Avaliação comportamental de camundongos submetidos ao modelo de transtorno por estresse pós-traumático: uma abordagem emocional e bioquímica

Murilo Luiz Cerutti

AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE TRANSTORNO POR ESTRESSE PÓS-TRAUMÁTICO: UMA ABORDAGEM

EMOCIONAL E BIOQUÍMICA

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Neurociências.

Orientador: Prof. Dr. Adair Roberto Soares Santos

Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Bainy Leal

Florianópolis 2014

AGRADECIMENTOS

Sempre tive a certeza de que tão importante quanto o resultado final obtido ao término destes dois anos de muito trabalho e estudo, é reconhecer, e ter a plena convicção de que caminhar sozinho é demasiadamente difícil e que por muitas vezes os obstáculos do caminho são intransponíveis sem a ajuda, presença ou mesmo o pensamento positivo de algumas pessoas, que passam a ocupar um lugar muito importante ou mesmo fundamental em nossas vidas.

Estes seis anos fora de casa me ensinaram muitas coisas, proporcionaram-me experiências das quais jamais esquecerei, conheci pessoas especiais, vivi momentos especiais, e tenho certeza que tudo isso foi importante para minha formação tanto profissional quanto pessoal, sendo fundamental para lapidar meus conceitos, meu caráter. Seria simplesmente impossível transcrever em poucas linhas todas as palavras que eu gostaria de dirigir a tantas pessoas, mas farei o possível.

Inicio agradecendo ao meu nôno, Selvino in memória e a minha nona Deonira. Por vezes em momentos difíceis me agarrei a recordações de vocês. Carrego um pouco de vocês dois comigo, sempre e para sempre. A minha nona Maria in memória, nona, eu gostaria de ter a metade da fibra que a Sra tem, ser forte, guerreiro e batalhador como a Sra. Em momentos de fraqueza, a Sra serve de inspiração.

Aos meus queridos pais Vander e Odete, a vocês pai e mãe, devo, além do dom da vida também a educação, o caráter, a dignidade, o respeito, a força de vontade, a esperança. Vocês me ensinaram os valores que um homem deve possuir. Vocês me ensinaram que a honestidade não tem preço, e sem ela, não somos ninguém. A vocês que por diversas vezes privaram-se do próprio conforto em favor do meu, a vocês que não fizeram nada mais na vida do que batalhar para proporcionar a mim aos meus irmãos uma vida melhor do que a que vocês tiveram. Nas vezes em que pensei em desistir era em vocês que eu pensava, e isso me fortalecia. Obrigado por tudo pai e mãe, eu amo muito vocês, e se um dia eu puder ensinar aos meus filhos metade dos valores que aprendi com vocês, já me darei por satisfeito!

Aos meus irmãos de sangue, Maicon e Thais, que mesmo distante sempre me incentivaram e me motivaram e aos meus outros irmãos Karen e Luiz, obrigado pelo apoio sempre! Mesmo ao ―malinha sem alça‖ do Jhonatan ―piti‖ sei que também posso sempre contar com você!

Agradeço a Dandara, minha namorada por 9 anos (agora esposa) pessoa que eu amo muito, que me apoia em tudo, me da força, está comigo em todos os momentos. Amor, não tenho palavras para descrever o quanto seu carinho e seu conforto foram importantes para mim, com ele toda a jornada foi menos árdua e mais fácil de ser superada. Agora chega de brincar de namorados, agora é vida nova, literalmente. Espero viver muitos e muitos anos ao seu lado, do mesmo jeito que vivemos até hoje.

Tive a grande sorte de ter cruzado com pessoas incríveis ao longo da vida. Acredito que um homem pode ter tudo na vida, mas se ele não tiver amigos ao seu redor, ele jamais será feliz por completo. Eu tenho o prazer e a honra de ter como amigos pessoas como o Paulo, o Róger e a Mayara, o Beto e a Mimi‘s. Incrivelmente, entra ano e sai ano nós continuamos unidos. Não existem palavras para estimar o quanto vocês são importantes para mim, por isso agradeço a todos vocês.

Durante a faculdade fiz amizades das quais jamais esquecerei. Na turma 2008-1 de farmácia conheci pessoas do mais alto gabarito no quesito parceria, honestidade e companheirismo. Agradeço a todos vocês Serjão, Juju, Mococa, Adriana, Mayara, Fernanda, Samara, Bianca, Camila e Greici, o companheirismo de vocês foi fundamental para o meu crescimento e amadurecimento pessoal.

Durante o quinto semestre de faculdade, decidi que experimentaria a área de pesquisa. E foi então que descobri outra grande paixão, além das ciências farmacêuticas. Em meados de fevereiro de 2010 conheci o Ney que me mostrou esse fantástico mundo da pesquisa, Ney te agradeço por todos os ensinamentos, pela paciência, pelo companheirismo, pelas diversas vezes que você me incentivou, diminuindo as minhas dificuldades e buscando sempre enaltecer o que eu tinha de melhor, por me ensinar que o melhor calçado a se usar é o ―kichute branco‖, sem palavras, apenas muito obrigado por ter cruzado um dia o meu caminho.

Agradeço imensamente ao Ginho, e ao Gaúcho (vulgo nêne gordinho). Vocês dois foram meus irmãos durante todo o tempo. Sempre estiveram ao meu lado, aprendi muito com vocês, desde a história política do Brasil as 3:00 da manhã num posto de gasolina, até como fazer uma formalina e extrair um hipocampo. Aos demais AMIGOS do LANDI, aos quais infelizmente não posso me dirigir individualmente por uma questão de tamanho que ficaria esta sessão da dissertação. Marina, Franciane, Fernanda, Ana, Rafaela, Catarina, Tátila, Isis, Deise, Róli, Bruno, Ígor, Josiel, Mariza, Ari, Daniel, Leidi, Chico, Tatiane,

Bira, Morgana, junto com todos vocês, esses anos de laboratório foram muito mais divertidos, obrigado, de coração a todos.

Aos amigos que fiz no LIDOc, Katia, Thayz, Cris e especialmente a Amandinha, esta que veio de tão longe para trazer alegria a todos nós e me mostrou que a vida pode ser mais bela e doce do que eu estava acostumado a ver e sentir, seu carinho e companheirismo foram essenciais nesta jornada.

Não poderia deixar de mencionar aqui meu grande amigo e mestre professor Dr Adair, prof Ada para os mais chegados. Muito obrigado professor por ter apostado em mim, por não ter me deixado desistir (o Sr sabe do que eu estou falando), por ter acreditado e confiado na minha capacidade. Quero que saiba, que antes de orientador e mestre, eu o tenho como um amigo. Por tudo o que o Sr fez por mim eu lhe agradeço muito.

Ao grande professor Dr Rodrigo, que me recebeu de braços abertos em seu laboratório, esteve sempre pronto para colaborar como fosse possível para o meu aprendizado e aperfeiçoamento, obrigado professor, são pessoas como o Sr que nos fazem acreditar que vale a pena seguir essa carreira, que por muitas vezes, é ingrata àqueles que dedicam uma vida inteira ao crescimento dos outros. Agradeço muito a Ana Paula, Ana nós que fomos colegas durante a graduação em bioquímica, somos agora colaboradores do mesmo trabalho. Foi um grande prazer trabalhar e aprender com você, sem sua ajuda, paciência e dedicação, não seria possível a elaboração deste trabalho.

Não poderia deixar de concluir esta etapa do trabalho sem agradecer de coração a Dona Vilma e ao Sr Carlos, nossos grandes amigos e colaboradores no CCB. A dedicação de vocês ao trabalho faz de vocês peças fundamentais para o andamento do departamento.

O que dizer do Nivaldinho no comando da secretaria??? Nivaldo, o pequeno grande homem da PGN. Obrigado por tudo!!!

Agradeço ainda a Universidade Federal de Santa Catarina por ter me acolhido durante estes anos maravilhosos. Agradeço ao CNPq pelo apoio financeiro.

Aos camundongos utilizados neste trabalho, ferramentas de estudo, que por muitas vezes foram minhas únicas companhias durante as horas de experimento, meus sinceros agradecimentos e meu profundo respeito.

