Estudo da variabilidade genética do papilomavírus humano e determinação de alvos moleculares para detecção e tipagem

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA. GUSTAVO HENRIQUE OLIVEIRA CAVALCANTE. ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO E DETERMINAÇÃO DE ALVOS MOLECULARES PARA DETECÇÃO E TIPAGEM. NATAL 2018.

(2) Gustavo Henrique Oliveira Cavalcante. ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO E DETERMINAÇÃO DE ALVOS MOLECULARES PARA DETECÇÃO E TIPAGEM Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Daniel Carlos Ferreira Lanza. Natal 2018.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB. Cavalcante, Gustavo Henrique Oliveira. Estudo da variabilidade genética do papilomavírus humano e determinação de alvos moleculares para detecção e tipagem / Gustavo Henrique Oliveira Cavalcante. - Natal, 2018. 140 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Daniel Carlos Ferreira Lanza.. 1. Câncer cervical - Dissertação. 2. Diagnóstico Dissertação. 3. PCR - Dissertação. 4. Genotipagem - Dissertação. 5. Evolução molecular - Dissertação. I. Lanza, Daniel Carlos Ferreira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 618.14-006. Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351.

(4)

(5) AGRADECIMENTOS “Ser grato não é apenas retribuir atitudes ou situações agradáveis que outras pessoas nos propiciaram. Ser grato é um estado de espírito e não é referente somente a fatos positivos, mas a tudo que está presente em nossa vida”. Em iguais importâncias, listo o meu agradecimento: Aos estimados colegas do “Grupo 9”, Daniel, Emília, Marcel, Mirella, Pedro, Renata, Sara e Talita, por suscitarem inestimáveis aprendizados para mim, cada um à sua maneira, ao longo dessa próspera convivência desde a graduação; e por todos os (poucos) momentos de reunião, de comemoração e de (muitas) reflexões filosóficas, como “Um canudo tem dois buracos ou um?”: amigos são irmãos que o coração acolhe. Ao professor Daniel Lanza, por quem tenho grande apreço profissional e pessoal, pela extraordinária capacidade de lidar com inúmeras formas de pensar diferentes reunidas em um mesmo espaço físico, desdobrando-se para trilhar lado a lado os caminhos de cada uma delas; e pela formidável orientação ao longo do laborioso caminho dessa primeira etapa da Pós-Graduação, propiciando vários momentos de aprendizado intelectual, profissional e pessoal: um mestre lapida, inspira e estimula seus discípulos, fazendo brotar duas ideias onde antes só havia uma. A todos que colaboraram direta e indiretamente para o desenvolvimento desse trabalho e das produções científicas a ele relacionadas, e aos professores que contribuíram com suas críticas, ajudando a aprimorá-lo: dedicação e competência são importantes, mas ninguém obtém êxito sozinho. Aos companheiros da equipe LAPLIC, com quem aprendo de tudo um pouco a partir do dom da observação, não apenas no que tange à Ciência, mas também à cultura, compras e, principalmente, zoeira: quem quiser sobreviver e ser feliz, precisa treinar, trabalhar e viver em equipe. A todos os familiares que estiveram presentes fisicamente ao longo de mais essa jornada, e também espiritualmente, a centenas de quilômetros de distância, por intercessão do Altíssimo: jamais podemos esquecer que somos galhos sustentados por um tronco comum e unidos a uma mesma raiz. Aos meus pais, Wilson e Lucineide, e à minha irmã, Maria Luiza; há 6 anos longe de casa, continuam sendo refúgios que prevalecem de pé, mesmo quando as maiores tempestades passam pela vida: como posso ser suficientemente grato a Deus por vocês? A todos os companheiros da turma “Biomed+”, que mesmo na dificuldade de conseguir datas para reunir todas as pessoas, suscitaram momentos únicos de confraternizações com sidra, (muita) comida, e (muitos e muitos) risos ao longo desse ano: como não lembrar de vocês?.

(6) Aos companheiros da turma 2016.1, com os quais dei os primeiros passos no Mestrado e enfrentei todas as angústias das apresentações e das temidas discussões de artigos das disciplinas, especialmente aquelas que foram em inglês: aprendemos a dar as mãos uns aos outros nos momentos difíceis. A Hannaly Wana (a.k.a. Manady), mãe de “Marcos Paulo Jr.” desde a disciplina de Genética Molecular, pelos vários momentos de resenha no CB e fora dele, ajudando a segurar essa barra que é a pós-graduação; e pelas incontáveis discussões filosóficas, teorizações “dragonballísticas”, vídeos de Gleyfy Brauly, dentre outras coisas: algumas pessoas têm o dom de jamais serem esquecidas. A Deus Pai, rico em amor e compaixão, por todos os momentos felizes e pelas pessoas com as quais tenho e tive a oportunidade de conviver; por todos os obstáculos colocados em meu caminho: quando chego ao topo da montanha, reconheço na paisagem a lição que Ele me deu..

(7) Seja você quem for, seja qual for a posição social que você tenha na vida, a mais alta ou a mais baixa, tenha sempre como meta muita força, muita determinação e sempre faça tudo com muito amor e com muita fé em Deus, que um dia você chega lá. De alguma maneira, você chega lá. Ayrton Senna.

(8) RESUMO O papilomavírus humano (HPV) é um pequeno vírus de DNA de dupla fita circular, caracterizado como um dos mais comuns agentes sexualmente transmissíveis no mundo, cuja detecção e genotipagem acuradas só são possíveis por meio de técnicas de biologia molecular. Diferentes propriedades biológicas têm sido reportadas dentre os mais de 170 tipos já caracterizados, de maneira que um grupo particular de HPVs está fortemente relacionado a infecções persistentes, lesões intraepiteliais de diferentes graus e progressão para cânceres tais como cervical, anal, vulvar, vaginal, orofaríngeo e de pênis. No presente trabalho foram realizadas análises de variabilidade genética e evolução molecular nos genomas dos principais HPVs de importância clínica. Reconstruções filogenéticas e análises dos perfis de assinatura genética nos genomas de cada genótipo sugeriram a presença de subgrupos de HPVs definidos por diferenças nas sequências dos genes E1, E6, L1 e L2. Testes de evolução em nível de DNA revelaram uma atuação mais forte da seleção natural em códons específicos, mais frequentemente nos genes E1, E2, L1 e L2. A partir dos dados obtidos nas análises de variabilidade, foi desenhado um novo conjunto de primers para a detecção e genotipagem dos HPVs de importância clínica por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). O gene E1 foi escolhido como alvo molecular devido a presença de uma região conservada com tamanho variável entre genótipos. O sistema proposto teve sua eficiência avaliada in vitro e foi comparado ao protocolo de PCR mais utilizado para detecção do HPV em amostras clínicas. Utilizando a amplificação de ácido nucleico de forma semianinhada (seminested), o sistema proposto foi capaz de detectar com boa sensibilidade alguns dos principais HPVs de alto risco oncogênico e mostrou melhor especificidade em relação aos primers genéricos GP5+/6+, mesmo aplicando uma temperatura de anelamento consideravelmente maior. A análise do tamanho dos fragmentos amplificados usando a separação por eletroforese em gel de agarose pode favorecer a identificação do tipo de HPV presente nas amostras, permitindo a discriminação entre aqueles mais prevalentes na população e a redução do tempo e do custo necessários para a identificação do agente. Opcionalmente, a separação dos produtos em matrizes de alta resolução e o sequenciamento direto podem ser usados para a tipagem, possibilitando a identificação de uma ampla variedade de genótipos de HPV descritos. Palavras-chave: diagnóstico, câncer cervical, PCR, genotipagem, evolução molecular..

