Desenvolvimento e caracterização térmica do peguilado de albumina humana

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA DO PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA. Rodrigo Albuquerque da Costa. Recife 2010.

(2) i. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA DO PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA. Dissertação submetida ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas na Área de Concentração: Produção e Controle de Qualidade de Medicamentos. Orientador: Prof. Dr. Rui Oliveira Macedo. Rodrigo Albuquerque da Costa. Recife 2010.

(3) Costa, Rodrigo Albuquerque da Desenvolvimento e caracterização térmica do peguilado de albumina humana / Rodrigo Albuquerque da Costa. – Recife: O Autor, 2010. 79folhas: il., fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.. Inclui bibliografia e anexos. 1. Peguilação. 2. Análise térmica. 3. Estabilidade. 4. Caracterização. 5. Albumina humana. I. Título.. 615.074 615.19. CDU (2.ed.) CDD (20.ed.). UFPE CCS2010-124.

(4) ii. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA DO PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA. BANCA EXAMINADORA:. Membros Internos Titulares Prof. Dr. Rui Oliveira Macêdo – UFPB Profª. Drª. Beate Saegesser Santos – UFPE. Membro Externo Titular Prof. Dr. Celso Amorim Camara – UFRPE. Membros Suplentes Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto – UFPE Prof. Dr. Fábio Santos Souza – UFPB.

(5) iii. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. REITOR Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins. VICE-REITOR Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva. PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado. DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro. VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros. CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Dalci José Brondani. VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Antonio Rodolfo de Faria. COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto. VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Profª. Drª. Beate Saegesser Santos.

(6) iv. DEDICATÓRIA.

(7) v. dedicatória. Aos meus pais Geraldo Xavier e Lourdes Albuquerque, ao meu Irmão Zé Ricardo e a minha inspiração Daniela Fernandes. A vocês, com muito amor..

(8) vi. AGRADECIMENTOS Aos meus pais Geraldo e Lourdes, pelo amor, carinho e dedicação depositados a mim no decorrer da minha existência, minha fonte de energia, de inspiração para tudo o que faço e pelo exemplo de vida e por terem me ensinado que as conquistas na vida só são alcançadas por meio de muita fé, luta e honestidade.. Ao meu irmão Zé Ricardo pelas injeções de ânimo, quando pareciam que as coisas não tinham mais jeito e por ser parte do que eu sou e junto com nossos pais configurarem meu porto seguro.. A todos os meus familiares e amigos agradeço a força e as vibrações positivas para o meu sucesso profissional, em especial aos tios José e Yzete partes integrantes e essenciais da minha vida educacional e moral. Ao primo Yardan pelo carisma e espelho de felicidade. Agradecimento especial aos tios Jayme, Clotilde, e Severina. Agradecimento especial aos mais novos e abençoados amigos Angélica, D. Luisa e Léa.. Ao orientador, Prof. Dr. Fábio de Souza, pela orientação competente e pela amizade demonstrada em cada ensinamento e conselho durante esta caminhada.. Ao meu amor, Daniela Fernandes Hermínio, luz da minha vida, pela cumplicidade, amor e carinho incondicionais. Alguém que admiro e amo simplesmente por ela ser quem ela é.. Aos meus colegas de laboratório que não mediram esforços em ajudar-me em especial a Valdilanio pelo apoio, ensino e incentivo.. À Universidade Federal de Pernambuco. À Universidade Federal Rural de Pernambuco. À Universidade Federal da Paraíba.

(9) vii A todos os professores do Mestrado, pelos ensinamentos.. Aos colegas de curso, companheiros e amigos, em especial ao amigo e colega de graduação Augusto Souto, presentes nos momentos alegres e difíceis. Aos amigos do L.T.F( muitas recordações alegres).. Ao meu orientador Rui Oliveira Macêdo, que além de brilhantemente conduzir o trabalho, sempre esteve à disposição em todos os momentos. Muito obrigado!. À família Fernandes Hermínio que, desde o primeiro momento, me deu todo o apoio, colaboração e carinho, me acompanhando cada dia, durante estes anos.. À batalhadora professora Tânia Maria Sarmento da Silva pela amizade e colaboração com informações que auxiliaram na concretização deste estudo.. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas de Pernambuco.. Ao CAPES pela bolsa fornecida durante o mestrado.. Agradecimento especial ao Prof. Dr. Celso de Amorim Câmara, pelo profissionalismo, dedicação dada ao trabalho, compreensão e paciência no decorrer do projeto. Obrigado, Celso, do fundo do meu coração! Muito obrigado!.

