TÍTULO: PADRONIZAÇÃO DE TESTE DIAGNÓSTICO PARA DETECÇÃO DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): KATHARYNA CARDOSO DE GOIS AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): FLÁVIA DE SOUSA GEHRKE ORIENTADOR(ES):
Resumo
Introdução: O vírus da febre amarela (YFV) é um arbovírus que pertence à família Flaviviridae. O YFV tem dois ciclos distintos: o silvestre e o urbano. Neste último o
homem é o principal hospedeiro e tem como vetor o Aedes aegypti. A manifestação clínica é bifásica, na primeira há sintomas inespecíficos (febre, cefaleia, mialgia ou é assintomática). Na segunda: febre alta, comprometimento do fígado com manifestações hemorrágicas e icterícia. O Brasil tem se tornado epidêmico para YFV devido à expansão da área de circulação do vetor urbano. De julho de 2017 a junho de 2018 foi confirmado 1.266 casos, destes 415 óbitos. O aumento do número de casos justifica o incremento de um método de diagnóstico laboratorial rápido, sensível e com baixo custo. Objetivo: Padronizar um método de diagnóstico molecular laboratorial da YF em amostras de sangue. Material e métodos: A extração do RNA total foi realizada com o kit QIAamp Viral RNA Mini, o RNA foi convertida em DNA complementar utilizando o kit QuantiNova Reverse Transcription. A reação de RT-PCR foi realizado no termociclador ABI 7500 com auxílio de um par de primer específico. Resultados: Das amostras testadas 6/20 (30%) foram positivas e 14/20 (70%) negativas. Dentre os pacientes positivos um tinha sido vacinado recentemente o que demonstrou a capacidade do teste em detectar tanto o vírus selvagem como a cepa 17D utilizada na vacina. Os testes sorológicos também identificaram os mesmos 6/20 reagentes para IgM. Conclusão: Foi possível padronizar um teste rápido e sensível através da metodologia proposta. Os pacientes que foram positivos 6/20 nos testes de triagem (teste rápido e imunofluorescência) foram positivos nos testes de RT-PCR inclusive um paciente que foi recentemente vacinado. Demonstrando a capacidade do primer de detectar o vírus selvagem e o vírus atenuado da cepa 17D utilizada nas vacinas.
Palavras-chave: Febre Amarela, Arbovírus, Infecções por flavivirus, Diagnóstico,
Abstract
Introduction: The yellow fever virus (YFV) is an arbovirus belonging to the family Flaviviridae. The YFV has two distinct cycles: the wild and the urban. In the latter
man is the main host and has as vector the Aedes aegypti. The clinical manifestation is biphasic, in the first there are non-specific symptoms (fever, headache, myalgia or is asymptomatic). In the second, high fever occurs, liver involvement with hemorrhagic manifestations and jaundice. In recent years Brazil has become an epidemic for YFV due to the expansion of the urban vector circulation area. From July 2017 to June 2018, 1.266 cases were confirmed, out of 415 deaths. The increase in the number of cases justifies the increase of a quick, sensitive and low cost laboratory diagnostic method. Objective: To standardize a laboratory molecular diagnostic method of YF in blood samples. Material and methods: Total RNA extraction was performed according to the kit QIAamp Viral RNA Mini, the RNA was converted into complementary DNA using the QuantiNova Reverse Transcription kit. The RT-PCR reaction was performed in the ABI 7500 thermal cycler with the aid of a specific primer pair. Results: Of the samples tested 6/20 (30%) were positive and 14/20 (70%) negative. Among the positive patients one had been vaccinated recently which demonstrated the ability of the test to detect both the wild virus and the 17D strain used in the vaccine. Serological tests also identified the same 6/20 reagents for IgM. Conclusion: It was possible to standardize a rapid and sensitive test through the proposed methodology. Patients who were positive 6/20 in the screening tests (rapid test and immunofluorescence) were positive in the RT-PCR tests including a patient who was recently vaccinated. Demonstrating the ability of the primer to detect the wild virus and the attenuated strain 17D virus used in the vaccines.
