UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
JAMILLY LORÊNCIO PEREIRA
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES APEX1, POLΒ, RAC1 E NFKΒ EM PORTADORES DE ANEMIA FALCIFORME
FORTALEZA 2019
JAMILLY FLORÊNCIO PEREIRA
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES APEX1, POLΒ, RAC1 E NFKΒ EM PORTADORES DE ANEMIA FALCIFORME.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito para à obtenção do título de Mestre em Patologia. Área de concentração: Doenças onco-hematológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Romélia Pinheiro Gonçalves Lemes.
Co-orientadora: Profa. Dra. Juliana Cordeiro de Sousa.
FORTALEZA 2019
JAMILLY FLORÊNCIO PEREIRA
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES APEX1, POLΒ, RAC1 E NFKΒ EM PORTADORES DE ANEMIA FALCIFORME.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito para à obtenção do título de Mestre em Patologia. Área de concentração: Doenças Onco-hematológicas.
Aprovada em: ___/___/______
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Profa. Dra. Romélia Pinheiro Gonçalves Lemes (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Alcínia Braga de Lima Arruda
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. Howard Ribeiro Junior Lopes
Universidade da Integração Internacional da lusofonia Afro-Brasileira (UNILAB)
_________________________________________ Profa. Dra. Rosangela Pinheiro Gonçalves Machado
À Deus, por tudo que tenho e que sou. À minha família, que sempre foram meus incentivadores. Dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A minha família, minha mãe Edilania, a minha vó Maria do socorro, a minhas irmãs Juliette, Juliana, Joycilane e minha namorada Priscila Couto pelo apoio em todos momentos da realização desses sonhos.
A minha orientadora Romélia Pinheiro Gonçalves Lemes pela oportunidade pelos valiosos ensinamentos que certamente acrescentaram muito em minha jornada profissional.
A minha coorientadora Juliana Cordeiro de Sousa pelo apoio técnico em muitas etapas da execução dessa pesquisa.
Aos professores Dr. José Ajax Nogueira Queiroz, Prof. Dr. Howard Ribeiro Junior Lopes, Profa. Dra. Alcínia Braga de Lima Arruda e Profa. Dra. Rosangela Pinheiro Gonçalves Machado pelas valiosas colaborações e sugestões para a melhoria do meu trabalho.
Aos funcionários do HEMOCE e da UFC que sempre ajudaram na execução da pesquisa. Aos queridos amigos do laboratório de hematologia de hemoglobinopatias de doenças genéticas e hematológicas, Tarcísio Filho, Islara Rodrigues, Yasmine Delles, Pedro Aurio, Renata Eleutério, Luana Leticia, Laís Masullo, Marilia Laurentino, Joicelene, Talyta Ellen, Maritza Cavalvante, Anna Thawanny, Mariane, Juliene, Joicelene e Suzzy Dantas pela assistência cientifica, suporte emocional e bom humor no laboratório de pesquisa.
Aos queridos amigos do mestrado que caminharam comigo essa etapa gratificante da minha vida Leonardo Barbosa, Aline Maia, Patrícia Nunes, Priscila Nunes, John Washington, Gunter Gerson.
“Não venci todas as vezes que lutei, mas perdi todas as vezes
que deixei de lutar!” Cecilia Meireles
RESUMO
A anemia falciforme (AF) é uma doença hematológica hereditária caracterizada por uma mutação pontual no gene da beta globina, gerando uma hemoglobina anormal denominada de hemoglobina S (HbS), em homozigose (HbSS). O tratamento consiste no uso continuo da hidroxiuréia (HU), que aumenta a concentração da hemoglobina Fetal (HbF). Relatos da literatura apontam para um potencial efeito genotóxico da HU, podendo aumentar o risco da instabilidade gênica nesses pacientes. O gene APEX1 possuí diferentes funções, atuando no reparo do dano de fita simples no DNA principalmente induzida pela oxidação e na regulação do estresse oxidativo e de diversos fatores de transcrição via redox. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão dos genes APEX1, POLβ; NFκβ e RAC1, associando a dados laboratoriais, com o tratamento com a HU e com a gravidade da doença em pacientes com AF. Trata-se de um estudo transversal com 98 pacientes adultos com AF, em uso de HU e sem HU, em acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC) e um grupo controle composto por 28 indivíduos saudáveis (HbAA). Os dados epidemiológicos, hematológicos e bioquímicos foram obtidos da análise de prontuários. A expressão dos genes APEX1, POLβ; RAC1 e NFκβ foi realizada em sangue periférico, por Reação em Cadeia da Polimerase quantitativo em tempo real (qPCR), utilizando sondas TaqMan®. A análise estatística foi realizada utilizando o software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versão 21, com nível de significância de 5% (p<0,05). A idade média dos pacientes foi de 32 (18-32) anos, sendo 59 (60,2%) do sexo feminino e 39 (39,8%) masculino. A HU induziu macrocitose, redução no número de leucócitos e neutrófilos e nos parâmetros de hemólise. Verificou-se achados similares ao se estratificar os pacientes em relação a HbF. Ao analisar a expressão dos genes APEX1 POLB, RAC1 e NFKB quanto ao uso ou não da HUobservamos uma redução significativa da expressão de APEX1 e RAC1 em pacientes que não utilizavam a HU. Pacientes sem uso da HU apresentaram níveis mais baixos da expressão de RAC1 quando comparados a pacientes tratados com doses de 500mg/dia. Pacientes tratados com maiores doses de HU apresentaram níveis mais elevados de expressão do gene POLB. Pacientes com HbF < 15% apresentaram os maiores níveis de expressão do gene RAC1 e uma maior expressão do gene NFKB em Hb ≥25%. Observou-se que os genes POLB e RAC 1 (p<0,001, R= 0,1760) e NFKB e POLB (p<0,001 e R= 0,1730) se correlacionaram positivamente e moderadamente em pacientes com AF. Observou-se uma maior expressão dos genes APEX1 e POLB em pacientes com a forma mais graves da doença, o gene RAC1 foi mais expresso na forma leve e um aumento da expressão do gene NFKB, na forma intermediária da doença. Os resultados apontam que os portadores de AF apresentam anormalidade na expressão de genes relacionados ao reparo de excisão de base (BER) APEX1 e POLB, e genes relacionados ao estresse oxidativo e a inflamação como os genes RAC1 e NFKB. Em relação ao uso de HU, o fármaco possivelmente pode estar colaborando para o agravamento da instabilidade genômica na doença. No entanto, estudos mais aprofundados sobre a ação dos referidos genes são necessários para avaliar o seu papel na AF.
