Caracterização da composição química de suplementos
desportivos
Estudos de citotoxicidade de alguns dos compostos
presentes nesses suplementos
Tânia Alexandra Fernandes Oliveira Martins
Dissertação do 2º Ciclo de Estudos Conducente ao Grau de Mestre
em Toxicologia Analítica, Clinica e Forense
Orientadores
Doutora Maria Paula do Amaral Alegria Guedes de Pinho Professora Maria de Lourdes Pinho Almeida Souteiro Bastos
Universidade do Porto
II É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS
PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE
III
Agradecimentos
Terminada mais uma etapa da minha vida, não poderia deixar de agradecer o apoio de todas as pessoas que tornaram este desafio possível de concretizar. Desta forma, gostaria de agradecer...
À comissão coordenadora do Mestrado em Toxicologia Analítica, Clinica e Forense, em especial à Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, pela criação e orientação do mesmo e pela oportunidade de realizar o trabalho numa área que me dá tanto gosto.
À Doutora Paula Guedes de Pinho, orientadora deste trabalho, por me acompanhar nesta jornada, por todos os ensinamentos, conselhos, confiança e incentivo.
Mais uma vez, à Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, pela co-orientação deste trabalho. Por toda a disponibilidade e palavras carinhosas de incentivo.
A todos os colegas e colaboradores do Departamento de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto pela amizade e pela integração no grupo. A todos agradeço a forma amiga como me receberam.
Um obrigado especial à Bárbara Silva, Maria Enea e Margarida Araújo, pelo incansável apoio e ajuda na cultura celular. Obrigada por todo o tempo disponibilizado, dedicação, paciência e ensinamentos.
Aos meus amigos que me acompanharam nesta jornada, à Rita Pereira e ao Brandon Aguiar. Por todos os conselhos, apoio e incentivo…por todos os almoços, lanches e horas de conversa...obrigada!
Por último, mas os mais importantes nesta caminhada…à minha família. Espero que se orgulhem de mim! Obrigada por sempre acreditarem em mim, por me fazerem ir sempre mais além e nunca desistir.
Por tudo isto e tantas outras coisas...
IV
Abstract
The relevance of a balanced diet and the regular practice of physical exercise has become increasingly important in the daily life of society. Inside sports practice there are the sportsmen who practice sports on a daily basis and the high-level athletes. When exercise intensity is high, nutrition and the delivery of certain nutrients is essential for the performance and recovery of the individual. Generally, a balanced diet that provides the energy required for good sports practice is sufficient. However, in some cases, there may be nutritional deficiencies, which lead to symptoms of stress or even exhaustion, therefore food supplements are used.
In recent times, supplements have been prominent in the sports market and its consumption has been increasing day by day. The speed at which these supplements appear on the market makes it difficult to analyze and evaluate the potential harm they may cause, so many of these supplements may not be effective and consumers are unaware of their adverse effects. It is therefore increasingly important and necessary to develop studies of their safety and the associated risks to health.
In this context, the chemical characterization (qualitative and quantitative) of some sports supplements was performed through a very selective and sensitive methodology, the analysis by GC-MS.
GC-MS analysis was then applied to reveal the real composition of these commercial products. Given the nature of commercial products, mostly proteins, the main compounds identified were, as expected, essential and non-essential amino acids such as L-leucine, L-isoleucine, L-valine, β-alanine, L-arginine, L-tyrosine, glycine, as well as creatine. Some inconsistencies in the composition of these products were also found: in products in which compounds that were not indicated on the labels (such as L-alanine, citrulline, L-norvaline) were detected, as well as compounds that were not detected but were present on the label (such as L-glutamine, taurine, L-phenylalanine). Some variability was also found between identical products.
The cytotoxicity of some commercial products and some of their constituent compounds, was also studied using HK-2 human kidney cell lines. In this study, the cells were exposed to these commercial products, to the individual compounds and to mixtures of amino acids, during a 24 h incubation period at 37 °C. The results showed that for L-alanine and L-isoleucine there is an increase in cell death dependent of concentration. Of
V all the amino acids tested, L-alanine, L-leucine and β-alanine had the lowest viability and L-tyrosine the highest viability. Of the 5 sports supplements tested in the cells, one achieved values of 1.5% viability, and two presented a high viability, superior to 79%, for the concentrations tested. Mixtures of their constituent amino acids were also tested and did not present significant differences in the cellular viability values, as compared to the respective sports supplements.
In summary, these results showed a qualitative and quantitative variability of the products sold as sports supplements, with nephrotoxic effects in some of the concentrations tested. They also showed that the toxicity presented in these products comes from their constituent amino acids. This information is essential to show concern about what we are actually consuming, and to elicit the risks that the consumption of these sports supplements can cause, essentially in the long term and in high doses. It is important for the consumer to be aware of the doses he consumes, given that food is also a source of protein and amino acids.
Key words:
Sports Supplements; Amino acids; L-leucine; L-isoleucine; L-valine; β-alanine; L-tyrosine; L-alanine; GC-MS; Nephrotoxicity; Human kidney cell line - HK-2
VI
Resumo
A relevância de uma alimentação equilibrada e a prática regular de exercício físico tem vindo a tornar-se cada vez mais importante no dia-a-dia da sociedade. Dentro da prática desportiva pode dividir-se os desportistas que praticam desporto diariamente e os de alta competição. Quando a intensidade do exercício é elevada, a nutrição e o aporte de determinados nutrientes é essencial para o desempenho e recuperação do indivíduo. Geralmente, uma alimentação equilibrada, que proporcione a energia necessária para a boa prática desportiva é suficiente, no entanto, em alguns casos, pode haver carências nutricionais, que levam a sintomas de stress ou mesmo desgaste físico pelo que se recorre a suplementos alimentares.
Nos últimos tempos, os suplementos têm-se destacado no mercado desportivo e o seu consumo tem vindo a aumentar de dia para dia. A velocidade a que estes suplementos surgem no mercado dificulta a análise e avaliação dos potenciais danos que estes possam causar, pelo que muitos destes suplementos podem não ter a sua eficácia demonstrada e os seus consumidores desconhecem os seus efeitos adversos. É, por isso, cada vez mais importante e necessário o desenvolvimento de estudos acerca da sua segurança e dos riscos associados para a saúde.
Neste contexto, procedeu-se à caracterização química (qualitativa e quantitativa) de alguns dos suplementos desportivos, através de uma metodologia bastante selectiva e sensível, a análise por GC-MS.
A análise por GC-MS foi então aplicada para revelar a verdadeira composição destes produtos comerciais. Dada a natureza dos produtos comerciais, maioritariamente proteínas, os principais compostos identificados foram, como o esperado, aminoácidos, essenciais e não essenciais, tais como a leucina, isoleucina, valina, β-alanina, L-arginina, L-tirosina, glicina, assim como a creatina. Foram também encontradas algumas inconsistências na composição destes produtos, nomeadamente em produtos nos quais foram detetados compostos que não se encontravam indicados nos rótulos (tais como a L-alanina, citrulina, L-norvalina), assim como compostos que não foram detetados mas que se apresentavam no rótulo (tais como a L-glutamina, taurina, L-fenilalanina). Foi ainda encontrada alguma variabilidade entre produtos idênticos.
Procedeu-se ainda ao estudo da citotoxicidade de alguns dos produtos comerciais e de alguns dos compostos que os constituíam, usando linhas celulares de rim humano,
VII HK-2. Neste estudo, as células foram expostas a estes produtos comerciais, aos compostos individuais e a misturas de aminoácidos, durante um período de incubação de 24 h, a 37 °C. Os resultados mostraram que para a L-alanina e L-isoleucina existe um aumento da morte celular dependente da concentração. De todos os aminoácidos testados, a alanina, leucina e β-alanina apresentaram a menor viabilidade e a L-tirosina a maior viabilidade. Dos 5 suplementos desportivos testados nas células, um atingiu valores de 1,5% de viabilidade, e dois apresentaram elevada viabilidade, superior a 79%, para as concentrações testadas. Foram também testadas as misturas dos aminoácidos constituintes dos suplementos desportivos para verificar o efeito destes na toxicidade dos produtos comerciais. Estas misturas não apresentaram diferenças significativas nos valores de viabiliadade celular, comparativamente com os respetivos suplementos desportivos.