Key-Words: Yellow Fever, Arboviruses, Flavivirus Infections, Diagnosis, Aedes and
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1. INTRODUÇÃO
O vírus da febre amarela (YFV) pertence à família Flaviviridae e ao gênero
Flavivirus1. O YFV tem capsídeo icosaédrico envolto por uma bicamada lipídica. No envelope é expresso dímeros da proteína envelope (E), glicoproteínas e proteína de membrana (prM). Tem diâmetro aproximado de 40 nanômetros (nm) com projeções de superfície de cinco a dez nm. A glicoproteína E é o principal componente da superfície e possui atividades biológicas (ligação ao receptor de superfície celular, montagem da estrutura, fusão com células do hospedeiro)2. O genoma viral é composto por uma única fita de RNA de polaridade positiva com 11 kb de comprimento, composto por dez genes que codificam três proteínas estruturais Capsídeo (C), Pré-membrana (prM) e Envelope (E) e sete não estruturais: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS51,2,3. O YFV foi isolado pela primeira vez em 1927 a partir do soro de um macaco Rhesus, através da inoculação do sangue de um paciente africano chamado Asibi e a cepa YFV Asibi é utilizada até hoje4. O cultivo da cepa YFV Asibi em diferentes tecidos levou a identificação da cepa 17D. Desde 1937, utiliza-se a vacina 17D feita de vírus vivo atenuado, sendo considerada uma das vacinas mais eficazes já produzidas, pois induz a produção de anticorpos neutralizantes em 90% dos receptores em dez dias e 99% em 30 dias4,5,6.
O YFV tem dois ciclos: o silvestre e o urbano. No silvestre tem como hospedeiro o macaco onde o vírus é transmitido pela picada do mosquito infectado do gênero Haemagogus, Sabethes e/ou Aedes. No ciclo urbano o homem é o principal hospedeiro e tem como vetor a espécie Aedes aegypti2,7,8,9.
A manifestação clínica é bifásica, a primeira ocorre após o período de incubação três a seis dias que corresponde a viremia e o aparecimento de sintomas inespecíficos (febre, cefaleia, mialgia) ou também pode ser assintomática e evoluir para cura. A segunda é o “período de intoxicação” e ocorre febre alta, vômitos, dor epigástrica, comprometimento do fígado gerando manifestações hemorrágicas como petéquias, equimoses e icterícia que distingue a YF de outras febres hemorrágicas virais e danos renais causando insuficiência renal aguda em que 20 a 60% dos pacientes vão à óbito 2,7,8,9.
As epidemias urbanas de YF ocorreram mais expressivamente ao longo da história na Europa, África e América2,7. Na África a YF continua a ser um enorme fardo, pois há muitas áreas endêmicas. Entre 1980 e 2012 foram notificados 150
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surtos em 26 países. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que dos 200.000 casos mundiais 90% tenha ocorrido no continente2,7.
O Brasil tem se tornado potencialmente epidêmico para YF devido à expansão da área de circulação do vetor urbano o Aedes aegypti10. Entre 2012 e 2013 a maior parte de casos suspeitos notificados foi na região Sudeste (143) seguido pela região Centro-Oeste (52) e na região Sul (43). O maior índice de notificações em regiões não endêmicas se deve a tais regiões terem sido afetadas entre 2007 e 2008 durante a re-emergência do YFV fora da região Amazônica10. Em 2015 foram confirmados oito casos de YF no Brasil com cinco mortes. Os casos ocorreram nos estados de Goiás, Mato Grosso do Sul, Pará e um caso não localizado11. No período de monitoramento julho/2016 a junho/2017, foram confirmados 777 casos humanos e 261 óbitos, o que evidencia a dispersão do vírus e um aumento da área endêmica para YF12. Os dados epidemiológicos atuais sobre a YF no país correspondem ao intervalo entre 1° de julho de 2017 a 30 de junho de 2018, sendo que foram confirmados 1.266 casos, destes 415 vieram a óbito. Neste período entre casos suspeitos foram notificados 6.589, sendo que 1.232 permanecem em investigação13.
