Caracterização bioquímica do inibidor de tripsina purificado da semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) e avaliação do seu efeito na secreção de colecistocinina e leptina em modelo de obesidade experimental

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA. AMANDA FERNANDES DE MEDEIROS. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) E AVALIAÇÃO DO SEU EFEITO NA SECREÇÃO DE COLECISTOCININA E LEPTINA EM MODELO DE OBESIDADE EXPERIMENTAL. NATAL 2017.

(2) AMANDA FERNANDES DE MEDEIROS. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) E AVALIAÇÃO DO SEU EFEITO NA SECREÇÃO DE COLECISTOCININA E LEPTINA EM MODELO DE OBESIDADE EXPERIMENTAL. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Profª. Dra. Ana Heloneida de Araújo Morais Co-orientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos. NATAL 2017.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB Medeiros, Amanda Fernandes de. Caracterização bioquímica do inibidor de tripsina purificado da semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) e avaliação do seu efeito na secreção de colecistocinina e leptina em modelo de obesidade experimental / Amanda Fernandes de Medeiros. - Natal, 2017. 83 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Orientadora: Profa. Dra. Ana Heloneida de Araújo Morais. Coorientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos.. 1. Atividade antitríptica - Dissertação. 2. Kunitz Dissertação. 3. Ratos Wistar - Dissertação. 4. CCK - Dissertação. I. Morais, Ana Heloneida de Araújo. II. Santos, Elizeu Antunes dos. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 577.1.

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(5) Aos meus pais..

(6) AGRADECIMENTOS Primeiramente, a Deus, pelo dom da vida e discernimento em trilhar esse caminho, dando-me saúde e proteção. Aos meus pais, Delma e Adailton, que me educaram e me deram apoio em cada passo até chegar aqui e continuam me incentivando. Ao meu irmão, Dennis, e à minha cunhada, Tainara que, também, têm muito carinho por mim e me incentivam nesse caminho que decidi trilhar, estando sempre presente em cada passo, seja na conquista ou nos tropeços. Ao meu namorado, Victo, que me apoia e me compreende, permanecendo presente em todas as etapas. À professora Ana Heloneida que, desde o início da minha graduação, me orienta e deposita confiança em mim, para realizar pesquisas acadêmicas, proporcionado meu crescimento. Ao professor Elizeu, que me recebeu em seu laboratório (LQFPB), desde o início da graduação, também depositando confiança, permitindo-me todo esse aprendizado e participação e, também, por ter participado da banca de qualificação, ajudando a lapidar esse trabalho. À professora Adriana Uchôa por todo cuidado e dedicação que tem comigo. Sempre com muita paciência e demandando tempo para me ensinar e acompanhar em experimentos no laboratório. À professora Bruna que participou, com maestria, da banca de qualificação, e me presenteou com suas contribuições, além de ter também contribuído para minha formação enquanto nutricionista, como professora na graduação. Ao professor Cícero que aceitou o convite e contribuiu para a lapidação desse trabalho, fazendo-se presente na banca de qualificação e de defesa, banca essa reconhecidamente criteriosa e construtiva. Sou grata pela forma como conduziu suas correções, sugestões e perguntas na qualificação. À Profª. Dr. Liziane, pela disponibilidade e por todo o cuidado que teve em participar da banca de defesa. Fiquei muito satisfeita com sua participação e contribuições. À Fabiana e ao Izael que sempre estiveram presente desde o início dessa jornada. Formamos um trio, em que um sempre ajudou e apoiou o outro..

(7) Nossos dias no laboratório comprovam que o crescimento de um significa crescimento de todos. À Jéssyca que, a princípio, como uma “concorrente” no processo seletivo do mestrado, me ajudou com um dicionário para a prova de inglês, para uma, até então, desconhecida. Uma amizade, relativamente, de pouco tempo, mas que cresceu exponencialmente. Sua ajuda e parceria nas disciplinas foram fundamentais para que eu pudesse chegar até aqui. Àqueles, mestrandos na época, que participaram ativamente enquanto aluna de iniciação científica e continuam auxiliando até hoje e torcem por mim. Obrigada Alexandre Serquiz e Richele, com vocês aprendi muito enquanto aluna e pessoa. Especialmente à Richele, que me ensinou muitos experimentos de bancada e, até hoje, me orienta e ajuda sempre que preciso. À Dr. Sumika Kyiota que nos recebeu (eu e o Izael) em seu laboratório no Instituto Biológico, em São Paulo. Além de haver contribuído com esse trabalho, teve muito carinho conosco. Esteve presente dia a dia no laboratório, empenhada para que obtivéssemos sucesso. Ao grupo de pesquisa Nutrição e Substâncias Bioativas aplicadas à Saúde (NutriSBioativoS), do qual faço parte. Fazendo parte do grupo, além de Fabi e Izael, Vanessa, Anna Beatriz, Bianca, Luana, Luiza, Ana Júlia, Rafael, Camila, Ana Gomes, Anne, Júlia, Tatiana e Lídia. Alguns mais próximos, mas todos fazendo parte deste grupo e espero que continuemos com o mesmo sentimento do início desse grupo, a conquista de um na verdade é de todos. Também agradeço as meninas que passaram por esse grupo, Fernanda, Janaína e Gerciane. A todos que fazem parte do laboratório LQFPB, que, de uma forma ou de outra contribuíram para minha formação. Tatiana, Jonalson, Anderson, Raphael Serquiz, Rayanna, Igor, Dani, Geovanna e todos os que passaram por esse laboratório. Aos que fazem parte do LEM, Laboratório de Espectrometria de Massa, na Embrapa – Cenargem, Brasília - DF. Começando pelo pesquisador Dr. Marcelo Bem-Querer, que providenciou tudo o que era necessário para que pudesse chegar à Embrapa e realizar experimentos significativos para mim (e para esse trabalho). E devido a alguns tropeços do caminho, tive a excelente oportunidade de ter orientações do pesquisador Dr. Carlos Bloch e da pesquisadora Dr. Maura Prates, os quais me acolheram e proporcionaram um aprendizado de excelência. Ao.

(8) analista Dr. Daniel Sifuentes, por ter contribuído com seu tempo e conhecimento, mesmo sem contar com esse “trabalho extra”. Ao Dr. José (o qual atende simplesmente por Zé), que também participou e contribuiu com ensinamentos técnico, intelectual e também como pessoa. E, claro, à doutoranda Beatriz Blenda, carinhosamente a chamo de Bia. Por todo o auxílio no laboratório, seu companheirismo, toda a preocupação acadêmica e pessoal, abrindo as portas de sua casa e me recebendo. Aos. professores. da. Pós-Graduação. e. aos. funcionários. do. Departamento de Bioquímica. A todos os que contribuíram indiretamente para a concretização desse sonho. Ao CNPq e à Capes pelo auxílio financeiro, fundamental nesta jornada acadêmica..

(9) “A. ciência. nunca. resolve. um. problema sem criar pelo menos outros dez.” George Bernard Shaw..