Em suma, estes resultados mostraram uma variabilidade qualitativa e quantitativa dos produtos vendidos como suplementos desportivos, com efeitos nefrotóxicos em algumas das concentrações testadas. Mostraram ainda que a toxicidade apresentada nestes produtos advém dos aminoácidos presentes na sua composição. Esta informação é essencial para mostrar a preocupação a ter com o que realmente estamos a consumir, e para elertar para os riscos que o consumo destes suplementos desportivos pode provocar, essencialmente a longo prazo e em doses elevadas. É importante que o consumidor esteja ciente das doses que consome, tendo em conta que a alimentação também é uma fonte de proteínas e aminoácidos.
Palavras-chave:
Suplementos Desportivos; Aminoácidos; L-leucina; L-isoleucina; L-valina; β-alanina; L-tirosina; L-alanina; GC-MS; Nefrotoxicidade; Linha celular de rim humano - HK-2
VIII
Índice Geral
Agradecimentos ... III Abstract ... IV Resumo ... VI Índice Geral ... VIII Índice de Figuras ... X Índice de Tabelas ... XIII Lista de Abreviaturas ... XIV
Introdução ... 1
1. Suplementos Desportivos ... 2
1.1. Origem e uso dos suplementos ... 2
1.2. Riscos associados aos suplementos ... 3
1.3. Prevalência do uso de suplementos... 5
1.4. Classificação dos suplementos ... 6
2. Exemplos de Suplementos Desportivos ... 9
2.1. Proteínas ... 9
2.2. Aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA´s) ... 16
2.3. β-alanina ... 23
3. Métodos de Análise de Suplementos Desportivos / Aminoácidos ... 29
3.1. Técnicas cromatográficas ... 29
Objetivos ... 32
Estudos de Caracterização Química ... 34
1. Parte Experimental ... 35
1.1. Reagentes e Padrões ... 35
1.2. Produtos comerciais usados como suplementos desportivos ... 35
1.3. Análise qualitativa dos suplementos por GC-MS ... 36
... 38
... 38
1.4. Quantificação dos compostos por GC-MS ... 39
IX 2.1. Comparação dos espetros de massa dos padrões utilizados com os da NIST 14
... 41
2.2. Caracterização dos produtos comerciais ... 47
2.3. Análise dos compostos presentes nos produtos comerciais ... 48
2.4. Inconsistências na composição dos produtos comerciais analisados ... 61
2.5. Análises quantitativas ... 66
Estudos de Citotoxicidade dos Suplementos ... 71
3. Parte Experimental ... 72
3.1. Reagentes ... 72
3.2. Cultura celular HK-2 ... 72
3.3. Exposição das amostras, misturas e respectivos compostos isolados ... 73
3.4. Ensaio de redução de MTT para determinação da viabilidade celular ... 74
3.5. Análise estatística... 75
4. Resultados e Discussão do Estudo de Citotoxicidade ... 76
4.1. Análise da citotoxicidade das amostras, misturas e aminoácidos isolados ... 76
4.2. Relação concentração-efeito das amostras, misturas e aminoácidos individuais analisados ... 79
Conclusões ... 90
X
Índice de Figuras
Figura 1. Tipo de apresentação dos vários suplementos desportivos vendidos no
mercado. ... 3 Figura 2. Estrutura da proteína. ... 9 Figura 3. Ciclo da ureia. A amónia é formada no ciclo da ureia para produzir ureia que é eliminada pelos rins (retirada de (23)). ... 12 Figura 4. Vias de degradação de aminoácidos para produção de energia. Alguns dos aminoácidos podem entrar no ciclo de Krebs através de mais do que uma via (adaptada de (23))... 13 Figura 5. Estrutura química dos aminoácidos de cadeia ramificada: leucina, isoleucina e valina. ... 16 Figura 6. Regulação do complexo enzimático desidrogenase de α-cetoácidos de cadeia ramificada (DCCR), (ATACR = aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada; α-CCR = α-cetoácidos de cadeia ramificada; R-CoA = acil-CoA) (retirada de (40)). ... 18 Figura 7. Metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada. Os aminoácidos valina e isoleucina formam propionil-CoA, que pode ser convertido em succinil-CoA. Os
aminoácidos leucina e isoleucina formam acetil-CoA. O aminoácido leucina pode ainda formar acetoacetato (retirada de (40)). ... 18 Figura 8. Quebra dos aminoácidos de cadeia ramificada no músculo-esquelético. Esta termina com a formação de acetil-CoA e sucinil-CoA que são ótimas fontes de energia (retirado de (44)). ... 19 Figura 9. Relação entre o metabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e a síntese de alanina e de glutamina no tecido muscular. ATACR= aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada; AAT= alanina aminotransferase; GS= enzima
glutamina sintetase (retirada de (40)). ... 21 Figura 10. Estrutura química da β-alanina. ... 23 Figura 11. (A) Vias de produção da β-alanina. (B) Principal via de produção da β-alanina (adaptado de (58)). ... 24 Figura 12. Formação da carnosina através da β-alanina e histidina (adaptada de (60)). . 25 Figura 13. Síntese de ATP através do metabolismo da glicose. ... 26 Figura 14. Via geral do transporte de β-alanina, síntese e degradação de carnosina (retirada de (58)). ... 27 Figura 15. Apresentação de alguns dos suplementos desportivos analisados... 35 Figura 16. Procedimentos envolvidos na análise dos suplementos desportivos por GC-MS. ... 38 Figura 17. Reação do grupo hidroxilo (sililação) com MSTFA (81). ... 39 Figura 18. Espetros de massa da isoleucina 2TMS, leucina 2TMS, valina 2TMS, L-alanina 2TMS, L-tirosina 2TMS, e β-L-alanina 2TMS, respectivamente (injecção após derivatização). Os principais iões (m/z) no espetro de massa de cada padrão são os mesmos que dos respectivos espetros de massa da NIST 14. ... 46 Figura 19. Rótulo e indicações presentes nas embalagens de alguns dos produtos. ... 48
XI Figura 20. Perfil cromatográfico dos extratos metanólicos da amostra 3 injectada no GC-MS, diretamente (Cromatograma A) e após derivatização com MSTFA (Cromatograma B). ... 49 Figura 21. Espetros de massa e respectivos tempos de retenção da L-isoleucina 2TMS (padrão e na amostra 17), L-leucina 2TMS (padrão e na amostra 17), L-valina 2TMS (padrão e na amostra 17), L-alanina 2TMS (padrão e na amostra 17), L-tirosina 2TMS (padrão e na amostra 29) e β-alanina 2TMS (padrão e na amostra 15). ... 52 Figura 22. Perfil cromatográfico dos extractos após derivatização das amostras 3, 17, 2 e 7, injectados no GC-MS, indicando a identificação dos compostos, baseada na análise dos espetros de massa, e a variabilidade quantitativa e qualitativa das amostras com o mesmo nome comercial. 1- L-valina TMS; L-alanina 2TMS; 3- L-leucina TMS; 4- 2-metilalanina 2TMS; 5- isoleucina TMS; 6- valina 2TMS; 7- norvalina 2TMS; 8- L-leucina 2TMS; 9- L-isoL-leucina 2TMS; 10- Glicina 2TMS; 11- Creatina 3TMS. ... 64 Figura 23. Redução do MTT a formazan (adaptado de (86)). ... 74 Figura 24. Resultados de viabilidade celular, obtidos pelo ensaio de MTT em HK-2 após 24 horas de incubação a 37°C, para seis concentrações dos aminoácidos L-valina (0,08 – 16 mg/mL), L-isoleucina (0,02 – 10 mg/mL), L-tirosina (0,003 – 0,14 mg/mL), L-alanina (0,5 – 60 mg/mL) e L-leucina (1,5 – 14 mg/mL). Os resultados estão apresentados em percentagem de viabilidade celular, normalizados com o controlo negativo e positivo. A análise estatística foi realizada utilizando a one-way ANOVA / Tukey´s multiple