(9) ABSTRACT Human papillomavirus (HPV) is a small circular double-stranded DNA virus, characterized as one of the most common sexually transmitted agents in the world, whose accurate detection and genotyping is only possible through molecular biology techniques. Different biological properties have been reported among the more than 170 types already characterized, so that a particular group of HPVs is strongly related to persistent infections, intraepithelial lesions of different degrees and progression to cancers such as cervical, anal, vulvar, vaginal, oropharyngeal and penis. In the present work, analyzes of genetic variability and molecular evolution were performed in the genomes of the main clinically important HPVs. Phylogenetic reconstructions and analyzes of genetic signature profiles in the genomes of each genotype suggested the presence of subgroups of HPVs defined by differences in the E1, E6, L1 and L2 gene sequences. Evolution tests at DNA level have shown a stronger acting of natural selection at specific codons, more often in the E1, E2, L1 and L2 genes. From the data obtained in the analyzes of variability, a new set of primers was designed for the detection and genotyping of HPVs of clinical importance by polymerase chain reaction (PCR) technique. E1 gene was chosen as the molecular target due to the presence of a conserved region of variable size among genotypes. The proposed system had its efficiency evaluated in vitro and was compared to the most used PCR protocol for HPV detection in clinical samples. Using the seminested nucleic acid amplification, the proposed system was able to detect some of the major oncogenic HPVs with good sensitivity and showed a better specificity than the generic primers GP5+/6+, even applying a considerably higher annealing temperature. The analysis of the size of the amplified fragments using agarose gel electrophoresis may favor the identification of the HPV type present in the samples, allowing the discrimination between those more prevalent in the population and the reduction of the time and cost necessary for the identification of the agent. Optionally, the separation of products into high resolution matrices and direct sequencing can be used for typing, enabling the identification of a wide variety of HPV genotypes described. Keywords: diagnosis, cervical cancer, PCR, genotyping, molecular evolution..

(10) LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Estrutura dos vírions dos papilomavírus . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 2 – Comparação dos dez genótipos mais prevalentes nos casos de câncer no mundo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 3 – Mapa da incidência global estimada de câncer cervical em 2012 . . Figura 4 – Representação esquemática da organização genérica do genoma dos Alfapapilomavírus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 5 – Agrupamento dos genótipos com base na frequência de uso de oligonucleotídeos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 6 – Análises de componentes principais com base na abundância relativa de hexanucleotídeos em cada gene viral . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 7 – Árvores filogenéticas inferidas com base nas sequências de genoma completo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 8 – Comparação de identidades genômicas entre os genótipos dos quatro grupos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 9 – Valores médios das diferenças nucleotídicas por sítio e escalada pelo tamanho populacional efetivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 10 – Padrões de diversidade nucleotídica e taxa de mutação populacional por sítio nos genomas virais agrupados . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 11 – Representação esquemática da organização dos motivos na região regulatória N-terminal da proteína E1 . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 12 – Alinhamento das sequências dos primers com as regiões correspondentes no gene E1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 13 – Predição in silico do tamanho dos produtos de PCR gerados dos HPVs de alto e baixo risco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 14 – Padronização das condições ideais de termociclagem com os primers FW e RV1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 15 – Padronização da concentração de primers e temperatura ideais . . Figura 16 – Teste de sensibilidade de detecção do sistema . . . . . . . . . . . . Figura 17 – Detecção de HPV em amostras clínicas . . . . . . . . . . . . . . . .. 16 19 20 24 44 45 50 51 52 53 62 64 65 68 69 71 72.

(11) LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Estimativas da incidência de câncer cervical e número de óbitos por continentes e no Brasil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tabela 2 – Resumo dos principais testes moleculares utilizados na detecção do HPV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tabela 3 – Principais primers utilizados na detecção de HPV por PCR . . . . . Tabela 4 – Variabilidade relativa de cada gene e LCR . . . . . . . . . . . . . . Tabela 5 – Teste de neutralidade de Tajima para regiões codificantes e LCR . . Tabela 6 – Teste de seleção positiva em genes individuais . . . . . . . . . . . . Tabela 7 – Localização no genoma e tamanho do fragmento amplificado na segunda etapa da PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tabela 8 – Condições de termociclagem, sequências e características dos primers utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tabela 9 – Condições de termociclagem, sequências e características dos primers utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 22 32 34 55 57 58 66 70 74.

(12) LISTA DE QUADROS Quadro 1 – Testes para detecção de sítios sob seleção positiva . . . . . . . . .. 60.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BLAST. Ferramenta de Busca por Alinhamento Local Básico. CBM. Motivo de ligação a ciclina-Cdk. Cdk. Quinase dependente de ciclina. Crm1. Exportina de manutenção cromossomal 1. DBD. Domínio de ligação ao DNA. dN. Número de substituições não sinônimas por sítio não sinônimo. dS. Número de substituições sinônimas por sítio sinônimo. DNA. Ácido desoxirribonucleico. dNTP. Desoxirribonucleotídeo-trifosfato. E6AP. Proteína associada a E6. EGFR. Receptor do fator de crescimento epidérmico. ERK1. Quinase regulada por sinal extracelular. FEL. Verossimilhança de Efeitos Fixos. HC2. Captura híbrida 2. HPV. Papilomavírus Humano. IARC. Agência Internacional de Pesquisa em Câncer. INCA. Instituto Nacional de Câncer. LCR. Região regulatória longa. MEGA. Análise de Genética Molecular Evolutiva. MEME. Modelo de Evolução de Efeitos Mistos. MHC. Complexo principal de histocompatibilidade. MUSCLE. Comparação de Múltiplas Sequências por Expectativa de Log. NES. Sinal de exportação nuclear. NLS. Sinal de localização nuclear. ORF. Quadro de leitura aberto. PaVE. Papillomavirus Episteme. PCA. Análise de componentes principais. PCR. Reação em cadeia da polimerase. PDGFR. Receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas. pRB. Proteína do retinoblastoma. RNA. Ácido ribonucleico.

(14) SV40. Vírus símio 40. Tm. Temperatura média de anelamento. TLR9. Receptor do tipo Toll 9. URR. Região regulatória upstream. VLP. Partículas semelhantes ao vírus.

(15) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 15. 1.1. ASPECTOS GERAIS DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO . . . . . . . .. 15. 1.2. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 18. 1.3. BIOLOGIA MOLECULAR DO HPV . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 23. 1.3.1. Genes precoces (E) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 25. 1.3.2. Genes tardios (L) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 27. 1.4. ASPECTOS EVOLUTIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 28. 1.5. DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 31. 1.5.1. Detecção molecular do HPV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 33. 1.6. JUSTIFICATIVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 36. 2. OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 37. 3. MATERIAIS E MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 38. 3.1. OBTENÇÃO E COMPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS . . . . . . . . . .. 38. 3.2. ANÁLISES DE FILOGENIA MOLECULAR . . . . . . . . . . . . . . .. 38. 3.2.1. Análise de agrupamento e reconstruções filogenéticas . . . . . . . .. 38. 3.2.2. Avaliação da diversidade nucleotídica e testes de seleção . . . . . .. 39. 3.3. DESENHO DE PRIMERS E AVALIAÇÃO IN SILICO. . . . . . . . . .. 40. 3.4. PADRONIZAÇÃO DO PROTOCOLO IN VITRO . . . . . . . . . . . .. 41. 3.5. TESTES COM AMOSTRAS CLÍNICAS . . . . . . . . . . . . . . . . .. 41. 4. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 43. 4.1. VARIÂNCIA DOS COMPONENTES PRINCIPAIS E ANÁLISES FILOGENÉTICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 43. 4.1.1. Análise de relação entre genótipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 43. 4.1.2. Variabilidade nucleotídica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 51. 4.2. SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO ALVO MOLECULAR . . . . . .. 61. 4.2.1. Caracterização do alvo molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 61. 4.3. DESENHO DE PRIMERS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 63. 4.4. PADRONIZAÇÃO IN VITRO DA PCR SEMINESTED . . . . . . . . .. 67. 4.5. DETECÇÃO E GENOTIPAGEM EM AMOSTRAS CLÍNICAS . . . . .. 72. 5. DISCUSSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 75. 5.1. VARIABILIDADE GENÉTICA E IMPLICAÇÕES . . . . . . . . . . . .. 75. 5.1.1. Divergências nos perfis de assinatura genética. 75. . . . . . . . . . . . ..