ABSTRACT Sickle cell anemia (SCA) is a hereditary hematological disease characterized by a point
mutation in the beta globin gene, generating an abnormal hemoglobin called hemoglobin S (HbS), homozygous (HbSS). Treatment consists of continuous use of hydroxyurea (HU), which increases the concentration of Fetal hemoglobin (HbF). Literature reports point to a potential genotoxic effect of UH, which may increase the risk of gene instability in these patients. The APEX1 gene has different functions, acting to repair DNA single strand damage mainly induced by oxidation and regulating oxidative stress and various redox transcription factors. In this context, the aim of the present study was to evaluate the expression of APEX1, POLβ; NFκβ and RAC1, associated with laboratory data, treatment with UH and disease severity in patients with AF. This is a cross-sectional study of 98 adult patients with PA, using HU and without HU, in outpatient follow-up at Walter Cantídio University Hospital (HUWC) and a control group of 28 healthy individuals (HbAA). Epidemiological, hematological and biochemical data were obtained from the analysis of medical records. APEX1, POLβ gene expression; RAC1 and NFκβ were performed in peripheral blood by quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) using TaqMan® probes. Statistical analysis was performed using the Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 21 software, with a significance level of 5% (p <0.05). The mean age of the patients was 32 (18-32) years, 59 (60.2%) females and 39 (39.8%) males. UH induced macrocytosis, reduction in leukocyte and neutrophil count and hemolysis parameters. Similar findings were found when stratifying patients in relation to HbF. By analyzing the expression of APEX1 POLB, RAC1 and NFKB genes regarding the use or not of HU, we observed a significant reduction of APEX1 and RAC1 expression in patients who did not use HU. Patients not using UH had lower levels of RAC1 expression when compared to patients treated with doses of 500mg / day. Patients treated with higher doses of HU had higher levels of POLB gene expression. Patients with HbF <15% had the highest levels of RAC1 gene expression and higher NFKB gene expression in Hb ≥25%. The POLB and RAC 1 (p <0.001, R = 0.1760) and NFKB and POLB (p <0.001 and R = 0.1730) genes correlated positively and moderately in patients with AF. A greater expression of APEX1 and POLB genes was observed in patients with the most severe form of the disease, the RAC1 gene was more expressed in mild form and an increase in NFKB gene expression in the intermediate form of the disease. The results show that AF patients have abnormalities in the expression of genes related to base excision repair (BER) APEX1 and POLB, and genes related to oxidative stress and inflammation such as RAC1 and NFKB genes. Regarding the use of UH, the drug may possibly be contributing to the worsening of genomic instability in the disease. However, further studies on the action of these genes are needed to assess their role in PA.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Alterações genéticas em Anemia Falciforme... 19
Figura 2 - Mapa dos números estimados de nascimentos com anemia falciforme... 20
Figura 3- Fisiopatologia da Anemia Falciforme... 21
Figura 4 - Manifestações clínicas na Anemia Falciforme... 22
Figura 5 - Múltiplos mecanismos de ação da hidroxiuréia na AF... 24
Figura 6 - Esquema de reparo da via curta de BER... 27
Figura 7 - Modelos moleculares da função redox de APE1-REF1 como coativador de vários fatores de transcrição... 28
Figura 8 - Diferença no número de leucócitos e neutrófilos entre pacientes com uso e sem uso de HU... 41
Figura 9 - Analise da concentração da HbF e HbS entre pacientes com uso e sem uso de HU... 41 Figura 10 - Expressão (mRNA) de APEX1 em pacientes com Anemia Falciforme de acordo com o uso de HU em relação aos controles... 44
Figura 11 - Expressão (mRNA) de RAC1 em pacientes com Anemia Falciforme de acordo com o uso de HU... 44
Figura 12 - Expressão (mRNA) de RAC1 de acordo com a dose de HU em pacientes com AF... 45
Figura 13- Expressão do gene POLB em pacientes com AF de acordo com a dose de HU... 46
Figura 14 - Expressão (mRNA) de RAC1 em pacientes com Anemia Falciforme de acordo com os níveis de HbF... 47
Figura 15 - Expressão (mRNA) do NFKB em pacientes com Anemia Falciforme de acordo com a concentração de HbF... 48
Figura 16 - Analise de correlação entre os genes APEX1, POLB, NFKB e RAC1 em pacientes com Anemia Falciforme... 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sondas utilizadas na avaliação da expressão (mRNA) por qPCR... 35 Tabela 2 - Caracterização epidemiológica dos pacientes com Anemia Falciforme
(n=98) ... 37 Tabela 3 - Características dos dados laboratoriais dos pacientes com Anemia
Falciforme. (n = 98) ... 38 Tabela 4 - Características hematológico e bioquímico dos pacientes com Anemia
Falciforme tratados ou não com HU... 40 Tabela 5 - Parâmetros hematológicas e bioquímica dos pacientes com Anemia
Falciforme de acordo com as classes de
HbF... 42 Tabela 6 - Comparação da expressão (mRNA) de POLB e NFKB em pacientes com
Anemia Falciforme de acordo com o uso ou não de HU e com o grupo controle... 43 Tabela 7 - Analise de correlação dos genes APEX1, POLB, NFKB e RAC1 em pacientes
com Anemia Falciforme... 48 Tabela 8 - Expressão do mRNA de APEX1, POLB, RAC1e NFKB em pacientes com Anemia
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AF APE1 APEX1 BD BER BI BT CHCM C-Jun Cys65 DNA ERG1 EROs FAL FTs GAPDH GGT GTPase HBS HCM HEMOCE HIF-1α HR HUWC LDH MMR NADPH NER NFκβ NHEJ POLβ Anemia Falciforme Apurínico/Apiridiminico de Endonuclease
Apurínico/Apiridiminico de Endonuclease (Gene) Bilirrubina Direta
Reparo por Excisão de Base Bilirrubina Indireta
Bilirrubina Total
Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média Proteína c-Jun
Resíduos de Cisteínas 65 Ácido Desoxirribonucleico
Proteína de Resposta ao Crescimento Inicial 1 Espécies Relativas do Oxigênio
Fosfatase Alcalina Fatores Transcricionais
Gliceraldeido fosfati desideogenase Gama Glutamil Transferase
Guanosina Trifosfatase Hemoglobina S
Hemoglobina Corpuscular Média
Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará Fator Induzível de Hipóxia 1 Subunidade Alfa Recombinação Homóloga
Hospital Universitário Walter Cantídio HUWC Lactato Desidrogenase
Mismatch Repair (Reparo de Pareamentos Errados) Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Reparo por Excisão de Nucleotídeos Nuclear Fator Kappa B
Recombinação de Extremidade não Homológa DNA polimerase, beta
p53 qPCR RAC1
Proteína 53
Reação em cadeia da polimerase quantitativa Família Rac Pequeno GTPase 1
RAC2 RNA SOH SSB TGP TGO TRX VCM VEGF
Família Rac pequena GTPase 2 Ácido Ribonucléico
Ácido Sulfênico
Quebras de cadeia simples de DNA Transaminase Glutâmico Pirúvica Transaminase lutâmico-oxalacética Tiorredoxina
Volume Corpuscular Médio Fator de Crescimento Endotelial Vascular
XRCC1 Proteína 1 de complementação cruzada de reparo de raios X
NO Óxido Nítrico
VCAM-1 Molécula de Adesão Celular Vascular 1 ICAM- 4 Molécula de Adesão Intracelular 4
FT Fator de transcrição
ID Índice de dano
UV Ultravioleta
LACT Laboratório de análises clínicas e toxicológicas
LHGDH Laboratório de pesquisa em hemoglobinopatias e genética das doenças hematológicas
NHEJ União de extremidade não-homóloga HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
RPM Rotação por minuto
IMC Índice de massa corpórea AVC Acidente vascular cerebral
STA Síndrome torácica aguda
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido CFA Modelo Adjuvante Completo de Freund (CFA)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 18
1.1 Anemia Falciforme ... 18
1.2 Epidemiologia ... 19
1.3 Fisiopatologia... 20
1.4 Estresse oxidativo e a AF... 22
1.5 Hidroxiuréia... 23
1.6 Mecanismos de reparo de dano ao DNA ... 25
1.7 APEX1 e sua função na via do Reparo de excisão de base (BER)... 25
1.8 APEX1 e sua atividade pela via Redox... 26
2 OBJETIVOS ... 30 2.1 Objetivo geral ... 30 2.2 Objetivo específicos ... 30 3 CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 31 3.1 Aspectos éticos ... 31 3.2 Local do estudo ... 31 3.3 Casuística... 31 3.4 Seleção da amostra... 32
3.5 Coleta das amostras e dados... 32
3.6 Classificação da gravidade da AF... 32
3.7 Estratificação dos pacientes em relação à dosagem de HbF... 33
3.8 Expressão do gene APEX1; POLβ; RAC1e NFκβ em pacientes com AF e grupo controle... 33
3.8.1 Processo de lise dos leucócitos... 33
3.8.2 Extração de RNA total... 33
3.8.3 Avaliação da concentração e grau de pureza das amostras de RNA por espectrometria ... 34
3.8.4 Síntese de cDNA... 34
3.9 qPCR (PCR quantitativa em tempo real) ... 35 3.10 Análise Estatística ...
36 4 RESULTADOS...
37 4.1 Dados demográficos e laboratoriais...
4.2 Analise da expressão de mRNA de APEX1, POLB, RAC1 e NFKB em relação ao tratamento com hidroxiuréia (HU)...
43 4.2.1 Comparação da expressão dos genes relacionados ao uso ou não de HU e o
grupo controle... 43 4.2.2 4.2.2 Expressão (mRNA) de APEX1, POLB, RAC1 e NFKB em pacientes com
Anemia Falciforme de acordo com a dose de HU... 46 4.2.3 Expressão (mRNA) de APEX1, POLB, RAC1 e NFKB em pacientes com
Anemia Falciforme de acordo com os níveis de HbF... 46 4.2.4 Análise da expressão (mRNA) de APEX1, POLB, RAC1 e NFKB em pacientes
com Anemia Falciforme de acordo com a gravidade da doença...
49 5 DISCUSSÃO... 50 6 CONCLUSÃO... 55 REFERÊNCIAS ... 56 APÊNDICE A ... 63 ANEXO A ... 64
1 INTRODUÇÃO
1.1 Anemia Falciforme
A anemia falciforme (AF) é uma doença com uma complexa sintomatologia caracterizada por anemia e crises de dores agudas graves com hospitalizações frequentes, infecções, processos inflamatórios, limitando a expectativa de vida dos pacientes para 36 a 40 anos de idade (LOGGETTO et al., 1999; THEIN, 2017).
A AF é um da doença monogênica causada por um único ponto de mutação gerada por uma mudança de base, da adenina para a timina localizado na posição genômica −69-70-71-bp (uma posição correspondente ao 6º codon) do gene da cadeia βA (localização citogenética: 11p15.4; coordenadas genômica (GRCh38): 11:5,225,465-5,227,070) (RODWELL, 2000; L2014ONERGAN; CLINE; ABBONDANZO, 2001). A doença se caracteriza por uma herança autossômica recessiva, na qual os pacientes herdam uma cópia mutada do gene da globina de cada genitor. Os pais geralmente carregam um gene da β-globina tipo selvagem e um gene mutante que resulta em uma hemoβ-globina falciforme (ASHLEY-KOCH; YANG; OLNEY, 2000).