(10) Caracterização bioquímica do inibidor de tripsina purificado da semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) e avaliação do seu efeito na secreção de colecistocinina e leptina em modelo de obesidade experimental RESUMO A obesidade é uma das Doenças Crônicas Não Transmissíveis de maior impacto na saúde pública. A semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) vem sendo estudada por possuir inibidor de tripsina, e, entre os atributos relacionados a esse inibidor parcialmente purificado (ITT), tem-se a sua relação com a saciedade, por aumentar colecistocinina (CCK) plasmática em animais eutróficos e seu efeito na redução da concentração circulante de leptina em animais com obesidade, entretanto sem aumento plasmático de CCK. Neste estudo, o ITT foi purificado, caracterizado e avaliado quanto às suas propriedades frente aos hormônios CCK e leptina em ratos Wistar com obesidade. Para purificação e caracterização desse inibidor, foram realizados: fracionamento do extrato bruto proteico com sulfato de amônio; cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC); determinação da massa molecular por MS-ESI; sequenciamento parcial por MALDI-TOF com ISD; ensaio de estabilidade de temperatura e pH; estimativa dos parâmetros de especificidade; eletroforese bidimensional (2-DE) e dosagens de CCK e leptina plasmática, por ELISA, em ratos com obesidade, submetidos à gavagem oral (730 µg/kg) do inibidor de tripsina purificado (ITTp) comparando-os a ratos com obesidade sem tratamento. Desse modo, o ITT purificado por HPLC foi denominado ITTp. Com o refinamento do método, obtiveram-se, com base no ITTp, dois picos proteicos, as frações: Fr 1 e Fr 2. As massas moleculares médias dessas frações proteicas foram de [M+H]+ = 19594,690 Da e de [M+H]+ = 19578,266 Da, respectivamente. Após redução e alquilação, estimou-se a presença de 4 cisteínas para Fr 1 e Fr 2. As sequências parciais obtidas para Fr 1 e Fr 2 foram de 54 e 53 resíduos de aminoácidos identificados e exatamente com a mesma sequência para ambas, sugerindo-se tratar da mesma molécula. O ITTp se mostrou resistente à variação de temperatura até 80ºC, reduzindo cerca de 30% de sua atividade antitríptica quando em 100 ºC, e resistente aos extremos de pH. Para o ITTp estimou-se a IC50 de 2,7 x 10-10 mol.L-1 e a Ki de 2,9 x 10-11 mol.L-1. Na eletroforese bidimensional com ITTp foram revelados pontos isoelétricos entre pH 5 e 6, além de um spot próximo ao pH 8. Dessa forma, foi constatado que se trata de um inibidor de tripsina da família Kunitz. No experimento in vivo foi confirmada a ação de ITTp sobre a redução de leptina plasmática, mas sem efeito sobre CCK em animais com obesidade, como já atestado em estudos prévios com o ITT. A caracterização bioquímica desse inibidor e os seus efeitos sobre CCK e leptina, observados em experimentos in vivo, constituem relatos inéditos e promissores para uma provável aplicação biotecnológica. Palavras-chave: Atividade antitríptica, Kunitz, ratos Wistar, CCK..

(11) Biochemical characterization of a Kunitz type inhibitor from Tamarindus indica L. seeds and its efficacy in reduces plasma leptin in a model of experimental obesity ABSTRACT Obesity is one of the non-communicable chronic diseases with a great impact on public health. The tamarind (Tamarindus indica L.) seed has been studied for its trypsin inhibitor and one of the attributes of this partially purified inhibitor (TTI) is its relationship with satiety, increasing cholecystokinin (CCK) in eutrophic and reducing leptin in obese animals. In this study the ITT was purified, characterized and evaluated for its properties against CCK and leptin in obese Wistar rats. For the purification and characterization of this inhibitor, the crude protein extract was fractionated with ammonium sulfate followed by trypsin-Sepharose affinity chromatography, two-dimensional electrophoresis (2-DE) and High Efficiency Liquid Chromatography (HPLC). TTIp molecular mass was determined by MS-ESI. Partial sequencing of TTIp was established by MALDI-ISD. Inhibitory specificity, stability to temperature and pH was characterized for TTIp. Plasma CCK and leptin was evaluated in rats submitted to oral gavage with TTIp (730 μg / kg) comparing them to untreated obese rats. TTI was purified by HPLC with a single protein peak (ITTp). After refinement of the methods, two protein fractions were observed: Fr 1 and Fr 2, with average mass of [M+H]+ = 19594.690 Da and [M+H]+ = 19578.266 Da, respectively. The presence of 4 cysteines was estimated after reduction and alkylation of Fr 1 e Fr 2. The protein fractions showed 54 and 53 amino acid residues with exactly the same sequence. TTIp presented resistance to temperature variations, reducing about 30% of its anti-tryptic activity at 100 ºC, and resistance to pH extremes. TTIp IC50 was 2.7 x 10-10 mol.L-1 and Ki was 2.9 x 10-11 mol.L-1. The 2DE revealed spots with isoelectric points between pH 5 and 6, and a spot near pH 8. TTIp characteristics are compatible with trypsin inhibitors from the Kunitz family. In the in vivo experiment, ITTp action on leptin reduction was confirmed, but no effect on CCK was observed in animals with obesity, corroborating previous studies using unpurified TTI. Biochemical knowledge of this molecule and the in vivo experiments shown here are novel and provide essential information for a biomolecule of possible biotechnological application. Key words: Antitryptic activity, Kunitz, Wistar rats, CCK..

(12) LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Representação esquemática de alterações metabólicas acometidas. pelo excesso de tecido adiposo................................................................................ 24 FIGURA 2. Representação esquemática da estrutura primária do hormônio. colecistocinina............................................................................................................28 FIGURA 3. Fluxograma da metodologia utilizada para obtenção do ITT purificado,. sua caracterização e ensaio biológico........................................................................43 FIGURA 4. Passos para obtenção da farinha de tamarindo...................................44. FIGURA 5. Perfil cromatográfico do TTI, ITTp e suas frações em Cromatografia. Líquida de Alta Eficiência de fase reversa.................................................................53 FIGURA 6. Espectros de massa em MALDI-TOF e Espectro de massas ESI das. frações 1 e 2 do ITTp. ...............................................................................................55 FIGURA 7. Cromatogramas, espectros de massa com fonte de ionização MALDI-. TOF e espectros por ESI em micrOTOF-Q II das frações 1 e 2 e reduzidas e alquiladas (Fr1.1 e Fr2.1)...........................................................................................57 FIGURA 8. Sequenciamento das frações do TTIp reduzidas e alquiladas por. MALDI-TOF modo ISD da estrutura primária, apresentando a sequência de resíduos de aminoácidos acima da região 1000m/z.................................................................59 FIGURA 9. Alinhamento múltiplo da sequência parcial primária do ITTp com. demais depositadas no NCBI.....................................................................................60 FIGURA 10 Estimativa. dos. parâmetros. de. especificidade. do. ITTp............................................................................................................................60.

(13) FIGURA 11 Estabilidade do ITTp em diferentes temperaturas e pH........................62 FIGURA 12 Eletroforese bidimensional do ITTp com tiras em gradiente de pH 310................................................................................................................................62 FIGURA 13 Espectros de análise em espectrômetro MicrOTOF-Q II por ESI, com deconvolução das frações Fr1 e 2, apresentando a Massa molecular relativa (Mr).............................................................................................................................80 FIGURA 14 Cromatograma e espectros em MALDI-TOF frações obtidas da Fr1 após redução e alquilação..........................................................................................81 FIGURA 15 Espectros de análise em espectrômetro MicrOTOF-Q II por ESI, com deconvolução das Fr1.1 e 2.1 apresentando a Massa molecular relativa (Mr)..........82.

(14) LISTA DE TABELAS. TABELA 1. Descrição dos métodos utilizados no HPLC para a purificação do. inibidor de tripsina das sementes de Tamarindo........................................................46 TABELA 2. Etapas de purificação do ITTp das sementes de Tamarindus indica L.. ....................................................................................................................................54 TABELA 3. Concentrações plasmáticas de CCK e leptina, de ratos Wistar com. obesidade tratados com ITTp por 10 dias..................................................................63.

(15) LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS. ACN. Acetonitrila. AgRP. Proteína relacionada ao gene Agouti, Agouti-related protein. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. BApNA. Benzoil-DL-arginina-p-nitro-anilida. BLASTp. Protein Basic Local Alignment Search Tool. BSA. Albumina Sérica Bovina, Bovine serum albumin Transcrito relacionado à cocaína e à anfetamina, cocaine- and. CART amphetamine-regulated transcript CCK. Colecistocinina. CCK-1R. Receptor 1 de CCK. CFN. Conselho Federal do Nutricionista. CHCA. Matriz α-ciano-4-hidroxi-cinâmico. DAN. 1,5-diaminonaftaleno. DBP/DS. Derivações biliopancreáticas à duodenal switch. DBP/S. Derivações biliopancreáticas à Scopinaro. DCNT. Doenças crônicas não transmissíveis. DO. Densidade óptica.