(16) 5.1.2. Evolução molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 76. 5.2. SISTEMA DE DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DE HPV . . . . . . . .. 80. 6. CONCLUSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 84. REFERÊNCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 86. APÊNDICE A – ANÁLISES DE COMPONENTES PRINCIPAIS COM BASE NA ABUNDÂNCIA RELATIVA DE TRINUCLEOTÍDEOS EM CADA GENE VIRAL . . . . . . . . . . . . . . .. 102. APÊNDICE B – DISTRIBUIÇÃO DE PROBABILIDADES MARGINAIS ESTIMADAS COM O BEAST . . . . . . . . . . . . . . . . .. 103. APÊNDICE C – ELETROFEROGRAMAS OBTIDOS APÓS SEQUENCIAMENTO DIRETO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 104. APÊNDICE D – ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DOS PRIMERS GP5+/6+ COM AS REGIÕES CORRESPONDENTES NO GENE L1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 105. APÊNDICE E – RESULTADOS DA SELEÇÃO DO MODELO DE SUBSTITUIÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS . . . . . . . . . . . . . .. 106. APÊNDICE F – RESULTADOS DOS TESTES DE SELEÇÃO COM BASE NO MÉTODO MODIFICADO DE NEI-GOJOBORI . . .. 107.

(17) 15 1 INTRODUÇÃO A família Papillomaviridae compreende um grupo diverso de vírus ubíquos capazes de infectar todas as classes de Tetrapoda, exceto anfíbios, sendo considerada uma das famílias de vírus de vertebrados mais bem-sucedidas. As origens desses vírus datam de cerca de 350 milhões de anos atrás, quando ocorreram alterações no epitélio dos primeiros répteis ancestrais que emergiram (BRAVO, DE SANJOSÉ & GOTTSCHLING, 2010; DE VILLIERS et al., 2004; DOORBAR et al., 2015). Os mais de 300 papilomavírus caracterizados até hoje são estritamente espécie-específicos e acredita-se que tenham coevoluído com seus respectivos hospedeiros. Muito pouca ou nenhuma transferência cruzada entre espécies ao longo do tempo tem sido relatada (BERNARD, CHAN & DELIUS, 1994; BRAVO & FELEZ-SANCHEZ, 2015; DOORBAR et al., 2015; SUNDBERG et al., 1997; VAN DOORSLAER, 2013). 1.1. ASPECTOS GERAIS DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO O papilomavírus humano (HPV) é um pequeno vírus não-envelopado de DNA. dupla fita circular caracterizado como um dos mais comuns agentes sexualmente transmissíveis em todo o mundo. A infecção é altamente contagiosa e sua transmissão se dá não apenas por meio de relações sexuais com penetração, mas também por contato direto com pele ou mucosa infectadas (MOSCICKI et al., 2006). A infecção é mais comumente encontrada no trato anogenital de homens e mulheres, causando verrugas genitais ou lesões intraepiteliais escamosas de diferentes graus, as quais, em alguns casos, podem progredir para lesões mais graves e culminar no desenvolvimento de câncer. Acredita-se que a taxa de prevalência global da infecção pelo HPV é subestimada, em razão da ocorrência de infecções assintomáticas e das limitações nas metodologias de estudo. Contudo, observam-se variações nas taxas de prevalência em diferentes regiões geográficas, sendo inversamente proporcionais ao nível de desenvolvimento socioeconômico e tendendo a crescer à medida que se observa maior severidade na lesão (BRUNI et al., 2010; DE SANJOSÉ et al., 2007). A Figura 1 representa a estrutura das partículas infecciosas dos vírus da família Papillomaviridae..

(18) 16 Figura 1 – Estrutura dos vírions dos papilomavírus. Fonte: Adaptado de ViralZone. Disponível em: <http://viralzone.expasy.org/all_by_species/5.html>. Atualmente, mais de 170 tipos diferentes de HPVs já foram catalogados e registrados no International Human Papillomavirus Reference Center, dentre os quais cerca de 40 são encontrados com frequência causando infecções no epitélio de revestimento do trato genital e de outras mucosas do corpo (BERNARD et al., 2010; DE VILLIERS, 2013). A classificação atual dos HPVs é feita com base nas semelhanças das sequências nucleotídicas do gene L1, que codifica a proteína principal do capsídeo viral, obtidas por meio do sequenciamento nucleotídico, bem como levando-se em conta propriedades biológicas, tais como virulência e potencial oncogênico, além da própria relação filogenética. Com base nesses critérios, estabeleceu-se que os HPVs são agrupados em cinco gêneros distintos, designados pelas letras do alfabeto grego Alfa, Beta, Gama, Mi e Ni, que por sua vez são divididos em várias espécies e “tipos-espécies", então subdivididos em genótipos, aos quais são atribuídos números de acordo com a ordem de caracterização (BERNARD et al, 2010; SCHIFFMAN et al, 2010). Os genótipos que pertencem a gêneros diferentes possuem menos de 60% de identidade na sequência do gene L1. Para que haja a caracterização de um novo genótipo, é necessário haver pelo menos 10% de divergência na sequência do gene em relação a todos os outros já descritos (BERNARD et al., 2010; DE VILLIERS et al., 2004). De acordo com o sítio anatômico que infectam, os HPVs podem também ser classificados em cutaneotrópicos e mucosotrópicos, causando lesões hiperproliferativas.

(19) 17 (verrugas) como principal manifestação clínica (SCHEURER; TORTOLERO-LUNA; ADLER-STORTHZ, 2005; DOORBAR et al., 2015). No entanto, a maior parte das infecções é assintomática, causadas principalmente por genótipos dos gêneros Betapapilomavírus e Gama-papilomavírus, sendo controlada e eliminada pela resposta imune do hospedeiro em um período de oito a 24 meses (SMITH & ANGARONE, 2015; VELDHUIJZEN et al., 2010). Em indivíduos imunossuprimidos, alguns tipos de Beta-HPV podem levar ao desenvolvimento de carcinoma de queratinócitos, um dos mais comuns tipos câncer de pele não-melanoma (QUINT et al., 2015). Os HPVs mucosotrópicos, em sua maioria pertencentes ao gênero Alpha, são encontrados frequentemente nas mucosas urogenital, anal e oro-respiratória, causando verrugas genitais (condiloma acuminado) e papilomas orais. Entretanto, esse grupo de HPVs engloba genótipos com diferentes propriedades biológicas. Aqueles que são comumente associados a lesões hiperproliferativas benignas e raramente são encontrados em cânceres, como os HPVs 6, 11, 13, 44 e 47, são classificados como HPVs de baixo risco oncogênico (MUÑOZ et al., 2006). Já os genótipos que apresentam elevada tendência a causar lesões intraepiteliais e são fortemente associados ao desenvolvimento de câncer, como os HPVs 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 e 58, são classificados como HPVs de alto risco oncogênico (SCHIFFMAN et al., 2010). Este grupo inclui genótipos capazes de infectar diferentes tipos de células epiteliais, existindo fortes evidências sobre o seu papel etiológico no desenvolvimento de neoplasias tais como de pênis, ânus, vulva, vagina, orofaringe e, principalmente, cérvice uterina (IARC, 2007). Caracterizado como um dos mais bem-sucedidos agentes infecciosos, o HPV é capaz de induzir infecções persistentes não produtivas por tempo indeterminado, podendo ser reativado a qualquer momento (STANLEY, 2012). Uma vez que esse vírus não infecta células apresentadoras de antígeno, não causa viremia, nem induz citólise e, portanto, não induz resposta inflamatória, o sistema imune do hospedeiro tem poucas oportunidades de detectar a sua presença, sendo apenas uma quantidade mínima de partículas virais expostas (STANLEY, 2012; TINDLE, 2002). A hipótese mais aceita é que microinjúrias induzidas por contato sexual ou por infecções por micro-organismos, eventualmente promovem a exposição de proteínas virais a células apresentadoras de antígeno profissionais, como as células de Langerhans (SASAGAWA, TAKAGI & MAKINODA, 2012). Ainda assim, a produção de citocinas importantes para a apre-.