A diferença estrutural entre hemoglobina normal adulta e hemoglobina falciforme (HbS) é a substituição do ácido glutâmico por valina na cadeia de aminoácidos da β-globina (STUART; NAGEL; 2004). Resultante da alteração na mutação do DNA é a produção de uma hemoglobina anômola, a HbS. As consequências dessa substituição do aminoácido só se tornam aparentes quando o oxigênio se dissocia da hemoglobina. Em estado de hipóxia, a HbS desoxigenada altera a conformação de tal forma que a valina exposta adere a região hidrofóbica de uma molécula de hemoglobina vizinha. Isso leva ao empilhamento da hemoglobina em polímeros longos que deformam a membrana celular do eritrócito para uma forma rígida em forma de “foice”. As hemacias distorcidos retomam uma forma normal nos pulmões quando o oxigênio mais uma vez se liga à hemoglobina. Ao longo do tempo, no entanto, essas transições levam a distorções irreversíveis da membrana eritrocitária (FIGURA 1) (STUART; NAGEL, 2004;PIEL; STEINBERG; REES, 2017; KATO et al., 2018).
Figura 1 – Alterações genéticas em Anemia Falciforme.
Nota: A hemoglobina normal A (HbA) é formada por duas subunidades α-globina e dois subunidades de β-globina, Alelo da HbS, βS, é um alelo em que a uma substituição adenina-timina resulta na substituição do ácido glutâmico por valina na posição 6 na cadeia β-globina. A Anemia falciforme ocorre quando ambos os alelos hemoglobina subunidade β estão mutados pelo βS. Em baixas concentrações de oxigênio, as hemácias HbSS adquirem uma forma de “foice” sendo as principais responsáveis pela grande maioria das complicações clínicas da doença. Fonte: Adaptada de Kato et al., (2018).
1.2 Epidemiologia
O gene βs que é referente a uma mutação pontual, que dá origem a HbS, é amplamente distribuído em todo o mundo, sendo encontrado em torno do Mediterrâneo na Sicília, partes do sul da Itália, na Grécia, Turquia, Arábia Saudita, Irã, na Índia central e em grande parte da África (SERJEANT, 1997).
Na África sub-saariana foi estimado uma incidência de nascimentos com Anemia Falciforme (HbSS) de 230.000 casos em 2010, o que corresponde a 75% dos nascimentos com HbSS no mundo (PIEL et al., 2017). A figura 2 demonstra a estimativa de recém-nascido
Desoxigenada Oxigenada Normal HbA Hibrido Hb Polímero HbS HbA HbA HβS HβS HβS
com AF no mundo (KATO et al., 2018).
No Brasil a incidência de HbS oscila entre os estados, refletindo a heterogeneidade étnica da população. Em 2014, a ocorrência foi de 1 em 650 recém-nascidos no estado da Bahia, 1 em 1.300 no estado do Rio de Janeiro e 1 em 13.500 no estado de Santa Catarina (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Figura 2 – Mapa dos números estimados de nascimentos com Anemia Falciforme.
Nota: Números estimados de nascimentos com Anemia Falciforme por 100.000 nascimentos por país em 2015. Fonte: Adaptada de Kato et al., (2018).
1.3 Fisiopatologia
A HbS em homozigose polimeriza em baixar tensões de oxigênio, a molécula de HbS torna-se tensa e as globinas beta S ficam mais próximas, favorecendo o contato entre as regiões da desoxi-Hb, o que não é possível no estado oxigenado, essa proximidade forma os polímeros de HbS, com várias moléculas agregadas, que se precipitam no citoplasma, modificando assim a conformidade do eritrócito que deixa de ter a forma bicôncava e apresenta a forma de ‘’foice’’, que é mais rígida e perde a flexibilidade ao passar pelos pequenos capilares, aumentando assim a obstrução do vaso (vaso-oclusão) e os eventos de hemólise (STYPULKOWSKI; MANFREDINI, 2010; PIEL et al., 2017).
O processo de hemólise na AF acarreta disfunção endotelial, vasculopatia, hiper-coagulabilidade e ativa processos inflamatórios. O NO é produzido pelo endotélio e regula o tônus vasodilatador basal, inibe a ativação plaquetária e hemostática, inibe a expressão
transcricional de moléculas de adesão, como a VCAM-1, e dificulta a ligação entre as células, normalizando a função vascular. As células em ‘’foice’’ são muito frágeis e possuem uma meia vida reduzida em 75%, quando a membrana eritrocitária é rompida libera polímeros de Hb, polímeros esses que podem prejudicar os níveis de oxido nítrico (NO). A eliminação de NO favorece a adesão intercelular e a vaso-oclusão, além disso esse processo hemolítico também contribui no aumento de arginase que reduz a arginina, assim diminuindo ainda mais os níveis de NO. A liberação de reticulócitos que são muito ricos em moléculas de adesão, como VLA-4 (α4β1), CD36 e molécula de adesão intercelular ‐ 1 (ICAM ‐ 4). Os níveis diminuídos de NO favorecem na ativação plaquetária, plaquetas ativadas expressam e liberam E-selectina, ICAM-1, solúvel e P-selectina, este último leva a expressão do fator tecidual (TF). Moléculas como P ‐ selectina e E ‐ selectina beneficiam a adesão de leucócitos e a adesão leucocitária ‐ endotélio, contribuindo ainda mais para os processos vaso oclusivos na doença. (KATO et al., 2009; SUNDD; GLADWIN; NOVELLI, 2018; WILLIAMS; THOMAS; SWEE, 2018; PICCIN et al., 2019).
Figura 3 – Fisiopatologia da Anemia Falciforme.
Nota: Fisiopatologia, estímulos inflamatórios e interações celulares na AF. A polimerização da deoxi-HbS eventualmente leva a formação de eritrócitos em forma de “foice’’. As células falciformes desencadeiam a oclusão microvascular ao interagir com neutrófilos e plaquetas ativados e adesão ao endotélio vascular, levando a isquemia e hipóxia a restauração do fluxo pode causar lesão de reperfusão. Os eritrócitos deformados tem uma curta duração, liberando continuamente hemoglobina, e hemoglobina oxidada libera heme. A heme funciona
como um padrão molecular associado a danos que ativa as células endoteliais, macrófagos e neutrófilos e promove a formação de NETs (NETosis) via ligação TLR4. Legenda: HbS, hemoglobina S; NET, armadilha extracelular de neutrófilos; NO, óxido nítrico; RBC, glóbulos vermelhos; EROs, espécies reativas de oxigênio; SCA, anemia falciforme; sRBC, glóbulos vermelhos falciformes; VWF, fator von Willebrand. Fonte: THOMAS N. WILLIAMS, AND SWEE LAY THEIN, 2018.
As manifestações clinicas nesta doença são heterogêneas, apresentam diferentes níveis de complexidades, afetando diversos sistemas do corpo do paciente, podendo se manifestar de forma aguda ou crônicas como descrito por Pecker e Little, 2017 e Kato et al., 2018 (Figura 4).
Figura 4: Manifestações clínicas na Anemia Falciforme.
Nota: Principais complicações clínicas da Anemia Falciforme. Complicações agudas trazem ao indivíduo uma atenção médica imediata; a dor é a complicação aguda mais comum. Os indivíduos com complicações crônicas apresentam disfunções orgânicas que podem contribuir para a morte prematura. Complicações da gravidez incluem pré-eclâmpsia, restrição de crescimento intra-uterino, parto prematuro e mortalidade perinatal. Fonte: Adaptada de Kato et al., 2018.
1.4 Estresse oxidativo e a AF
As espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ter origem exógenas, através da luz ultravioleta (UV), UVA e UVB, radiação ionizante e agentes químicos. Sua origem também pode ser endógena através do metabolismo celular ou através de processos
patológicos como inflamações e aumento de estresse oxidativo. As EROs podem causar danos no DNA, nos lipídeos, nas proteínas e açucares, entretanto, os danos a nível de DNA são mais complexos, uma vez que, os danos nas outras macromoléculas podem ser degradados e removidos caso danificados, o que nem sempre ocorre com a molécula de DNA. (BERRA; MENCK, 2006).
A hemólise crônica, a ativação de células endoteliais vasculares e a vaso-oclusão são as principais características da doença, outro fator que pode agravar ainda mais na AF é a lesão de reperfusão de isquemia que é caracterizada pela interrupção intermitente do vaso, seguida da restauração do fluxo sanguíneo, este processo de reestabelecimento do fluxo sanguíneo está relacionado com a produção de espécies reativas (EROS), evento que contribui para o aumento do estresse oxidativo na doença (WOOD; GRANGER., 2007; ALAYASH, 2018).