Dedico este trabalho aos colegas cientistas. Cientistas por amor, por paixão! A ciência não é construída apenas por verdades impostas e provadas numa bancada de laboratório, mas também pela dedicação, perseverança, boa vontade e ética de poucos.

RESUMO

O Transtorno por Estresse Pós-Traumático (TEPT) é um transtorno mental causado por um fator inicialmente estressante, como acidentes automobilísticos, assaltos, guerras, desastres naturais, entre muitos outros exemplos. Os principais sintomas são ansiedade (caracterizada por hiperexcitação, vigília e medo) quando as experiências do indivíduo de algum evento traumático são revividas. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar um modelo de indução de transtorno por estresse pós-traumático (TEPT) em camundongos, por meio de observação emocional (in vivo) e avaliação bioquímica (ex vivo). Para tal, foram utilizados camundongos Swiss machos (25-35 g) submetidos a uma série de cinco choques elétricos (0,8 mA e duração de 10 s). Estes animais foram expostos novamente ao mesmo aparelho 1, 6 e 24 horas, 7 e 14 dias mais tarde. Imediatamente após a reexposição, avaliou-se o estado de medo, ansiedade e depressão. Em seguida, o hipocampo foi removido para aferir a concentração de proteínas envolvidas na neuroplasticidade. Este protocolo foi capaz de induzir um comportamento excessivo de medo nos animais quando foram reexpostos ao aparelho gerador de choque. Além disso, os animais apresentaram comportamento de ansiedade e depressão avaliados no labirinto em cruz elevado e no nado forçado, respectivamente.

A análise bioquímica mostrou elevação da concentração de BDNF 24 h após a série de choques e imediatamente após a reexposição, bem como um aumento da concentração de CREB 1 e 6 h após os choques. Além disso, observou-se uma redução da concentração 24 e 1 h da caspase 8 e de p38 MAPK após os choques, respectivamente.

Assim, conclui-se que o modelo utilizado induziu mudanças comportamentais (medo, ansiedade e depressão) e bioquímicas condizentes com os sinais observados em humanos, sugerindo que ele pode ser útil para se estudar a fisiopatologia e o tratamento do TEPT

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ABSTRACT

Post-Traumatic Stress Disorder (PTSD) is a mental disorder caused by an factor initially stressful. Automobile accidents, muggings, wars, natural disasters among many other examples. The main symptoms are anxiety (characterized by hyperexcitation, hypervigilance and fear) when the patient relives some traumatic event from the past. Thus, the aim of this study was to standardize a model of PTSD in mice by observation of emotional (in vivo) and biochemical (ex vivo) parameters. For this purpose male Swiss mice were used (25-35 g) and submitted to a series of five electric shocks (0,8 mA, for 10 s) in a step down apparatus. The animals were re-exposed to the apparatus 1, 6, 24 hours, 7 and 14 days later. Immediately after re-exposure, we evaluated the state of fear, depression and anxiety. After that, the hippocampus was collected to mensure the expression of proteins that are involved in hippocampus neuroplasticity. This protocol was able to induce excessive fear behavior in the animals when they were re-exposed to the shock apparatus. Moreover, the animals showed anxiety and depression behavior in the elevated plus maze and forced swimming test, respectively.

Biochemical analysis showed an increase in BDNF concentration 24 h after the shock series and immediately after the exposure, as well as an increase in CREB levels 1 and 6 h after shock series. Further, caspase 8 and p38 MAPK showed a decrease of their levels 24 and 1 h after the shock exposure, respectively.

We can conclude that this PTSD model induced behavioral changes in the animals (fear, anxiety and depression), accompanied by biochemical changes. Thus, this profile is consistent with symptoms observed in humans, suggesting that the model used in this work can be useful to study the physiopathology and treatment of PTSD.

Keywords: PTSD. Depression. Anxiety. Fear. Memory. BDNF. CREB. p38 MAPK.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Participação da carga genética e riscos ambientais para o desenvolvimento do TEPT. ... 23 Figura 2 - Regiões límbicas e suas funções, conhecidamente alteradas durante o TEPT. ... 24 Figura 3 - Diferenças entre o curso de aquisição e extinção das memórias aversivas e em indivíduos normais e com TEPT. ... 25 Figura 4 - Representação esquemática da metodologia utilizada para indução do TEPT. ... 34 Figura 5 - Fotografia mostrando a postura que o animal adota quando está exibindo o comportamento de congelamento (freezing) durante a reexposição ao aparato de choque. ... 35 Figura 6 - Fotografia mostrando a postura do animal durante o comportamento exploratório vertical (rearing) no momento da reexposição ao aparato gerador de choque. ... 36 Figura 7 - Fotografia mostrando a postura dos animais ao serem submetidos ao teste do nado forçado logo após terem sido reexpostos ao aparato de choque. ... 37 Figura 8 - Fotografia mostrando a postura dos animais ao serem submetidos ao teste suspensão de cauda logo após terem sido reexpostos ao aparato de choque. ... 38 Figura 9 - Fotografia mostrando o comportamento exploratório do animal sobre o labirinto em cruz elevado logo após eles terem sido reexpostos ao equipamento gerador de choque. ... 39 Figura 10 - Decurso temporal do comportamento de congelamento e de exploração vertical dos camundongos reexpostos ao aparato de choque. ... 44 Figura 11 - Comportamento ―tipo‖ depressivo no teste do nado forçado e suspensão de cauda e o tempo de congelamento e explorações verticais durante a reexposição do animal ao aparato de choque... 45

Figura 12 - Comportamento ―tipo‖ ansiogênico no teste do labirinto em cruz elevado, 24h após a exposição dos animais ao modelo de indução de TEPT e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque. ... 47 Figura 13 - Concentração de BDNF no hipocampo dos animais 1, 6 e 24 h após terem sido submetidos aos choques elétricos e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque. ... 48 Figura 14 - Avaliação da concentração de CREB no hipocampo 1, 6 e 24 h após a exposição dos animais ao choque e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque. ... 49 Figura 15 - Concentração de p38 MAPK no hipocampo 1, 6 e 24 h após a exposição dos animais ao choque e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque. ... 50 Figura 16 - Concentração das caspases 8 e 9 no hipocampo em 1, 6 e 24 h após a exposição dos animais ao choque e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque. ... 51 Figura 17 - Esquema da participação simultânea dos fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento de quadros depressivos. ... 54 Figura 18 - Esquema da sinalização de BDNF via receptores TrkB. .... 58

LISTA DE ABREVIATURAS

AKT (PKB) Proteína cinase B

AMPc Monofosfato Cíclico de Adenosina BDNF Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro

BLA Amigdala Basolateral

CaMK Calmodulina cinase

CREB Proteína de Ligação do Elemento Responsivo ao AMPc

D2 Receptor dopaminérgico D2

D3 Receptor dopaminérgico D3

DHA Ácido Docosahexaenoico

DNA Ácido Desoxiribonucleico

DO Densidade Óptica

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético ELISA Imuno Ensaio de Adsorção Enzimática ERK Proteína Cinase Regulada Extracelularmente HPA Eixo Hipotálamo-Pituitária-Adrenal

mA Miliampére

NGF Fator de Crescimento Neural

P38 Proteína cinase p38 PFC Córtex Pré-Frontal PI3K Fosfatidilinositol-3-cinase PLC Fosfolipase C PMSF Fluoreto de Fenilmetilsulfonilo RA Ácido Retinóico

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Polimorfismo de Nucleotídeo Simples TEPT Transtorno por Estresse Pós-Traumático TRK B Receptor de Tirosina cinase do tipo B