(20) 18 sentação de antígenos é bastante reduzida, em virtude da quase total ausência de inflamação no sítio de infecção (STANLEY, 2012). Estudos mostram que a resposta imune adaptativa é capaz de reagir contra certas proteínas virais, sendo a resposta de linfócitos Th1 crucial para a eliminação da infecção e prevenção da evolução das lesões precursoras (DE JONG et al., 2002; WELTERS et al., 2003). Entretanto, o HPV dispõe de uma série de mecanismos de evasão imune envolvendo as proteínas não estruturais expressas nas células das camadas basais do epitélio infectado, como será discutido mais adiante. 1.2. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS Pelo menos 18 genótipos (incluindo os HPVs 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51,. 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 e 82) são causas bem estabelecidas de virtualmente todos os casos de câncer do colo do útero (DE VILLIERS et al., 2013), neoplasia cuja incidência é estimada em cerca de 530 mil casos por ano e que é responsável por mais de 265 mil mortes de mulheres no mundo (FORMAN et al., 2012; FERLAY et al., 2015). ALEMANY et al., 2015 recentemente observaram que a contribuição relativa de diferentes genótipos na prevalência do câncer cervical não tem sofrido variações nos últimos 70 anos. A Figura 2 representa a comparação entre os 10 genótipos de HPV mais prevalentes nos principais tipos de câncer relacionados à infecção por esse patógeno..

(21) 19 Figura 2 – Comparação dos dez genótipos mais prevalentes nos casos de câncer no mundo. Os dados apresentados nos gráficos representam a porcentagem de prevalência relativa para cada genótipo. Fonte: Adaptado de BRUNI et al., 2016..

(22) 20 Os genótipos 16 e 18 são responsáveis por mais de 70% de todos os casos de câncer cervical no mundo (CLIFFORD et al., 2003; SMITH et al., 2007). Os dados apresentados na Figura 3 representam a distribuição global da incidência de câncer cervical.. Figura 3 – Mapa da incidência global estimada de câncer cervical em 2012. As taxas correspondentes às cores representadas equivalem ao número de casos por 100 mil mulheres. Fonte: Disponível em: <http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx>. Acesso em: 19 de janeiro de 2017.. Na América Latina e no Caribe, a prevalência da infecção por HPV em mulheres sem alterações ao exame citológico é estimada em 28,4% na faixa etária de até 25 anos, permanecendo em média 10% nos grupos etários de 25 a 64 anos, e aumentando nas mulheres acima de 65 anos para 18,5% (BRUNI et al., 2010; DE SANJOSÉ et al, 2007). A incidência de câncer cervical nessa região corresponde a cerca de 82% do total de casos notificados no continente Americano, sendo estimados cerca de 68.818 novos casos diagnosticados por ano, com 28.565 mortes anuais (FERLAY et al., 2015). Quando analisados os genótipos mais comumente detectados em mulheres com câncer cervical invasivo, os HPVs 16 e 18 respondem por mais de 60% dos casos, seguidos de 31 e 45, que somam mais de 10% (CLIFFORD et al., 2003; GUAN et al., 2012; LI et al., 2011; SMITH et al., 2007). No Brasil, a prevalência estimada da infecção pelo vírus é de cerca de 24,3% nas mulheres com idade inferior a 25 anos, mas apresenta-se acima das médias.

(23) 21 mundiais na maioria dos grupos etários (BRUNI et al., 2010; DE SANJOSÉ et al, 2007). A incidência de câncer cervical no país foi estimada em 16.340 casos para o ano de 2016, com 5.448 óbitos ocorridos no ano de 2014 (INCA, 2014, 2015), data dos registros mais recentes. Seguindo a tendência global, os genótipos mais comumente isolados em pacientes com câncer cervical invasivo são 16 e 18, somando mais de 68% dos casos, seguidos de 31, 33, 35 e 45, que juntos somam quase 18% (CLIFFORD et al., 2003; GUAN et al., 2012; LI et al., 2011; SMITH et al., 2007). A Tabela 1 contém o resumo das informações sobre a incidência de câncer cervical por regiões geográficas e os respectivos números de óbitos..

(24) 22 Tabela 1 – Estimativas da incidência de câncer cervical e número de óbitos por continentes e no Brasil Taxa anual Número de óbitos (por 100.000 mulheres). Região. Número de casos. Mundo*. África Américas Ásia Europa Oceania Total. 99.038 83.195 284.823 58.373 2.195 527.624. 27,6 14,9 12,7 11,4 10,2 14,0. 60.098 35.673 144.434 24.404 1.063 265.672. Brasil**. Acre Alagoas Amapá Amazonas Bahia Ceará Distrito Federal Espírito Santo Goiás Maranhão Mato Grosso Mato Grosso do Sul Minas Gerais Pará Paraíba Paraná Pernambuco Piauí Rio de Janeiro Rio Grande do Norte Rio Grande do Sul Rondônia Roraima Santa Catarina São Paulo Sergipe Tocantins Total. 40 310 50 630 1.120 930 260 270 620 880 390 370 880 830 290 1.000 970 400 1.340 260 840 110 50 480 1.880 210 180 15.590. 12,17 17,93 15,93 35,13 14,43 20,27 17,96 14,91 19,66 26,25 25,21 29,90 8,31 21,13 14,43 17,64 20,47 23,91 15,47 15,80 14,63 14,55 21,29 14,97 8,53 19,50 28,06 15,33. 28 101 42 287 389 242 83 96 192 322 87 61 391 271 126 261 293 117 510 102 306 53 15 166 777 70 60 5.448. *Dados estimados para 2012; **Dados estimados para 2014 Fonte: Adaptado de Atlas On-Line de Mortalidade (https://mortalidade.inca.gov.br/MortalidadeWeb), acesso em: 21 de janeiro de 2017; FERLAY et al., 2015; INCA, 2014..

(25) 23 1.3. BIOLOGIA MOLECULAR DO HPV Os genomas dos HPVs apresentam tamanhos entre 7,0 e 8,0 kb, apresentando-. se na forma de fita dupla de DNA circular e associado a proteínas semelhantes a histonas, podendo ser dividido funcionalmente em três segmentos principais: região regulatória não codificante, região dos genes precoces e região dos genes tardios. O primeiro segmento corresponde a uma longa região regulatória não-codificante, designada LCR (long control region) ou URR (upstream regulatory region), compreendendo cerca de 10% do genoma e englobando múltiplas sequências regulatórias necessárias para o controle de vários processos envolvidos em eventos de replicação e transcrição, incluindo as regiões promotoras (DE VILLIERS, 1989; ZHENG & BAKER, 2006). A ativação do promotor precoce é dependente da diferenciação da célula hospedeira, enquanto a ativação do segundo promotor (tardio) depende de dois sinais de poliadenilação definidos por genes virais, regulados de forma coordenada durante a diferenciação celular (BODILY & LAIMINS, 2011). O segundo segmento corresponde à região de genes precoces (E, early genes), que contém seis quadros de leitura abertos (ORFs) expressos nos queratinócitos basais indiferenciados, os quais codificam proteínas não-estruturais necessárias para a replicação do genoma viral e desempenham importante papel na oncogênese, participando de uma gama de mecanismos de modificação do ambiente celular (DOORBAR et al., 2012). A Figura 4 apresenta o modelo genérico da organização do genoma do HPV..

(26) 24 Figura 4 – Representação esquemática da organização genérica do genoma dos Alfapapilomavírus. O posicionamento, o tamanho e a presença de alguns genes podem variar de acordo com o gênero. Os quadros em verde e vermelho representam a região dos genes precoces (E), enquanto aqueles em amarelo representam a região dos genes tardios (L). Região regulatória (LCR) em destaque, exibindo os principais motivos de ligação de proteínas. P97: promotor precoce no HPV16. P670: promotor tardio no HPV16. PAE: sítio de poliadenilação precoce. PAL: sítio de poliadenilação tardia. Fonte: Adaptado de DOORBAR, 2006..