comparison test para a L-valina, L-isoleucina, L-alanina e L-leucina e o teste de Kruskal-Wallis / Dunn's multiple comparisons test para a L-tirosina. (** p<0,01; *** p<0,001; **** p<0,0001 vs controlo). ... 81 Figura 25. Resultados de viabilidade celular, obtidos pelo ensaio de MTT em HK-2 após 24 horas de incubação a 37°C, para seis concentrações da β-alanina (5 – 100 mg/mL) e amostra 15 (5 – 100 mg/mL). Os resultados estão apresentados em percentagem de viabilidade celular, normalizados com o controlo negativo e positivo. A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Kruskal-Wallis / Dunn's multiple comparisons test (* p<0,05; ** p<0,01; **** p<0,0001 vs controlo). ... 82 Figura 26. Resultados de viabilidade celular, obtidos pelo ensaio de MTT em HK-2 após 24 horas de incubação a 37°C, para seis concentrações da amostra 17 (2,5 – 20 mg/mL) e mistura 17 (2,5 – 20 mg/mL). Os resultados estão apresentados em percentagem de viabilidade celular, normalizados com o controlo negativo e positivo. A análise estatística foi realizada utilizando a one-way ANOVA / Tukey´s multiple comparison test (****
p<0,0001 vs controlo). ... 83 Figura 27. Resultados de viabilidade celular, obtidos pelo ensaio de MTT em HK-2 após 24 horas de incubação a 37°C, para seis concentrações da amostra 23 (1,5 – 15 mg/mL) e mistura 23 (1,5 – 15 mg/mL). Os resultados estão apresentados em percentagem de viabilidade celular, normalizados com o controlo negativo e positivo. A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Kruskal-Wallis / Dunn's multiple comparisons test (*** p<0,001; **** p<0.0001 vs controlo). ... 85 Figura 28. Resultados de viabilidade celular, obtidos pelo ensaio de MTT em HK-2 após 24 horas de incubação a 37°C, para seis concentrações da amostra 29 (0,8 – 6,4 mg/mL) e mistura 29 (0,8 – 6,4 mg/mL). Os resultados estão apresentados em percentagem de viabilidade celular, normalizados com o controlo negativo e positivo. A análise estatística foi realizada utilizando a one-way ANOVA / Tukey´s multiple comparison test (* p<0,05; ** p<0,01; **** p<0,0001 vs controlo). ... 86
XII Figura 29. Resultados de viabilidade celular, obtidos pelo ensaio de MTT em HK-2 após 24 horas de incubação a 37°C, para seis concentrações da amostra 30 (0,4 – 3 mg/mL) e mistura 30 (0,4 – 3 mg/mL). Os resultados estão apresentados em percentagem de viabilidade celular, normalizados com o controlo negativo e positivo. A análise estatística foi realizada utilizando a one-way ANOVA / Tukey´s multiple comparison test (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; **** p<0.0001 vs controlo). ... 88
XIII
Índice de Tabelas
Tabela 1. Aminoácidos essenciais, semi-essenciais e não essenciais na dieta humana, adaptado de (18). ... 10 Tabela 2. Técnicas cromatográficas utilizadas na análise de proteínas/aminoácidos ... 31 Tabela 3. Composição química indicada no rótulo vs. compostos identificados por GC-MS, de 23 produtos comerciais vendidos como suplementos desportivos. ... 53 Tabela 4. Tempo de retenção, iões característicos (m/z) e R.Match dos compostos
detetados por GC-MS, após derivatização com MSTFA. ... 60 Tabela 5. Compostos identificados por GC-MS nas amostras com o mesmo nome
comercial e marcas iguais ou diferentes. ... 62 Tabela 6. Curva de calibração para a β-alanina, isoleucina, tirosina, valina,
L-leucina e L-alanina ... 67 Tabela 7. Concentrações obtidas de cada analito em cada uma das amostras
seleccionadas. ... 68 Tabela 8. Comparação das quantidades obtidas de cada composto em cada uma das amostras com as indicadas no rótulo... 69 Tabela 9. Concentrações testadas para as amostras, misturas e compostos isolados. ... 73 Tabela 10. Solubilidades dos compostos presentes nas amostras, de acordo com a literatura. ... 78 Tabela 11. Solubilidades máximas das amostras/misturas e aminoácidos analisados, após dissolução total em meio de cultura. ... 78
XIV
Lista de Abreviaturas
AA – Aminoácidos
acetil-CoA – Acetilcoenzima A
ADME – Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção ALP - Fosfatase alcalina
ALT - Alanina transaminase AST - Aspartato transaminase
ATACR – Aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada ATP – Adenosina Trifosfato
BCAA - Aminoácidos de cadeia ramificada
CE-UV – Eletroforese capilar com deteção Ultravioleta cm2 – Centimetro quadrado
CO2 – Dióxido de carbono
DCCR – Desidrogenase de cetoácidos de cadeia ramificada DGAV - Direção Geral de Alimentação e Veterinária
DMSO – Dimetilsulfóxido ECF – Cloroformato de etilo EI – Impato eletrónico FBS – Soro bovino fetal GC – Cromatografia Gasosa
GC-MS – Cromatografia Gasosa acoplada à Espetrometria de Massa H+ - Ião hidrogénio
HK-2 – Células de rim humano 2
HPLC-UV – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção Ultravioleta IDR – Ingestão diária recomendada
Infarmed – Autoridade Nacional do Medicamento e Produtos de Saúde, I.P. IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada
XV m/z - Razão massa por carga
MeOH – Metanol
MS – Espectrometria de Massa
MSTFA – N-metil-N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida
MTT – Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio NaHCO3 - Hidrogenocarbonato de sódio
NIST - Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia O2 - Óxigénio
OPA/NAC - o-Oftalaldeído-N-acetil-L-cisteína PBS - Tampão fosfato-salino
Pi – padrão interno PITC - Fenilisotiocianato
pKa - Constante de dissociação ácida R2 - Coeficiente de correlação
RSD – Desvio padrão relativo T.r. – Tempo de retenção
TauT – Transportador da taurina TMS – Trimetilsililo
1
2 1. Suplementos Desportivos
Nos últimos anos a prevalência da obesidade tem vindo a aumentar e, consequentemente, o número de doenças provocadas por esta tem sido alvo de grande preocupação por parte de toda a comunidade médica (1). De maneira a contrariar esta tendência, surgem, por todo o mundo, estratégias de marketing e de promoção da prática de exercício físico.
Para além da saúde e o bem-estar físico individual, é a procura pelo corpo perfeito idealizado pela sociedade que leva ao aumento do número de praticantes de desporto. Para atingirem os seus objetivos e ―o corpo ideal‖ de forma mais rápida, alguns indivíduos tendem a recorrer a suplementos alimentares.
1.1. Origem e uso dos suplementos
A suplementação e consequente alteração da dieta dos atletas teve origem na Grécia antiga, em que os atletas gregos, antes das competições dos jogos olímpicos, recorriam a determinados alimentos, como fígado de veado ou coração de leão, com o intuito de aumentar a sua força e velocidade (2). Desde então o uso de suplementos, com o intuito de melhorar o rendimento físico, por parte dos atletas tem vindo a aumentar.
De acordo com o Decreto-Lei n.º 118/2015, de 23 de junho, publicado no diário da República, os suplementos alimentares são ―géneros alimentícios que se destinam a complementar e/ou suplementar o regime alimentar normal‖. Constituem fontes concentradas de determinadas substâncias e nutrientes (tais como vitaminas, sais minerais, proteínas, aminoácidos, entre outros), com efeito nutricional ou fisiológico (estremes ou combinadas), comercializados em vários tipos de formulações, tais como: comprimidos, pós, cápsulas, granulados, pastilhas, soluções, suspensões, entre outras, destinados a serem tomados de forma rigorosa e em quantidades reduzidas, podendo ser compostos por um ingrediente único ou por uma mistura de várias substâncias (3). Desta forma, os suplementos alimentares nada mais são do que um conjunto de substâncias utilizadas, por desportistas e praticantes de exercicio fisico, para reforçar e complementar a sua alimentação de forma a permitir o ganho de massa muscular, a perda de peso, entre outros objetivos pessoais.