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ________________________________________ 21 1.1 O QUE É E ONDE SURGIU O TERMO TRANSTORNO POR ESTRESSE PÓS-TRAUMÁTICO __________________________ 21 1.2 PARTICIPAÇÃO DE ESTRUTURAS LÍMBICAS NO TEPT _ 23 1.3 RELAÇÃO ENTRE MEDO E TEPT _____________________ 24 1.4 A DOR EM PACIENTES COM TEPT ___________________ 25 1.5 O TEPT EM ANIMAIS _______________________________ 26 2 JUSTIFICATIVA ______________________________________ 29 3 OBJETIVO ___________________________________________ 31 3.1 OBJETIVO GERAL __________________________________ 31 3.1.1 Objetivos Específicos _____________________________ 31 4 MATERIAL E MÉTODOS ______________________________ 33 4.1 ANIMAIS __________________________________________ 33 4.2 INDUÇÃO DO TRANSTORNO POR ESTRESSE PÓS-TRAUMÁTICO (TEPT) _________________________________ 33 4.3 AVALIAÇÃO DO COMPONENTE EMOCIONAL _________ 34 4.4 AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DE MEDO E ANSIEDADE __________________________________________ 35 4.5 TESTE DO NADO FORÇADO _________________________ 36 4.6 TESTE DE SUSPENSÃO DE CAUDA ___________________ 37 4.7 TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO ___________ 38 4.8 AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA __________________________ 39 4.9 WESTERN BLOTTING ______________________________ 39 4.10 QUANTIFICAÇÃO DE BDNF POR ELISA _____________ 40 4.11 DOSAGEM DAS CASPASES 8 E 9 ____________________ 41 4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA ____________________________ 42 5 RESULTADOS ________________________________________ 43

5.1 COMPORTAMENTO DE MEDO E ANSIEDADE ________ 43 5.2 TESTE DO NADO FORÇADO E SUSPENSÃO DE CAUDA 44 5.3 TESTE DO LABIRINDO EM CRUZ ELEVADO __________ 46 5.4 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE BDNF NO HIPOCAMPO _________________________________________ 47 5.5 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO CREB E DA PROTEÍNA CINASE P38 ______ 48 5.6 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DAS CASPASES 8 e 9 ______________________________________________________50 6 DISCUSSÃO __________________________________________ 53 7 CONCLUSÃO ________________________________________ 63 8 PERSPECTIVAS ______________________________________ 65 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _____________________ 67

1 INTRODUÇÃO

1.1 O QUE É E ONDE SURGIU O TERMO TRANSTORNO POR ESTRESSE PÓS-TRAUMÁTICO

O Transtorno por Estresse Pós-Traumático (TEPT) é uma síndrome caracterizada por um espectro variado de sintomas que surgem após a exposição de um indivíduo a agentes estressores traumáticos (muitos dos quais com risco de morte) como, por exemplo, assaltos, acidentes automobilísticos, guerras, e outros eventos de forma geral violentos. Os critérios de diagnóstico, na maioria das vezes, incluem uma revivência do evento traumático inicial, evitar locais, objetos ou estímulos associados ao evento estressante e uma hiperexcitação que não estava presente no indivíduo antes do evento estressante (American Psychology Association, 2000).

Uma das primeiras descrições do TEPT remete à guerra civil americana (1861-1865) quando se observou que os soldados veteranos passavam a apresentar arritmia cardíaca, bem como um comportamento hipervigilante que não era evidenciado antes da experiência em combate. Entretanto, apenas em meados da década de 80 o termo TEPT foi introduzido no contexto científico primeiramente nos EUA, e posteriormente na Europa ocidental (LIPOV e KELZEMBERG, 2012).

Embora exista a possibilidade de qualquer evento estressante promover o TEPT, aqueles em que há lesão física do indivíduo são os mais prováveis de provocar alguma sequela psicológica, sendo o TEPT uma delas (KOREN et al., 2005).

Existe ainda uma grande discrepância entre os indivíduos que desenvolvem o TEPT e aqueles que não o desenvolvem, bem como a intensidade ou a gravidade dos sintomas do transtorno entre estas pessoas. Sabe-se, por exemplo, que o trauma é necessário, mas não suficiente para precipitar o desenvolvimento do TEPT. Esta questão é tão primordial que pode ser a chave para explicar como alguns indivíduos, mas não outros, desenvolvem o transtorno (cerca de 5 a 30%) mesmo todos tendo passado pelo mesmo evento traumático (GILLESPIE et al., 2009; MILLIKE, AUCHTERLONIE e HOGE, 2007; DAVIDSON et al., 2004).

Existe, portanto, uma variedade de fatores que contribuem para a magnitude dos sintomas durante o TEPT, são eles: predisposição genética, a rede social de apoio, ou seja, as pessoas mais próximas que convivem com o indivíduo e experiências de vida que antecedem o evento traumático (àquelas que ocorrem normalmente durante a

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infância) (Figura 1). Em suma, estes fatores podem determinar se um indivíduo é resistente ou sensível à exposição a um trauma (BINDER e SCHARFMAN, 2008; JOVANOVIC e RESSLER, 2010).

Estudos de associação alélica buscaram identificar uma associação entre uma variante genética (polimorfismo) e a expressão fenotípica. Estes estudos compararam o DNA (mas não sequências de DNA, e sim marcadores de variações regionais do DNA também conhecidos pela sigla SNP ou polimorfismo de nucleotídeo simples) de indivíduos que passaram por algum tipo de trauma que desenvolveram e outros que não desenvolveram o transtorno (MAHAN e RESSLER, 2012).

Associações genéticas replicadas encontradas em pacientes com TEPT em Val66Met o qual possui função neurotrófica, já que se trata de uma porção do gene responsável pela produção de BDNF, apontou que portadores da variação Met/Met neste SNP mostraram aumento da ativação do lobo temporal medial durante a recuperação do episódio traumático e codificação de tarefas. Por outro lado, portadores Met/Met exibem extinção prejudicada de memórias que está correlacionado com uma ativação alterada da amígdala, PFC (Córtex pré-frontal) e hipocampo; maior recrutamento da amígdala e PFC em portadores Met/Met durante a formação da memória (DENNIS et al., 2010; VAN WINGEN et al., 2010; LONSDORF et al., 2010). De acordo com a literatura, parece que qualquer variação deste SNP que não seja entre uma valina e uma metionina no códon 66, pode promover ou facilitar o desenvolvimento de TEPT em humanos.

Em relação aos alelos curtos e longos dos genes que estão associados com funções no transportador de serotonina sugeriu-se na ocasião daquele estudo, que o alelo curto estaria associado com uma diminuição do risco para desenvolvimento de TEPT em ambientes de baixo risco, enquanto que em ambientes de risco elevado ele estaria associado a um grande risco de desenvolvimento do TEPT.

Estes achados sugerem que o ambiente pode exercer influência no gene na região polimórfica ligada ao transportador de serotonina e indiretamente ao risco de desenvolvimento de TEPT (GRABE et al, 2009).

A proteína de ligação FK506 com função chaperona (proteínas chaperonas, também conhecidas por proteínas auxiliares que tem como função a indução da correta configuração terciária de outras proteínas) glicocorticóide também se mostraram alteradas em indivíduos com TEPT; o SNP FKBP5, está relacionado com histórico de maus tratos em crianças e serve como um preditor da gravidade dos sintomas do TEPT

no indivíduo adulto (Figura 1). Assim, o FKBP5 pode contribuir para o aumento da sensibilidade da amígdala e a resposta do eixo HPA ao estresse no adulto (MEHTA et al., 2011; BINDER et al., 2008).

Figura 1 - Participação da carga genética e riscos ambientais para o desenvolvimento do TEPT.

FKBP5, SNP do gene que expressa a proteína FK506 esta última com função chaperona glicocorticóide; BDNF, fator neurotrófico derivado do cérebro; Genes associados com funções no transportador de serotonina (Serot). Fonte: Adaptação de MAHAN e RESSLER, 2012.

1.2 PARTICIPAÇÃO DE ESTRUTURAS LÍMBICAS NO TEPT Tanto em homens quanto em animais, as estruturas neuronais mais claramente alteradas durante o TEPT são: amígdala, hipocampo e córtex pré-frontal (PFC) (HEIMER e VAN HOESEN, 2006) (Figura 2).