1.5 Hidroxiuréia
A hidroxiuréia (HU) é o único medicamento aprovado pelo Food and Drug Administration para tratamento da AF. O principal benefício da HU é a elevação da concentração da hemoglobina fetal (HbF), com consequente redução da expressão de moléculas de adesão e mediadores inflamatórios, diminuindo assim os processos de vaso-oclusão (WILLIAMS; THEIN, 2018).
A HU inibi a enzima ribonucleoside difosfato redutase, enzima esta que converte ribonucleotídeos em desoxirribonucleotídeos (dNTPs), esgotando o pool de dNTP intracelular, a HU atua na fase S do ciclo celular parando a divisão celular, atuando como um mielosupressor, com ação citoredutora, citotóxico e anti-neoplásico. (KOÇ et al., 2004; HANFT et al., 2000; LIMA et al., 2003; WARE., 2010).
A HU está relacionada ao aumento da HbF nos eritrócitos, diminuição de processos de falcização, levando à melhora da clínica dos pacientes e a redução do número de hospitalizações, entretanto apesar dos seus benefícios, o seu mecanismo de ação ainda não foi totalmente elucidado. (FIGURA 5) (STUART; NAGEL, 2004; COKIC, 2007; WONG, 2014; DA GUARDA, 2016).
Figura 5 - Múltiplos mecanismos de ação da hidroxiuréia na AF.
Nota: Múltiplos mecanismos de ação por hidroxiuréia para SCA. (1) Indução de hemoglobina fetal através de guanilina solúvel ativação da ciclase e cinética eritroide alterada; (2) menor contagem de neutrófilos e reticulócitos da ribonucleotídeo redutase inibição e citotoxicidade da medula; (3) diminuição da adesividade e melhor reologia dos neutrófilos circulantes e reticulócitos; (4) hemólise reduzida através da melhoria da hidratação dos eritrócitos, macrocitose e redução da falcização intracelular;e (5) liberação de óxido nítrico (NO) com potencial vasodilatação local e melhora da resposta vascular. Fonte: Imagem de McGann & Ware (2015).
Embora apresente muitos benefícios para o paciente com AF, a HU também demonstra algumas desvantagens. Sakano et al. (2001) sugerem que este quimioterápico induz à oxidação de base do DNA, conferindo, desse modo, um potencial aumento da instabilidade genômica e assim provocando um risco aumentado de desenvolver neoplasias.
Estudo relata uma associação do uso prolongado da HU ao aumento do dano do DNA em pacientes com AF podendo levar a um risco aumentado para a malignidades hematológica nesses pacientes, principalmente para o surgimento de leucemias (BRUNSON et al., 2017).
A literatura tem demonstrado que, pacientes com AF tratados com HU apresentam maiores níveis de dano no DNA quando comparado com indivíduos saudáveis. Esse dano no DNA mostrou ser maior em pacientes que utilizavam doses elevadas e que tinham um maior tempo de utilização deste medicamento, indicando, desse modo, que a HU apresenta um potencial genotóxico (ROCHA et al., 2012).
Estudo publicado por nosso grupo de pesquisa tem demonstrando os possíveis efeitos deletérios da HU. Pedrosa et al., (2014), ao avaliar o índice de danos (ID) em neutrófilos isolados de pacientes com AF tratados ou não com HU, evidenciaram que o grupo
tratado com HU apresentou valores ID significativamente maiores quando comparado ao grupo controle e ao grupo de pacientes AF não tratados, demonstrando que o HU aumenta os riscos de dano ao DNA.
1.6 Mecanismos de reparo de dano ao DNA
As quebras de fitas duplas (“Double Strand Breaks” – DBS) são danos que rompem a dupla fita de DNA, tais danos são reparados por dois tipos de mecanismos de reparos diferentes. O primeiro deles conhecido como reparo por recombinação homologa (HR) obtém informações de cromossomos homólogos para reparar o DNA duplamente quebrado, o segundo mecanismo é o reparo por junções de extremidades não homologas (NHEJ) no qual o reparo é realizado pela união aleatória de qualquer extremidade do DNA (KHANNA; JACKSON, 2001).
Além dos reparos de danos de fita duplas, existem outros mecanismos de reparo que irão corrigir as quebras nas fitas simples no DNA (DSS) gerados pela exposição a agentes cancerígenos, tais como a luz ultravioleta, EROs e estresse oxidativo. Existem três tipos de reparos que requerem funções diferentes e irão corrigir as alterações ocasionadas aos nucleotídeos: reparo por excisão de nucleotídeos (NER), que consiste na retirada dos nucleotídeos danificados em blocos e adiciona novos nucleotídeo que serão alocados no ponto onde ocorreram o dano ao DNA (MARTEIJN et al., 2014). Reparo por excisão de bases (BER), que remove a base defeituosa por um processo de clivagem da ligação da base nitrogenada (desoxirribose), seguida pelo preenchimento da base correta por ação da DNA polimerase (KROKAN; BJORAS, 2013). E por fim, o reparo de incompatibilidade de DNA (MMR); que é responsável pela correção de erros realizados na replicação do DNA e na recombinação de genes que resultam em um mau pareamento dos nucleotídeos. É uma via biológica altamente conservada que desempenha um papel fundamental na manutenção da estabilidade genômica, reparando erros de correspondência de base-base e de inserção / deleção gerados durante a replicação e recombinação do DNA (GOU-MIN LI, 2008).
1.7 APEX1 e sua função na via do Reparo de excisão de base (BER)
As EROs são geradas pela célula no seu processo metabólico normal, porém a produção desses EROs não deve exceder a capacidade antioxidante celular, pois pode ocasionar o aumento do estresse oxidativo podendo comprometer a integridade do material genético, causando danos oxidativos, levando a um aumento do potencial de mutações
genômicas. O reparo por excisão de base (BER) é encarregado de realizar o reparo das lesões de DNA geradas pela oxidação e perda de base espontânea (WHITAKER et al., 2017).
O BER é o mecanismo mais utilizado para corrigir danos de fita simples do DNA ocasionados principalmente por EROs gerados pelo processo de estresse oxidativo. A via do BER, é um mecanismo de reparo coordenado por um grupo de enzimas. Uma glicosilase de DNA é capaz de realizar a excisão de uma base modificada específica resultando em um sitio abásico. A enzima apurínico/apirimidínico endonuclease (APE1) reconhece este sítio e cliva a ligação 5'-fosfodiéster, gerando as extremidades 3′OH e 5'dRP. A DNA polimerase β (polβ) reconhece as extremidades modificas pela APE1 e inicia a correção da falha com a inserção de nucleotídeos no local abásico. Finalmente, são recrutados para relizar a ligação dos nucleotídeos as enzimas DNA ligases I e III e XRCC1 (FIGURA 6) (HEGDE et al., 2008; TELL et al., 2009; NICKSON.; PARSON, 2014; DI MASI, 2017).
Um dos genes envolvidos no reparo de fita simples é o gene APEX1, que codifica a proteína APE1. O APEX1 possui funções distintas atuando no reparo de danos de fita simples do DNA e na via redox. Sua função redox está associada a regulação de fatores de transcrição, podendo ter ação direta na transcrição de muitos genes, tais como o NF-kβ, ERG1, Tp53, HIF-1α. Por esta via redox, este gene pode atuar inibindo a GTPase RAC1, diminuindo a produção de espécies reativas de oxigênio e o estresse oxidativo (DEMPLE et al., 1994; MICHITAKA et al., 2002; BHAKAT et al. 2009; LI et al., 2014).
1.8 APEX1 e sua atividade pela via Redox
O APEX1 é um gene que codifica a proteína APE1/Ref-1, a qual possui função dupla, estando envolvida tanto nas vias de reparo BER de lesões de DNA, como também na função redox. A estrutura molecular da proteína APE1 determina sua função. A extremidade C-terminal está associada a função AP-endonuclease com ação no reparo do DNA e a extremidade N-terminal (Cys65) da proteína está associada à sua função redox. Essas distintas funções da APE1 são completamente independentes. Na via redox, que regula os fatores de transcrição (FTs), tais como: Egr-1, NF-kB, p53, AP-1, HIF-1α, STAT3. O aumento da expressão desta função redox da APE1 está relacionada a um aumento de crescimento celular, aumento da migração e da resistência a quimioterápicos, e assim, pode conferir um pior prognóstico do paciente com câncer (SHAH et al., 2017).
Nota: O reparo por excisão de base (BER) é iniciada por uma DNA Glicosilase especifica (OGG1) que reconhece e excita a base danificada para criar um sítio abásico, que é então incisado por APE1 que reconhece esses sítios abásicos e cria um DNA SSB flanqueado por extremidade 3′-hidroxil e 5′-dRP. Pol β cliva a porção 5′-dRP e simultaneamente adiciona um único nucleotídeo correto na lacuna. Finalmente as extremidades do DNA SSB são seladas pelo complexo XRCC1-lig IIIα que completam a correção da via BER. Fonte: Di Masi, (2017).
