da reação foi purificado com kit comercial (illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification kit – GE Healthcare®) e visualizado por eletroforese em gel de agarose 1%.