Com função de regular a ―aprendizagem‖ do medo, a amígdala recebe projeções do hipocampo e do PFC, sendo que indivíduos com TEPT apresentam uma diminuição da ativação do PFC e hipocampo, coincidindo com um aumento da ativação da amígdala devido a uma perda do controle da mesma, possivelmente resultando em uma hiper-responsividade da amígdala frente a estímulos que provocam medo, ou mesmo, resultam nas respostas de medo exagerado frequentemente presentes durante o TEPT e também em outras disfunções psicológicas relacionadas com medo (ETKIN e WAGER, 2007). Outras estruturas

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como giro parahipocampal, córtex orbito frontal, córtex sensório motor, tálamo e o córtex cingulado anterior também estão alterados em indivíduos com o transtorno (ABE et al., 2006; ROGERS et al., 2009) (Figura 2).

Figura 2 - Regiões límbicas e suas funções, conhecidamente alteradas durante o TEPT.

Fonte: Adaptação de MAHAN e RESSLER, 2012. 1.3 RELAÇÃO ENTRE MEDO E TEPT

O medo irracional é um grande impedimento para o sucesso e produtividade. Franklin D. Roosevelt (presidente dos EUA de 03/1933 até 04/1945) já sabia disso quando em 1933 reconheceu, referindo-se na ocasião, ao futuro econômico dos EUA que: “a única coisa que

devemos temer é o próprio medo”. Embora se saiba que a aprendizagem

do medo é algo, evolutivamente benéfico e necessário, quando o medo se torna generalizado, este mecanismo passa a ser além de improdutivo, prejudicial ao indivíduo (Figura 3). E durante o TEPT, é exatamente o que acontece, pois o medo aprendido durante um evento traumático torna-se generalizado mesmo em situações consideradas seguras (GILLESPIE et al., 2009; WILCOX, STORR e BRESLAU, 2009).

Evidencias de estudos em animais bem como estudos de neuroimagem em humanos, sugerem que um dos mecanismos subjacentes ao TEPT é a plasticidade neuronal exacerbada, que, originalmente é à base da aprendizagem e da memória (LANIUS et al., 2006; FRANCATI, VERMETTEN e BREMNER, 2007; PAPE e PARE, 2010; SHUMYATSKY et al., 2005).

Comportamentalmente, transtornos psiquiátricos como o TEPT apresentam um aumento da sensibilização ao estresse, excesso de generalização de situações rotineiras com situações de medo e finalmente uma deficiência na capacidade de extinguir a memória aversiva (MCLAUGHLIN et al., 2010; JOVANOVIC et al., 2009) (Figura 3).

Figura 3 - Diferenças entre o curso de aquisição e extinção das memórias aversivas e em indivíduos normais e com TEPT.

Fonte: Adaptação de MAHAN e RESSLER, 2012. 1.4 A DOR EM PACIENTES COM TEPT

Além daqueles sintomas já conhecidos e citados até o momento, ainda existem outras disfunções que acometem estes pacientes, sendo a dor crônica uma das mais importantes delas. Estudos com amostras de pacientes com transtornos psiquiátricos apontaram que cerca de 46% deles apresentavam sintomatologia condizente com TEPT, e destes, 24% relatavam também dor crônica em diferentes partes do corpo (VILLANO, ROSENBLUM e MAGURA, 2007).

Em meados de 2007 um extenso estudo canadense verificou uma notável diferença entre indivíduos com e sem diagnóstico de TEPT em relação à dor crônica. Observou-se que entre os pacientes com TEPT, 46% também sofriam de dor crônica na região lombar (em comparação com 20,6% da amostra sem TEPT) e 33% relatavam fortes crises de enxaqueca (em comparação com 10% sem TEPT) (SAREEN,

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COX e STEIN, 2007). A relação entre o referido transtorno e quadros de aumento de dor é conhecida há muitos anos e é demonstrada em diversos estudos (BRAS et al., 2011; MOELLER e KELTNER, 2012), porém, ainda há uma carência de estudos para melhor relatar o mecanismo pelo qual isto ocorre.

1.5 O TEPT EM ANIMAIS

Atualmente são descritos alguns modelos animais que tem como propósito mimetizar um quadro típico de TEPT. Estes modelos são comumente utilizados com um resultado satisfatório há alguns anos (WANG et al., 2012) e dentre eles destacam-se: medo condicionado, exposição única e prolongada a um evento estressante, exposição a predadores ou simplesmente ao odor destes. Assim, a indução do TEPT através de choques elétricos é conhecida e utilizada com o propósito de se estudar alterações comportamentais, e também o efeito de algumas substâncias frente a essas alterações (LI et al., 2006).

Um exemplo deste fato, é que a aplicação de sucessivos choques elétricos nas patas de camundongos da linhagem ICR, seguida de reexposição deste evento aversivo, promove alterações comportamentais nos testes do labirinto em cruz elevado e na caixa clara e escura (ambos os testes preditivos para ansiedade) por até quatro semanas após a indução dos choques, e até duas semanas após a última reexposição do evento estressante (LI et al., 2006).

Além das alterações de âmbito comportamental nos animais submetidos ao modelo de indução de TEPT por choques elétricos, também tem sido observado alterações relevantes no que diz respeito ao sono destes animais. Percebeu-se que após a aplicação dos estímulos elétricos, em camundongos, os mesmos demonstraram uma diminuição nos episódios de sono por até 21 dias. A exploração de objetos que haviam sido previamente associados ao evento estressante (choques) também foi significativamente diminuída nos animais que receberam os estímulos quando comparado àqueles do grupo controle, sugerindo um comportamento de medo excessivo (PHILBERT et al., 2011).

Também durante a experimentação animal, evidenciou-se uma significativa redução do volume do hipocampo, naqueles animais submetidos ao modelo de indução de TEPT quando comparados aos animais controle, tal qual ocorre em humanos portadores do transtorno (PYNOOS et al., 1996; BACHMANN et al., 2005).

Através de ressonância magnética, notou-se uma lateralidade no que diz respeito à amígdala dos animais com TEPT, já que ocorreu

também uma diminuição da amígdala direita nestes animais. Concomitantemente com os achados citados, através de western blotting observou-se que também ocorreu uma diminuição da forma fosforilada da proteína GAP43/B-50 a qual é expressa exclusivamente no corpo celular e processos axonais dos neurônios hipocampais e possuem um papel importante no crescimento dos neuritos e na sinaptogênese desta região (GOLUB et al., 2011).

Ainda não está totalmente elucidado como essa redução do volume da amígdala ocorre, no hipocampo, entretanto, alguns estudos de imagem por ressonância magnética (RMI) sugerem ser a apoptose (evento também conhecido por morte celular programada) a causa principal dessa atrofia (ZHANG et al., 2006).

A apoptose é um processo extremamente complexo e estreitamente controlado que é fundamental para o desenvolvimento e para manutenção tanto da homeostase como da doença. Este processo que é responsivo a sinais ambientais e intrínsecos tem como função eliminar células defeituosas de forma controlada (YAN et al., 2006; YAO et al., 2007), mantendo e promovendo a homeostase. Existem duas vias de sinalização que promovem a morte celular por apoptose, a via intrínseca que é dependente da mitocôndria e a via extrínseca que é dependente de receptor, sendo que ambas as vias são reguladas por caspases (THORNBERRY e LAZEBNIK, 1998), além de serem moduladas pela família de genes de células de linfomas do tipo B2 (Bcl-2), que compreende proteínas pró apoptóticas como a BCLS associada à proteína X (Bax) e proteínas anti-apoptóticas como a Bcl-2 (PANARETAKIS et al., 2002; KONOPLEVA et al., 2002).

As caspases compreendem um grupo de proteases que são expressas intracelularmente como pró-caspases. Estas últimas possuem um domínio proteolítico que é capaz de ser clivado, sendo subsequentemente divididas em caspases iniciadoras e efetoras. As caspases iniciadoras se localizam upstream na cadeia e estão vulneráveis a clivagem proteolítica e consequentemente clivam caspases dowstream da cadeia, ditas caspases efetoras. A caspase 3 é um exemplo de caspase efetora deste processo, já as caspases 8 e 9 por sua vez, constituem-se de caspases iniciadoras do processo de morte celular sendo estas últimas portanto, upstream a caspase 3 (COHEN, 1997; BAO e SHI, 2007; GELDERBLOM et al., 2004).