(10) viii. RESUMO A instabilidade relacionada às proteínas, tanto estruturalmente quanto quimicamente, compromete a sua utilização em formulações como um agente terapêutico, isto se deve a um curto tempo de vida quando são submetidas a um estresse químico ou físico. Para melhorar a estabilidade de fármacos de origem protéica foi desenvolvida uma modificação química em aminoácidos e proteínas denominada peguilação. A caracterização termoanalítica de proteínas bioativas e seus produtos peguilados tem aplicação limitada na indústria farmacêutica em comparação com outras técnicas analíticas. O presente trabalho realizou estudos de caracterização térmica da forma natural e modificada por peguilação da albumina humana sérica (HSA). As técnicas térmicas envolvidas foram: Termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e calorimetria exploratória diferencial fotovisual (DSC fotovisual). Os estudos termogravimétricos dinâmicos comprovaram que as formas peguiladas da albumina humana sérica apresentaram uma melhor estabilidade térmica nas razões de aquecimento de 10 oC/min, 20 oC/min, 40 oC/min. As curvas calorimétricas obtidas na razão de aquecimento de 10 oC/min mostraram diferenças entre os produtos peguilados e não peguilados em relação aos eventos endotérmicos e exotérmicos. A preparação da albumina humana peguilada (HSA-PEG) (82-85% de rendimento) ocorreu através de uma reação de substituição nucleofílica. A reação ocorre a partir do metoxipolietilenoglicol Propionaldeído (75% rendimento) e o grupo alfa-amino do aminoácido livre da HSA em meio ácido com o agente redutor hidreto de metal complexo. Os intermediários peguilados foram caracterizados através de RMN1H e RMN13C. Palavras-chave: Peguilação, análise térmica, estabilidade, caracterização, albumina humana..

(11) ix. ABSTRACT The instability related protein, both structurally and chemically, compromises its use in formulations as a therapeutic agent, this is due to a short life when subjected to a chemical or physical stress. To improve the stability of protein drugs of origin was developed a chemical modification of amino acids and proteins called pegylation. Thermoanalytical characterization of bioactive proteins and their products pegylated has limited application in the pharmaceutical industry compared with other analytical techniques. The present work studies the thermal characterization of natural and modified by pegylation of human serum albumin (HSA). The thermal techniques were involved: Thermogravimetry (TG), differential scanning calorimetry (DSC) and fotovisual differential scanning calorimetry (DSC fotovisual). Thermogravimetries dynamic studies have shown that pegylated forms of human serum albumin showed better thermal stability in the grounds of heating 10°C/min, 20°C/min, 40°C/min. Calorimetric curves obtained at a heating rate of 10ºC/min showed differences between the products pegylated and non pegylated compared to endothermic and exothermic events. The preparation of human albumin pegylated (HSA-PEG) (8285% yield) occurred through a nucleophilic substitution reaction. The reaction occurs from the methoxypolyethylene Propionaldehyde (75% yield) and the alpha amino group of amino acid free HSA in acid with the reducing agent metal hydride complex. Intermediaries pegylated were characterized by RMN1H and RMN13C.. Keywords: pegylation, thermal analysis, stability, characterization, human albumin..

(12) x. ABREVIATURAS E SIGLAS PEG – polietilenoglicol PEGs – polietilenoglicóis mPEG – metoxipolietilenoglicol mPEG-ALD – metoxipolietilenoglicol propionaldeído t-BuOK – tert-butóxido de potássio HSA-PEG – albumina sérica humana peguilada HSA – albumina sérica humana SBA – albumina sérica bovina HSA-Liof – albumina humana sérica liofilizada HSA-n1 – albumina humana peguilada com 5M do aldeído peguilado HSA-n2 – albumina sérica humana peguilada com 10M do aldeído peguilado DSC – Calorimetria exploratória diferencial TG – Termogravimetria DTA – Análise térmica diferencial DNPH – 2,4 dinitrofenilhidrazina CHCl3 – clorofórmio MeOH – metanol CDCl3 – clorofórmio deuterado RMN1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1 RMN13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 KDa – Quilo-Dalton US FDA – United States Food and Drug Administration ΔH – Variação de entalpia.