2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi a padronização de um método diagnóstico molecular laboratorial rápido e sensível para febre amarela. Para tanto, os seguintes objetivos específicos foram desenvolvidos:
a. Padronizar e validar um método molecular de diagnóstico;
b. Relacionar os resultados laboratoriais com as demais variáveis clínicos epidemiológicas.
3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Pacientes
O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa (CEP), sob o número 2.338.566. Foram testadas 20 amostras de pacientes com sintomatologia suspeita para febre amarela, encaminhados pela rede pública de saúde do município de Santo André.
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3.2. Amostra Controle
A amostra controle foi cedida pelo laboratório de Virologia Clínica e Molecular do Instituto de Ciências Biomédicas II da Universidade de São Paulo (ICB II – USP), sobre a responsabilidade do Prof. Edison Luiz Durigon. Amostra de RNA caracterizada como YFV/ICB II, obtida por meio de cultura de célula VERO.
3.3. Extração de RNA e Síntese de RNA
De cada paciente foi coletado 5 mL de sangue periférico por venopunção, em tubo com EDTA. O RNA total foi obtido utilizando o kit QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen), conforme o protocolo do fabricante. A concentração de RNA total foi estimada através de leitura espectrofotometrica no equipamento NanoDrop™ Lite (GE Health Care).
A síntese de DNA complementar (cDNA) das amostras foi realizada a partir de um micrograma de RNA total utilizando a o kit QuantiNova Reverse Transcription (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante.
3.4. RT-PCR
As reações de amplificação foram realizadas em um termociclador ABI Prism 7500 (Applied Biosystems). Para cada reação, as seguintes condições de amplificação foram utilizadas: 1X o tampão de SYBR Green, 0,40 μM de oligonucleotídeos (senso TGCCATGCCACCCTAACTTA-3’ e antisenso 5’-CCCAACCTCTAGCGGCTATG-3’; produto: 252 pares de base) e 2,0 μL de cDNA diluído 10X, em 15 μL finais de reação . O perfil térmico utilizado foi de um passo inicial de 950 C por 10 minutos e 45 ciclos de 950 C, 15 segundos e 61 0 C, 60 segundos. A eficiência da reação foi determinada através da diluição seriada da amostra controle.
4. RESULTADOS
No laboratório da FMABC foram analisadas 20 amostras suspeitas de febre amarela com quadro clínico compatível com arboviroses. O RNA foi extraído e quantificado no equipamento NanoDrop™ Lite (GE Health Care), variando entre 0,153 µg/µL e 1,24 µg/µL. Este foi convertido em cDNA com auxílio do kit QuantiNova Reverse Transcription (Qiagen), utilizando 1μg de RNA. Na reação de
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RT-PCR, após a padronização da concentração dos oligonucleotídeos a concentração ideal foi de 0,40 μM. Na figura 1 observa-se a curva de amplificação para o fragmento do gene que codifica proteína não estrutural 3 (NS3) do vírus YF e a curva de melting (dissociação).
Figura 1 - Amplificação do fragmento do gene que codifica a proteína NS3 do vírus
YF (YFV/ICB II).
a) Curva de amplificação b) Curva de Melting
Fonte:Arquivo Pessoal
Para verificação da especificidade do oligonucleotídeo foi realizado um teste cruzado (RT-PCR). Neste teste o mesmo par de primers foi utilizado com diferentes amostras controles de cDNA de vírus. Não foi detectado amplificação do fragmento alvo em nenhuma amostra, exceto com o cDNA de YF, Tabela 2.
Tabela 2: Teste cruzado entre o oligonucleotídeo e outras arboviroses
YFV Dengue 1 Dengue 2 Dengue 3 Dengue 4 Zika Chikungunya
Detectado ND ND ND ND ND ND
ND: Não detectado
Das amostras testadas 6/20 (30%) foram positivas para o gene pesquisado e 14/20 (70%) negativas para os genes pesquisados. Dentre os 6/20 pacientes positivos um havia sido vacinado recentemente o que demonstrou a capacidade do oligonucleotídeo especifico detectar tanto o vírus selvagem como a cepa 17D utilizada nas vacinas. Na figura 3 observa-se a curva de amplificação para o fragmento do gene que codifica NS3 do YFV dos pacientes positivos. Os testes sorológicos também identificaram 6 (30%) amostras reagentes para IgM positivo
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para febre amarela e 14 (70%) amostras foram não reagentes, demonstrando uma concordância nos resultados.