Estudos ex vivo serviram para estabelecer a participação de cada uma das proteínas na manutenção das caspases no processo de apoptose. Assim, descobriu-se que quando ocorria o aumento da concentração de Bax havia concomitantemente um aumento da apoptose

(MATTER-28

REISSMANN et al., 2002; LANZI et al., 2001; CHANG et al., 2002), enquanto que aumento da concentração de Bcl-2 estava relacionado com uma diminuição da apoptose (USUDA et al., 2002; SUN et al., 2002; TILLI et al., 2002). Desta forma, a relação entre Bcl2/Bax é crítico para a manutenção adequada do processo de apoptose (JARSKOG et al., 2004; PETTERSSON et al., 2002).

2 JUSTIFICATIVA

Sabe-se que a exposição a eventos traumáticos é frequente ao longo da vida, afetando até 90% da população em geral, sendo que os homens são a grande maioria. Somente nos Estados Unidos estima-se que 7% da população irão desenvolver o TEPT ao longo da vida (CERVANTES, TREVISOL e JORNADA, 2013). Após todas as informações mencionadas até então, a execução deste projeto torna-se interessante e principalmente importante devido os seguintes aspectos:

 A padronização de metodologias simples e rápidas que sejam capazes de induzir um comportamento semelhante àqueles evidenciados em indivíduos com TETP, se faz muito importante para melhor compreendermos estes sintomas e também verificar a possibilidade de novos tratamentos;

 A importância de se compreender os mecanismos que favorecem a consolidação das memórias aversivas que são, basicamente, as responsáveis por desencadear todos os efeitos do TEPT em humanos;

 Compreender as vias de sinalização que levam a morte neuronal em algumas regiões cerebrais sabidamente envolvidas no transtorno, e mais importante ainda, descobrir mecanismos ou estratégias para minimizar o máximo possível este ―dano‖ no SNC;

Finalmente, juntando todos os itens, chegamos à principal justificativa para o presente estudo, que seria contribuir a médio e longo prazo para a descoberta de estratégias para melhorar a qualidade de vida dos pacientes acometidos por este transtorno já que o TEPT é capaz de causar prejuízos significativos na qualidade de vida dos seus portadores.

3 OBJETIVO

3.1 OBJETIVO GERAL

Verificar se os choques elétricos nas patas de camundongos induzem um quadro semelhante ao TEPT convencionalmente observado em humanos, e verificar possíveis alterações de cunho emocional (in

vivo) e bioquímico (ex vivo), bem como os possíveis mecanismos e

estruturas neuronais envolvidas. 3.1.1 Objetivos Específicos

 Padronizar o modelo de indução de TEPT em camundongos;

 Verificação dos comportamentos indicativos de medo excessivo, ansiedade e de depressão;

 Verificar a duração do comportamento de medo e ansiedade;

 Mensurar a concentração de BDNF, p38 MAPK, CREB e das caspases 8 e 9 no hipocampo dos animais submetido ou não ao modelo de TEPT;

4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 ANIMAIS

Para a realização dos experimentos foram utilizados cerca de 290 camundongos Swiss machos (2 meses de idade), pesando entre 25 a 35 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC. Uma vez recebidos do Biotério Central, os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Neurobiologia da Dor e da Inflamação (LANDI), em micro isoladores com circulação de ar (Alesco), em gaiolas de 12x30x18 cm (6 animais por gaiola), com temperatura controlada de 20 ± 2 °C, em ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes acesas às 6:00 h) e com água e ração ad libidum.

Antes dos experimentos, os animais foram aclimatados ao laboratório por período mínimo de 1h, e todos os procedimentos foram realizados após aprovação dos protocolos experimentais pela Comissão de Ética para o Uso de Animais (CEUA) – UFSC (protocolos nº PP00699 e PP00745) e conduzidos de acordo com as normas de cuidados com animais de laboratório e as diretrizes éticas para investigação de dor em animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983).

Ressaltamos ainda, que todos os procedimentos foram executados de maneira a preservar ao máximo a integridade física do animal, tendo como princípio reduzir ao máximo o desconforto que eventualmente foi necessário para demonstrar a efetividade do modelo proposto.

4.2 INDUÇÃO DO TRANSTORNO POR ESTRESSE PÓS-TRAUMÁTICO (TEPT)

Os animais foram submetidos a uma série de choques elétricos nas patas através de uma grade metálica conforme modelo previamente descrito por Pynnos e colaboradores (1996).

Neste modelo utilizou-se um equipamento de Esquiva Inibitória ou Step-Down (Modelo EFF 342, INSIGHT, São Paulo, SP) no qual se isolou a área/plataforma de escape normalmente utilizada para avaliação cognitiva. Os choques elétricos tiveram uma intensidade de 0,8 mA e duração de 10 s (Figura 4). No total, foram aplicados 5 choques elétricos em intervalos de 30 s. Uma, seis ou vinte e quatro horas após a aplicação dos choques os animais foram reexpostos durante 3 minutos ao mesmo aparato de choque utilizado, para que houvesse uma ‗‗lembrança‘‘ da situação estressante a qual o animal foi submetido

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no dia anterior e então o quadro ‗‗tipo‖ TEPT foi analisado, ressaltando que não houve qualquer estímulo elétrico neste momento.

Três diferentes grupos experimentais foram utilizados neste trabalho. O grupo naive não recebeu qualquer estímulo elétrico, apenas foi exposto ao aparato de choque uma vez, previamente a todas as análises. O grupo controle também não recebeu nenhum choque elétrico, porém, foi apresentado ao equipamento gerador de choque duas vezes, sendo que a última corresponde a reexposição que ocorreu em 1 h, 6 h, 24 h, 7 e 14 dias após a primeira exposição. Por fim, tem-se o grupo TEPT, o qual recebeu os choques elétricos e foi reexposto ao aparato de choque em 1 h, 6 h, 24 h, 7 e 14 dias após os estímulos elétricos.

Figura 4 - Representação esquemática da metodologia utilizada para indução do TEPT.

Fonte: Elaborado pelo autor (2014).

4.3 AVALIAÇÃO DO COMPONENTE EMOCIONAL

Após os animais terem sido expostos aos estímulos elétricos conforme descrito acima, eles foram avaliados em relação ao desenvolvimento de comportamentos ―tipo‖ depressivo, medo e ansiedade, conforme descrito a seguir.

4.4 AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DE MEDO E ANSIEDADE

Dentro do contexto de medo o qual é evocado pela memória do evento traumático, o comportamento de ‗‘congelamento‘‘ dos animais submetidos aos choques elétricos tem sido utilizado para mensurar uma resposta de medo exagerado. Portanto, optou-se por gravar em vídeo o comportamento destes camundongos submetidos ao modelo de indução de TEPT durante a reexposição ao aparato gerador de choques para posteriormente mensurar o tempo de congelamento (Figura 5) dos mesmos em comparação aos demais grupos (SZCZYTKOWSKI, LEBONVILLE e LYSLE, 2012).

Figura 5 - Fotografia mostrando a postura que o animal adota quando está exibindo o comportamento de congelamento (freezing) durante a reexposição ao aparato de choque.

Fonte: Elaborado pelo autor (2014).

Durante o período de reexposição, que foi de 3 minutos, quando o tempo de congelamento foi mensurado, também se observou o número de explorações verticais (rearing) (Figura 6) executadas pelos animais submetidos ao modelo em comparação aos demais grupos experimentais, esta foi tomada como uma variável de avaliação motora e de ansiedade conforme descrito por Polesel e colaboradores (2014).

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Figura 6 - Fotografia mostrando a postura do animal durante o comportamento exploratório vertical (rearing) no momento da reexposição ao aparato gerador de choque.

Fonte: Elaborado pelo autor (2014). 4.5 TESTE DO NADO FORÇADO

Com o objetivo de observar o possível efeito tipo depressivo que pode ser evidenciado durante o TEPT, os animais foram forçados a nadar individualmente no interior de cilindros de plástico PVC com água a uma profundidade de 20 cm e temperatura de aproximadamente 25±1ºC (Figura 7).

Neste ambiente os animais foram filmados durante 6 minutos e posteriormente foi contabilizado o tempo (em segundos) de imobilidade do animal, tempo este em que o animal permanece totalmente imóvel, apenas boiando sobre a água, e a imobilidade mensurada foi considerada como indicativo de comportamento ―tipo‖ depressivo (PORSOLT, 1979).