(13) xi. LISTA DE FIGURAS. CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. Figura 1. Polietilenoglicol (1) e alguns derivados peguilados ativos (2), (3) e (4) para a síntese com biomoléculas protéicas.------------------------------------------------------------27 Figura 2. Figura ilustrativa de um modelo para o mecanismo pelo qual o PEG fornece proteção proteolíticas. (A): acoplamento de uma protease do plasma (azul claro) em uma molécula peguilada (azul escuro) é prejudicado pelo impedimento estérico do domínio PEG (amarelo, com círculos brancos). O domínio PEG móvel gera diferentes configurações que reduzem a probabilidade de uma colisão favorável levando a interação enzima-substrato e clivagem da proteína. (B): Para a molécula-alvo (receptor) (rosa), a maior afinidade da interação conduz o equilíbrio para aumentar a probabilidade de uma interação produtiva e, portanto, mais configurações são possíveis para conseguir uma eficácia biológica (FISHBURN, 2007)--------------------------------------------------30 CAPÍTULO III – ARTIGO 1: obtenção e Caracterização Térmica de Peguilados de Albumina Humana Figura 1. Reação de obtenção do acetal (4) a partir do metoxipolietilenoglicol (1), tBuOK, 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano e do catalisador iodeto de potássio.--------------52 Figura 2. Mecanismo de reação de formação do alcóxido (2) e substituição do Br pelo I, na molécula do 2-(2-bromoetil)-1,3-dioxalano (3) com formação do acetal (4).---------53 Figura 3. Reação de hidrólise ácida do acetal (4) originando o metoxipolietilenoglicol propionaldeído (5) sob leve aquecimento (30-40oC).----------------------------------------54 Figura 4. Reação de peguilação da HSA em meio ácido com o agente redutor hidreto de metal complexo.-----------------------------------------------------------------------------------54 Figura 5. Mecanismo de reação da albumina humana peguilada (HSA-PEG) (7) a partir do metoxipolietilenoglicol propionaldeído (5) e HSA (6).----------------------------------55.

(14) xii Figura 6. Curvas dinâmicas termogravimétricas (TGA 50H) obtidas na razão de aquecimento de 10, 20 e 40 ºC min-1 sob fluxo de ar sintético de 20 mL.min-1, usando uma atmosfera de nitrogênio na razão de 50 mL.min-1 para a amostra de albumina humana sérica (HSA)(1), albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof)(2), albumina humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado (HSA-n1)(3) e albumina sérica humana peguilada com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2)(4).-----------------------57 Figura 7. Curvas DSC -50, obtidas na razão de 10 ºC min-1 e sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL.min-1) para as amostra de albumina humana sérica (HSA) (6), albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof) (7), albumina humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado (HSA-n1) (5) e albumina sérica humana peguilada com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2) (4). Os círculos representam os picos exotérmicos.-------------------------------------------------------------------------------------------------------58 Figura 8. Fotos da HSA, HSA-n1 e HSA-n2 através do processo calorimétrico por DSC fotovisual, obtidos do sistema fotovisual, modelo VCC-520, constituído de microscópio Olympus conectado a uma câmera Sanyo acoplada ao DSC-50, usando uma atmosfera de nitrogênio, fluxo de ar de 50 mL.min-1 com razão de aquecimento de 10 oC/min até a temperatura de 400oC/min.----------------------------------------------------------------------60.