A via redox da APE1/Ref-1 regula a atividade de ligação desses FTs ao DNA. Para que a via redox seja efetivamente ativa acontece um processo de oxido redução, e juntamente com a Tioredoxina que é reduzida para Tiorredoxina redutase, auxilia assim na redução e ativação de fatores de transcrição, agindo principalmente no núcleo das células endoteliais humanas, fazendo com que esses FT se liguem a regiões gênicas especificas (FIGURA- 7) (TELL et al., 2009; LUKOSZ et al., 2010; THAKUR et al., 2014).
- Base de DNA danificada - Base de DNA recém inserida Glicosilase de DNA (OGG1)
APE1
Pol β
Pol β
XRCC1- ligIIIα Figura 6 – Esquema de reparo da via curta de BER
Figura 7 – Modelos moleculares da função redox de APE1-REF1 como coativador de vários fatores de transcrição.
Nota: Modelo molecular da função redox de APE1 como coativador de vários fatores de transcrição, converte fatores de transcrição (FT), de um estado oxidado inativo para um reduzido ativo, podendo assim se ligar a regiões regulatórias de genes alvos. A tiorredoxina (TRX) é responsável para completar o ciclo redox pelo qual a forma reduzida de APE1 é restaurada. Fonte: figura adaptada de Lukosz, et al, 2010.
Hye-mi Lee et al.,(2009) relataram que APE1 foi essencial para a ativação transcricional do fator induzido por hipóxia 1 (HIF-1α) e o fator nuclear kappa β (NF-κB), ambos cruciais na indução inflamatória em testes realizados em queratinócitos psoríaticos, agindo, assim, como um modulador da resposta inflamatória.
Ozaki et al., (2002) ao avaliarem a expressão de APE1 no fígado de camundongo in vivo e isolado de hepatócitos relataram que a APE1 pela sua via redox Ref-1 foi capaz de inibir a atividade GTPase Rac1 e diminuir o estresse oxidativo induzido pela re-oxigenação / re-perfusão, suprimindo a atividade da NFκβ e lesão tecidual oxidativa, atuando, assim, como uma proteção contra a lesão oxidativa.
Células mais expostas a EROs mostraram um aumento significativo na resistência à citotoxicidade, demonstrando que uma “resposta adaptativa” parece resultar do reparo aprimorado de lesões de DNA citotóxico devido a uma atividade aumentada de APE-1 (RAMANA et al., 1998).
O complexo NADPH oxidase consiste de um componente de membrana que compreende duas subunidades, gp91phox e p22phox, e vários componentes citosólicos incluindo p40phox, p47phox, p67phox e a pequena GTPase Rac (Rac1 ou Rac2). Evidências relatam que a NADPH oxidase tem como principal atividade a geração de EROs. Relatos também indicam que várias moléculas podem interagir com esse complexo NADPH oxidase e
Ativação mais fraca ou inativa do gene alvo
Ativação mais forte e ativa do gene alvo
o APEX1 tem sua participação na inibição da NADPH oxidase e redução de EROs (Gerco et al., 2016).
George et al. (2013) demonstraram que a produção de EROs em células falciformes é mediada enzimaticamente pela NADPH oxidase que é regulada pela RAC1 no interior do eritrócito falciforme. O grupo conclui que o processo fisiopatológico da AF, como a hemólise, a vaso-oclusão e o processo inflamatório crônico ocasionados pelos danos teciduais podem originar um ciclo de geração de EROs.
A AF apresenta um processo inflamatório crônico associado a um aumento na geração de EROs, hemólise, ativação endotelial, e possíveis danos oxidativos no DNA (ALAYASH, 2018). Destaca-se que estudos do nosso grupo demonstram um aumento no índice de dano (ID pela técnica do cometa) e instabilidade genômica, pelo micronúcleo em pacientes com AF em uso crônico com HU (MAIA FILHO et al., 2018). Porém um outro estudo do mesmo grupo avaliou a instabilidade genômica por citogenética em pacientes com AF com elevado ID no DNA e não detectou alterações cromossômicas (ROCHA et al., 2012).
Diante deste contexto, o presente estudo propôs-se a investigar a influência da expressão do gene APEX1 que possui funções distintas tanto no reparo de dano de fita simples do DNA, como função redox (regulação transcricional) e sua influência na regulação da expressão dos genes PolB, NFκβ e RAC1 em pacientes com AF, bem como avaliar se a terapia com a HU influencia na expressão dos genes acima e suas possíveis modulações nas manifestações clínicas da doença.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliara expressão dos genes APEX1, Polβ, NFκβ; e RAC1 em pacientes com AF.
2.2 Objetivos específicos
• Determinar o perfil da população em estudo quanto a idade, sexo, origem, peso, altura, IMC, Pressão sistólica e diastólica. Tempo de diagnostico, parâmetros hematológicos (hemácia, hemoglobina, hematócrito, VCM, HCM, CHCM, HbS, HbF, HbA2, reticulócitos) e bioquímicos (ureia, creatinina, LDH, Ácido úrico, BT, BD, BI, TGO, TGP, GGT, FAL, Ferro, Ferritina).
• Analisar os parâmetros hematológicos e bioquímicos em pacientes AF em relação ao uso ou não de HU.
• Avaliar os parâmetros hematológicos e bioquímicos dos pacientes com AF de acordo com os níveis de HbF.
• Analisar a expressão dos genes APEX1, POLB, NFΚβ e RAC1 em pacientes com Anemia Falciforme (HbSS) e em indivíduos saudáveis do grupo controle (HbAA) quanto ao uso ou não de HU e a dose do fármaco utilizada (15-25 mg/kg/dia).
• Associar a expressão dos genes APEX1; POLβ; RAC1 e NFΚβ em pacientes com AF, com os níveis de HbF.
• Avaliar a correlação entre os genes APEX1; POLβ; RAC1 e NFΚβ na AF.
• Associar a expressão dos genes APEX1; POLβ; RAC1 e NFΚβ com diferentes níveis de gravidade da doença.
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1 Aspectos éticos
O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará, sob o número de parecer; 3.089.093, e todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), após concordarem em participar do estudo.
3.2 Local do Estudo
A coleta das amostras de sangue periférico dos pacientes portadores de AF (HbSS) foi realizada no ambulatório de hematologia do Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC) e Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará (HEMOCE). A coleta das amostras dos indivíduos saudáveis para compor o grupo controle (HbAA) foi realizada no HEMOCE. O período das coletas foi de julho de 2018 até o mês de novembro de 2018.
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Hemoglobinopatias e Genética das Doenças Hematológicas (LPHGDH), do Curso de Farmácia da Universidade Federal do Ceará em parceria com o Laboratório de Análises Clinicas e Toxicológicas (LACT), onde foram realizados todos os testes moleculares.
3.3 Casuística
Trata-se de um estudo transversal analítico, no qual foram selecionados aleatoriamente pacientes portadores de AF no Ambulatório do HUWC. Participaram do estudo 98 pacientes com diagnóstico de AF acompanhados no Hospital Universitário Walter Cantídio. Essa amostragem corresponde a aproximadamente 83% dos pacientes com cadastro ativo na referida instituição.
Os pacientes com AF (n=98) foram estratificados quanto ao tratamento com HU: grupo HbSS (pacientes não tratados com HU, n= 30), pacientes com mais de doze meses sem utilizar o HU e grupo HbSSHU (pacientes tratados com HU nas doses de 15 a 25 mg/kg/dia, n=68).
Um grupo controle (HbAA) (n=28) foi formado por indivíduos doadores voluntários de sangue do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará (HEMOCE), de
ambos os sexos.
3.4 Seleção da amostra
Critérios de inclusão
• Grupo AF: Pacientes adultos com diagnóstico de anemia falciforme confirmado por cromatografia líquida de alta eficiência (High performance liquid chromatography - HPLC) em uso ou não de HU que aceitaram e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE);
• Grupo controle; indivíduos doadores voluntários de sangue do Centro de
Hematologia e Hemoterapia do Ceará (HEMOCE), de ambos os sexos que aceitaram
participar e assinaram o termo do TCLE.
Critérios de exclusão
• Pacientes com outras hemoglobinopatias após a análise do prontuário; • Pacientes que realizaram transfusões há menos de 90 dias no dia da coleta; • Pacientes em período gestacional.
3.5 Coleta das amostras e dados
Todas as amostras de sangue periférico foram coletadas em tubos Vacutainer® contendo EDTA para a obtenção do pool de células para a extração do material genético e expressão dos genes APEX1; POLβ; RAC1 e NFκβ em pacientes portadores de Anemia Falciforme e do grupo controle. Posteriormente, foi realizada a avaliação dos prontuários para traçar as características epidemiológicos, hematológicos e bioquímicos foram obtidas em prontuários de pacientes com AF no mesmo período da coleta de sangue periférico.