Figura 7 - Fotografia mostrando a postura dos animais ao serem submetidos ao teste do nado forçado logo após terem sido reexpostos ao aparato de choque.

Fonte: Elaborado pelo autor (2014). 4.6 TESTE DE SUSPENSÃO DE CAUDA

Assim como no teste do nado forçado, com o objetivo de observar o possível efeito tipo depressivo que é evidenciado durante o TEPT, os animais foram suspensos pela cauda a uma altura de aproximadamente 80 cm do chão e separados por divisórias de isopor espaçadas cerca de 25 cm não possibilitando, portanto, que os animais pudessem interagir um com o outro, visualmente, durante o experimento.

Os animais tiveram suas caudas fixadas com fita adesiva aproximadamente a 2 cm da extremidade proximal da cauda na própria bancada de experimento (Figura 8). Neste teste, de forma semelhante ao que ocorre no teste do nado forçado, mensura-se o tempo de imobilidade dos animais, ou seja, o tempo em que eles permaneceram totalmente imóveis sem debater-se buscando uma possibilidade de fuga. Os animais foram filmados e o seu comportamento foi avaliado em vídeo por um período de 6 minutos (SACHARCZUK et al., 2009).

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Figura 8 - Fotografia mostrando a postura dos animais ao serem submetidos ao teste suspensão de cauda logo após terem sido reexpostos ao aparato de choque.

Fonte: Elaborado pelo autor (2014).

4.7 TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO

Com o objetivo de observar o nível de ansiedade gerado pelo modelo proposto, fez-se uso do Labirinto em Cruz Elevado o qual consiste em dois braços abertos e dois braços fechados ambos com 30 cm de comprimento, conectados entre si por uma plataforma central de 5x5 cm, sendo que os quatro braços estão dispostos em um ângulo de 90º entre si, e elevados do chão cerca de 25 cm (Figura 9).

Um a um, os animais foram levados à plataforma central e avaliados em relação ao tempo de permanência nos braços abertos e fechados, bem como o número de entradas no braço fechado do equipamento. Para tanto, registrou-se com a utilização de uma câmera o comportamento dos animais durante um período de 5 minutos os quais posteriormente foram avaliados utilizando o software Plus MZ v1.v (REHNI et al., 2010).

Figura 9 - Fotografia mostrando o comportamento exploratório do animal sobre o labirinto em cruz elevado logo após eles terem sido reexpostos ao equipamento gerador de choque.

Fonte: Elaborado pelo autor (2014). 4.8 AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA

Após a verificação das alterações emocionais induzidas pelos choques elétricos nos camundongos em outro grupo experimental, verificou-se possíveis alterações em nível de expressão de proteínas especificas no hipocampo dos mesmos, bem como a verificação da concentração das caspases 8 e 9, conforme descrito a seguir.

4.9 WESTERN BLOTTING

Após o estabelecimento do quadro ‗‘tipo‘‘ TEPT, os animais foram sedados com isoflurano e sacrificados por decapitação, posteriormente, extraiu-se o encéfalo e em seguida o hipocampo para semi-quantificação de p38 MAPK e CREB.

As amostras foram imediatamente homogeneizadas mecanicamente a 4ºC em homogeneizador de tecidos de vidro (Dounce Grinders, Omni International, Kennesaw, GA, EUA) com 500 µL de Tris-base 50 mM, pH 7,0; EDTA 0,1 mM, NaF 100 mM, PMSF 0,1 mM e Na3VO4 2mM. Em seguida, as amostras foram centrifugadas (13.000

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x g por 10 minutos) para separação dos detritos celulares (OLIVEIRA et al., 2008).

O sobrenadante foi diluído individualmente 1/1 (v/v) com tampão de amostra de eletroforese com concentração final de Tris 50 mM (pH 6,8) EDTA 2 mM, SDS 4% e glicerol 8%. O teor de proteínas foi quantificado pelo método de Lowry utilizando albumina de soro bovino como padrão (LOWRY et al., 1951). Cada uma das amostras foi submetida à eletroforese em 10% de SDS-PAGE em minigéis após a adição de 2% de azul de bromofenol e 5% de mercaptoetanol (CORDOVA et al., 2004).

As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitro-celulose (1,2 mA/cm2; 1,5 h) como descrito por Bjerrum e Heegaard (1988) com adaptações, e o bloqueio das membranas foi feito com uma solução a 5% de leite em pó desnatado em TBS (10 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5) por 1h.

As respectivas proteínas foram detectadas utilizando anticorpos específicos diluídos em TBS-T (Tris 10 mM, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20, pH 7,5) contendo BSA a 2,5% nas seguintes diluições: 1:1000 para P - p38 MAPK; 1:10000 para T – p38 MAPK; para P-CREB e T-P-CREB a diluição foi de 1:1000 e 1:2000 para β - actina. Posteriormente, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário ligado a uma peroxidase (com diluição de 1:2000) por 1h, e o sinal quimioluminescente foi detectado utilizando um kit ECL da Amersham.

Todos os passos de bloqueio e de incubação foram seguidos por três lavagens de 5 minutos cada das membranas com TBS-T e a densidade óptica (D.O.) das bandas foram quantificadas utilizando Scion Image TM (Frederick, MD, EUA) (COSTA et al., 2012).

4.10 QUANTIFICAÇÃO DE BDNF POR ELISA

Vinte e quatro horas após a indução do transtorno, e logo após a reexposição dos animais ao aparato de choque, os mesmos foram sedados com isoflurano e sacrificados por decapitação.

Retirou-se, em seguida, o hipocampo destes animais, os quais foram imediatamente homogeneizados em homogeneizador de tecidos de vidro (Dounce Grinders, Omni International, Kennesaw, GA, EUA), com uma solução de PBS (tampão fosfato salino) contendo Tween 20 (0,05%), fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM, EDTA 10 mM, protinina a 2ng/ml, e cloreto de benzetônio 0,1 mM.

Os homogeneizados foram transferidos para tubos de 1,5 ml (Eppendorfs), e centrifugados a 3.000 g durante 10 min a 4 °C, sendo que o sobrenadante obtido foi armazenado a -80 °C até o momento da quantificação do BDNF. O conteúdo total de proteína foi mensurado no sobrenadante utilizando o método de Bradford.

Alíquotas de 100 µl das amostras foram utilizadas para mensurar a quantidade de fator neurotrófico derivado do cérebro

(brain-derived neurotrophic factor BDNF) nas amostras por ensaio

imunoenzimático (ELISA) utilizando o kit da R&D (Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante.

Os valores obtidos foram estimados por meio da interpolação de uma curva padrão, utilizando-se ensaio colorimétrico, medido a 450 nm (comprimento de onda de correção de 540 nm) em um leitor de placa de ELISA (Berthold Technologies – Apollo 8 – LB 912, Alemanha). Assim todos os resultados foram expressos em pico gramas de BDNF por miligrama de proteína (BOBINSKI et al., 2011).

4.11 DOSAGEM DAS CASPASES 8 E 9

Após o estabelecimento do quadro ―tipo TEPT‖ e sob o efeito de isoflurano, os animais foram sacrificados por decapitação. Em seguida extraiu-se o encéfalo e o hipocampo bilateralmente dos mesmos os quais foram armazenados a -80 ºC até o momento do ensaio.

As amostras foram homogeneizadas mecanicamente utilizando um homogeneizador de tecidos de vidro (Dounce Grinders, Omni International, Kennesaw, GA, EUA) em tampão TRIS EDTA no mesmo dia do ensaio. Utilizou-se um ensaio de quimioluminescência, utilizando-se de kit comercial (Caspase-Glo® 8 e Caspase-Glo® 9 – Assay, Promega Corporation, USA), conforme instruções do fabricante. Depois de homogeneizadas as amostras foram inseridas na placa de leitura (placa branca fosca com 96 poços) onde se acrescentou igual volume de reagente de trabalho (substrato liofilizado + tampão + inibidor de proteases MG-132) totalizando um volume de 100 µl (50 µl de amostra para 50 µl de reagente de trabalho).