(15) xiii. LISTA DE TABELAS. CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Tabela 1. Principais derivados de PEGs e suas aplicações durante o desenvolvimento da peguilação ao longo dos anos.-------------------------------------------------------------------26 Tabela 2. Proteínas peguiladas disponíveis no mercado ou em fases de testes clínicos (PARVEEN, 2006).-------------------------------------------------------------------------------29. CAPÍTULO II – PATENTE: Desenvolvimento de Processo de Obtenção de Peguilado de Albumina Humana (HSA) Tabela 1. Deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCl3) e RMN13C (50 MHz, =ppm, CDCl3) dos produtos peguilados.-----------------------------------------------------45 CAPÍTULO III – ARTIGO: obtenção e Caracterização Térmica de Peguilados de Albumina Humana Tabela 1. Proteínas peguiladas disponíveis no mercado ou em fases de testes clínicos (PARVEEN, 2006).------------------------------------------------------------------------------49 Tabela 2. Deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCl3) e RMN13C (50 MHz, =ppm, CDCl3) dos produtos peguilados.-----------------------------------------------------55 Tabela 3. Temperatura média e ΔH médio das bandas endotérmicas das curvas DSC 50, obtidas na razão de 10 ºC min-1 e sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL min1 ) para as amostra de albumina humana sérica (HSA), albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof), albumina humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado (HSA-n1) e albumina sérica humana peguilada com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2).------------------------------------------------------------------------------------------59.

(16) xiv. sUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO---------------------------------------------------------------. 18. 2. OBJETIVOS-------------------------------------------------------------------. 21. 2.1. Objetivo geral ----------------------------------------------------------------. 21. 2.2. Objetivos específicos -------------------------------------------------------. 21. CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3. Revisão bibliográfica----------------------------------------------------------. 23. 3.1. Albumina sérica humana --------------------------------------------------. 23. 3.1.1. Aspectos gerais------------------------------------------------------------. 23. 3.1.2. Funções fisiológicas da albumina---------------------------------------. 23. 3.1.2.1. Pressão Osmótica Coloidal---------------------------------------------. 23. 3.1.2.2. Associação de ligantes--------------------------------------------------. 24. 3.1.2.3. Efeitos Antioxidantes---------------------------------------------------. 24. 3.2. Peguilação--------------------------------------------------------------------. 25. 3.2.1. Utilização de compostos de natureza protéica-------------------------. 25. 3.2.2. Desenvolvimento da Peguilação-----------------------------------------. 25. 3.2.3. Química da peguilação----------------------------------------------------. 27. 3.2.4. Propriedades farmacológicas de produtos peguilados----------------. 28. 3.2.4.1. Prolongamento do tempo de meia vida-------------------------------. 29. 3.3. Análise térmica---------------------------------------------------------------. 30. 3.3.1. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)--------------------------. 32. 3.3.2. DSC Acoplado a um Sistema Fotovisual-------------------------------. 34. 3.3.3. Análise térmica diferencial (DTA)--------------------------------------. 34. 3.3.4. Termogravimetria (TG)---------------------------------------------------. 35. 3.3.4.1. Classificação-------------------------------------------------------------. 36. 3.3.4.2. Aplicações----------------------------------------------------------------. 37. CAPÍTULO II Patente: Desenvolvimento de Processo de Obtenção de Peguilado de Albumina Humana (HSA) 1. Estado da arte-------------------------------------------------------------------. 39.

(17) xv 2. Descrição do evento-----------------------------------------------------------. 40. 3. Detalhes do procedimento experimental químico-------------------------. 40. 3.1. Preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído-----------------. 41. 3.2. Preparação da albumina humana peguilada------------------------------. 41. 4. Referências----------------------------------------------------------------------. 42. 5. Reivindicações-----------------------------------------------------------------. 44. 6. Resumo--------------------------------------------------------------------------. 46. CAPÍTULO III ARTIGO I: Obtenção e Caracterização Térmica de Peguilados de Albumina Humana Resumo ----------------------------------------------------------------------------. 48. 1. Introdução ----------------------------------------------------------------------. 48. 2. Experimental -------------------------------------------------------------------. 49. 2.1. Materiais e Métodos---------------------------------------------------------. 49. 2.1.1. Obtenção dos Peguilados-------------------------------------------------. 49. 2.1.1.1. Preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído------------. 50. 2.1.1.2. Preparação da albumina humana peguilada--------------------------. 51. 2.1.2. Estudos Térmicos----------------------------------------------------------. 51. 3. Resultados e discussões ------------------------------------------------------. 52. 3.1. Obtenção dos Peguilados---------------------------------------------------. 52. 3.2. Caracterização Térmica-----------------------------------------------------. 56. 4. Conclusões----------------------------------------------------------------------. 60. 5. Referências ---------------------------------------------------------------------. 61. 4. CONCLUSÕES---------------------------------------------------------------. 64. PERSPECTIVAS----------------------------------------------------------------. 66. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS--------------------------------------. 69. ANEXO I---------------------------------------------------------------------------. 75. ANEXO II--------------------------------------------------------------------------. 76. ANEXO III-------------------------------------------------------------------------. 77. ANEXO IV------------------------------------------------------------------------. 78. ANEXO V-------------------------------------------------------------------------. 79.