(16) DM2. Diabetes melittus tipo 2. DTT. Ditiotreitol Ácido etilenodiaminotetracético, Ethylenediamine tetraacetic. EDTA acid ENDEF. Estudo Nacional de Despesa Familiar. ENH. Elastase de neutrófilo humana. ESI. Eletrospray. GLP-1. Peptídeos tipo glucagon 1, Glucagon-like peptide-1. HAS. Hipertensão arterial sistêmica. HPLC. High performance liquid chromatography. IAM. Iodoacetamida Concetração de inibidor que reduz a atividade em 50%, Inhibitor. IC50 concentration that reduces these activities by 50%. Fator de crescimento semelhante à insulina, Insulin-like growth IGF factor IMC. Índice de massa corporal. IPs. Inibidores de proteases. ISD. Fragmentação direto na fonte, In-Source Decay. ITT. Inibidor de Tripsina do Tamarindo isolado.

(17) ITTp. Inibidor de Tripsina do Tamarindo purificado. JAK. Proteína cinase solúvel, Janus Kinase. Lep-R. Receptor de Leptina Ionização e dessorção a laser assistida por matriz, Matrix-. MALDI assisted laser desorption/ionization MPT. Modificações pós-traducionais. EM. Espectrometria de massa, mass spectrometry. NCBI. National Center for Biotechnology Information. NPY. Neuropeptídeo Y Grupo de pesquisa Nutrição e Substâncias Bioativas aplicadas à. NutriSBioativoS Saúde OMS. Organização Mundial da Saúde. PAGE. Gel de Poliacrilamida, Polyacrylamide gel electrophoresis Inibidor do ativador de plaminogênio 1, Plasminogen activator. PAI-1 inhibitor-1 PCR. Proteína C reativa Pró-proteína convertase subtilisina/kexina, proprotein convertase. PCSK subtilisin/kexin POMC. Pró-opiomelanocortina, Pró-opiomelanocortin.

(18) PYY. Peptídeo YY. RCQ. Relação do perímetro abdominal e quadril. RPM. Rotações pode minuto. SAA. Soro amiloide A. SDS. Dodecil Sulfato de Sódio, sodium dodecyl sulfate. SM. Síndrome metabólica. SNC. Sistema Nervoso Central. SRA. Sistema renina-angiotensina Transdutores de sinal e ativadores da transcrição, signal. STAT transducers and activators of transcription SUS. Sistema Único de Saúde. TNF-α. Fator de Necrose Tumoral-α, Tumor necrosis factor-α. TOF. Tempo de voo, Time of flight. TR. Tempo de Retenção. UV. Ultravioleta. VET. Valor Energético Total Vigilância de fatores de risco e proteção para doenças crônicas. VIGITEL por inquérito telefônico.

(19) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 20. 1.1 OBESIDADE ....................................................................................................... 20 1.1.1. Problema de saúde pública .......................................................................... 20. 1.1.2. Diagnóstico clínico e nutricional ................................................................... 21. 1.1.3. Alterações e complicações metabólicas na obesidade................................. 22. 1.1.4. Tratamento nutricional, farmacológico e cirúrgico ........................................ 23. 1.2 REGULAÇÃO HORMONAL DA FOME E APETITE .......................................... 26 1.2.1. CCK e leptina como reguladores da homeostase energética ....................... 27. 1.2.3. Inibidor de tripsina vs. CCK e leptina ............................................................ 31. 1.3 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE INIBIDORES DE PROTEASES .... 33 1.3.1. Cromatografias para purificação de proteínas .............................................. 35. 1.3.2. Análise de proteínas por espectrometria de massa ...................................... 36. 1.3.3. Parâmetros de especificidade e resistência proteica .................................... 37. 1.4 TAMARINDO ...................................................................................................... 38 2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 41 2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 41 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 41 3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 42 3.1 MATERIAL BIOLÓGICO .................................................................................... 42 3.1.1. Tamarindo .................................................................................................... 42. 3.1.2. Animais ......................................................................................................... 42. 3.2 MÉTODOS .......................................................................................................... 42 3.2.1 Obtenção do extrato bruto e fracionamento proteico da semente de tamarindo .................................................................................................................. 43 3.2.2. Quantificação proteica e detecção da atividade antitríptica .......................... 44. 3.2.3. Cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose .......................................... 45. 3.2.4. HPLC e análise das etapas de purificação ................................................... 45. 3.2.5. Análise das etapas de purificação ................................................................ 47. 3.2.6. MALDI-TOF .................................................................................................. 47.

(20) 3.2.7. ESI-MS ......................................................................................................... 48. 3.2.8. Redução e Alquilação ................................................................................... 48. 3.2.9. Sequenciamento ........................................................................................... 49. 3.2.10 Alinhamento múltiplo .................................................................................... 49 3.2.11 Caracterização quando aos parâmetros de especificidade (IC50 e Ki) .......... 50 3.2.12 Estabilidade sob ação de agentes desnaturantes ........................................ 50 3.2.13 Eletroforese bidimensional ........................................................................... 51 3.2.14 Ensaio em modelo experimental de obesidade ............................................ 51 3.2.15 Análise Estatística ........................................................................................ 52 5. RESULTADOS ................................................................................................... 53. 5.1 PURIFICAÇÃO DO ITTp .................................................................................... 53 5.2 ANÁLISE DAS ETAPAS DE PURIFICAÇÃO .................................................... 54 5.3 DETERMINAÇÃO DAS MASSAS MOLECULARES POR MALDI-TOF E ESI-MS 54 5.4 REDUÇÃO E ALQUILAÇÃO .............................................................................. 56 5.5 SEQUENCIAMENTO E ALINHAMENTO ........................................................... 58 5.6 CARACTERIZAÇÃO QUANTO AOS PARÂMETROS DE ESPECIFICIDADE (Ki E IC50) ....................................................................................................................... 61 5.7 ESTABILIDADE SOB AÇÃO DE AGENTES DESNATURANTES .................... 61 5.8 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL ................................................................. 62 5.9 ENSAIO EM MODELO EXPERIMENTAL DE OBESIDADE .............................. 63 6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 64. 7. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 70. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 71 APÊNDICE A – Espectros com deconvolução MALDI-TOF modo ESI das frações 1 e 2 e após redução e alquilação e cromatograma e espectros MALDITOF de frações de Fr1 ITTp após redução e alquilação. ..................................... 80.

(21) 20 1 INTRODUÇÃO 1.1 OBESIDADE 1.1.1 Problema de saúde pública. As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são caracterizadas por múltiplos fatores de risco, períodos longos de latência, origem não infecciosa, associações às deficiências e incapacidades funcionais. O aparecimento das DCNT, no Brasil, vem acontecendo desde a década de 60, caracterizado um processo de transição demográfica, epidemiológica e nutricional (BRASIL, 2008). Uma das DCNT de destaque é a obesidade. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) comprovam que a obesidade é uma DCNT preocupante mundialmente. Na década de 80, a obesidade, em muitos países, mais do que duplicou, e em outros continuou crescente (WHO, 2016). No ano de 2015, um total de 603,7 milhões de adultos e 107,7 milhões de crianças estavam com obesidade. O índice de massa corporal (IMC) elevado, indicativo do estado nutricional de obesidade, provoca cerca de 4 milhões de mortes no mundo, sendo 2/3 dos casos devido às doenças cardiovasculares (GBD, 2017). Dados do Estudo Nacional de Despesa Familiar (ENDEF) de 1975 comparados aos de vigilância de fatores de risco e proteção para doenças crônicas por inquérito telefônico (Vigitel) de 2016 expressam, em percentual, essa transição nutricional no Brasil. O excesso de peso em adultos aumentou de 18,6% para 57,7% e de 28,6% para 50,5% em homens e mulheres, respectivamente, apresentando maior frequência em adultos com idade de até 64 anos em ambos os sexos. A obesidade, comparando o mesmo período, aumentou de 2,2% para 18,1% e de 7,8%, para 19,6% em homens e mulheres, respectivamente. A frequência da obesidade para ambos os sexos foram maiores com idade entre 25 a 34 anos (BRASIL, 2016). Em consequência do aumento de peso corporal da população não só brasileira, mas mundial, há, naturalmente, o aumento dos gastos diretos com o tratamento da obesidade e doenças relacionadas. Além do sério problema de saúde pública que o sobrepeso e a obesidade representam, a implicação financeira para a sociedade e para o sistema de saúde é motivo de grande relevância, por isso deve ser levada em consideração (BAHIA; ARAÚJO, 2014). Isso repercute diretamente no.