3.6 Classificação da gravidade da AF
Nós usamos a ferramenta "Calculadora da Gravidade da Doença Falciforme", disponível em http://www.bu.edu/sicklecell/downloads/Projects, para o cálculo dos escores de gravidade e classificação dos pacientes em categorias por fenótipo (leve, intermediária, grave). Esta ferramenta foi desenvolvida por meio de modelagem de rede Bayesiana usando 25 variáveis clínicas e laboratoriais para estimar a gravidade da doença falciforme em um estudo
que acompanhou 3.380 pacientes. O modelo de rede calcula o risco de morte dentro de cinco anos e considera este risco como um escore de gravidade da doença, que varia de 0 (menos grave) a 1 (mais grave). O valor preditivo é feito com base em um perfil clínico e laboratorial do modelo foi validado em dois conjuntos independentes de pacientes e mostrou alta especificidade e sensibilidade (SEBASTIANI et al., 2007). Os escores de gravidade calculados para este estudo incluiu as variáveis exigidas pela calculadora: idade, síndrome torácica aguda (STA), níveis de bilirrubina total, transfusão de sangue, níveis de lactato desidrogenase (LDH), volume corpuscular médio (VCM), crises de dor, priapismo, reticulócitos absoluto, gênero, acidente vascular encefálico (AVE), leucócitos totais, genótipo da doença falciforme e necrose avascular óssea.
3.7 Estratificação dos pacientes em relação à dosagem de HbF
Nós estratificamos os pacientes com AF de acordo com os níveis de HbF que foi categorizado em 3 grupos ≤ 15%, 15-25% e ≥ 25%, a concentração de HbF foi estimada a partir da HPLC, esta informação foi retirada previamente dos prontuários dos pacientes, utilizamos o mesmo modelo de categorização de HbF empregado por Jit et al., 2019.
3.8 Expressão do gene APEX1; POLβ; RAC1e NFκβ em pacientes com AF e grupo controle.
3.8.1 Processo de lise dos leucócitos
Foi realizada a centrifugação das amostras em tubos de EDTA a 4000rpm durante 10 minutos para resgatar o pellet leucocitário e transferi-lo para um tubo do tipo Falcon de 50 mL o qual foi lavado com solução de lise (25mL de solução de cloreto de amônio 0,144M e bicarbonato de amônio 0,01 M), homogeneizado lentamente, deixado em banho de gelo por 15 minutos e centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos a 4º C. Em seguida foi despreza a fase aquosa e acrescenta 250μL de PBS e 750μL de Trizol LS Reagent® (Invitrogen, EUA), posteriormente o material foi homogeneizando com pipeta até total dissolução. Após este procedimento, essa amostra lisada foi devidamente armazenada no freezer a –80°C para posterior extração do RNA total.
3.8.2 Extração de RNA total
A) Fase de separação do RNA:
O RNA extraído de leucócitos do sangue periférico dos pacientes com AF e dos indevíduos do grupo controle a partir da utilização do Trizol LS Reagente®, foi realizada de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Para cada amostra coletada e armazenada em 1mL de Trizol Reagente® foi adicionado 200µL de Clorofórmio para desproteinização e 10µL de glicogênio, as amostras foram vortexadas e, em seguida, centrifugadas a 14.000rpm por 15 minutos a 4º C e retirada do sobrenadante de cada amostra evitando a interfase.
B) Fase de precipitação do RNA:
O material restante foi transferindo para novos tubos, seguidos de precipitação com 400µL de isopropanol, homogeneizouse e incubouse por 60 minutos ou overnight a -20°C.
C) Fase de lavagens:
Passado o período da precipitação realizou-se outra centrifugação a 14.000rpm por 30 minutos a 4°C e o sobrenadante foi descartado por inversão cuidadosamente. O pellet formado foi ressuspenso em etanol 70% (v/v) e novamente centrifugado por 10 minutos.
D) Dissolução do RNA
Desprezou-se novamente o sobrenadante por inversão e preservando o precipitado deixou-se secar o tubo (invertido) durante 10 a 15 minutos, após totalmente seco, o pellet foi diluído com 17 µL de água livre de RNAse.
3.8.3 Avaliação da concentração e grau de pureza das amostras de RNA por espectrometria
Realizamos leituras no espectrofotômetro NanoDrop ND-100 para determinar a concentração e a qualidade do RNA total. Para determinar a pureza das amostras utilizamos razão de ondas de 260 e 280 nm, onde consideramos as amostras com a melhor qualidade de ácidos nucleicos aquelas que apresentaram um padrão de razão A260/A280 entre 1.8 e 2.0.
3.8.4 Síntese de cDNA
Para a obtenção do DNA complementar (cDNA), foi utilizada 2000ng de cada amostra, para realizar a síntese do cDNA utilizamos o Kit para Transcrição Reversa da Applied Biosystems® (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems®), de acordo com as recomendações do fabricante. O cDNA foi diluído cinco vezes para a ser utilizado nas reações de qPCR e armazenado a -20°C.
3.9 qPCR (PCR quantitativa em tempo real)
Para as realizações das reações foi utilizado o aparelho 7500 Fast Real-Time PCR System® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) onde quantificamos a expressão genica dos 6 genes (APEX1; POLβ; RAC1e NFκβ) e do gene endógeno (GPDH) de acordo com a tabela1, em placas transparentes de 96 poços (MicroAmp 96-well Plates, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA). As reações de PCR em tempo real foram realizadas em duplicata utilizando sondas TaqMan assay® com marcação FAM-MGB pela Applied Biosystems. O volume final de cada reação foi de 10μl, sendo 7μl de TaqMan Universal, 0,5μl de primer (TaqMan Assay) e 2,5μl de cDNA. As condições de termociclagem compreenderam uma incubação a 50ºC por 2 minutos, 95ºC por 10 minutos (para ativação da DNA polimerase), seguidos por 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos (desnaturação) e 60ºC por 1 minuto (anelamento e extensão simultâneos).
Tabela 1 – Sondas utilizadas na avaliação da expressão (mRNA) por qPCR
GENES ESTUDADOS CÓDIGOS DE REFERÊNCIA (applied Biosystems)
Gene Normalizador
GAPDH (Gliceraldeido fosfati desideogenase)
Hs02786624gl Genes de Estudo
APEX1 (Apurinérgica / Apirimidinica 1Enduroxirribonuclease)
HS00172396_ml
POLβ (Polymerase beta)
Hs01099715_m1
NF-KB (RELA) (factor nuclear kappa B)
Hs00968440_m1
RAC1 (Família Rac Pequeno GTPase 1) Hs00251654_ml
3.10 Análise Estatística
As expressões de mRNA dos genes APEX1, PolB, RAC1 e NFκβ foram expressas como média e amplitude (máxima e mínima), a fim de determinar a possível associação entre expressões gênicas relativas e as variáveis. Cada amostra foi realizada em duplicata e a expressão as razões foram calculadas usando o método 2-ΔCq. A normalidade foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. Outliers foram removidos. O teste t de Student ou a análise unidirecional da variância com o teste post hoc de Tukey / Games-Howell foram usados para analisar as associações entre a expressão gênica e as variáveis. A homogeneidade das variâncias para todas as variáveis foi testada pelo teste de Levene. Para todas as análises, considerou-se p <0,05 para significância estatística. A análise estatística foi desenvolvida usando o software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) v.21.
4 RESULTADOS
4.1 Dados demográficos e laboratoriais
A população estudada foi constituída de 98 pacientes com AF, com idade variando de 18 a 68 anos, com média de 32 anos, sendo 68 em uso de HU (HbSSHU) e 30 sem o HU (HbSS). Em relação ao sexo foram 59 (60,2%) do sexo feminino e 39 (39,8%) do sexo masculino. Quanto à origem 43 (45,2%) pacientes eram de Fortaleza e 55 (54,8%) do interior do estado, com média de peso de 56,26 kg (34,41- 87,80 kg), altura média de 1,59 (1,29-1,86), com IMC médio de 21,90 (16,71 – 33,7), pressão sistólica média de 110,76 mmHg (80 – 180) e pressão diastólica, média 67,89 mmHg (38 – 100). O tempo de diagnóstico dos pacientes foi de 24 (2-49) anos. As características demográficas e hematológicos dos pacientes com AF estão apresentados na Tabela 2.
O grupo HbAA foi constituído por 28 doadores voluntários de sangue, sem hemoglobinopatias.