(27) 25 1.3.1. Genes precoces (E) Os genes E1 e E2 são essenciais para a replicação viral, gerando proteínas. que reconhecem e ligam-se à sua origem de replicação e regulam a transcrição dos demais genes do vírus por meio da ligação a múltiplos sítios específicos na região regulatória LCR. A proteína E1 combina-se com a proteína E2, e o complexo interage especificamente com a origem de replicação viral, região rica em A/T localizada na LCR, que contém os sítios de ligação para ambas as proteínas. A abertura da dupla fita de DNA viral ocorre após a formação de hexâmetros de E1, por meio de sua atividade ATPase-helicase (FERNANDES; ARAÚJO & FERNANDES, 2013; WILSON et al., 2002). Apesar da replicação viral ser quase que totalmente dependente da maquinaria celular, e de a síntese de DNA celular só ocorrer em células mitoticamente ativas, a proteína E2 é capaz de suportar a amplificação do genoma viral de forma a garantir que esta possa iniciar mesmo em células que não estão em divisão ativa, permitindo que a replicação viral ocorra de forma independente da replicação do DNA celular (BLAKAJ et al., 2009; DOORBAR, 2006; STANLEY, 2012). A proteína E2 atua como o principal regulador da transcrição e da replicação dos papilomavírus, tendo importante papel na regulação da expressão dos oncogenes virais E6 e E7. A perda de função do gene E2 é comumente relatada após a integração do genoma viral ao DNA da célula hospedeira, contribuindo para a progressão das lesões precursoras causadas pelos HPVs de alto risco para a forma maligna, em virtude da superexpressão das oncoproteínas E6 e E7 (FERNANDES; ARAÚJO & FERNANDES et al., 2013). A proteína E4 é associada a um importante papel relacionado à interferência na progressão do ciclo celular e na alteração do citoesqueleto de células infectadas nas camadas mais superiores do epitélio (DOORBAR et al., 1991). A proteína é capaz de se associar a filamentos de citoqueratina e reorganizar o citoesqueleto celular (DOORBAR et al., 1991; ROBERTS et al., 1993). Muitos HPVs cutâneos formam papilomas caracterizados histologicamente pela presença de grânulos de inclusão citoplasmáticos formados predominantemente por E4, descritos como sendo os principais causadores das alterações nas células das camadas epiteliais basal e intermediária (DOORBAR et al., 1996; EGAWA et al., 1993; GROSS et al., 1982; LAURENT et al., 1982). Além disso, diversos estudos mostram que a expressão de E4 em cultura de células infectadas com HPV16 e 18 causa uma série de efeitos, tais como a parada drástica do ciclo celular em.

(28) 26 G2 com provável sequestro de ciclina B/Cdk1 no citoplasma, interação com quinases e com a proteína E2 (DAVY et al., 2002, 2005, 2009; DOORBAR, 2013; MCINTOSH et al., 2010; NAKAHARA et al., 2002; WANG et al., 2009). Essa proteína também tem importante papel na amplificação do número de cópias do genoma viral e regula a expressão dos genes tardios, controlando a maturação viral e facilitando a liberação dos vírions (FERNANDES; ARAÚJO & FERNANDES et al., 2013). E5 é uma pequena oncoproteína variável em comprimento e na sequência primária de aminoácidos, mas mantém sua natureza hidrofóbica, sendo capaz de promover a fusão entre células e de interagir com os receptores dos fatores de crescimento epidérmico (EGFR) e derivado de plaquetas (PDGFR), atuando de forma a promover a proliferação celular e interferir em vias de transdução de sinais (CRUSIUS, AUVINEN & ALONSO, 1997; HWANG, NOTTOLI & DIMAIO, 1995; MOODY & LAIMINS, 2010). Apesar de nem todos os HPVs a expressarem, sua elevada hidrofobicidade e localização na membrana citoplasmática a caracterizam como necessária e suficiente para a indução da fusão célula-célula, causa comum de aneuplodias e instabilidade genômica (HU et al., 2009), eventos que parecem preceder e favorecer a integração do genoma viral ao da célula hospedeira. Dessa maneira, a expressão de transcritos de fusão viral-celular aumenta a expressão dos genes E6 e E7, favorecendo o crescimento de células transformadas (ZIEGERT et al., 2003). Corroborando a sua importância na oncogênese, estudos mostram que E5 pode ter coevoluído com os oncogenes E6 e E7 (BRAVO & ALONSO, 2004; SCHIFFMAN et al., 2005). Além disso, a deleção de E5 após a integração do genoma viral no genoma celular é relatada (CHANG et al., 2001; SAHAB et al., 2012; ZUR HAUSEN, 1996). A proteína E5 também parece estar relacionada à evasão da resposta imune, promovendo diminuição da expressão de proteínas de superfície envolvidas na apresentação de antígenos. Estudos têm mostrado que E5 é capaz de interagir com a cadeia pesada da molécula de MHC de classe I, impedindo seu transporte à superfície celular (ASHRAFI et al., 2005, 2006) e também é capaz de alterar o processo de maturação das moléculas de MHC de classe II, bloqueando o seu processamento e transporte até a superfície (ZHANG, Benyue et al., 2003). Outra função de E5 é a desregulação do ciclo celular, especialmente nos HPVs de alto risco oncogênico, importante etapa nos estágios iniciais do processo de transformação. Assim, sugere-se que a fusão celular induzida por E5 pode ser um evento crítico no estágio inicial do desenvolvimento de.

(29) 27 câncer invasivo induzido pelo vírus (GAO & ZHENG, 2010). As proteínas E6 e E7 são expressas em conjunto em células infectadas e transformadas, sendo consideradas oncoproteínas, pois são capazes de impedir os mecanismos de reparo do DNA, uma vez que promovem a degradação das proteínas celulares supressoras tumorais p53 e pRB, respectivamente (HUIBREGTSE, SCHEFFNER & HOWLEY, 1993; JONES et al., 1997). E6 é também capaz de degradar o repressor transcricional da telomerase, inibir a apoptose e interagir com proteínas da resposta imune inata. Ao degradar p53 e inibir a apoptose, E6 impede a parada do ciclo celular para que haja correção de danos no DNA, levando a instabilidade genômica e desregulação do processo de morte celular programada. Além disso, a ativação da telomerase contribui para a imortalização das células infectadas (FERNANDES; ARAÚJO & FERNANDES et al., 2013). A proteína E7 é capaz de fosforilar ou induzir a degradação proteossomal de pRB (MCLAUGHLIN-DRUBIN & MUNGER, 2009), interrompendo a sua interação com o fator de transcrição E2F, levando a expressão constitutiva de genes codificantes das ciclinas A e E, promovendo entrada na fase S do ciclo celular (ZERFASS-THOME et al., 1996; ZHANG, Benyue et al. 2006). Assim, nas células infectadas por HPVs de alto risco oncogênico, o checkpoint G1/S é perdido e a proliferação celular perde o controle. Ademais, E7 induz tolerância periférica em linfócitos T citotóxicos e regula negativamente a expressão do receptor TLR9, contribuindo para a evasão da resposta imune inata (FERNANDES; ARAÚJO & FERNANDES et al., 2013). 1.3.2. Genes tardios (L) O terceiro segmento funcional do genoma do HPV consiste na região de genes. tardios (L, late genes), correspondendo à região de codificação das proteínas do capsídeo L1 e L2, expressas apenas nas células das camadas mais diferenciadas do epitélio, nos quais ocorre a montagem do capsídeo viral e liberação das partículas infeciosas. O gene L1 contém aproximadamente 1200 nucleotídeos e codifica a proteína principal do capsídeo viral, altamente conservada entre diferentes tipos de HPV. A proteína é altamente imunogênica, induzindo a produção de anticorpos neutralizantes específicos que previnem a infecção (FERNANDES; ARAÚJO & FERNANDES et al., 2013). Além disso, apresenta uma peculiar capacidade de espontaneamente montar-se em partículas semelhantes ao vírus (VLPs) essencialmente indistinguíveis do vírion. Esta.