(22) 21 aumento crescente dos gastos do Sistema Único de Saúde (SUS) com o tratamento da obesidade e doenças associadas, impactando negativamente nos cofres públicos do Brasil (MAZZOCCANTE; MORAES; CAMPBELL, 2012). Não apenas o gasto financeiro direto, mas também as consequências econômicas da obesidade abrangem custos indiretos como diminuição da qualidade de vida, perda de produtividade e aposentadoria precoce. Todos esses aspectos causam impactos tanto no SUS como no sistema de saúde privado (saúde suplementar), sugerindo que, em longo prazo, o aumento do excesso de peso e a obesidade podem provocar um colapso nos recursos, que são limitados, e ao financiamento para tratamento desses indivíduos (BAHIA; ARAÚJO, 2014). 1.1.2 Diagnóstico clínico e nutricional. A realização do diagnóstico de sobrepeso e obesidade segue orientações da Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia tendo como base, para adultos, em medidas antropométricas: IMC, avaliação de massa gordurosa e sua distribuição e ainda ressalta a importância da avaliação mais completa, combinando as técnicas citadas. A medida de massa corporal tradicionalmente utilizada é o peso; e a distribuição de gordura é um ponto crítico para avaliação clínica, visto que essa distribuição, quando adequada, é preditiva de saúde (WHO, 2000). O IMC utiliza-se do peso corporal e da altura do indivíduo ao quadrado, por meio da seguinte fórmula: IMC = Peso (kg) / altura (m)2, e a OMS preconiza pontos de corte para o resultado do cálculo de IMC, sendo: sobrepeso ou pré-obeso (25,0 a 29,9 kg/m2), obesidade grau I (30,0 a 34,9 kg/m2), obesidade grau II (35,0 a 39,9 kg/m2) e obesidade grau III (≥ 40,0 kg/m2). Conforme essas divisões classificam-se também o risco de doenças relacionadas à obesidade como: pouco elevado, elevado, muito elevado e muitíssimo elevado, respectivamente. (WHO,. 2000). Mesmo o IMC sendo um bom indicador para diagnóstico de sobrepeso e obesidade, esse indicador não está diretamente relacionado à gordura corporal, já que a massa muscular e a massa gordurosa não são passíveis de diferenciação por esse índice, podendo ser obtido resultados superestimados. Ainda, a distribuição de gordura corporal, pelo fato de não ser refletida, e se apresentar como indicador de.

(23) 22 extrema importância de risco para doenças cardiovasculares, a não ser estimada, pode mascarar esses riscos (GALLAGHER et al., 1996; REXRODE et al., 1998; DEURENBERG et al., 1999). Assim, preconiza-se que o IMC e as medidas de massa gordurosa e distribuição de gordura sejam utilizados, conjuntamente, para que haja diagnósticos mais fidedignos. Essas medições, complementares ao IMC, são: espessura das pregas cutâneas, relação do perímetro abdominal e quadril (RCQ), perímetro abdominal,. além. de. utilização. de. equipamentos. como. a. bioimpedância,. ultrassonografia, tomografia computadorizada e ainda ressonância magnética; sendo uns mais utilizados e outros, como a ressonância magnética, menos utilizada, tomando com base o custo (WHO, 2000).. 1.1.3 Alterações e complicações metabólicas na obesidade O excesso de tecido adiposo, principalmente o visceral, está fortemente associado às alterações e complicações metabólicas, tais como: hipertensão, resistência à insulina, hiperglicemia, dislipidemia, efeito protrombótico e inflamatório, diabetes melittus tipo 2 (DM2), doenças cardiovasculares, síndrome metabólica e, até mesmo, fator de risco para câncer (HIRABAYASHI, 2016; KERSHAW; FLIER, 2004; PANDIT; PANDEY, 2015). A hipertensão ocorre devido ao aumento do débito cardíaco por pressão de preenchimento intravascular elevada. No indivíduo com obesidade, a hipertensão está relacionada com alterações hormonais que provocam estimulação do sistema renina-angiotensina (SRA), alterações hormonais relacionadas aos adipócitos, como aumento das concentrações circulantes de leptina, e, esse, por sua vez, ligado ao estado hiperadrenérgico. Indivíduos com obesidade e hipertensão arterial sistêmica (HAS) também possuem tendência para desenvolver desordens respiratórias no sono, como apneia obstrutiva do sono (GOOD et al., 2008; GRASSI et al., 2005). Diversas complicações cardiovasculares podem conduzir à morte súbita devido à hipertrofia do ventrículo esquerdo (GOOD et al., 2008). Já o quadro de resistência à insulina provada pelo excesso de tecido adiposo, pode gerar falha nas células β do pâncreas devido ao aumento da secreção de insulina para compensar a hiperglicemia crônica. Esse desequilíbrio ocorre devido ao balanço energético positivo levando ao acúmulo de gordura corporal e.

(24) 23 desenvolvimento do DM2. Adicionalmente, essas desordens levam ao quadro inflamatório do paciente por aumento da contagem de leucócitos e fatores de coagulação, tais como fibrinogênio e inibidor do ativador de plaminogênio 1 (PAI-1); aumento das citocinas inflamatórias, como Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α), interleucina-1 e interleucina-6; elevação das proteínas de fase aguda, como proteína C reativa (PCR) e soro amilóide A (SAA) e aumento das quimiocinas (ESSER et al., 2014; EVERARD; CANI, 2013). Os marcadores inflamatórios, a resistência à insulina, a hiperglicemia, o aumento das concentrações do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) e dos esteroides somam-se como fatores que envolvem a associação positiva da obesidade, DM2 e o câncer (COHEN; LEROITH, 2012). O elevado percentual de gordura corporal tem sido relacionado a diversos tipos de câncer como: esôfago, colorretal, vesícula biliar, pâncreas, ovário, cérebro, endométrio, rins e próstata. Apesar de apresentarem grande impacto, as respostas às questões sobre a associação da obesidade com câncer ainda precisam ser mais bem esclarecidas, sendo necessária uma vigilância mais efetiva dos fatores de risco à saúde (ARNOLD et al., 2016). Algumas complicações mencionadas são possíveis de visualizar na figura 1, em que é visto um desencadeamento de alterações metabólicas em decorrência do excesso de tecido adiposo, e retroalimentação positiva para tais alterações apresentadas, como a hiperleptinemia e a inflamação (SÁINZ et al., 2015).. 1.1.4 Tratamento nutricional, farmacológico e cirúrgico Independente do tipo de tratamento para a obesidade, é necessário alterar o estilo de vida e manter um padrão alimentar e atividade física adequada para cada indivíduo de maneira saudável. Quanto maior for o grau de excesso de peso maior a complexidade do tratamento. É esse grau de complexidade que irá definir a escolha do tratamento (JEFFREYS et al., 2003; SBEM, 2006). A priori, inicia-se o tratamento com intervenção dietoterápica; para tanto, é preciso compreender e conhecer o consumo alimentar do indivíduo a ser tratado (FISBERG; MARCHIONI; COLUCCI, 2009)..