Tabela 2 - Caracterização epidemiológica dos pacientes com Anemia Falciforme (n=98) Parâmetros demográficos e
laboratoriais
Número absoluto (%) ou média (Mínimo – Máximo) Variável Valores
Origem, N (%) Fortaleza 43 (45,2%)
Interior do estado 55 (54,8%)
Idade, média (anos) 32 (18-68)
Sexo N (%) Feminino 59 (60,2%)
Masculino 39 (39,8%)
Peso, média (kg) 56,26 (34,41 -87,80)
Altura, média (metros) 1,59 (1,29 – 1,86)
IMC, média 21,90 (16,71 – 33,7)
Pressão sistólica mmHg, média 110,76 (80 – 180)
Pressão diastólica mmHg, média 67,89 (38 – 100)
Tempo do diagnóstico (anos), média 24 (2-49)
Nota: Os valores acima apresentados foram como Número absoluto (%) ou média (Mínimo – Máximo).
A Tabela 3 descreve os padrões laboratoriais (hematológico e bioquímico) apresentados pelo grupo de pacientes com anemia falciforme.
Tabela 3 – Características dos dados laboratoriais dos pacientes com Anemia Falciforme. (n = 98)
Parâmetros laboratoriais Média (Mínimo – Máximo)
Hemácias (x106/mm³) 2,51(1,30-4,80) Hemoglobina (g/dL) 9,37 (5,80-14,90) Hematócrito (%) 27,11 (16,70-43,60) VCM (fL) 108,75 (11,70-155,78) HCM (pg) 38,54 (20,88-88,00) CHCM (g/dL) 35,14 (30,47-88,00) Leucócitos (/mm³) 9834,02 (4449,00-19760,00) Neutrófilos (/mm³) 5059,87 (1279,00-14442,00) Plaquetas (/mm³) 358589,13 (134600,00-659600,00) Reticulócitos(/mm³) 223356,82 (47980,00-479400,00) HbA2 (%) 2,80 (2,30-3,50) HbF (%) 13,24 (1,80- 34,60) HbS (%) 79,61 (22,40-93,30) Ureia (mg/dL) 19,77 (8,00-119,00) Creatinina (mg/dL) 0,66 (0,30-5,00) LDH (UI/L) 878,64 (375,00-1863,00) Ácido úrico (mg/dL) 4,79 (2,40-10,20) BT (mg/dL) 3,03 (0,68-13,57) BD (mg/dL) 0,49 (0,06-3,18) BI (mg/dL) 2,54 (0,55-12,80) TGO (U/L) 43,09 (17,00-114,00) TGP (U/L) 31,77 (10,00-251,00) FAL (mg/dL) 231,09 (60,00-505,00) GGT (U/L) 61,04 (13,00-344,00) Ferro Sérico (mg/dL) 117,54 (24,00-266,00) Ferritina (ng/dL) 467,38 (19,90-2768,00)
Nota: Os valores acima apresentados foram como média (Mínimo – Máximo) Legenda: Hidroxiuréia (HU);
Volume Corpuscular Médio (VCM); Hemoglobina Corpuscular Média (HCM); Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM), lactato desidrogenase(LDH), Bilirrubina Total (BT), Bilirrubina Direta (BD), Bilirrubina Indireta (BI) Transaminase glutâmico-oxalacética (TGO), Transaminase Glutâmico Pirúvica (TGP), Gama Glutamil Transferase (GGT), Fosfatase alcalina (FAL). Fonte: Elaborada pelo próprio autor.
A Tabela 4 está descrevendo os parâmetros hematológicos e bioquímicos dos pacientes com AF, em relação ao uso da HU. Foi observado um aumento significativo entre as variáveis VCM, HCM e dosagem de ferro sérico e uma redução significante nas contagens de
leucócitos, neutrófilos, HbS, LDH, BT e BD no grupo em uso contínuo de HU em relação ao grupo sem uso do fármaco. Nos demais parâmetros não houve diferença entre os grupos estratificados em relação ao uso do HU.
A figura 8 demonstra a diferença entre o número de leucócitos e neutrófilos entre pacientes com e sem o uso do HU, demonstrando uma ação citorredutora significante nos pacientes em uso da HU quando comparado ao grupo de pacientes que não fazem uso do fármaco.
A figura 9 demonstra as diferenças entre as concentrações de HbF e HbS entre pacientes com e sem o uso do HU, demonstrando uma redução na concentração de HbS significante nos pacientes em uso da HU quando comparado ao grupo de pacientes que não fazem uso do fármaco, entretanto não foi observada diferenças estatísticas nas concentrações de HbF entre o grupo estudado.
A tabela 5 descreve os parâmetros laboratoriais (hematológicos e bioquímicos) dos pacientes com AF, em relação ao percentual da concentração da HbF (<15%, 15-25% e >25%) (JIT et al., 2019). Observou-se um aumento significativo entre as variáveis do grupo com maiores níveis de HbF quanto ao VCM e HCM, este mesmo grupo apresentou uma redução dos leucócitos e neutrófilos em comparação aos outros grupos com níveis menores de HbF. Nos parâmetros bioquímicos foi observado redução de LDH, BT e BTI nos pacientes que apresentam maiores níveis de HbF em comparação ao grupo com níveis HbF < 15%. Nos demais parâmetros não houve diferença entre os grupos.
Tabela 4 – Características hematológico e bioquímico dos pacientes com Anemia Falciforme tratados ou não com HU.
Parâmetros demográficos e
laboratoriais
Média (%) ou mínimo – Máximo)
Valor de p HbSS (n=30) HbSSHU(n=68) Hemácias (106/mm³) 2,61 (1,40 – 3,80) 2,45 (1,30-4,80) 0,102 Hemoglobina (g/dL) 8,96 (5,8 – 12) 9,49 (5,80-14,90) 0,119 Hematócrito (%) 26,03(16,9 – 36) 27,44 (16,70-43,60) 0,118 VCM (fL) 100,92 (68,53 – 123,57) 112,40 (11,70-155,78) <0,001 HCM (pg) 34,81 (20,88 – 42,31) 39,35 (28,00-48,42) <0,001 CHCM (g/dL) 34,45 (30,47 – 37,40) 34,61 (31,08-39,20) 0,920 Leucócitos (/mm³) 11218 (5823 – 17040) 9261 (4449-19760) 0,012 Neutrófilos (/mm³) 5843 (2079 - 9554) 4742 (1279-14442) 0,017 Plaquetas (/mm³) 388892 (134600 – 641000) 347486 (145100-659600) 0,132 Hemoglobina A2 (%) 3,32(2,80-3,50) 3,18 (2,30-3,20) 0,617 Hemoglobina F (%) 12,38(1,80-29,00) 13,65 (2,70-34,60) 0,390 Hemoglobina S (%) 82,39(67,40-92,00) 78,36 (22,40-93,30) 0,023 Ureia (mg/dL) 18,35 (10- 55) 20,34 (8,00-119,00) 0,393 Creatinina (mg/dL) 0,57 (0.30 – 1.4) 0,69 (0,30-5,00) 0,495 LDH (UI/L) 1005,65 (509 – 1863) 827,05 (375,00-1668,00) 0,014 Ácido úrico (mg/dL) 5,25 (2.70 – 9.8) 4,67 (2,40-10,20) 0,174 BT (mg/dL) 4,05 (1.18 – 13.57) 2,63 (0,68-7,95) 0,054 BD (mg/dL) 0,61 (0,21 – 3.18) 0,44 (0,06-2,61) 0,007 BI (mg/dL) 3,44 (0,84 – 12,8) 2,18 (0,55-7,03) 0,070 TGO (U/L) 45,35 (18 – 88) 42,18 (17-114) 0,229 TGP (U/L) 37,27 (11 – 251) 29,57 (10,00-88,00) 0,843 FAL (mg/dL) 243,52 (60- 505) 226,16 (63,00-503,00) 0,397 GGT (U/L) 65,46 (19 – 299) 59,30 (13,00-344,00) 0,310 Ferro sérico (mg/dL) 99,67 (24- 174) 124,35 (43,00-266,00) 0,040 Ferritina (ng/dL) 450,49 (27,9 2768) 473,46 (19,90-2261,00) 0,207 Legenda: Hidroxiuréia (HU); Volume Corpuscular Médio (VCM); Hemoglobina Corpuscular Média (HCM); Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM), lactato desidrogenase(LDH), Bilirrubina Total (BT), Bilirrubina Direta (BD), Bilirrubina Indireta (BI), Transaminase glutâmico-oxalacética (TGO), Transaminase Glutâmico Pirúvica (TGP), Gama Glutamil Transferase (GGT), Fosfatase alcalina (FAL). Fonte: Elaborada pelo próprio autor.
Figura 8 - Analise do número de leucócitos e neutrófilos entre pacientes com uso e sem uso de Hu.
Nota: Representação gráfica dos números de leucócitos e neutrófilos entre pacientes com e sem uso da HU. Valores de p foram considerados significantes quando p<0,05, foi observada uma redução de leucócitos e neutrófilos no grupo HbSSHU em comparação com o grupo HbSS. Fonte: Elaborada pelo próprio autor.