(30) 28 descoberta permitiu a obtenção de proteínas recombinantes na ausência de chaperonas (SCHILLER & LOWY, 2012) e, consequentemente, levou ao desenvolvimento das vacinas que oferecem proteção efetiva contra os principais HPVs causadores de câncer (D’ANDRILLI; BOVICELLI & GIORDANO, 2010; VILLA, 2007). L1 tem papel crucial na interação inicial do vírus com a célula hospedeira, atribuído a interações com moléculas de heparan sulfato ligadas a proteoglicanos ancorados na superfície celular e na matriz extracelular (GIROGLOU et al., 2001; JOYCE et al., 1999). Essa interação leva a uma mudança conformacional no capsídeo que expõe a porção N-terminal da proteína L2, a qual é clivada pela pró-convertase celular furina (RICHARDS et al., 2006). A clivagem de L2 permite a interação do capsídeo com um receptor de superfície no queratinócito ainda não bem caracterizado, reduzindo a afinidade da ligação ao heparan sulfato e permitindo a endocitose das partículas virais. L2 é a proteína secundária do capsídeo viral e está presente em número variável de cópias na superfície interna do capsídeo (BUCK et al., 2008), apresentando papéis complexos e multifuncionais, especialmente na montagem do vírion e nos estágios iniciais da infecção. KÄMPER et al. e BRONNIMANN et al. demonstraram que L2 apresenta regiões capazes de interagir e integrar-se a membranas celulares, sugerindo a sua atuação na facilitação da saída do DNA viral da vesícula endocítica. Além disso, FLORIN et al. sugeriram que L2 é capaz de interagir com a rede de proteínas do citoesqueleto e atuar na condução do DNA viral até o núcleo celular via ligação a proteínas motoras dineína. PYEON et al. mostraram que a entrada do complexo L2-genoma viral no núcleo celular envolve o rompimento do envelope nuclear associado à mitose. 1.4. ASPECTOS EVOLUTIVOS Acredita-se que a extensa diversificação e a expansão demográfica do HPV. aconteceram anteriormente à evolução do Homo sapiens, refletindo a dispersão da população de hominídeos naquele período (BERNARD, 1994). Paralelamente à introgressão de material genético, relações sexuais entre Neandertais e os ancestrais modernos do Homo sapiens parecem ter contribuído para a transmissão do vírus à espécie, especialmente de linhagens mais virulentas do HPV16 (PIMENOFF, OLIVEIRA & BRAVO, 2016). Embora a taxa de mutação no genoma viral seja atipicamente baixa, estimada entre 10-8 a 10-7 nucleotídeos por ano (RECTOR et al., 2007), a variabilidade nu-.

(31) 29 cleotídica intratipos pode ser atribuída a eventos randômicos de substituição ou inserções/deleções de nucleotídeos que se fixaram (HARARI, CHEN & BURK, 2014), hipótese reforçada pela falta de evidências da ocorrência de recombinações defendida por alguns trabalhos (CHEN et al., 2009; HO et al., 1993). Entretanto, outros trabalhos têm reportado a ocorrência de eventos de recombinação entre as regiões dos genes precoces e tardios em Alfa-papilomavírus clinicamente importantes (BRAVO & ALONSO, 2004; CARVAJAL-RODRIGUEZ, 2008; JIANG et al., 2009; NARECHANIA et al., 2005). Esta hipótese, por sua vez, é reforçada pelo fato da replicação dos papilomavírus requerer a atividade de recombinação homóloga, abrindo possibilidade para a ocorrência de raros eventos de recombinação não homóloga. Como consequência, as incongruências observadas em reconstruções filogenéticas baseadas nos genes precoces e tardios dos Alfa-papilomavírus seriam explicadas. Reconstruções baseadas em genes envolvidos em eventos de transformação celular e replicação viral (precoces) agrupam genótipos associados a infecções com manifestações clínicas similares, padrão não observado quando a reconstrução é baseada nos genes que codificam as proteínas estruturais (tardios) (BRAVO & ALONSO, 2004; NARECHANIA et al., 2005). Linhagens variantes de um mesmo genótipo comumente apresentam distintas origens geográficas e dinâmica evolutiva, levando a manifestações clínicas heterogêneas entre populações, em virtude de diferenças nas suas propriedades biológicas e, consequentemente, no risco oncogênico (CHAN et al., 1997; RECTOR et al., 2007; YAMADA et al., 1997). Características peculiares, tais como a transmissão por via sexual, a habilidade de evadir do sistema imune e o estrito controle da expressão gênica dependente da diferenciação do epitélio do hospedeiro, revelam uma forma de adaptação dos HPVs a nichos específicos, que os permitiu prosperar ao longo do tempo (HARARI, CHEN & BURK, 2014). A coevolução com os hospedeiros é historicamente considerada uma importante força que conduz a evolução desses vírus, mas não fornece evidências suficientes para reconciliar as suas histórias evolutivas com as dos seus hospedeiros (BERNARD, CHAN & DELIUS, 1994; GOTTSCHLING et al., 2011). De acordo com GOTTSCHLING et al., 2011, o cenário que parece melhor se encaixar à diversidade do HPV é uma série de eventos de duplicação basal seguidos por uma coevolução limitada. Dessa maneira, os papilomavírus ancestrais diversificaram-se enquanto colonizaram novos nichos nos mamíferos ancestrais que desenvolviam estruturas anexas ao epitélio (glândulas e.

(32) 30 pelos). BRAVO & FÉLÉZ-SÁNCHEZ, 2015 argumentam que a introdução do gene E5 nos papilomavírus ancestrais (BRAVO & ALONSO, 2004) desencadeou eventos que permitiram a diversificação do tropismo celular e a geração de linhagens com diferentes potenciais infectantes. Assim, a oncoproteína E6 teria evoluído posteriormente, com ganho de função para a interação com ubiquitina-ligases celulares e degradação de p53 (FU et al., 2010; MESPLÈDE et al., 2012), gerando o ancestral comum para os HPVs oncogênicos. A infecção simultânea por múltiplos genótipos não é necessariamente correlacionada a uma maior probabilidade de progressão maligna, embora existam evidências de que possa aumentar o risco de persistência. A maioria das infecções individuais derivam de um único genótipo (QUINT et al., 2012), tendo o seu potencial oncogênico principalmente relacionado a capacidade de E5 em promover a fusão entre células e facilitar a evasão do sistema imune do hospedeiro; de E6 em induzir a degradação de p53, inibir a apoptose e ativar a telomerase permanentemente; e de E7 em promover a desregulação do ciclo celular, junto a E6, e a inibição dos mecanismos de verificação da integridade genômica (BRAVO & ALONSO, 2004; MESPLÈDE et al., 2012). Casos de evolução intrahospedeiro também são relatados em infecções crônicas, apesar da baixa taxa evolutiva viral. Substituição de linhagem predominante em amostragens consecutivas tem sido sugerida em vários trabalhos como possíveis casos de evolução intrahospedeiro (GERAETS et al., 2013; KOCJAN et al., 2013; MAYRAND et al., 2000; STEINAU et al., 2010; XI et al., 2010). DILORENZO et al., 1992 e YUAN et al., 2012 relataram duplicações da região regulatória (LCR) em genomas virais isolados de lesões malignas em dois casos independentes de papilomatose respiratória, condição não detectada quando analisados genomas isolados de lesões benignas nos mesmos pacientes. A relativamente recente introdução de vacinas direcionadas à proteção contra grupos específicos de HPVs circulantes implica uma alteração dramática da dinâmica evolutiva viral. Apesar de parecer pouco provável a substituição de genótipos circulantes predominantes após a vacinação em massa, em virtude da forte resposta protetiva, da indução de proteção cruzada e da lenta taxa evolutiva do vírus (STANLEY, LOWY & FRAZER, 2006; TOTA et al., 2013), o principal risco parece ser a emergência de variantes recombinantes de alto risco oncogênico contendo a região tardia (proteínas estruturais) de vírus não cobertos pelas vacinas (BRAVO, DE SANJOSÉ &.