(25) 24. Figura 1 – Representação esquemática de alterações metabólicas acometidas pelo excesso de tecido adiposo. A hiperleptinemia e o processo inflamatório levando ao quadro de resistência à leptina central e periférica, acarretando prejuízo no metabolismo da glicose e de lipídeos, aumento com consumo alimentar e prejuízo na absorção de nutrientes. Fonte: SÁINZ et al., (2015), adaptado.. O Conselho Federal de Nutricionistas (CFN) estabelece critérios pertinentes na anamnese alimentar e nutricional como: frequência, qualidade e quantidade do consumo alimentar, levando em consideração os hábitos e a cultura, restrições e intolerância alimentares, entre outros. Com base nesses desses dados e outros, como parâmetros bioquímicos, tais como dosagem de colesterol total e frações, triglicerídeos, glicemia de jejum, insulina, entre outros, é possível traçar o plano alimentar levando em conta o valor energético total (VET), com balanço adequado de calorias diárias que, consequentemente, favoreça a perda de peso do individuo (CFN nº 417/2008). Junto ao plano alimentar, deve-se incentivar para que haja gasto energético por meio de exercícios físicos regulares (FISBERG; MARCHIONI; COLUCCI, 2009)..

(26) 25 O tratamento farmacológico pode vir a ser um aliado junto ao tratamento dietoterápico, quando não há sucesso no tratamento não farmacológico. Os fármacos permitidos no Brasil para tratar obesidade são, atualmente, sibutramina, orlistate e recentemente aceito pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) o saxenda. Cada um com o seu modo de ação e com indicações específicas, desde que estejam associados com o tratamento dietoterápico (ABESO, 2016). A sibutramina é indicada para pacientes com IMC>30 kg/m2 e contraindicado para aqueles com doenças cardiovasculares e com histórico de DM2. Seu mecanismo de ação se dá por inibição da recaptação da noradrenalina, serotonina e dopamina provocando, assim, aumento da saciedade e diminuição da fome (HALPERN et al., 2010). O orlistate é indicado para pacientes com sobrepeso e obesidade e contraindicado para pacientes com síndrome de má absorção crônica e colestase. Seu mecanismo de ação se dá por inibição irreversível das lipases gastrointestinais, tornando o indivíduo incapaz de hidrolisar a gordura provinda da alimentação reduzindo a absorção de triglicerídeos, ácidos graxos livres e monoglicerídeos absorvíveis (HECK; YANOVSKI; CALIS, 2000). O Saxenda® é indicado em caso de obesidade e de sobrepeso quando associados ao menos uma comorbidade. O composto ativo do medicamento saxenda® é a liraglutida, agonista do receptor dos peptídeos tipo glucagon 1 (GLP1) acilado, regulando o apetite por meio do aumento da saciedade, assim, reduzindo a fome e a ingestão alimentar (PANDIT; PANDEY, 2015). Quando não há sucesso, para pacientes com IMC>40 kg/m2 e para aqueles que possuem IMC>35 kg/m2 com comorbidade associadas e realizados os tratamentos dietoterápico, farmacológico, psíquico e atividade física, por pelo menos dois anos, a cirurgia bariátrica é indicada. Esse tratamento tem por finalidade a mudança anatômica e/ou funcional do trato gastrointestinal, provocando redução da ingestão alimentar e da absorção de nutrientes. Nesse sentido, há uma divisão técnica para o procedimento cirúrgico, sendo: não derivativas e derivativas, além do balão intragástrico (NIH, 1992). Independente da técnica cirúrgica ou medicamento utilizado durante o tratamento da obesidade é imprescindível a mudança no estilo de vida, incluindo nos hábitos alimentares, para que haja sucesso a curto e longo prazo (ABRAN, 2009)..

(27) 26 Ademais, sabe-se que a utilização de medicamentos e a cirurgia bariátrica podem causar efeitos colaterais como: deficiência da cobalamina, também conhecida como vitamina B12, gastrite, colecistite, desidratação, desnutrição, entre outros (NGUYEN et al., 2008). Em relação ao uso de medicamentos - inibidores enzimáticos, como a sibutramina - estudos controlados mostraram também alta prevalência de efeitos colaterais, tais como: xerostomia, obstipação, cefaleia e insônia. O orlistate também possui alguns efeitos colaterais como incontinência fecal, presença de óleo nas fezes, flatulência e outros (SBEM et al., 2010). Em face dessas constatações, e sabendo que outros medicamentos que eram usados no tratamento da obesidade foram extintos no Brasil, como, por exemplo, anfepramona e femproporex, sente-se a necessidade de estudos para produção de novos fármacos, que apresentem efeitos colaterais menos frequentes e assim poderem ser aliados ao tratamento da obesidade.. 1.2 REGULAÇÃO HORMONAL DA FOME E APETITE. A regulação da fome e do apetite neuronal central e periférica controla a ingestão alimentar e o gasto energético, buscando o equilíbrio homeostático. Alterações no sistema neural podem afetar o comportamento alimentar, quando em excesso (HALPERN; RODRIGUES; COSTA, 2004). Desse modo, diversos hormônios estão envolvidos no controle da saciedade, sobressaindo: o glucagon, a grelina, a insulina, a leptina e a colecistocinina (CCK). O glucagon é um hormônio, secretado pelas células α das ilhotas do pâncreas, de modo inversamente proporcional à concentração de insulina, em função da concentração de glicose sanguínea. Quando a glicose está diminuída, as concentrações séricas de insulina diminuem e as do glucagon aumentam, com o objetivo de estimular o aumento da produção de glicose hepática, para que aumente a glicose sanguínea (DOWNES, 2003; NELSON; COX, 2013). O glucagon, que é inicialmente secretado durante as refeições, está associado à redução do tamanho da refeição, sendo essa sinalização no cérebro via axônios sensoriais do nervo vago (WOODS et al., 2006). Outro hormônio de importância no controle do centro da fomesaciedade é a grelina, peptídeo composto por 28 aminoácidos que apresenta ação.

(28) 27 orexigênica (MURAKAMI et al., 2002). Esse hormônio é, primariamente, sintetizado e liberado por células endócrinas do estômago, sendo as concentrações produzidas e liberadas dependentes da adiposidade corporal. Há evidências de que as concentrações de grelina basal estão diminuídas em humanos com obesidade e essas concentrações aumentam quando há perda de peso. Dessa forma, sugere-se a forte ligação do controle alimentar por adiposidade, associado às concentrações de grelina (GEARY, 2004). A leptina e a insulina são dois dos principais fatores que sinalizam para o cérebro a informação de saciedade. Esses dois hormônios são secretados, perifericamente, e, quando atingem o Sistema Nervoso Central (SNC), reconhecem receptores do hipotálamo, promovendo, assim, tal informação (HALPERN; RODRIGUES; COSTA, 2004). A insulina, com seu efeito anabólico, é secretada, proporcionalmente, à quantidade de gordura corporal, e pode ser caracterizada como sinal de adiposidade. O hormônio insulina é transportado do sangue para o cérebro e executa sua sinalização neuronal. Esse hormônio auxilia na captação da glicose para dentro das células, regulando a concentração da glicose sanguínea, promovendo o armazenamento de substrato em gordura, no fígado e no músculo, devido à estimulação da lipogênese, síntese de glicogênio e, consequentemente, à inibição da lipólise, glicogenólise e degradação de proteínas (SALTIEL; KAHN, 2001) Já a leptina, uma proteína, de 16 kDa, sintetizada e liberada pelo tecido adiposo subcutâneo, atua sinalizando ao cérebro quando há excesso de tecido adiposo, provocando a redução do apetite (DAMIANI; DAMIANI, 2011). A CCK realiza, também, esse papel regulador do centro da fome e saciedade, a qual é dada via receptores gástricos que levam a informação de saciedade ao hipotálamo e ao núcleo do trato solitário por meio do nervo vago aferente (REHFELD, 2004). Na literatura, há relatos da interação de CCK com a leptina, também relacionada ao controle do apetite e da fome (LARTIGUE et al., 2012).. 1.2.1 CCK e leptina como reguladores da homeostase energética A CCK foi, inicialmente, descrita por Ivy e Oldberg (1929) como hormônio com mecanismo de ação envolvido na contração da vesícula biliar e.