3 Figura 1. Tipo de apresentação dos vários suplementos desportivos vendidos no mercado.
Actualmente, estes suplementos são de venda livre no mercado nomeadamente em supermercados, internet, ginásios, entre outros.
Como não são considerados medicamentos, mas sim géneros alimentícios, a sua colocação no mercado não é da competência do INFARMED (Autoridade Nacional do Medicamento e Produtos de Saúde, I.P.), mas sim da DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária), e não exige a apresentação de ensaios de segurança. A sua segurança é da responsabilidade dos fabricantes que os colocam no mercado, através do cumprimento das regras comunitárias de Segurança Alimentar impostas pela DGAV. No entanto, de acordo com o Decreto-Lei n.º 118/2015 de 23 de Junho ―o director geral de Alimentação e Veterinária pode, sempre que necessário, solicitar aos operadores que tenham feito a notificação de suplementos alimentares, nos termos do disposto no artigo anterior, que apresentem estudos de qualidade e segurança dos suplementos alimentares a serem realizados por entidades com reconhecida competência técnica nestas áreas‖ (3).
1.2. Riscos associados aos suplementos
A procura descontrolada por um corpo escultural, e o baixo conhecimento dos desportistas quanto à alimentação adequada e aos cuidados a ter com a suplementação,
4 mantêm o mercado em contínuo crescimento. Todos os dias, milhões de pessoas, atletas e não atletas, procuram suplementos que lhes permitam melhorar a sua performance e o seu aspeto físico, procura esta motivada por propagandas e anúncios que promovem os suplementos como produtos ―milagrosos‖ que, com pouco esforço e em pouco tempo, proporcionam a otimização do desempenho, aumento da massa muscular, perda de peso, entre outros (4).
Desta forma, a informação transmitida pelos media, muitas das vezes incompleta e distorcida, leva a que muitos dos desportistas utilizem suplementos de forma indiscriminada, sem qualquer tipo de informação adicional ou prescrição por parte dos nutricionistas, podendo levar a desequilíbrios nutricionais provocados pela ingestão de altas doses e, consequentemente causar problemas de saúde que se podem repercutir em consequências fatais.
Vários estudos científicos levados a cabo em diversas partes do mundo demonstraram que alguns dos suplementos contêm ingredientes ativos em menores quantidades dos que as indicadas no rótulo, ou ingredientes que não são indicados no rótulo (5). Foi ainda documentado que, alguns deles contêm algumas das substâncias presentes na lista de substâncias proibidas pela Agência Mundial de Antidopagem. Verificou-se a presença de precursores de testosterona e precursores de nandrolona, sem que estes estejam mencionados nos rótulos (4).
1.2.1. Reações adversas aos suplementos desportivos
É recorrente, entre os praticantes de desporto, pensarem que os suplementos nutricionais são seguros e eficazes pois são ―naturais‖ e porque têm uma tradição de consumo de centenas de anos. No entanto, tal não é completamente verdade porque, grande parte deles, são comercializados sem serem sujeitos a qualquer tipo de controlo ou garantia pelos laboratórios e não existe muita informação acerca dos possíveis efeitos colaterais adversos à saúde. Desta forma, podem ser prejudiciais, provocar desequilíbrios e apresentar toxicidade no organismo, uma vez que o efeito no organismo dos diferentes suplementos depende de vários factores entre os quais, da variabilidade individual (6).
Para além da variabilidade individual face aos efeitos dos suplementos no organismo, parte das reacções adversas descritas provêm ainda da interacção destes
5 com os fármacos, dado que, por vezes, os suplementos alimentares contêm compostos ativos que podem interagir com os fármacos, podendo provocar reações adversas. Estas interacções podem ser farmacodinâmicas – quando advêm da alteração da capacidade do medicamento em actuar no local de acção, ou farmacocinéticas – quando advêm da alteração da quantidade de fármaco no local de acção, provocando alterações quer na absorção, distribuição, metabolismo ou excreção, podendo provocar efeitos sinérgicos ou antagonistas (7).
As reacções adversas aos suplementos podem variar entre problemas gastrointestinais (náuseas, vómitos ou diarreia), reacções alérgicas (rash cutâneo), toxicidade renal (nefrolitíase ou falência renal) ou hepática (hepatite ou falência hepática), problemas cardiovasculares (hipotensão, hipertensão, arritmia) ou neurológicos (convulsões), alterações hormonais (acne, hirsutismo ou ginecomastia), cancro, entre outros (8-10).
1.3. Prevalência do uso de suplementos
O desporto está cada vez mais competitivo exigindo cada vez mais dos desportistas, pelo que qualquer ajuda para melhorar o estado físico e/ou psicológico do indivíduo é tida em conta. Desta forma surge o uso de suplementos alimentares, cada vez mais utilizados com o objectivo de melhorar o desempenho, a condição física, diminuir a fadiga e evitar a desidratação ao longo do treino. Segundo alguns estudos realizados em atletas, os principais motivos mencionados que os levam ao uso de suplementos são: melhorar o desempenho físico; ter mais energia e reduzir o cansaço; aumentar a força e resistência e ganhar massa muscular (4, 6, 11).
O consumo de suplementos entrou em grande uso nos Estados Unidos da América e, ao longo dos anos, tem vindo a disseminar-se por várias regiões da Europa, Ásia, e Brasil, tornando-se cada vez mais numa opção indispensável para os praticantes de desporto (12).
Desta forma, em vários países, têm sido realizados estudos acerca da prevalência do uso de suplementos, por praticantes de exercício físico em ginásios, de maneira a identificar os principais motivos que levam ao seu uso, a informação prévia que os seus consumidores adquirem acerca do uso dos mesmos, a satisfação com os resultados obtidos, entre outros (4, 6, 13, 14).
6 De acordo com alguns dos estudos realizados verifica-se uma prevalência do uso de suplementos desportivos de aproximadamente 30-40%, sendo esta significativamente maior em indivíduos do sexo masculino. A faixa etária dos consumidores de suplementos varia entre os 18 e os 55 anos, com maior incidência entre os 20 e os 30 anos. Alguns dos consumidores utilizam dois ou mais suplementos em simultâneo (maioritariamente proteínas, aminoácidos e minerais), sendo os principais motivos para o seu consumo o ganho massa muscular e a melhoria da performance. Um número significativo dos consumidores adquire os suplementos através de amigos, outros atletas, treinadores ou através da internet, verificando-se uma certa tendência dos consumidores para se informarem antes de iniciarem a suplementação perto dos amigos, treinadores ou outros atletas, em vez de consultarem profissionais de saúde (4, 6, 13, 14).
1.4. Classificação dos suplementos
A classificação dos suplementos desportivos não é unânime, sendo esta variável de autor para autor. Alguns classificam-nos de acordo com o principal nutriente neles presente (hidratos de carbono, multivitamínico, etc), enquanto que outros preferem classificá-los de acordo com o objectivo da sua comercialização (―fat burners‖, anabólicos, etc) (15).
De acordo com Linhares e Lima (2006), os suplementos podem ser classificados essencialmente em: ergogénicos, termogénicos e anabólicos (4):
Suplementos ergogénicos
Segundo Linhares e Lima (2006), suplementos ergogénicos são substâncias que melhoram e intensificam o desempenho de um atleta eliminando qualquer sensação de cansaço, fadiga física e mental, resultando na otimização da sua performance. Exemplos destes são a creatina e a cafeína (4).
Suplementos termogénicos
Ainda de acordo com Linhares e Lima (2006), os termogénicos, também conhecidos como queimadores de gordura, pertencem a um grupo de substâncias cuja acção é aumentar a temperatura corporal, provocando uma perda maior de calorias e reduzindo o apetite. Através da metabolização das gorduras, transformam as calorias provenientes da gordura em energia, sendo esta consumida pelo organismo de forma
7 mais rápida acelerando o metabolismo e promovendo a perda de peso. Um dos suplementos termogénicos utilizados pelos praticantes de desporto é a L-carnitina (4).