(18) INTRODUÇÃO.

(19) 18 1. INTRODUÇÃO. O termo peguilação descreve uma modificação em moléculas biológicas por uma conjugação covalente com polietilenoglicol (PEG), um polímero não tóxico e não imunogênico (VERONESE, 2008). As razões para a peguilação de peptídeos e proteínas são numerosas e incluem diminuição da imunogenecidade e da degradação por enzimas do trato digestório e do plasma. A conjugação também aumenta o tamanho da estrutura do polipeptídeo, deste modo reduzirá a filtração renal com conseqüente aumento no tempo de meia vida do fármaco (FISHBURN, 2007). Um importante aspecto da peguilação é a incorporação de vários derivados peguilados, mais reativos que o PEG, em compostos de natureza protéica. Esses derivados reagem com maior eficácia através de ligações específicas (ROBERTS, 2002). A peguilação deve ocorrer em resíduos específicos da proteína para que exerça um efeito mínimo de alteração farmacodinâmica, ou seja, a proteína peguilada deve se ligar nos seus respectivos receptores ou substratos de reconhecimento da mesma forma quando não estava na forma peguilada (LEE, 2003). Sítios específicos de proteínas estão sendo utilizados para a conjugação com derivados de PEG. Como exemplo tem-se a peguilação no grupo N-terminal alfa-amino de um fator de crescimento epidérmico (LEE, 2003). Derivados de PEG, que contêm um grupo funcional aldeído, são seletivos para o N-terminal alfa-amino sob condições ácidas. Essa reação de peguilação foi utilizada em um fator de crescimento de granulócito. A utilização de aldeídos peguilados na literatura é encontrada para reação com o N-terminal alfa-amino de fatores de estimulação de granulócitos em condições ácidas. Tal síntese foi realizada por uma modificação da síntese de Williamson (ZHAO, 2009). Não há relatos na literatura dessa síntese com o grupamento alfa-amino dos resíduos de aminoácido da albumina sérica humana (HSA). A HSA, amplamente estudada no campo da bioquímica, é a proteína mais abundante no plasma sanguíneo, bem como contribui para a regulação da pressão coloidal osmótica do sangue e também para o transporte de outros compostos (NGUYEN, 2006). A estrutura secundária da HSA contém muitos resíduos de cisteína que são helicoidais em grande parte da cadeia. Sua alta estabilidade e solubilidade em água favorece seu isolamento em grandes quantidades. Consiste em um monômero com uma massa molecular de 66 KDa (GHUMAN, 2005)..

(20) 19 As interações químicas de proteínas com outras moléculas é um assunto de especial interesse na área bioquímica, já que muitos processos celulares dependem da dissociação daquelas interações. Novos métodos são constantemente desenvolvidos para elucidar as interações energéticas entre proteínas e seus ligantes. A calorimetria exploratória diferencial (DSC) mostrou ser uma ferramenta útil para caracterizar tais interações. Entretanto, a aplicabilidade do DSC e de outras técnicas térmicas para estudar a interação de biomoléculas não são comuns (CELEJ, 2006).. ..

(21) OBJETIVOS.