(29) 28 evacuação, sendo posteriormente, denominada CCK (SILVER; MORLEY, 1991). Em 1966, esse hormônio foi identificado no intestino delgado e, posteriormente, localizado no cérebro, sendo caracterizado um peptídeo e, logo após, em 1968, foi descoberto que a CCK, composta por 33 resíduos de aminoácidos, possuía a maior atividade colecistocinética, comparada às suas demais formas ativas (CRAWLEY; CORWIN, 1994; REHFELD, 2004). Atualmente, sabe-se que a CCK é um hormônio secretado por células enteroendócrinas especializadas denominadas células-I, localizadas na porção duodenal do intestino delgado, na camada apical em contato direto com o lúmen intestinal. Para estar nas suas formas ativas são necessárias modificações póstraducionais (MPT), por ação das serino endopeptidases PCSK (pró-proteína convertase subtilisina/kexina, do inglês proprotein convertase subtilisin/kexin), sobre a PreproCCK, que contém 115 resíduos de aminoácidos, apresentando em sua primeira parte o peptídeo sinal e, na segunda, o peptídeo espaçador. As MPT ocorrem em diversas isoformas e são nomeadas conforme as quantidades de resíduos de aminoácidos: CCK-83, -58, -39, -33, -22, -8 e -5, dessas, são principalmente encontradas no plasma humano a CCK-58, -33, -22 e -8, estando representadas, a maioria, na figura 2 (REHFELD, 2004).. Figura 2 - Representação esquemática da estrutura primária do hormônio colecistocinina. As setas indicam os pontos de hidrolise da PCSK (proprotein convertase subtilisin/kexin) sobre a PreproCCK e as formas ativas CCK-58, -39, -33 e -8. Fonte: Dufresne; Seva; Fourmy (2006).. A sinalização para a secreção de CCK é, principalmente, em resposta à presença de lipídeos, com mais de 10 átomos de carbono, e proteínas, principalmente as que contêm triptofano e fenilalanina, provenientes da ingestão dietética, além de íons cálcio que também estimulam a sua secreção (MISHRA; DUBEY; GHOSH, 2016; MORLEY, 1980)..

(30) 29 Sua principal função relacionada à saciedade é com ação sob o eixo intestino-cérebro, por meio de um dos principais receptores de CCK que é CCK-1R, expressos no nervo vago aferente com inervação para o intestino (BAUER; HAMR; DUCA, 2016). Há outras funções conhecidas do hormônio em questão, tais como: aumento da contração da vesícula biliar, aumento da secreção de enzimas pancreáticas, motilidade intestinal, gasto energético e homeostase da glicose (BAUER; HAMR; DUCA, 2016; MISHRA; DUBEY; GHOSH, 2016). A leptina é um peptídeo constituído por 167 resíduos de aminoácidos, expressa, principalmente, no tecido adiposo branco; dessa forma, está diretamente proporcional à quantidade de tecido adiposo. As concentrações de leptina variam com a ingestão calórica e decrescem durante o período de jejum (PARK; AHIMA, 2015). Essa adipocina foi descoberta, em 1994, e tem sua ação mediada por meio de ligação com receptores (Lep-R) pela via de transdução de sinal JAK-STAT 3 (Proteína cinase solúvel - do inglês, Janus Kinase – JAK, e transdutores de sinal e ativadores da transcrição, do inglês, signal transducers and activators of transcription, STAT) (TRIANTAFYLLOU; PASCHOU; MANTZOROS, 2016). A leptina está diretamente relacionada com o balanço: ingestão de alimento vs. gasto energético. A leptina circulante é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica chegando ao núcleo arqueado do hipotálamo, ligando-se a receptores específicos. A ativação desses receptores, pela cascata de sinalização de leptina, é regulada, negativamente, pela ingestão de alimentos. São bem conhecidos dois tipos de receptores: LepRa e LepRb. O LepRa tem função principal de transportar a leptina do plasma para o fluido cerebroespinal, enquanto os LepRb estão localizados no hipotálamo, responsável por ativar a ingestão alimentar e regulação do gasto energético (JACQUIER; SOULA; CRAUSTE, 2015). Quando há leptina agindo no complexo neural, ocorre ativação de neuropeptídeos anorexígenos, que reduzem a ingestão alimentar, tais como o próopiomelanocortina (POMC) e o transcrito relacionado à cocaína e à anfetamina (CART), e inibição dos neuropeptídeos orexígenos, que estimulam a ingestão alimentar, como o neuropeptídeo Y (NPY) e o peptídeo relacionado a Agouti (AgRP). E no estado de jejum, as concentrações de leptina decrescem e provocam inibição dos. neuropeptídios. anorexígenos. e. ativação. dos. orexígenos,. provocando. estimulação da ingestão alimentar e reduzindo o gasto energético (PARK; AHIMA, 2015)..

(31) 30. 1.2.2 Sensibilidade ao CCK e a resistência à leptina por animais com obesidade Sabe-se que em condições fisiológicas ditas normais, a presença de gordura no lúmen intestinal suprime a ingestão alimentar, por meio da sensação de saciedade, provocada por hormônios intestinais como a CCK, o Peptídeo YY (PYY) e o Peptídeo Semelhante ao Glucagon-1 (GLP-1, do inglês Glucagon-like peptide-1) (LITTLE; FEINLE-BISSET, 2011). Entretanto, estudos com animais com obesidade, alimentados com dieta rica em gordura, mostram-se menos sensíveis ao efeito de saciedade por CCK, devido à redução da sua ação na ativação neuronal (DUCA; ZHONG; COVASA, 2013). A obesidade em ratos e camundongos, assim como em humanos, se apresenta pelo excesso de peso e, em animais, tem sido diagnosticada com base em um parâmetro zoométrico equivalente ao IMC para humanos, denominado índice de Lee. Para esse, é calculada a raíz cúbica do peso corporal (g) em razão do comprimento naso-anal (cm) do rato. Assim, é possível diagnosticar ratos com obesidade quando esse índice é ≥ 0,3 (BERNARDIS, 1970; NOVELLI et al., 2007). Estudo com ratos Zucker com obesidade e eutróficos, comparou o consumo alimentar dos dois grupos ao injetar via subcutânea a CCK; com isso, constatou-se que houve redução do consumo de alimentos pelos ratos eutróficos, mas não pelos animais com obesidade; sugerindo-se que os ratos com obesidade possuam menor sensibilidade ao efeito sacietogênico da CCK devido às diferenças na ligação do CCK com o seu receptor e no sítio de ação do nervo vago periférico (NIEDERAU et al., 1997). Outro experimento, em ratos Sprague-Dawley com obesidade induzida por dieta, verificou a importância da CCK para auxiliar na perda de peso. Entre os grupos estudados por 23 dias, observou-se que o grupo que recebeu CCK-8 exógeno apresentou redução do ganho de peso quando comparado ao controle (MHALHAL et al., 2016). No estudo de Duca; Zhong; Covasa (2013), utilizando modelo animal de ratos propensos à obesidade (OP) e ratos resistentes (OR), ambos mantidos com dieta rica em gordura, experimentou-se dosar CCK plasmático após administrar óleo de milho por gavagem, em três tempos: 30, 60 e 120 min após a gavagem. Verificou-se que, após 30 e 60 min, o grupo OR teve aumento plasmático de CCK.