Após um período de incubação de 3h em baixa luminosidade, procedeu-se a leitura do sinal quimioluminescênte utilizando um equipamento EnSpire Alpha®, Perkin – Elmer, EUA. A intensidade do sinal quimioluminescente é diretamente proporcional à concentração das caspases na amostra.

Os resultados obtidos no ensaio foram corrigidos pela quantidade de proteína presente em cada amostra, sendo, portanto

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representado a concentração da caspase (em unidades arbitrárias) por mg de proteína na amostra conforme metodologia descrita por Andrew et al., 2004, com modificações.

4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram analisados no programa Graph Pad Prism versão 5.01 (2005, San Diego, CA, USA). Os dados apresentados possuem uma distribuição normal, de acordo com o teste de Shapiro – Wilk (P>0,05). Desta forma, os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) e foram avaliados através da análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste pos-hoc de Student - Newman-Keuls. Valores de p menores que 0,05 (p<0,05) foram considerados estatisticamente significativos.

5 RESULTADOS

5.1 COMPORTAMENTO DE MEDO E ANSIEDADE

Os dados representados pela figura 10 (A e B) mostram que os animais controle que foram apenas colocados no aparato de choque, e que não receberam qualquer estímulo elétrico, e que foram reexpostos ao aparato 24 h, 7 e 14 dias após a aplicação dos choques elétricos, não apresentaram o comportamento de congelamento e tampouco demonstraram uma diminuição do comportamento de exploração vertical associado ao medo e ansiedade, respectivamente, quando comparados com os animais do grupo naive.

Já os animais do grupo TEPT, (que receberam os estímulos elétricos nas patas) e que foram reexpostos ao aparato de choque, após 24 h e 7 dias desenvolveram o comportamento de congelamento [F(2,16) = 28,48, P=0,0001] e [F(2,16) = 4,465, P=0,0316] e de redução da exploração vertical [F(2,15) = 20,44, P=0,0001] e [F(2,14) = 11,12, P=0,0013] quando comparados com os grupos naive e controle, respectivamente (Figura 10 A e B).

No entanto, o comportamento de congelamento [F(2,16) = 1,256, P=0,3150] e de exploração vertical [F(2,16) = 1,012, P=0,3887] nos animais que receberam os estímulos elétricos e que foram reexpostos ao contexto 14 dias após a aplicação dos estímulos, não foi diferente dos animais do grupo naive e controle, sugerindo que houve uma extinção do comportamento de medo e ansiedade, respectivamente (Figura 10 A e B).

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Figura 10 - Decurso temporal do comportamento de congelamento e de exploração vertical dos camundongos reexpostos ao aparato de choque.

Painel A representa o tempo de congelamento e o painel B o número de explorações verticais. Os valores são expressos como média de 5 a 6 animais + EPM (erro padrão da média). O asterisco representa uma diferença significativa no tempo de congelamento e no número de explorações verticais quando comparado com o grupo controle ou naive. *** P < 0,001,** P < 0,01, * P < 0,05.

5.2 TESTE DO NADO FORÇADO E SUSPENSÃO DE CAUDA Observou-se nestes testes que o grupo que recebeu os estímulos elétricos apresentou um tempo de imobilidade no teste do nado forçado que foi significativamente superior ao grupo naive e controle, respectivamente (Figura 11 A). Além disso, foi possível observar que o tratamento com fluoxetina (10 mg/kg i.p.), 30 minutos antes do teste, foi capaz de reverter significativamente o comportamento tipo depressivo observado nos animais do grupo TEPT [F(4,21) = 15,12, P=0,0001] quando comparados àquele grupo que não recebeu o tratamento com a fluoxetina (Figura 11 A).

Assim como no teste do nado forçado, o comportamento ―tipo‖ depressivo foi observado nos animais do grupo TEPT quando analisados no teste de suspensão de cauda, uma vez que eles permaneceram imóveis por um tempo significativamente superior quando comparados aos do grupo controle e naive. E tal qual ocorreu anteriormente, o tratamento previamente ao teste com fluoxetina 10mg/kg i.p foi capaz de reverter de forma significativa o comportamento ―tipo‖ depressivo observado [F(4,29) = 4,027, P=0,018] (Figura 11 B).

Observou-se também durante esta etapa experimental que o tratamento com fluoxetina (10 mg/kg i.p.) previamente à reexposição ao contexto aversivo, não foi capaz de reverter o comportamento de congelamento e de exploração vertical demonstrado pelos animais que

receberam os estímulos elétricos quando comparados aos demais grupos (Figura 11 C e D).

Por fim, observa-se que os animais que não foram submetidos ao modelo deindução de TEPT e foram tratados com fluoxetina não apresentaram alteração comportamental quando comparados aos grupos controle e naive (Figura 11 A e B).

Figura 11 - Comportamento ―tipo‖ depressivo no teste do nado forçado e suspensão de cauda e o tempo de congelamento e explorações verticais durante a reexposição do animal ao aparato de choque.

Painel A representa o teste do nado forçado, Painel B a suspensão de cauda e o tempo de congelamento e exploração vertical (Paineis C e D), 24h após a exposição dos animais ao modelo de indução de TEPT e imediatamente após o tratamento com fluoxetina (10 mg/kg i.p.) e reexposição dos mesmos ao aparato de choque. Os valores são expressos como média de 4 a 6 animais + EPM (erro padrão da média). O asterisco e o sustenido representam um aumento no tempo de imobilidade significativo quando comparado com os demais grupos. *** P < 0,001, # P < 0,01, * P < 0,05.

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5.3 TESTE DO LABIRINDO EM CRUZ ELEVADO

A fim de verificar se o modelo de indução de TEPT adotado alterava o estado de ansiedade, os animais submetidos aos estímulos elétricos (aqueles do grupo TEPT) bem como aqueles do grupo controle e naive (que não receberam qualquer estímulo elétrico) foram analisados no teste preditivo de ansiedade, o labirinto em cruz elevado sendo que o número de entradas e saídas do braço fechado do aparato, bem como o tempo de permanência tanto no braço aberto quanto no fechado foi mensurado. Conforme pode ser observado na figura 12 A, os animais que receberam os choques elétricos apresentaram redução significante [F(2,12) = 6,696, P=0,0143] na permanência no braço aberto quando comparado com o grupo naive e controle, respectivamente. Consequentemente, os animais que receberam os estímulos elétricos permaneceram um tempo significativamente [F(2,18) = 5,559, P=0,0132] superior nos braços fechados do aparato quando comparado ao grupo naive e ao grupo controle (Figura 12 B), confirmando o comportamento tipo ansiogênico. Por fim, o número de entradas destes animais submetidos aos estímulos elétricos nos braços fechados do aparato também foi reduzido de forma significativa [F(2,16) = 11,84, P=0,001] quando comparado ao grupo naive e controle, respectivamente (Figura C).

Figura 12 - Comportamento ―tipo‖ ansiogênico no teste do labirinto em cruz elevado, 24h após a exposição dos animais ao modelo de indução de TEPT e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque.

O painel A representa o tempo de permanência dos animais no braço aberto, em B observa-se o tempo de permanência dos animais no braço fechado e o painel C representa o número de entradas no braço fechado do aparato. Os valores são expressos como média de 5 a 6 animais + EPM (erro padrão da média). O asterisco representa diferença estatisticamente significativa quando comparado com os demais grupos. *P < 0,05, **P < 0,01.

5.4 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE BDNF NO HIPOCAMPO

Os dados representados na figura 13 demonstram que os animais do grupo TEPT apresentaram aumento significativo [F(2,14) = 21,55, P=0,0001] na concentração de BDNF no hipocampo 24 h após a indução dos estímulos elétricos quando comparados aos animais do grupo naive e controle, sendo que não foi observado qualquer alteração na concentração de BDNF em 1 h [F(2,14) = 1,765, P=0,2128] e 6 h [F(2,14) = 2,804, P=0,1002] após a aplicação dos estímulos elétricos.

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Figura 13 - Concentração de BDNF no hipocampo dos animais 1, 6 e 24 h após terem sido submetidos aos choques elétricos e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque.