(33) 31 GOTTSCHLING, 2010). Portanto, uma compreensão mais profunda da dinâmica evolutiva dos HPVs ainda é necessária e é uma importante ferramenta para entender minuciosamente os mecanismos ligados à oncogênese e, consequentemente, para a concepção de novas abordagens diagnósticas e terapêuticas para esse problema de saúde pública mundial. 1.5. DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO A triagem do câncer cervical e a detecção do HPV atualmente são baseadas. no teste Papanicolaou e na detecção de ácidos nucleicos virais. O método de triagem mais comumente utilizado é a citologia líquida, na qual células epiteliais são coletadas por meio da esfoliação cervical e visualizadas ao microscópio óptico após coloração com o corante Papanicolaou. Devido ao longo curso da infecção até o desenvolvimento de lesões de alto grau e câncer, é possível obter um diagnóstico precoce e atribuir diferentes classificações de risco conforme as anormalidades celulares observadas nesse teste, apesar da sua baixa especificidade. Entretanto, no início da infecção as células podem não apresentar alterações morfológicas suficientemente distintas de células normais durante muito tempo, requerendo um acompanhamento regular para o diagnóstico eficaz. Considerando a baixa especificidade do teste citológico na triagem do câncer cervical, a detecção acurada do HPV só é possível por meio de técnicas de biologia molecular. Atualmente, a detecção molecular é o método padrão-ouro e há pelo menos 193 testes comerciais disponíveis no mercado (POLJAK et al., 2016), muitos deles clinicamente validados e aprovados para uso em mulheres com citologia anormal. Os métodos mais comumente empregados incluem os ensaios de hibridização, amplificação de sinal e amplificação de ácidos nucleicos. A Tabela 2 contém o resumo dos principais testes moleculares utilizados na detecção e genotipagem do HPV..

(34) Hibridização de sondas em reação isotérmica e amplificação de sinal fluorescente. Hibridização de sondas em reação isotérmica e amplificação de sinal fluorescente. PCR multiplex em tempo real seguida de hibridização com sondas. PCR seguida de hibridização em chip com sondas imobilizadas contendo fluoróforos. PCR multiplex em tempo real. PCR multiplex em tempo real. PCR multiplex em tempo real. Captura, amplificação mediada por transcrição e hibridização com sondas quimioluminescentes. Captura, amplificação mediada por transcrição e hibridização com sondas quimioluminescentes. PCR multiplex em tempo real e hibridização com sondas. Hibridização reversa. HotStart PCR, hibridização e captação de fluorescência. Cervista HPV HR. Cervista HPV16/18. Cobas HPV test. R PapilloCheck. Abbott real-time HR HPV. BD onclarity. HPV-Risk. Aptima HPV test. Aptima HPV16, 18/45 genotype. Linear Array HPV genotyping test. INNO-LiPA HPV genotyping Extra. HPV Genotyping LQ. Fonte: BURD, 2016.. Hibridização com sondas de RNA e amplificação de sinal quimioluminescente. Princípio. Digene Hybrid Capture 2. Teste. Semiautomatizado. Semiautomatizado. Automatizado. Automatizado. Automatizado. Semiautomatizado. Automatizado. Automatizado. Semiautomatizado. Automatizado. Semiautomatizado. Semiautomatizado. Semiautomatizado. Instrumentação. Gene L1; 18 genótipos de alto risco. Gene L1; 28 genótipos incluindo alto e baixo risco. Gene L1; 13 genótipos de alto risco e 24 de baixo risco. RNAm de E6 e E7; HPV16, 18 e 45. RNAm de E6 e E7; 14 genótipos de alto risco. Gene E7; 15 genótipos de alto risco. Genes E6 e E7; 14 genótipos de alto risco. Múltiplos genes; 14 genótipos de alto risco. Gene E1; 18 genótipos de alto risco e 6 de baixo risco. Gene L1; 14 genótipos de alto risco. Genes L1, E6 e E7; HPV16 e 18. Genes L1, E6 e E7; 14 genótipos de alto risco. Múltiplos genes; 13 genótipos de alto risco e 5 de baixo risco. Alvo molecular. Tabela 2 – Resumo dos principais testes moleculares utilizados na detecção do HPV. Sim. Sim. Sim. 16, 18 e 45. Não. 16 e 18. 16, 18, 31, 45, 51 e 52. 16 e 18. Sim. Não. 16 e 18. Não. Não. Permite tipagem?. 32.

(35) 33 1.5.1. Detecção molecular do HPV O teste de captura híbrida 2 (HC2), um método de detecção baseado em hibridi-. zação e amplificação de sinal, foi o único método disponível para detecção até 2009 (BURD, 2016) e ainda é um dos mais utilizados na rotina laboratorial. Nesse teste, o espécime cervical é tratado e misturado com múltiplas sondas de RNA específicas para 18 genótipos de alto risco, havendo hibridização com o DNA alvo, caso presente. Os híbridos DNA-RNA formados são capturados por anticorpos monoclonais específicos em poços de microplacas e então um segundo anticorpo, desta vez conjugado a fosfatase alcalina, é adicionado, ligando-se aos híbridos previamente capturados. A detecção só é feita com auxílio de um luminômetro, após a adição de um substrato quimioluminescente que emite luz ao ser desfosforilado pela fosfatase alcalina. A captação de luz em unidades superiores ao limiar de detecção indica a presença de HPV de alto risco, porém não distingue o genótipo presente. A sensibilidade de detecção do teste é de 0,2 a 1 pg/ml, equivalente a aproximadamente mil a cinco mil cópias do genoma viral (BURD, 2016). Além do elevado custo, o teste de captura híbrida apresenta limitações como a possibilidade de reatividade cruzada das sondas com outros genótipos de HPVs não oncogênicos, a ocorrência de resultados falso-negativos, a ausência de um controle interno e a impossibilidade de distinção de genótipos (CASTLE et al., 2008; KITCHENER et al., 2009; KURIAN et al., 2011; NARYSHKIN & AUSTIN, 2012). Um dos principais problemas dos métodos de detecção molecular que não envolvem amplificação de DNA é a sua relativamente baixa especificidade, que é influenciada pela carga viral. Por este motivo há uma maior recomendação que sejam utilizados métodos baseados em amplificação de ácidos nucleicos. Dentre esses métodos, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das metodologias mais utilizadas tanto para detecção quanto genotipagem. A maioria dos protocolos utiliza primers consenso direcionados ao gene que apresenta maior conservação entre os genótipos, L1. Os principais conjuntos de primers para detecção por PCR estão representados na Tabela 3..