Suplementos anabólicos
O termo anabólico provém da palavra anabolismo que consiste na síntese/formação de compostos responsáveis pelos ganhos de massa muscular. O anabolismo é afectado por factores como o treino, o descanso, a alimentação e a ingestão de suplementos. Os suplementos anabólicos ajudam assim o corpo a maximizar a produção de hormonas essenciais ao desenvolvimento muscular tais como a testosterona ou a hormona de crescimento. De entre os vários suplementos anabólicos existentes, temos os BCAA´s (Branched-Chain Amino Acids) (aminoácidos de cadeia ramificada: valina, leucina, isoleucina) e a glutamina (4).
Já segundo Kreider (2010), os suplementos podem ser classificados como suplementos de conveniência (por exemplo: barras energéticas, pós de substituição de refeições, suplementos prontos a beber), com o objectivo de fornecer uma quantidade adequada de calorias e substâncias necessárias; suplementos para perda de peso, suplementos para ganho de massa muscular e suplementos para melhoria do desempenho. Com base nestes critérios, categoriza-os de acordo com a sua eficácia comprovada da seguinte forma (16):
Suplemento aparentemente eficaz
Suplemento que permite suprir as necessidades calóricas gerais de um indivíduo, e em que a maioria dos estudos realizados, nas populações relevantes, mostrou a sua eficácia e a sua segurança (exemplos: proteínas, creatina, cafeína).
Suplemento possivelmente eficaz
Suplemento com estudos iniciais apoiados por fundamentação teórica, no entanto são necessárias mais pesquisas para determinar como este pode afetar o desempenho e a performance do atleta (exemplo: BCAA).
Suplemento com dados experimentais insuficientes para provar a sua eficácia
Suplemento teoricamente eficaz, mas sem pesquisas suficientes para comprovar a sua verdadeira eficácia (exemplo: fosfatidilcolina).
8
Suplemento aparentemente eficaz
Suplemento que não possui uma fundamentação científica sólida e/ou em que estudos realizados mostraram que era ineficaz (exemplo: glutamina)(16).
9 2. Exemplos de Suplementos Desportivos
2.1. Proteínas
Não deve haver um outro nutriente que tenha tanto destaque no desporto e entre os desportistas quanto a proteína, devido ao seu papel no crescimento e na reparação muscular.
2.1.1. Importância da proteína como nutriente
Proteínas são macromoléculas, constituídas por uma sequência de aminoácidos (compostos essencialmente por um grupo carboxilo e um grupo amina) ligados por ligações peptídicas (Figura 2).
Figura 2. Estrutura da proteína.
Com a exceção da água, as proteínas são as moléculas mais abundantes no corpo humano, sendo o principal componente estrutural de todas as células. Faz parte da constituição do cabelo, pele, olhos e órgãos do corpo, de várias membranas, hormonas, enzimas e particularmente dos músculos (17, 18). Por exemplo, o corpo de um homem de 70 Kg contém cerca de 11 Kg de proteína, sendo que quase metade desta (cerca de
10 43%) se encontra no músculo-esquelético, aproximadamente 15% está presente na pele e no sangue, 10% no fígado e rins, e a restante distribuída por outros órgãos como o cérebro, coração, pulmão e ossos (18).
As proteínas são ainda importantes na formação de células sanguíneas, na resposta imunitária (produzindo anticorpos para proteção de doenças e infecções), na reparação das células (nomeadamente das células musculares), no transporte de moléculas, utilização como fonte de energia (quando os níveis de hidratos de carbono e de lípidos no corpo diminui), entre outros (18, 19). É assim essencial a ingestão adequada de proteína para manter a integridade e a função celular.
Existem 20 AA (aminoácidos) que constituem as proteínas (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina). Desses, nove são chamados de aminoácidos essenciais uma vez que o organismo não é capaz de os sintetizar por si próprio (Tabela 1) pelo que devem ser obtidos através do consumo de alimentos que contenham proteínas. Como fontes de proteína de alta qualidade temos: a carne, o peixe, ovos, leite e seus derivados (lacticínios), entre outros (17, 18).
Tabela 1. Aminoácidos essenciais, semi-essenciais e não essenciais na dieta humana, adaptado de (18).
Aminoácidos essenciais Aminoácidos
semi-essenciais Aminoácidos não essenciais
Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Valina Arginina Cisteína Glutamina Glicina Prolina Tirosina Alanina Ácido aspártico Asparagina Ácido glutâmico Serina
11 2.1.2. Necessidades dietéticas de proteína
Existe uma grande controvérsia na literatura acerca da quantidade diária de proteína a consumir (20). Esta varia de indivíduo para indivíduo e depende de vários factores (composição e massa corporal, crescimento, nível de atividade física, presença de lesões ou doenças, entre outros) (17).
De acordo com a literatura, a ingestão diária recomendada (IDR) para adultos é de 0,8 a 1,2 g (gramas) de proteína por cada kg de peso corporal. No entanto, a IDR é baseada nas necessidades diárias de indivíduos com um estilo de vida relativamente sedentário, sem considerar o uso de proteínas no metabolismo energético. Estudos mais recentes indicam que indivíduos que praticam exercício físico necessitam de ingerir níveis mais elevados de proteína uma vez que esta contribui para o fornecimento de energia e é importante para a reparação do tecido e síntese proteica. Sendo assim, para pessoas ativas e que praticam exercício físico, os valores diários recomendados aumentam para 1,2 a 1,8 g de proteína por cada kg de peso corporal (17, 21, 22).
2.1.3. Metabolismo das proteínas
As proteínas, depois de ingeridas, entram no estômago e sofrem desnaturação pelo ácido nele presente. O aumento da acidez do estômago, aquando da ingestão de alimentos, faz ativar a enzima pepsina que por sua vez transforma as proteínas em polipeptídeos mais pequenos. Seguem posteriormente para o intestino no qual sofrem hidrólise, por uma variedade de enzimas digestivas, e originam aminoácidos. Estes são posteriormente libertados para a corrente sanguínea e transportados para o fígado e outros tecidos periféricos, para sintetizar novas proteínas (18, 23).
Quando uma dieta é rica em proteínas e a ingestão ultrapassa as necessidades do organismo para a síntese proteica, o corpo é incapaz de as armazenar, pelo que o excedente sofre degradação, essencialmente no fígado. Neste, os aminoácidos são desaminados dando origem à amónia que, por sua vez, é utilizada no ciclo da ureia para formar a ureia que é excretada pelos rins através da urina (Figura 3) (23).
12 Figura 3. Ciclo da ureia. A amónia é formada no ciclo da ureia para produzir ureia que é eliminada pelos rins (retirada de (23)).
Para além da amónia, a decomposição dos aminoácidos dá origem a outros intermediários tais como o piruvato, a acetil-CoA (acetilcoenzima A), o oxaloacetato e o α-cetoglutarato, que podem também servir como fonte de energia através da glicólise e do ciclo de Krebs, também referido como ciclo do ácido cítrico (Figura 4).
13 Figura 4. Vias de degradação de aminoácidos para produção de energia. Alguns dos aminoácidos podem entrar no ciclo de Krebs através de mais do que uma via (adaptada de (23)).
14 A utilização das proteínas como fonte energética é significativa durante períodos de restrição energética (durante o jejum prolongado, por exemplo) ou após a utilização das reservas de hidratos de carbono do organismo (23).
2.1.4. Suplementação de proteína
Grande parte dos aminoácidos está disponível na dieta humana, pelo que uma pessoa saudável com uma dieta equilibrada raramente precisa recorrer a suplementos proteicos. No entanto, alguns atletas que visam a hipertrofia e a diminuição de massa gorda usam suplementos proteicos para dar resposta às necessidades nutricionais e/ou fornecer aminoácidos essenciais após o exercício, a fim de otimizar a síntese proteica (16).