(22) 21 2. OBJETIVOS. 2.1. Objetivo Geral Caracterizar os comportamentos térmicos da HSA e de suas formas peguiladas por calorimetria exploratória diferencial (DSC) frente aos ciclos de resfriamento e aquecimento e termogravimetria (TG).. 2.2. Objetivos Específicos.  Obter derivados do polietilenoglicol e HSA peguilada em diferentes concentrações;  Determinar os parâmetros cinéticos de estabilidade térmica da HSA e seus produtos peguilados através dos dados termogravimétricos dinâmicos;  Avaliar o comportamento térmico da HSA e de seus derivados peguilados, através do sistema fotovisual..

(23) CAPÍTULO I Revisão bibliográfica.

(24) 23 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 3.1. Albumina sérica humana. 3.1.1. Aspectos gerais. A albumina sérica humana é a mais abundante proteína do plasma humano, produzida no fígado, consistindo em um monômero de 66 KDa. Estruturalmente, a albumina é composta de vários segmentos em alfa-hélice, que se agrupam para formar dois subdomínios (A e B) (GHUMAN, 2005). A HSA possui em sua estrutura: 18 resíduos de tirosina, 6 resíduos de metionina, 1 resíduo de triptofano, 59 resíduos de lisina, 1 resíduo de cisteína, e 17 pontes disulfetos (WONG, 2007). Os grupos tiol estão envolvidos em várias reações bioquímicas que inativam as espécies reativas de oxigênio, dando à albumina um papel antioxidante importante em nosso organismo (WONG, 2007). A albumina tem uma concentração plasmática típica de 35 - 45 g/L, que representa 30 a 40% da albumina sintetizada no fígado, e o restante encontra-se distribuído entre os músculos e a pele. Sua principal função fisiológica é regular a pressão osmótica (ZUNSZAIN, 2003). Esta proteína é caracterizada por sua habilidade de se ligar a uma ampla variedade de moléculas hidrofóbicas, ácidos graxos, bilirrubina, hemina, tiroxina e esteróides. Serve como um solubilizador e transportador destes compostos. HSA tem alta afinidade pelo grupo heme (ZUNSZAIN, 2003). Um dos fatores mais importantes que afetam a distribuição e a concentração ativa de muitas drogas no organismo é a afinidade pela HSA. Um grau de afinidade pela albumina é desejável, para ajudar a solubilizar substâncias que de outra forma poderiam agregar-se e ser pobremente distribuídas. Já em relação às drogas com grande afinidade pela proteína, seriam necessárias grandes doses para atingir uma concentração efetiva in vivo, assim, seriam lentamente distribuídas aos sítios de ação e poderiam não ser eficientemente eliminadas. 3.1.2. Funções fisiológicas da albumina. 3.1.2.1. Pressão Osmótica Coloidal.

(25) 24 A função mais importante da albumina é regular a pressão osmótica coloidal. A albumina provê 60% da pressão osmótica coloidal. A proteína é negativamente carregada e, por conseguinte, atrai cátions, como os íons de sódio, os quais, por sua vez, retêm a água (NGUYEN, 2006).. 3.1.2.2. Associação de ligantes. A organização estrutural globular da HSA dá a possibilidade de se ligar com várias substâncias em múltiplos sítios da molécula, unindo-se assim a vários componentes endógenos e exógenos. Estes compostos incluem ácidos graxos, bilirrubina, metais, tiroxina e triptofano, assim como drogas que têm características ácidas ou eletronegativas (warfarina, ibuprofeno e diazepan). Estas características fazem com que a HSA seja um dos maiores transportadores de fármacos no sangue (GHUMAN, 2005). A HSA pode facilitar a ativação de várias sustâncias, tais como hormônios ou drogas, ou diminuir a presença de toxinas no plasma. Por exemplo, a ligação do triptofano à HSA regula a deposição daquele nos tecidos. Em pacientes com uma avançada cirrose e hipoalbuminemia, a diminuição dos sítios de ligação gera uma quantidade adicional de triptofano livre o qual pode gerar o desenvolvimento de encefalopatia hepática. A ligação de HSA também afeta a farmacocinética e eficácia de muitas drogas.. Por exemplo, drogas com alta afinidade pelo HSA têm que ser. administradas em altas doses para atingir uma efetiva concentração in vivo; sua distribuição nos sítios de ação poderia ser reduzida ou mesmo eliminada. Apesar disso, uma alta ligação da droga com a HSA poderia ser desejável porque ajudaria a solubilizar compostos que de outra forma originariam agregados e seriam pobremente eliminados (GRECO, 2000). 3.1.2.3. Efeitos Antioxidantes. Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio são extremamente voláteis e capazes de reagir com outras moléculas, que dão origem à acumulação de produtos tóxicos finais e dano celular. Estudos in vivo têm mostrado que o HSA pode ligar e, por conseguinte, remover espécies reativas de oxigênio que foram gerados indiretamente por neutrófilos, regulando a sinalização celular que é ativada nos processos.