(36) 34 Tabela 3 – Principais primers utilizados na detecção de HPV por PCR Primers MY09 MY11. Sequência 5’ - 3’ CGTCCMARRGGAWACTGATC GCMCAGGGWCATAAYAATGG. PGMY09-F PGMY09-G PGMY09-H PGMY09-I PGMY09-J PGMY09-K PGMY09-L PGMY09-M PGMY09-N PGMY09-Q PGMY09-P PGMY09-R PGMY11-A PGMY11-B PGMY11-C PGMY11-D PGMY11-E HMB01. Alvo Tm (◦ ). Referência. L1. 55◦ C. MANOS et al., 1989. CGTCCCAAAGGAAACTGATC CGACCTAAAGGAAACTGATC CGTCCAAAAGGAAACTGATC GCCAAGGGGAAACTGATC CGTCCCAAAGGATACTGATC CGTCCAAGGGGATACTGATC CGACCTAAAGGGAATTGATC CGACCTAGTGGAAATTGATC CGACCAAGGGGATATTGATC GCCCAACGGAAACTGATC CGACCCAAGGGAAACTGGTC CGTCCTAAAGGAAACTGGTC GCACAGGGACATAACAATGG GCGCAGGGCCACAATAATGG GCACAGGGACATAATAATGG GCCCAGGGCCACAACAATGG GCTCAGGGTTTAAACAATGG GCGACCCAATGCAAATTGGT. L1. 55◦ C. GRAVITT et al., 2000. GP5 GP6. TTTGTTACTGTGGTAGATAC GAAAAATAAACTGTAAATCA. L1. 40◦ C. VAN DEN BRULE et al., 1990. GP5+ GP6+. TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC. L1. 40◦ C. DE RODA HUSMAN et al., 1995. SPF1A SPF1B SPF1C SPF1D SPF2B-bio SPF2D-bio. GCICAGGGICACAATAATGG GCICAGGGICATAACAATGG GCICAGGGICATAATAATGG GCICAAGGICATAATAATGG GTIGTATCIACAACAGTAACAAA GTIGTATCIACTACAGTAACAAA. L1. 45◦ C. KLETER et al., 1998. FAP59 FAP64. TAACWGTIGGICAYCCWTATT GATGGIGAIATGDBWGATATWGG. L1. 50◦ C. FORSLUND et al., 1999. W = A/T; I = inosina; Y = C/T; D = A/G/T; B = G/C/T; M = A/C; R = A/G; bio = biotina. Fonte: Produção própria.. Um dos protocolos mais utilizados em estudos epidemiológicos é o dos primers genéricos GP5+/6+, que permite a detecção de vários HPVs de mucosa e a identificação do genótipo pode ser feita por meio de métodos como a hibridização com sondas tipo-específicas (DE RODA HUSMAN et al., 1995; VAN DEN BRULE et al., 1990, 2002). Os primers FAP (FORSLUND et al., 1999) têm sido bastante utilizados para a identificação de novos genótipos de HPV, devido à sua capacidade de amplificar uma grande variedade de vírus dos gêneros Alfa, Beta e Gama. Estudos recentes utilizando o protocolo de PCR FAP têm caracterizado vários prováveis novos genótipos utilizando.

(37) 35 variações dos primers e sequenciamento de nova geração (EKSTRÖM et al., 2013; LI et al., 2013). Apesar da grande gama de opções de primers consenso disponíveis, devese levar em consideração que boa parte dos que mais comumente são utilizados na detecção do vírus com finalidade clínica ou epidemiológica foram inicialmente desenvolvidos em épocas nas quais havia um número consideravelmente menor de HPVs caracterizados e com genoma completamente sequenciado. Ainda que tenham sido melhorados ao longo dos anos, muitos desses protocolos utilizam primers com sítios de bases degeneradas ou um pool de oligos, devido à relativa heterogeneidade na composição nucleotídica da região amplificada. Estas estratégias aumentam a probabilidade de resultados falso-negativos, uma vez que a utilização de um pool de primers e/ou de degenerações não garante um nível homogêneo de sensibilidade, já que a presença de mismatches entre os primers e a sequência-alvo pode levar a uma amplificação ineficiente (DEPUYDT et al., 2007). Outro problema observado é que nem todos os protocolos permitem a distinção de genótipo na própria reação de amplificação. A genotipagem do HPV é uma importante etapa do diagnóstico, pois permite a estratificação dos pacientes de acordo com o risco de desenvolvimento de lesões de alto grau e câncer, auxiliando o manejo clínico. Apesar da maioria dos casos de câncer cervical invasivo estar associada aos genótipos 16 e 18, uma substituição de genótipos prevalentes tem sido observada em populações submetidas a vacinação, que garante proteção contra ambos (DELERÉ et al., 2014; KAVANAGH et al., 2014; MARKOWITZ et al., 2013; MESHER et al., 2013; TABRIZI et al., 2014; SÖDERLUND-STRAND, UHNOO & DILLNER, 2014). Dessa maneira, se torna cada vez mais necessário o aprimoramento dos métodos de genotipagem para que haja a identificação rápida, simples e com uma maior cobertura de distinção dentre aqueles de importância clínica..

(38) 36 1.6. JUSTIFICATIVA O desenvolvimento deste trabalho se fundamenta nas premissas citadas an-. teriormente a respeito do diagnóstico molecular do HPV. Sendo a infecção por HPV notoriamente subnotificada e de lenta progressão, é fundamental dispor de métodos diagnósticos altamente eficazes que possam detectar a presença do agente o mais precocemente possível e ainda atribuir uma classificação de risco de progressão para lesões graves, de forma a auxiliar na condução do tratamento dos pacientes no sistema de saúde. O desenvolvimento de um novo sistema de primers para detecção e genotipagem proposto nesse trabalho se justifica também pela necessidade de métodos que sejam de fácil execução e manutenção no laboratório clínico, o que pode ocasionar uma redução de custos para o diagnóstico. A abordagem escolhida para o desenvolvimento do estudo incluiu a utilização de ferramentas de bioinformática para a busca de alvos moleculares, por meio da análise dos genomas dos HPVs de maior importância clínica. Com base nos dados obtidos in silico, foi possível planejar e desenvolver um novo sistema de detecção molecular baseado em PCR seminested, que possibilita a distinção entre os genótipos de alto e de baixo risco oncogênico mais prevalentes no mundo..

(39) 37 2 OBJETIVOS • Geral: Identificar alvos moleculares relacionados a variabilidade genética e ao potencial oncogênico nos genomas dos principais HPVs de importância clínica, e desenvolver um método de detecção molecular que permita a detecção e genotipagem dos mesmos.. • Específicos: – Analisar a variabilidade genética nos genomas dos HPVs de importância clínica; – Avaliar diferenças e semelhanças entre genótipos a partir do perfil de assinatura genética; – Determinar o perfil evolutivo nas sequências de DNA de cada gene viral; – Definir o melhor alvo molecular e desenhar primers específicos; – Desenvolver e validar in vitro um novo sistema que permita a detecção e a distinção entre os principais genótipos de alto e baixo risco a partir da reação de PCR..

(40) 38 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. OBTENÇÃO E COMPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS Sequências de genoma completo de todos os HPVs de importância clínica. foram obtidas no banco de dados específico Papillomavirus Episteme (PaVE) (VAN DOORSLAER et al., 2012; disponível em <https://pave.niaid.nih.gov/>) e alinhadas utilizando o software MUSCLE (EDGAR, 2004) com parâmetros padrão. Da mesma maneira, as sequências de nucleotídeos de cada gene dos referidos genótipos foram obtidas e alinhadas conforme descrito anteriormente. A visualização e edição dos alinhamentos foi realizada na interface Jalview v2.9 (WATERHOUSE et al., 2009). Como critério para a seleção dos genótipos de importância clínica, isto é, aqueles classificados nos grupos de alto e baixo risco oncogênico, foram levadas em consideração as classificações de risco oncogênico da Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC, 2007) e do banco de dados HPVdb (ZHANG, Guang et al., 2014; disponível em: <http://cvc.dfci.harvard.edu/hpv/HTML/classification.html>), totalizando 35 sequências. 3.2 3.2.1. ANÁLISES DE FILOGENIA MOLECULAR Análise de agrupamento e reconstruções filogenéticas A fim de analisar as diferenças e similaridades em nível de sequência nucle-. otídica entre os 35 genótipos de HPV de importância clínica, a abundância relativa de oligonucleotídeos foi comparada entre os respectivos genomas completos. Para isso, todos os genomas completos e genes individuais foram submetidos a contagem da frequência de uso de tri, tetra, penta e hexanucleotídeos, aplicando-se o método de sliding window (janela de 1 pb) por meio de um script in-house desenvolvido em linguagem de programação Python. Os resultados foram submetidos a uma análise de componentes principais (PCA) usando o software RStudio v1.1.383 por meio de um segundo script in-house, a fim de examinar estatisticamente as inter-relações entre os genótipos. Inferências filogenéticas foram realizadas por meio dos métodos Bayesiano e de máxima verossimilhança. A fim de padronizar as inferências, o gene E5 foi excluído de todas sequências, já que parte dos genótipos não o possui. Para as reconstruções,.