De entre os vários suplementos proteicos existentes no mercado, os mais utilizados são a proteína Whey (proteína do soro do leite, rica em aminoácidos essenciais), a caseína (também derivada do leite), a proteína de soja e a albumina do ovo (24).
Cada vez mais são os atletas que recorrem a suplementos proteicos com o intuito de melhorar a performance, diminuir a fadiga, aumentar a massa muscular, diminuir a massa gorda, entre outros motivos. No entanto, dados da literatura são controversos quanto a estes efeitos. Alguns estudos mostraram que a ingestão de suplementos proteicos era relevante para a melhoria da performance de atletas, enquanto que outros não verificaram qualquer beneficio da sua ingestão no exercício nem na composição corporal dos atletas (25-30).
2.1.5. Efeitos adversos da suplementação de proteínas
As proteínas são essenciais para o funcionamento do nosso organismo e quando o corpo não apresenta os níveis proteicos necessários para o seu bom funcionamento, atinge um estado de insuficiência e desnutrição proteica que pode levar a várias doenças, podendo afetar o cérebro, os rins, o sistema imunitário (tornando-o mais suscetível a infecções), entre outros órgãos (18).
15 No entanto, assim como uma dieta escassa em proteína é prejudicial ao nosso organismo, o seu excesso, para além de ser transformado em gorduras e armazenado no tecido adiposo (17), pode também provocar uma série de alterações a nível: renal, hepático, dermatológico, entre outros (31-35).
De acordo com a literatura, são mencionados casos de indivíduos saudáveis que, após ingestão de suplementos proteicos, apresentaram náuseas, vómitos, prurido e acne localizada (31, 32), tendo estes sintomas amenizado após a interrupção da ingestão dos suplementos. Foi ainda realizado um estudo no qual se verificou que a suplementação proteica, quando não associada a exercícios de resistência, fazia aumentar os níveis de aspartato transaminase (AST), de alanina transaminase (ALT), de fosfatase alcalina (ALP) e de creatinina. Como a AST, a ALT e ALP são biomarcadores clínicos da função hepática, e a creatinina sérica um biomarcador clínico da função renal (36), estes valores elevados evidenciaram a existência de lesões hepática e renal (33-35).
Em contrapartida, outros estudos mostraram que a ingestão de elevadas quantidades de proteína não afectava a função renal em adultos saudáveis (37-39), verificando-se uma grande controvérsia nos estudos já realizados para avaliar os efeitos adversos que estes suplementos possam causar na saúde do indivíduo. Torna-se assim essencial a realização de mais estudos para descrever melhor os efeitos da suplementação de proteínas na função hepática e renal e, desta forma, estabelecer as quantidades óptimas e seguras da sua ingestão.
16 2.2. Aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA´s)
Tal como já referido, os aminoácidos são a unidade básica constituinte de uma proteína, existindo um total de 20 aminoácidos diferentes. Desses 20 aminoácidos, 9 são essenciais o que significa que não conseguem ser sintetizados pelo nosso organismo, devendo assim ser obtidos através da dieta. Dos 9 aminoácidos essenciais, 3 são de cadeia ramificada: leucina, isoleucina e valina devido às suas estruturas químicas ramificadas (Figura 5) (40).
Figura 5. Estrutura química dos aminoácidos de cadeia ramificada: leucina, isoleucina e valina.
Juntos, constituem cerca de 35% a 40% dos aminoácidos essenciais presentes no nosso organismo e 14% a 18% dos encontrados nos músculos (41). Podem ser obtidos através de alimentos ricos em proteína (na carne, peixe, ovos, leite e seus derivados, leguminosas, entre outros), ou de suplementos proteicos (sob a forma de pó, cápsulas ou líquido).
De acordo com a literatura, a ingestão diária de referência de leucina, valina e isoleucina, para indivíduos adultos, é de, respectivamente, 42, 24 e 19 mg/Kg de peso corporal/dia (42), sendo que estes níveis recomendados dependem de uma série de factores nomeadamente da intensidade do exercício físico.
2.2.1. Metabolismo dos BCAA´s
Contrariamente a todos os outros aminoácidos, que são absorvidos no intestino, libertados na corrente sanguínea e metabolizados maioritariamente no fígado, os
17 aminoácidos de cadeia ramificada, depois de absorvidos no intestino e libertados na corrente sanguínea, são metabolizados no músculo-esquelético, nomeadamente nas mitocôndrias (43, 44).
Estes são inicialmente transaminados pela aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada (ATACR) aos seus respectivos cetoácidos (a leucina é convertida em cetoisocaproato; a isoleucina em ceto-β-metilvalerato; e a valina em α-cetoisovalerato). Ao mesmo tempo ocorre a transformação do α-cetoglutarato em glutamato (através do glutamato pode ocorrer a síntese de aminoácidos, como alanina e glutamina) (Figura 6) (40, 41, 43).
Posteriormente à transaminação e formação dos α-cetoácidos de cadeia ramificada ocorre a descarboxilação oxidativa dos mesmos (mediada pelo complexo enzimático: desidrogenase de cetoácidos de cadeia ramificada - DCCR) aos respectivos compostos de coenzima A, que podem sofrer oxidação por diferentes desidrogenases – a leucina forma acetil-CoA e acetoacetato pelo que é cetogénica; a valina é convertida em succinil-CoA pelo que é glicogénica; a isoleucina é convertida em succinil-CoA e acetoacetato pelo que é considerada um aminoácido glicogénico e cetogénico (Figura 6) (Figura 7) (40).
A DCCR é regulada por um ciclo de fosforilação/desfosforilação no qual a enzima DCCR quinase (DCCRQ) inactiva a DCCR por meio de fosforilação, enquanto que a DCCR fosfatase (DCCRF) ativa o complexo por meio de desfosforilação (Figura 6) (40, 41).
Apesar do fígado não conseguir metabolizar directamente os aminoácidos de cadeia ramificada, apresenta um sistema muito ativo para a degradação dos respectivos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Ou seja, a atividade da enzima DCCR é maior no fígado do que no músculo-esquelético, enquanto que a atividade da enzima ATACR é mais elevada no músculo esquelético (40, 41).
18 Figura 6. Regulação do complexo enzimático desidrogenase de α-cetoácidos de cadeia ramificada (DCCR), (ATACR = aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada; CCR = α-cetoácidos de cadeia ramificada; R-CoA = acil-CoA) (retirada de (40)).
Figura 7. Metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada. Os aminoácidos valina e isoleucina formam propionil-CoA, que pode ser convertido em succinil-CoA. Os aminoácidos leucina e isoleucina formam acetil-CoA. O aminoácido leucina pode ainda formar acetoacetato (retirada de (40)).
19 Em suma, o metabolismo dos BCAA´s resulta na formação de acetil-CoA e sucinil-CoA que podem ser utilizadas como fontes de energia; e na síntese de glutamato, que elimina a amónia através da síntese de glutamina no músculo-esquelético (Figura 8).
Figura 8. Quebra dos aminoácidos de cadeia ramificada no músculo-esquelético. Esta termina com a formação de acetil-CoA e sucinil-CoA que são ótimas fontes de energia (retirado de (44)).
2.2.2. Suplementação com BCAA
De acordo com vários autores, os aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA), em indivíduos adultos, são importantes na manutenção da massa muscular durante a perda de peso, no processo de cicatrização em casos de lesões e proporcionam efeitos benéficos no tratamento de doenças hepáticas e renais (45, 46). Além disso, estes aminoácidos despertaram especial interesse na indústria dos suplementos e entre os desportistas por apresentarem efeitos benéficos na hipertrofia muscular e na performance
20 através da diminuição da fadiga muscular, da melhoria da resposta imunológica após exercícios intensos, entre outros (40, 47-49).
Desta forma, muitos têm sido os estudos realizados com o intuito de demonstrar os efeitos destes suplementos no balanço proteico muscular e síntese proteica, na fadiga muscular e lesão muscular resultante do exercício físico, e no aumento da performance em exercícios de longa duração (47-52).