Os resultados apresentados expressos em pg/mg de proteína. Os valores são expressos como média de 5 a 8 animais + EPM (erro padrão da média). O asterisco e o sustenido representam um aumento significativo da expressão de BDNF em relação aos demais grupos e em relação ao grupo naive respectivamente. *P < 0,05, ## P < 0,01.

5.5 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO CREB E DA PROTEÍNA CINASE P38

Os dados representados na figura 14 demonstram que os animais do grupo TEPT apresentaram aumento de forma expressiva e significativa da concentração do fator de transcrição CREB no hipocampo 1 h após a indução dos estímulos elétricos e imediatamente após a reexposição quando comparados aos animais do grupo naive e controle, respectivamente. No entanto, 6 h após a indução do estímulo elétrico e da reexposição ocorreu aumento de forma expressiva e significativa da concentração do fator de transcrição CREB no hipocampo dos animais do grupo TEPT bem como controle quando comparado com o grupo naive (Figura 14).

Por outro lado, pode-se observar que a concentração do fator de transcrição CREB no hipocampo foi reestabelecido 24 horas após a reexposição, uma vez que não foi detectada diferença significativa na concentração de CREB nos animais do grupo naive em relação ao grupo TEPT e controle, respectivamente (Figura 14).

Na figura 15 observa-se que os animais do grupo TEPT apresentaram redução de forma significativa da concentração da proteína cinase p38 no hipocampo 1 h após a indução dos estímulos elétricos e imediatamente após a reexposição quando comparados aos animais do grupo naive e controle, respectivamente. Entretanto, 6 h após a indução do estímulo elétrico e da reexposição ocorreu diminuição de forma não significativa da concentração da proteína cinase p38 no hipocampo dos animais do grupo TEPT quando comparado com o grupo naive e controle (Figura 15). Por fim, pode-se observar que a concentração da proteína cinase p38 no hipocampo foi restabelecido 24 horas após a reexposição, uma vez que os valores encontrados foram semelhantes nos animais do grupo naive em relação ao grupo TEPT e controle, respectivamente (Figura 15).

Figura 14 - Avaliação da concentração de CREB no hipocampo 1, 6 e 24 h após a exposição dos animais ao choque e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque.

Os resultados apresentados são expressos em % em função do controle. Os valores são expressos como média de 5 a 6 animais + EPM (erro padrão da média). O asterisco representa uma alteração estatisticamente significativa na concentração de CREB em relação aos demais grupos. *P < 0,05.

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Figura 15 - Concentração de p38 MAPK no hipocampo 1, 6 e 24 h após a exposição dos animais ao choque e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque.

Os resultados apresentados são expressos em % em função do controle. Os valores são expressos como média de 5 a 6 animais + EPM (erro padrão da média). O asterisco representa uma alteração estatisticamente significativa na expressão de P38 MAPK em relação aos demais grupos. *P < 0,05.

5.6 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DAS CASPASES 8 e 9 O perfil de concentração das enzimas envolvidas na morte celular programada (caspases 8 e 9) também foram avaliadas neste trabalho. Esta atividade foi avaliada em três diferentes períodos: 1, 6 e 24h após a aplicação dos choques elétricos e imediatamente após a reexposição dos animais ao aparato de choque.

Neste experimento observou-se que a concentração da caspase 8 no hipocampo, foi significativamente [F(2,13) = 5,877, P=0,0184] reduzida no grupo TEPT quando comparado aos grupos naive e controle, somente 24 h após a aplicação dos choques e imediatamente após a reexposição (Figura 16A).

Por outro lado, observou-se que não houve alteração significativa na atividade da caspase 9 no hipocampo dos animais do grupo TEPT, controle e naive em nenhum dos períodos avaliados [F(2,15) = 1,784, P=0,2067] (Figura 16B), sugerindo que a participação da caspase 8 se sobrepõe à da caspase 9, pelo menos durante os períodos iniciais em que o TEPT está instalado.

Figura 16 - Concentração das caspases 8 e 9 no hipocampo em 1, 6 e 24 h após a exposição dos animais ao choque e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque.

O painel A representa a concentração da caspase 8 e o painel B representa a concentração da caspase 9 no hipocampo em 1, 6 e 24 h após a exposição dos animais ao choque e imediatamente após a reexposição dos mesmos ao aparato de choque. Os resultados apresentados são expressos unidades arbitrárias/mg de proteína. Os valores são expressos como média de 6 a 8 animais + EPM (erro padrão da média). *P < 0,05.

6 DISCUSSÃO

Os dados descritos no presente trabalho claramente mostram que a metodologia que foi empregada com a finalidade de induzir um quadro ―tipo‖ TEPT em camundongos foi bem sucedida, tendo em vista que foi possível observar alguns sinais tais como: depressão, ansiedade e medo que são condizentes com a doença em humanos.

O quadro de ansiedade, caracterizado pelo comportamento de medo exagerado e diminuição da exploração do ambiente aversivo, e depressão, mimetizam em parte sintomas presentes em vários transtornos.

Conforme já mencionado anteriormente, muitos são os fatores que podem contribuir para que um indivíduo possa apresentar os sinais e sintomas clinicamente conhecidos no TEPT, sendo que eles abrangem desde as características genéticas de cada indivíduo, bem como as variáveis ambientais (BINDER et al., 2008; JOVANOVIC e RESSLER, 2010).

Resultados descritos na literatura mostram que essas respostas exacerbadas de medo ocorrem em função do circuito de medo condicionado que é conservado na grande maioria dos vertebrados, e possui uma leitura das memórias aversivas de uma forma extremamente rápida e robusta, facilitando, portanto, o aparecimento das memórias intrusivas, ―flash-backs‖ e o conhecido comportamento de hiper excitação comumente observada durante o TEPT (JOVANOVIC et al., 2009; YEHUDA e LEDOUX, 2007; LANG, DAVIS e OHMAN, 2000; BELZUNG e PHILIPPOT, 2007).

Portanto, a diminuição do número de explorações verticais dentro do aparato de choque durante a reexposição, aliado ao tempo de congelamento destes animais, são comportamentos originados do medo exagerado e da ansiedade, respectivamente e tais comportamentos não haviam sido observados até então por outros autores utilizando-se a metodologia empregada neste trabalho

Ademais, diferentemente do que se pode inferir, a diminuição do número de explorações verticais não resulta de uma diminuição da atividade locomotora (uma vez que não há diferença na ambulação dos animais que receberam os estímulos elétricos quando comparado com os demais grupos), mas sim uma diminuição da atividade exploratória o que reflete indiretamente no aumento do comportamento ansiogênico do animal (ANKUR, MAHESH e BHATT, 2013).

Sabe-se que dependendo da intensidade e do tempo em que se sustenta a exposição ao estresse, as respostas do indivíduo podem ser

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mal adaptadas, ou seja, ocorre uma facilitação do indivíduo desenvolver ansiedade, abuso de drogas e claro, quadros depressivos (BALE e VALE, 2004; KRISHNAN e NESTLER, 2008; BRUCHAS, LAND e CHAVKIN, 2010; KOOB, 2008).

De forma semelhante ao TEPT como um todo, o desenvolvimento de quadros depressivos são também dependentes de fatores ambientais e genéticos. Esta interação (genético-ambiental), porém, pode ser mais bem contextualizada como uma vulnerabilidade genética que pode se expressar em resposta a eventos traumáticos e/ou estressantes durante a vida do indivíduo. Estudos apontam que distúrbios complexos que resultam de fatores genéticos e ambientais são os que melhor prevêem a ocorrência de depressão (WONG e LICINIO, 2001) (Figura 17).

Figura 17 - Esquema da participação simultânea dos fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento de quadros depressivos.

Fonte:Adaptação de WONG e LICINIO, 2001.

Em nosso estudo, os choques (eventos extremamente estressantes) foram capazes de induzir nos animais uma resposta mal adaptada, ou seja, o comportamento ―tipo‖ depressivo propriamente dito. Assim, pode-se afirmar que: 1) o modelo de indução de TEPT através de uma única seção de choques foi capaz de induzir um comportamento ―tipo‖ depressivo, avaliado por meio do teste do nado