Figura 3 – Curva de amplificação dos pacientes positivos para YFV.
Fonte: Arquivo Pessoal
Para confirmar a validade do teste, os resultados obtidos foram comparados com os testes realizados pelo Instituto Adolfo Lutz (padrão ouro). E os resultados demonstraram 100% de sensibilidade e 100% de especificidade.
5. DISCUSSÃO
Atualmente o método de diagnóstico mais utilizado é a detecção de anticorpos (Ac) contra a YFV por ELISA, que fornece um diagnóstico presuntivo de YF. Desta forma, há limitações no teste, pois pode ocorrer a reatividade cruzada entre Ac para outros Flavivirus14, além disso, em áreas endêmicas a imunização contra outros Flavivirus é comum. O IgM produzido muitas vezes se encontra abaixo do limiar de detecção dos testes de ELISA, especialmente em infecções secundárias. Após infecções por YFV, Ac IgM pode persistir circulante por longos períodos, um ano ou mais, sendo um marcador não confiável para infecções recentes15. O diagnóstico da YF é difícil principalmente no período primário da infecção por apresentar um quadro clinico inespecífico como febre, dor muscular e cefaleia. E nos casos graves a sintomatologia pode ser confundida com malária, leptospirose, hepatites virais (especialmente nos casos fulminantes) e com outras febres hemorrágicas9.
O desenvolvimento de ferramentas moleculares para diagnóstico tem avançado significativamente. O nosso teste demonstrou alta sensibilidade e especificidade do RT-PCR quantitativo em tempo real para a pesquisa do YF subjaz
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as atuais abordagens para o diagnóstico da YF, devido ser um teste rápido e mais preciso, pode detectar o YFV em amostras clínicas com baixa concentração de vírus16,17,18. O nosso teste possibilitou um resultado em 24 horas, sendo de extrema importância para os casos de urgência. Um estudo recente utilizando a técnica de qRT-PCR detectou a presença do YFV em amostras de urina e sêmen de um paciente 10 dias após a infecção. Este resultado sugere que o urina pode ser um material clínico útil para o diagnóstico de YF e indica a necessidade de testar mais amostras pacientes infectados19. Entretanto, o nosso teste possibilitou o laudo em 24 horas após a consulta clínica. Recentemente, um teste de RT-PCR LAMP foi usado para detectar o genoma do YFV20. Outro estudo estabeleceu um protocolo alternativo para detecção de YFV em um local onde não havia capacidade de refrigeração das amostras durante investigação de campo, a abordagem é baseada em ensaio de amplificação por polimerase recombinase (RPA). A sensibilidade e especificidade eram boas, e a abordagem promete ser útil para detecção de YFV em áreas remotas endêmicas, especialmente na África21. Porém com o nosso teste foi possível um diagnóstico 100% sensível e 100% específico, detectando apenas o fragmento do gene que codifica a proteínas NS3 do YFV.
6.CONCLUSÃO
A Febre Amarela é uma doença viral infecciosa grave, onde 20-60% dos pacientes podem evoluir para o óbito. Atualmente no Brasil o YFV circula em regiões metropolitanas do país com maior contingente populacional. Estão sob risco 35,9 milhões de pessoas que moram em áreas que nunca tiveram recomendação de vacina13.
Neste projeto foi possível:
- padronizar um teste rápido e sensível através da metodologia proposta. - os pacientes que foram positivos 6/20 nos testes de triagem (teste rápido e imunofluorescência indireta) foram positivos nos testes de RT-PCR inclusive um paciente que foi recentemente vacinado. Demonstrando a capacidade do primer de detectar o vírus selvagem e o vírus atenuado da cepa 17D utilizada nas vacinas. Desta forma o uso de metodologias mais rápidas e eficientes são importantes para o diagnóstico da doença.
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