Relativamente à síntese proteica, estes aminoácidos, especialmente a leucina, parecem estimular o crescimento muscular, daí os suplementos normalmente apresentarem duas vezes mais leucina do que isoleucina ou valina, usualmente numa proporção de 2: 1: 1. De acordo com a literatura, o aumento deste aminoácido no interior das células faz ativar uma proteína quinase – alvo da rapamicina em mamíferos (mammalian Target of Rapamycin), mTOR – que faz estimular a síntese proteica (40, 48). No que respeita à fadiga muscular, esta consiste na redução da capacidade do músculo em produzir força e é causada por uma série de factores, dependendo da intensidade e duração do exercício. Alguns dos factores associados à fadiga são a redução do pH muscular (devido à acumulação de iões H+), diminuição da quantidade de glicogénio muscular e hepático, aumento da libertação de neurotransmissores (tais como a serotonina), entre outros (40). De acordo com a literatura, a acção dos BCAA´s na fadiga baseia-se no facto de, durante exercícios físicos prolongados, haver um aumento da libertação cerebral de serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) devido ao aumento de triptofano (percursor de serotonina) associado à diminuição plasmática da concentração de BCAA´s. A serotonina é um dos principais neurotransmissores do sistema nervoso central com um importante papel na modulação da dor e na actividade motora e é regulada pela actividade da enzima triptofano hidroxilase, pelo que a sua síntese vai variar de acordo com a concentração plasmática de triptofano. Este, por sua vez, vai depender da facilidade com que atravessa a barreira hemato-encefálica através do sistema de transporte dos aminoácidos neutros. Assim sendo, a sua quantidade plasmática vai variar com a concentração dos aminoácidos presentes que partilhem o mesmo transportador de membrana. De entre esses aminoácidos a partilhar o mesmo sistema de transporte de membrana temos os BCAA´s, pelo que a concentração plasmática destes são um indicativo da acumulação cerebral de triptofano e consequente síntese de serotonina. Durante exercícios intensos e de longa duração, ocorre diminuição das reservas de glicogénio muscular e hepático, que obrigam o organismo a utilizar outros substratos como fonte de energia, como os BCAA´s. Sendo assim, há uma maior absorção destes para os músculos, diminuindo a sua quantidade plasmática, que faz aumentar as quantidades plasmáticas de triptofano. Este fenómeno leva ao aumento
21 cerebral de triptofano com consequente aumento da síntese de serotonina, provocando assim fadiga muscular (48, 53). Desta forma, uma suplementação com BCAA´s faria diminuir, por competição, a entrada de triptofano no cérebro que, consequentemente faria diminuir a libertação de serotonina e assim diminuir/retardar a fadiga central e melhorar a performance (40).
Quanto ao sistema imunológico, este é influenciado pelo exercício fisico uma vez que, quando um atleta aumenta o volume do treino e/ou intensidade do treino e/ou não dá ao organismo o tempo de recuperação necessário, há uma maior probabilidade de haver inflamação/infecção nos tecidos devido: à inibição de citocinas (tais como interleucinas - IL, fator de necrose tumoral – TNF, interferões - IFN) que são responsáveis pela emissão de sinais entre as células durante o desencadeamento das respostas imunes; ou à diminuição da concentração plasmática de glutamina (aminoácido livre mais abundante no músculo e sangue, utilizado por células do sistema imunitário para fornecer energia e favorecer a biossíntese de nucleotídeos) (43, 48). Uma vez que o exercício intenso e de alta duração faz diminuir os níveis plasmáticos de glutamina (54) e, dado que este é um aminoácido importante para certas células na resposta imunológica, é de esperar que haja alterações na imunocompetência dos atletas (40). Tal como já referido, os BCAA´s são precursores da síntese de glutamina no músculo-esquelético uma vez que no seu metabolismo ocorre formação de glutamato, que por acção da enzima glutamina sintetase, pode formar a glutamina (Figura 9), pelo que uma suplementação de BCAA´s faria aumentar a disponibilidade de glutamina.
Figura 9. Relação entre o metabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e a síntese de alanina e de glutamina no tecido muscular. ATACR= aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada; AAT= alanina aminotransferase; GS= enzima glutamina sintetase (retirada de (40)).
22 Desta forma, vários estudos têm sido realizados no sentido de verificar o efeito da suplementação de BCAA´s nos níveis plasmáticos de glutamina e na resposta imunológica face a exercícios intensos (54-56).
2.2.3. Possíveis efeitos da ingestão de BCAA´s
De acordo com a literatura, não foram reportados muitos casos acerca dos efeitos adversos associados à ingestão de suplementos de BCAA´s. Poucos também foram os estudos realizados, a curto e longo prazo dos possíveis efeitos colaterais que estes possam provocar.
De acordo com Scaini e colaboradores (2013), uma suplementação crónica de BCAA´s pode provocar défices de memória (57).
Foram ainda mencionados, num artigo de revisão realizado por Chen e colaboradores (2015), efeitos como náuseas, vómitos, diarreia, hipertensão e dor abdominal associados ao seu consumo, em pacientes com historiais clínicos de doenças hepáticas (45).
23 2.3. β-alanina
A Beta-alanina ou β-alanina é um aminoácido não essencial, com a denominação da IUPAC de ácido 3-aminopropanóico, que se diferencia de todos os outros aminoácidos pela sua estrutura química. Ao contrário dos aminoácidos essenciais, que dão origem às proteínas e são constituídos por um grupo carboxílico e um grupo amina separados por um carbono alfa, a β-alanina tem o grupo carboxílico e o grupo amina separados não por um, mas por dois carbonos (Figura 10).
Figura 10. Estrutura química da β-alanina.
2.3.1. A β-alanina e o seu perfil de Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção (ADME)
A β-alanina é um aminoácido ―não essencial‖ para a síntese de proteínas (uma vez que não é usada na biossíntese de qualquer proteína ou enzima importante para o nosso organismo), é sintetizado maioritariamente no fígado, e pode ser ingerido através da alimentação ou mediante suplementação.
Relativamente à sua síntese endógena, esta pode ocorrer sob duas vias (Figura 11): a via de degradação do oxopropanoato (na qual a beta alanina piruvato transaminase catalisa a transferência do grupo amino da L-alanina ao oxopropanoato, produzindo piruvato e beta alanina), ou a via de degradação do uracilo, sendo esta a principal via de produção da beta alanina (58).
24 Figura 11. (A) Vias de produção da β-alanina. (B) Principal via de produção da β-alanina
(adaptado de (58)).
Apesar de ser produzido endogenamente, a taxa da sua síntese é extremamente baixa, pelo que, para aumentar a sua disponibilidade no organismo, pode ser ingerido pela dieta ou através de suplementação (58).
Quando ingerido, chega ao intestino onde é absorvido e transportado para a circulação sanguínea, chegando ao cérebro, coração e músculo-esquelético. No interior das células musculares, a enzima carnosina-sintase faz a ligação entre a β-alanina e a histidina, dando origem à carnosina (Figura 12) que é um dipéptido que se encontra maioritariamente presente no músculo-esquelético e em menores quantidades no cérebro, coração, estômago e rins (58, 59).
25
Figura 12. Formação da carnosina através da β-alanina e histidina (adaptada de (60)).
2.3.2. A β-alanina e o exercício físico
Uma vez que a β-alanina, depois de ingerida e absorvida pelos músculos, é convertida em carnosina, é a carnosina que produz maioritariamente os seus efeitos no organismo. Desta forma, para entender os benefícios da beta-alanina, é necessário um pouco mais de conhecimento sobre sua conexão com a carnosina.
O exercício físico de alto esforço pode, a um dado momento, causar fadiga muscular devido a um desequilíbrio ácido-base no sangue. Isto porque, ao longo do exercício, há um grande desgaste de energia tornando necessária a produção de mais energia, sob a forma de ATP (Adenosina Trifosfato). Esta é conseguida através do metabolismo da glicose, com consequente formação de alguns metabolitos. Um desses metabolitos formados é o ácido láctico, que dá origem ao lactato e iões de hidrogénio (H+) (Figura 13). São estes iões de hidrogénio que, aquando da quebra do ácido láctico, são libertados dentro das células musculares diminuindo o pH, dificultando a contração muscular e provocando a fadiga muscular (61).