(32) 31 significativamente maior do que o grupo OP. Contudo, a dieta rica em gordura e o estado de obesidade resultaram em uma resposta reduzida à sinalização de CCK, sobretudo associada a uma regulação negativa de CCK1-R nos gânglios nodosos (DUCA; ZHONG; COVASA, 2013). CCK também pode ter seu efeito de sinalização potencializado pela leptina, por meio do nervo vago. Um experimento, com ratos Zucker, mostrou que a resistência à leptina, em resposta a uma alimentação rica em gordura, provocou redução da sensibilidade dos neurônios aferentes vagal à CCK (LARTIGUE et al., 2012). Desse modo, a redução da resistência à leptina parece ser um caminho positivo para potencialização dos efeitos sacietogênicos de CCK em animais com obesidade. A resistência à leptina está associada à incapacidade de o sistema integrar os sinais de leptina na regulação do consumo alimentar, sendo bastante observada na obesidade. Essa resistência é caracterizada por altas concentrações de leptina no cérebro, provocando redução nos receptores de leptina no hipotálamo, reduzindo, assim, a sensibilidade à leptina e não havendo a regulação da ingestão alimentar devida (JACQUIER; SOULA; CRAUSTE, 2015).. 1.2.3 Inibidor de tripsina vs. CCK e leptina. Estudos científicos com inibidores de proteases são tão antigos quanto os estudos de proteases. Atualmente, diversos inibidores são conhecidos e são alvos de pesquisa com potenciais aplicações em diversas áreas, tais como: medicina, biotecnologia e agricultura (RAWLINGS; TOLLE; BARRETT, 2004). Entre os inibidores, o inibidor de tripsina é, amplamente, difundido em inúmeros estudos; muitos desses o isolam ou purificam e os caracterizam de diversas sementes, tais como: Adenanthera pavonina L. (SOUZA et al., 2016), Entada acaciifolia (OLIVEIRA et al., 2012), Vigna radiata (L.) R. Wilczek (KLOMKLAO et al., 2011), Putranjiva roxburghii (CHAUDHARY et al., 2008), Trigonella foenum-graecum (ODDEPALLY; SRIRAM; GURUPRASAD, 2013). Diversos estudos apresentam a capacidade sacietogênica dos inibidores de tripsina isolados de diferentes fontes, sobre a alegação de estimularem o aumento de CCK e, por isso, são denominados como secretagogos desse.

(33) 32 hormônio (CHEN et al., 2012; KOMARNYTSKY; COOK; RASKIN, 2011; NAKAJIMA et al., 2011; RIBEIRO et al., 2015; SERQUIZ et al., 2016). No entanto, a maioria desses estudos é conduzida com animais eutróficos e as moléculas estudadas não estão puras; por isso, não se sabe a que de fato se atribui os respectivos efeitos revelados. No estudo utilizando extrato de batata, Potein, que em sua composição contém inibidor de tripsina, foi avaliado seu efeito sobre a ingestão de alimentos em ratos Sprague-Dawley eutróficos e se havia estimulação direta de secreção CCK em células enteroendócrinas, da linhagem STC-1, do inglês Secretin Tumor Cells, de murinos. Foi constatado que o Potein suprimiu a ingestão alimentar de forma dosedependente e estimulou a secreção de CCK em células STC-1. Os autores, portanto, sugerem que o Potein suprime a ingestão de alimentos por meio da secreção de CCK induzida por estimulação direta em células enteroendócrinas por meio da inibição da tripsina luminal (NAKAJIMA et al., 2011). Em um estudo seguinte, foi avaliado o consumo alimentar e dosada a liberação de CCK luminal de ratos Sprague-Dawley eutróficos recebendo Potein®, que contém inibidor de tripsina, por administração duodenal. Foram percebidos a redução do consumo alimentar e o aumento da secreção de CCK, sendo sugerida a supressão do consumo em consequência do aumento de CCK, provocado pelo Potein® (CHEN et al., 2012). Ademais, o estudo com o inibidor de tripsina concentrado de batata (denominado PPIC), com ratos Wistar (180-200 g), eutróficos, comprovou a concentração plasmática de CCK. O estudo comparou o grupo submetido ao PPIC com um grupo controle que recebeu caseína na mesma quantidade/kg. O sangue dos animais foi coletado em dois tempos: imediatamente e após 15 min da administração de PPIC e caseína, após tratamento por 10 dias. Houve diferença estatística entre os grupos apenas no segundo tempo de coleta, o grupo que recebeu PPIC apresentou concentração mais elevada de CCK plasmático do que o grupo que recebeu caseína (KOMARNYTSKY; COOK; RASKIN, 2011). O estado de obesidade resulta em uma resposta reduzida à sinalização não apenas de CCK (DUCA; ZHONG; COVASA, 2013), mas também de outros hormônios envolvidos na saciedade, como grelina, leptina, insulina e glucagon (GEARY, 2004; JACQUIER; SOULA; CRAUSTE, 2015; REHFELD, 2004). No entanto, há evidências de que esses hormônios interajam, e que essa relação possa.

(34) 33 potencializar ou inibir mecanismos envolvidos no controle da fome e do apetite (REHFELD, 2004; LARTIGUE et al., 2012). 1.3 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE INIBIDORES DE PROTEASES Existe um visível interesse em estudar inibidores de proteases (IPs). Estudo clássico já menciona que os inibidores de proteases estão presentes em múltiplas formas nos reinos animal, vegetal e em micro-organismos; buscando classificar os inibidores conhecidos conforme classe de família, além de discutir mecanismo de ação desses inibidores (LASKOWSKI JR.; KATO, 1980). Os IPs são, naturalmente, reguladores de enzimas proteolíticas. Como dimensão da importância desses inibidores, é descrito que um genoma típico de um organismo é composto por cerca de 2 a 4% de genes que codificam para diversas proteases. As proteases são elementos críticos para diversos eventos biológicos como digestão, cicatrização, replicação viral, cascata de coagulação sanguínea, entre outros. Esses processos devem ser regulados com muita precisão, visto que, quando. desregulados,. alteram. o. equilíbrio. homeostático. podendo. trazer. consequências irreversíveis. Assim, os IPs são elementos fundamentais de regulação (FARADY; CRAIK, 2010). Tamanha importância têm os IPs que há um investimento do mercado global na área de síntese de inibidores enzimáticos avaliado em US$ 104,4 bilhões no ano de 2010, e a taxa de crescimento anual nesse ramo é de 4%, segundo BCC Research Reports (https://www.bccresearch.com/) (DABHADE; MOKASHE; PATIL, 2016). Há uma gama de medicamentos comercializados que tem como mecanismo de ação a inibição de enzimas, entre eles, a notável classe das estatinas, que são inibidores de uma enzima chave no processo de síntese de colesterol, a hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase (FONSECA, 2005). Ademais, há investimento em pesquisas com inibidores de proteases para o tratamento do câncer, em que são mencionados como potenciais agentes terapêuticos (EATEMADI et al., 2017). A pesquisa com inibidores de proteases com esse potencial vem sendo estudada e aplicada em tratamento de outras doenças, tais como: síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) e hipertensão (FEAR;.

(35) 34 KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007). Dessa forma, é possível constatar a importância dos estudos com essas moléculas. Há, classicamente, quatro famílias dos IPs, conforme o tipo de protease que inibem: serino, cisteíno, aspártico e metalo-protease (RYAN, 1990). Existe uma classificação atual conforme similaridade de aminoácidos, identificados na sequência do IP, que podem ser agrupadas em 6 superfamílias, englobando, assim, a classificação clássica: serpina, kunitz, cisteíno, Bowman Birk, inibidor metalopeptidase e aspartil (RAWLINGS; TOLLE; BARRETT, 2004; SHAMSI; PARVEEN; FATIMA, 2016). A família serpina possui alto peso molecular: entre 39 e 43 kDa. Os inibidores dessa família têm sido purificados e caracterizados principalmente de sementes de cereais com aplicação na vertente medicinal, como controlador de processo inflamatório e coagulação. Já a família Kunitz possui inibidores, geralmente, de 18 a 22 kDa, com duas pontes dissulfeto e único sítio reativo, também com aplicação medicinal. Os da família Bowman Birk com peso molecular de, aproximadamente, 8 kDa, têm sido alvo para estudo em células de câncer de mama. Os IPs metalo são ainda menores, cerca de 4,2 kDa; enquanto os da família aspartil possuem massa molecular de 27 kDa, e os IPs cisteíno possuem subdivisão com diferentes massas moleculares que variam entre 11 a 120 kDa (SHAMSI; PARVEEN; FATIMA, 2016). Os inibidores de tripsina são amplamente extraídos de sementes, purificados e caracterizados para uso em diversas pesquisas (SOUZA et al., 2016). O tamarindo se apresenta como uma semente rica em diferentes inibidores de tripsina. Entretanto, os inibidores de tripsina do tamarindo, ainda são pouco estudados, alguns autores isolaram (FOOK et al., 2005; RIBEIRO et al., 2015) e outros purificaram diferentes inibidores (ARAÚJO et al., 2005; PANDEY; JAMAL, 2014), porém com objetivos de estudo diferentes. Há depositadas, no banco de dados de proteínas do NCBI (National Center for Biotechnology Information), três sequências primárias de inibidor de tripsina do tamarindo. Uma delas é uma proteína composta por 185 resíduos de aminoácidos, cuja sequência, deduzida a partir de cDNA, é parcial e não publicada em revista científica (código de acesso: ADO51067.1) (NCBI, 2016). As outras duas sequências são designadas como cadeia A e B de inibidor de tripsina de tipo kunitz.