Figura 9 - Analise da concentração da HbF e HbS entre pacientes com uso e sem uso de HU.
Nota: Representação gráfica da concentração de HbF e HbS entre pacientes com e sem uso da HU. Valores de p foram considerados significantes quando p<0,05, foi observada uma redução na contração de HbS no grupo HbSSHU em comparação com o grupo HbSS, não foi observada diferenças estatísticas entre as concentrações de HbF entre os grupos. Fonte: Elaborada pelo próprio autor.
H b S S H b S S H U 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 2 0 0 0 0 2 5 0 0 0 * N ú m e r o d e L e u c ó c i t o s ( m m 3 ) H b S S H b S S H U 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 2 0 0 0 0 * N u m é r o d e N e u t r ó f il o s ( m m 3 ) p = 0,3909 p = 0,0230*
Tabela 5 - Parâmetros hematológicos e bioquímicos dos pacientes com Anemia Falciforme de acordo com as concentrações de HbF.
Concentração de HbF
Média (Mínimo – Máximo) Valor
de p <15% 15-25% >25% Hemácias (106/mm³) 2,53 (1,30-4,80) 2,50 (1,40-3,80) 2,38 (1,90-3,20) 0,835 Hemoglobina (g/dL) 9,15 (5,80-14,90) 9,80 (5,80-12,20) 9,92 (9,20-12,00) 0,176 Hematócrito (%) 26,42 (16,70-43,60) 28,45 (17,30-36,00) 29,12 (24,70-35,60) 0,129 VCM (fL) 104,56 (11,70-134,62) 115,86 (94,74-134,74) 1 124,90 (100,00-155,78) 0,001* HCM (pg) 36,82 (20,88-46,92) 39,87 (30,00-47,14) 42,52 (35,38-48,42)) 0,002* CHCM (g/dL) 34,66 (30,47-39,20) 34,44(31,67-37,77) 34,22 (31,08-37,25) 0,708 Leucócitos (/mm³) 10565,76 (4581,00-19760,00) 8566,96 (4449,00-17860,00) 6668,40 (5823,00-7460,00) 0,004* Neutrófilos (/mm³) 5534,97(1738,00-14442,00) 4242,70 (1279,00-12859,00) 3216,40 (2575,00-4027,00) 0,019* Plaquetas (/mm³) 366572,88 (145100,00-641000,00) 339703,70 (134600,00-659600,00) 3216,40 (2575,00-4027,00) 0,569 Hemoglobina A2 (%) 3,41 (2,50-3,50) 3,10 (2,45-3,22) 2,34 (2,30-3,00) 0,081 Hemoglobina S (%) 82,47 (22,40-93,30) 76,07 (67,20-80,50) 65,34 (57,80-70,50) <0,001 Ureia (mg/dL) 18,60 (8,00-119,00) 20,85 (8,00-55,00) 29,20 (19,0-44,00) 0,214 Creatinina (mg/dL) 0,65 (,30-5,00) 0,65 (0,30-1,40) 0,85 (0,60-1,34) 0,726 LDH (UI/L) 936,09 (503,00-1863,00) 785,00 (375,00-1668,00) 671,80 (496,00-936,00) 0,044* Ácido úrico (mg/dL) 4,79 (2,40-10,20) 4,60 (2,90-8,30) 5,95 (4,50-7,20) 0,252 BT (mg/dL) 3,43 (0,99-13,57) 2,35 (0,80-4,71) 1,44 (0,68-2,33) 0,035* BD (mg/dL) 0,45 (0,06-1,38) 0,52 (0,16-2,61) 0,34 (0,13-0,61) 0,456 BI (mg/dL) 2,98 (0,80-12,80) 1,83 (0,57-3,71) 1,10 (0,55-2,01) 0,023* TGO (U/L) 45,74 (18,00-114,00) 38,52 (17,00-88,00) 29,40 (22,00-36,00) 0,059 TGP (U/L) 28,36 (11,00-63,00) 31,59 (10,00-88,00) 28,40 (14,00-59,00) 0,641 GGT (U/L) 52,81 (13,00-203,00) 70,26 (14,00-344,00) 97,60 (32,00-299,00) 0,130 FAL (mg/dL) 231,07 (63,00-505,00) 241,81 (111,00-503,00) 187,60 (60,00-293,00) 0,446 Ferro sérico (mg/dL) 112,04 (24,00-266,00) 124,59 (43,00-213,00) 147,00 (105,00-209,00) 0,209 Ferritina (ng/dL) 430,88 (19,90-2768,00) 496,84 (50,50-1122,00) 779,65 (696,60-930,00) 0,340
Nota: Os valores acima foram apresentados como média (mínima-máxima). Valores de p foram considerados significantes quando p<0,05.
Legenda: Hidroxiuréia (HU); Volume Corpuscular Médio (VCM); Hemoglobina Corpuscular Média (HCM); Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM), lactato desidrogenase(LDH), Bilirrubina Total (BT), Bilirrubina Direta (BD), Bilirrubina Indireta (BI), Transaminase glutâmico-oxalacética (TGO), Transaminase Glutâmico Pirúvica (TGP), Gama Glutamil Transferase (GGT), Fosfatase alcalina (FAL). Fonte: Elaborada pelo próprio autor.
4.2 Analise da expressão de mRNA de APEX1, POLB, RAC1 e NFKB em relação ao tratamento com hidroxiuréia (HU).
4.2.1 Comparação da expressão dos genes relacionados ao uso ou não de HU e o grupo controle.
A análise de expressão (mRNA) dos genes de reparo e redox foram de acordo
com a estratificação dos pacientes quanto ao uso (HbSSHU) ou não de HU (HbSS) e com o
grupo controle (HbAA). Nessa comparaçãoobservamos que os pacientes não tratados com HU (HbSS) possuem menor nível de expressão (mRNA) APEX1 quando comparado a indivíduos saudáveis (HbAA), e os pacientes tratados (HbSSHU), apresentando diferença estatística quanto a expressão entre o grupo de indivíduos saudáveis (p=0,035) (FIGURA10).
A tabela 6 descreve a análise de expressão (mRNA) dos genes POLB e NFKβ de
acordo com a estratificação dos pacientes quanto ao uso (HbSSHU), não uso de HU (HbSS) e
com o grupo controle (HbAA). Não observamos diferenças estatísticas entre todos os grupos quanto aos níveis de expressão dos genes em questão.
Tabela 6 - Comparação da expressão (mRNA) de POLB e NFKB em pacientes com Anemia Falciforme relacionado com o uso ou não de HU e com o grupo controle.
Nota: Representação dos níveis de expressão (mRNA) do APEX1 entre o grupo controle (HbAA) e os grupos de pacientes AF sem uso de HU (HbSS) e em uso de HU (HbSSHU), valores de p foram considerados significantes
quando p<0,05. Fonte: Elaborada pelo próprio autor.
HbSS (n=30) Média (mín-máx) HbSSHU (n=68) Média (mín-máx) HbAA (n=28) Média (máx – mín) p valor mRNA_POLB 241,13 (34,67-1290,40) 302,17 (32,53-1271,25) 261,57 (61,14-652,86) 0,311 mRNA_NFKβ 1269,97 (150,59-5852,52) 1219,00 (115,42-5486,07) 1559,48 (176,01-7251,08) 0,840
Figura 10 - Expressão (mRNA) de APEX1 em pacientes com Anemia Falciforme de acordo com o uso de HU em relação aos controles.
H b A A H b S S H b S S H U 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 * * * m RN A AP EX 1
Nota: Representação gráfica dos níveis de expressão (mRNA) do APEX1 entre o grupo controle (HbAA) e os grupos de pacientes AF sem uso de HU (HbSS) e em uso de HU (HbSSHU), valores de p foram considerados
significantes quando p<0,05(* p=0,035) (*p<0,05 Anova; **p<0,05 Pós teste – Turkey). Fonte: Elaborada pelo
próprio autor.
Em pacientes com AF que não faziam uso de HU a expressão (mRNA) de RAC1 também apresentou baixa expressão quando comparados aos indivíduos normais e quando comparado aos indivíduos que faziam uso de HU, apresentando diferença estatística entre todos os grupos (*, ** p<0.001) (Tabela 8, Figura 11).
Figura 11- Expressão (mRNA) de RAC1 em pacientes com Anemia Falciforme de acordo com o uso de HU.
Nota: Representação gráfica dos níveis de expressão (mRNA) de RAC1 entre o grupo controle (HbAA) e os grupos de pacientes AF sem uso de HU (HbSS) e em uso de HU (HbSSHU), valores de p foram considerados
significantes quando p<0,05 (*, ** p<0.001)( *p<0,05 Anova; **p<0,05 Pós teste – Turkey). Fonte: Elaborada pelo