26
Figura 13. Síntese de ATP através do metabolismo da glicose.
Assim, o organismo necessita de mecanismos de defesa que possuam um pKa dentro da variação do pH muscular, de maneira a contrariar a acumulação intracelular dos iões de hidrogénio. De entre as defesas, a carnosina parece ser um tampão ideal ao longo do exercício, por possuir um pKa de 6,83 (61). Assim, esta, quando presente nos músculos, vai atuar como tampão de pH, com o intuito de neutralizar esse aumento da acidez nas células (proveniente do aumento dos iões H+), de maneira a reduzir a fadiga (61). Desta forma, quanto mais carnosina houver nas células musculares, menor a probabilidade de haver acumulação de lactato e de iões de hidrogénio.
2.3.3. Suplementação com β-alanina
Com a ingestão de β-alanina faz-se aumentar os níveis de carnosina nas células musculares, e, quanto mais carnosina houver nas células, mais tempo se demora a alcançar a fadiga. Para além do aumento do tempo de alcance da exaustão muscular, estudos científicos provaram que a suplementação com β-alanina permite aumentar a resistência, a perda de gordura e o aumento da massa muscular (62).
De acordo com várias pesquisas, a síntese da carnosina nos músculos é limitada pela disponibilidade da β-alanina, proveniente da alimentação, uma vez que vários
27 estudos demonstraram que as concentrações de β-alanina nos músculos são relativamente mais baixas (cerca de 40 vezes menos), que as de histidina (59). Daí a necessidade/preferência de optar por uma suplementação de β-alanina em vez de uma suplementação de histidina.
Da mesma forma seria de esperar que, dada a importância da carnosina na contração muscular, em vez de um suplemento de β-alanina se optasse por um suplemento de carnosina. No entanto, vários estudos demonstraram que a suplementação com carnosina não era tão eficaz como com β-alanina uma vez que o organismo era incapaz de fazer passar a carnosina diretamente da corrente sanguínea para a célula muscular. Isto porque, parte da carnosina, quando ingerida, é hidrolisada em histidina e β-alanina; a restante, ao ser transportada para a corrente sanguínea sofre a ação da enzima carnosinase sérica, que também faz a quebra da substância em histidina e β-alanina (58, 63, 64) (Figura 14).
Figura 14. Via geral do transporte de β-alanina, síntese e degradação de carnosina (retirada de (58)).
2.3.4. Dosagem e efeitos tóxicos
De acordo com vários ensaios clínicos, a quantidade recomendada de ingestão de β-alanina varia entre os 3,2 e 6,4 g por dia, ao longo de um determinado período, sendo estas quantidades eficientes e seguras para um aumento de 40 a 80% de carnosina no músculo-esquelético (64).
Atualmente, os únicos efeitos adversos conhecidos são os sintomas de parestesia, como a sensação de formigueiro, que aparece após o consumo de doses
28 superiores às habituais, e que desaparecem cerca de 1 a 2 horas após a ingestão (65, 66).
Um outro possível efeito colateral está associado à taurina muscular. De acordo com a literatura, o transportador responsável pela captação de β-alanina pelos tecidos, a TauT (Figura 14), é o mesmo que realiza o transporte da taurina. Sendo assim, de um ponto de vista teórico, o aumento da concentração plasmática de β-alanina poderia fazer reduzir, por competição ao recetor, os níveis de taurina no interior das células e, uma vez que a taurina atua na proteção do stress oxidativo e na peroxidação lipídica, a diminuição da taurina intracelular poderia tornar a célula mais vulnerável a agentes agressores. No entanto, não se verificou nenhuma redução na concentração intramuscular de taurina no decorrer de uma suplementação de β-alanina, com concentrações baseadas nas quantidades obtidas a partir da dieta. Apenas foi verificado, em alguns estudos realizados em ratazanas e galinhas, uma diminuição da taurina intracelular quando ingeridas elevadas doses de β-alanina (doses cerca de 100 vezes maiores que as utilizadas no estudo em que não se verificou qualquer diminuição dos níveis de taurina) (64, 67, 68).
Apesar dos efeitos comprovados da β-alanina na prática de desporto, a sua segurança a longo prazo não tem sido completamente explorada, pelo que novos estudos são necessários para determinar a segurança do seu consumo continuado.
29 3. Métodos de Análise de Suplementos Desportivos / Aminoácidos
A composição dos suplementos alimentares é uma das preocupações associadas a estes produtos uma vez que estes suplementos contêm substâncias que, muitas das vezes, não se encontram mencionadas nos rótulos das embalagens e as suas quantidades indicadas nem sempre correspondem à realidade. Como consequência, a toma consecutiva destes suplementos pode produzir efeitos adversos a curto e longo prazo.
Desta forma é de extrema importância saber quais e em que quantidades os compostos estão presentes nos diferentes produtos. Para tal devem ser desenvolvidos procedimentos analíticos que permitam revelar a sua composição real.
3.1. Técnicas cromatográficas
Métodos cromatográficos, nomeadamente a cromatografia gasosa (GC) e a cromatografia líquida (LC) são amplamente utilizados em diversos laboratórios para a análise, qualitativa e quantitativa, de proteínas e aminoácidos. São técnicas que possuem excelentes características de análise, nomeadamente elevada sensibilidade, menores tempos de análise, assim como, a possibilidade de combinar a espectrometria de massa (MS) permitindo uma melhor identificação dos compostos (69, 70).
A cromatografia gasosa é uma técnica que permite a análise de substâncias voláteis e de baixo peso molecular (71) pelo que, no caso de aminoácidos, não voláteis, é necessário a sua derivatização prévia de maneira a diminuir o seu ponto de ebulição, aumentando assim a sua volatilidade resultando numa maior sensibilidade da sua detecção e eficiência na separação dos picos cromtográficos (72).
Estas técnicas analíticas normalmente utilizam como técnicas de detecção o ultra-violeta e a espectrometria de massa (MS). A espectrometria de massa, para além de uma boa precisão, exactidão e sensibilidade, tem ainda a vantagem de apresentar uma maior selectividade uma vez que permite identificar os analitos de interesse através dos iões característicos resultantes da sua fragmentação, sendo separados de acordo com sua relação massa / carga (m / z). A identificação dos picos de interesse é realizada por comparação com bibliotecas de espectros (por exemplo, a Biblioteca Espectral de Massa NIST 14 - Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia) (73, 74).
30 Vários métodos cromatográficos têm vindo a ser utilizados para a análise de proteínas e aminoácidos em amostras biológicas e/ou não biológicas, tal como se apresenta na Tabela 2.
31 Tabela 2. Técnicas cromatográficas utilizadas na análise de proteínas/aminoácidos
Analito Amostra Preparação da amostra Método Analítico Referências Vários aminoácidos Sumos Filtração, seguida de
derivatização com OPA/NAC HPLC-UV (75)
β-alanina Plasma/Urina Desproteinização seguida de
derivatização com PITC HPLC-UV (76)
β-alanina Plasma/Urina Desproteinização HPLC-UV (63)
Vários aminóacios Gelatinas de carne, albumina, caseína e
clara de ovo.
Hidrólise, seguida de
derivatização com ECF GC-MS (77)
Vários aminoácidos Plasma Extração seguida de
derivatização com MSTFA GC-MS (78)
BCAA´s Suplementos desportivos
Hidrólise seguida de centrifugação e colheita dos sobrenadantes. Filtração antes da
análise.
CE-UV (79)
Legenda – OPA/NAC (o-oftalaldeído-N-acetil-L-cisteína); PITC (fenilisotiocianato); ECF (etil cloroformato); MSTFA (N-Metil-N-(trimetilsililo) trifluoroacetamida); GC-MS (Cromatografia Gasosa acoplada à Espetrometria de Massa); HPLC-UV (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção Ultravioleta); CE-UV (Eletroforese capilar com deteção Ultravioleta)
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