(36) 35 com atividade inibidora do fator Xa, ambas com 185 resíduos de aminoácidos, também deduzidas por cDNA (PATIL et al., 2012). Com a purificação de uma proteína, é possível sequenciá-la e caracterizá-la bioquímica e funcionalmente. A caracterização bioquímica e molecular:. sequenciamento,. determinação. de. estruturas. tridimensionais,. especificidade de inibição para classes de peptidases e mecanismos de inibição são essenciais, objetivando o potencial uso dessas proteínas para diferentes fins, incluindo fitoterápico ou medicamento (FAN; WU, 2005; OLIVEIRA et al., 2002; RYAN, 1990). Entretanto, apesar da pressão para reduzir os custos na investigação de novos fármacos de origem natural, uma vez que demanda alto custo para a purificação do princípio ou componente ativo, a separação, purificação e caracterização de produtos naturais são consideradas a base do processo de desenvolvimento dos biofármacos (PRZYBYCIEN; PUJAR; STEELE, 2004).. 1.3.1 Cromatografias para purificação de proteínas. O processo de purificação de proteínas exige combinação de técnicas de separação que variam conforme as características estruturais e a natureza da moléculas de interesse (SANTOS et al., 2012). Entre essas técnicas, destacam-se as cromatografias, que são métodos físico-químicos de separação e compreendem diversos tipos, tais como as de troca iônica, exclusão molecular e afinidade. Geralmente, essa metodologia cromatográfica são combinadas, entre os diversos tipos, a fim de se obter uma melhor resolução no processo de purificação de proteínas (MORAES et al., 2013). As cromatografias de afinidade, especialmente, são as técnicas dominantes no processo de purificação de proteínas, permitindo uma boa eficiência na separação de componentes similares numa mistura complexa, importantes para definir sua especificidade de ligação com as diversas enzimas que podem estar imobilizadas na fase estacionária. Dessa forma, a purificação pode ser grandemente aumentada, utilizando essa propriedade de afinidade entre a molécula de interesse e o agente de ligação (ARAÚJO et al., 2014; GOTTSCHALK; BRORSON; SHUKLA, 2012; SANTOS et al., 2012). No. entanto,. em. algumas. circunstâncias,. outras. técnicas. cromatográficas mais robustas e especializadas se fazem necessárias, tais como, a.

(37) 36 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, do inglês High performance liquid chromatography - HPLC). Esse é um instrumento sofisticado e com capacidade de separação e quantificação de moléculas com alta resolução por meio de colunas modernas (LANÇAS, 2009). Essa técnica automatizada permite análise e purificação em larga escala, sendo possível lançar mão das diferentes características químicas das proteínas em diversas colunas com propriedades distintas (SALVATO; CARVALHO, 2010).. 1.3.2 Análise de proteínas por espectrometria de massa. A espectrometria de massa (EM) é uma técnica de alta resolução e amplamente utilizada, sendo uma tecnologia essencial para análise química qualitativa (MILMAN, 2015). Avanços tecnológicos são constantes para EM, uma vez que é uma ferramenta indispensável para estudar química de proteínas, além de ser um campo central para a proteômica (STEEN; MANN, 2004). Diversos estudos vêm discutindo a importância e aplicabilidade da EM para diferentes áreas, entre elas, a pesquisa na clínica médica, para diagnósticos por meio de análise de exames laboratoriais (FUH; HEIKAUS; SCHLÜTER, 2016); na ciência dos alimentos, verificando a composição química e segurança alimentar (BARBERA et al., 2017; CASTRO-PUYANA et al., 2017) e em biofármacos, como é o caso das proteínas terapêuticas. Essas possuem complexidade estrutural, sendo extremamente importantes para sua eficácia e é de fundamental importância a caracterização química para que possa ter um controle de qualidade. Para tanto, a EM permite uma variabilidade de abordagens no estudo de biofármacos proteicos, o que torna essa técnica valiosa desde a descoberta até a aprovação de uma proteína terapêutica. Sem dúvidas, essas análises apresentam grande impacto na área biofarmacêutica (KALTASHOV et al., 2012). Esse método analítico é capaz de detectar, em razão da massa molecular e carga (m/z), íons analito. Diversas fontes de ionização são utilizadas, entre elas, ionização e dessorção a laser assistida por matriz (do inglês, Matrixassisted laser desorption/ionization - MALDI) e ionização por eletrospray (do inglês, electrospray ionization – ESI), assim como vários analisadores são utilizados, tais como quadrupolo (Q) e o tempo-de-voo (do inglês, Time of flight - TOF), ou ainda associado como quadrupolo-tempo de voo (Q-TOF) (SCHERL, 2015)..

(38) 37 A junção técnica desses dois analisadores, TOF e Q-TOF, resulta em um equipamento de alta resolução, boa sensibilidade e rapidez de varredura para gerar os espectros. Sua aplicabilidade é muito ampla, principalmente para picos cromatográficos. estreitos. (LANÇAS,. 2009).. Diferente. das. técnicas. de. sequenciamento por cDNA, o sequenciamento e a massa molecular obtida por meio das técnicas de ionização são amplamente empregadas nas análises de substâncias de importância bioanalítica, alimentícia e farmacêutica (KÖCHE; ENGSTRÖM; ZUBAREV, 2005; LANÇAS, 2009).. 1.3.3 Parâmetros de especificidade e resistência proteica. Quanto à caracterização de inibidores, avaliar a estabilidade a temperatura e de pH (potencial hidrogeniônico) e a cinética enzimática da inibição, são informações de extrema importância, na área de biotecnologia de proteínas. Por meio da temperatura e pH, é possível esclarecer os limites extremos da bioatividade dessas moléculas (PRZYBYCIEN; PUJAR; STEELE, 2004). Já quanto ao esclarecimento sobre a cinética enzimática desses inibidores é possível identificar o tipo de inibição, a Ki (constante de inibição) e a IC 50 (concentração mínima para que ocorra a inibição). A cinética enzimática reversível pode ser classificada, basicamente, em duas formas: competitiva e não competitiva. Na competitiva, a estrutura do inibidor é semelhante à do substrato, competindo, de fato, pelo sítio ativo da enzima. Já a não competitiva, o inibidor liga-se em um local distinto do sítio ativo da enzima e provoca alteração na sua conformação estrutural, dessa forma, o substrato não se ligará mais de forma eficaz na enzima (MORAES et al., 2013; NELSON; COX, 2013). Há várias abordagens para estudar o mecanismo de ação de uma proteína purificada, e uma das mais importantes continua sendo a mais antiga, que é por determinação da velocidade de reação e como ela se altera em resposta a mudanças informações. nos são. parâmetros essenciais. experimentais para. o. (NELSON;. estudo. de. COX, potenciais. 2013).. Essas. biofármacos. (GOTTSCHALK; BRORSON; SHUKLA, 2012). Nesse sentido, purificar, sequenciar e caracterizar bioquímica e funcionalmente esses inibidores de proteases não é simples, no entanto se.