(26) 25 inflamatórios (KOUCH, 1999). HSA também influencia o status redox do plasma ao ligar metais como o ferro e o cobre que de outra forma se transformariam em formas redox-ativas. Desta forma o HSA tem um papel antioxidante importante em situações de inflamação (KRAGH-HANSEN, 2002).. 3.2. Peguilação. 3.2.1. Utilização de compostos de natureza protéica A utilização de proteínas e peptídeos na terapia clínica está em crescimento devido a alguns fatores como: descoberta de novos peptídeos e proteínas, novas descobertas em relação ao mecanismo farmacológico in vivo, otimização das condições para que ocorram as sínteses de natureza protéica e aperfeiçoamento nas formulações farmacêuticas e de tecnologias que liberem as proteínas e peptídeos próximo ao sítio de ação com um ganho farmacocinético e farmacodinâmico (ROBERTS, 2002). Apesar de muitos produtos biofarmacêuticos estarem sendo desenvolvidos, muitos ainda apresentam problemas durante o tratamento que incluem um curto tempo de meia vida entre as administrações, imunogenicidade, suscetibilidades a degradação proteolítica por enzimas e problemas em relação à solubilidade. Diversas estratégias estão sendo desenvolvidas para aumentar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas desses produtos, entre elas destacam-se: manipulação da seqüência de aminoácidos para diminuir problemas imunogênicos, incorporação de veículos nas formulações para melhorar a proteção e a liberação de fármacos e a conjugação natural ou por via sintética de polímeros e biomoléculas (MATEO, 2000). A formação de uma ligação covalente entre o PEG e biomoléculas protéicas utilizadas em tratamentos vêm crescendo e diversos fatores devem ser considerados durante a peguilação como: o número de moléculas de PEG que reagiram com o polipeptídeo, o peso molecular e a estrutura do PEG, a localização do PEG no peptídeo e as condições químicas utilizadas durante a reação com o polipeptídeo (HARRIS, 2003).. 3.2.2. Desenvolvimento da Peguilação.

(27) 26 Desde 1970 foram publicados diversos artigos referentes à modificação química das proteínas pela conjugação com macromoléculas sintéticas, que são derivadas do PEG (KODERA, 1998). Os estudos pioneiros que obtiveram sucesso na conjugação de polímeros foram iniciados com ABUCHOWSKI et al. na década de 70, que foram sendo aperfeiçoados ao longo dos anos (Tabela 1). Esses estudos levaram a aprovação do PEG pelo US FDA como polímero para uso interno devido as suas propriedades atóxicas e. não. imunogênicas. Até a década de 80 realizaram-se estudos em relação à utilização do PEG em formulações farmacêuticas devido as suas características anfifílicas, apresentando uma boa solubilidade em água e solventes orgânicos (VERONESE, 2008). Entre os anos de 1980 e 1990 estudos biológicos demonstraram que os compostos que formavam ligações com o PEG adquiriam suas propriedades físico-químicas o que acarretou também em uma boa solubilidade entre as membranas biológicas. Estes estudos observaram que os produtos peguilados apresentavam resistência a anticorpos e a enzimas proteolíticas bem como eram eliminados mais lentamente do organismo (KODERA, 1998). Em meados do ano 2000 ocorreram diversas reações de peguilação com compostos de origem não protéica como nucleotídeos e alguns produtos naturais utilizados na terapia do câncer. A tabela abaixo mostra a evolução da peguilação desde 1970. Período 1970-80. 1980-90. 1990-2000. PEGs PEG-clorotriazina PEG-succimilsucinato. PEG-aldeído PEG-pNO2-fenil carbonato PEG-carbonilimidazol PEG-AA-NHS. PEG-NHS PEG-maleimida PEG-OPSS. Acoplamento enzimático 2000-atual. Observação geral Estudos pioneiros. Estudos farmacocinéticos; Acoplamento dos derivados em sítios específicos. Derivados de PEGs mais seletivos. Caracterização química e biológica dos conjugados, descoberta de novas drogas, combinação da engenharia genética e da peguilação. Aplicação Enzimas. Terapia de reposição enzimática. Hormônios; Drogas antineoplásicas. Drogas de origem não protéicas (nucleotídeos). AA= Aminoácidos; NHS=N-hidroxisuccinimida; OPPS= Orto-piridildisulfeto. Tabela 1 – Principais derivados de PEGs e suas aplicações durante o desenvolvimento da peguilação ao longo dos anos..

(28) 27 3.2.3. Química da peguilação. O PEG (1) (Figura 1) é um polímero anfifílico que possui em sua estrutura química unidades repetidas de óxido de etileno e em suas terminações existem grupos hidroxilas que podem ser ativados. Os compostos (2), (3) e (4) (Figura 1) são exemplos de derivados de PEG. Os compostos (2) e (3) reagem, através de reações de substituição nucleofílica com o grupo funcional amino livre em proteínas. O composto (4) reage com resíduos de cisteína em proteínas, com formação de pontes dissulfeto (VERONESSE, 2008). Unidades repetidas de óxido de etileno. H-(OCH2CH2)n-OH (1) Grupos funcionais responsáveis pela síntese de novos derivados de PEG.. H-(OCH2CH2)n-OH (1) N. O. N. O N. mPEG S S. mPEG O (4) (2) O NO2. O mPEG O (3) mPEG=CH3-(OCH2CH2)n-OH. Figura 1. Polietilenoglicol (1) e alguns derivados peguilados ativos (2), (3) e (4) para a síntese com biomoléculas protéicas. A peguilação está classificada em duas gerações. A primeira geração apresenta as seguintes características: reações envolvendo formação de derivados de PEG impuros, as moléculas envolvidas na peguilação possuem baixos pesos moleculares, as ligações formadas no produto peguilado são instáveis e falta.

(29) 28 direcionamento para a formação de ligações em grupos específicos no reagente que será peguilado. Exemplos de PEG derivados de primeira geração incluem: PEGdiclorotriazina, PEG-tresilato, PEG-succimil carbonato, PEG-benzotriazol carbonato, PEG-p-nitrofenilcarbonato, PEG-triclorofenil carbonato e PEG-carbonilimidazol. A segunda geração de PEGs foi desenvolvida para superar os problemas envolvidos na primeira geração. Um típico exemplo de PEG derivado de segunda geração é o metoxipolietilenoglicol propionaldeído (mPEG-ALD). Este é mais fácil de ser obtido que o PEG-acetaldeído, devido ao acetaldeído ser mais suscetível a dimerização via condensação aldólica (ROBERTS, 2002). Um dos métodos de obtenção do mPEG-ALD ocorre primeiramente por formação de alcóxidos para a reação de Williamson, tal alcóxido é obtido entre a reação de um composto contendo um grupo funcional hidroxila sob condições básicas. Posteriormente, já na reação de Williamson, ocorre o deslocamento do íon haleto por ataque do alcóxido nucleofílico e formação de um acetal. O acetal é hidrolisado por técnicas corriqueiras de laboratório (refluxo em meio ácido) através de uma reação de hidrólise originando o metoxipolietilenoglicol propionaldeído. Um dos métodos para a peguilação de proteínas é a utilização de derivados peguilados com o grupo funcional aldeído, devido este ser seletivo no Nterminal de aminoácidos de proteínas. Esta reação ocorre sob condições ácidas na presença de um agente redutor (ZHAO, 2008).. 3.2.4. Propriedades farmacológicas de produtos peguilados. As reações de peguilação estão sendo aplicadas em compostos de natureza protéica que possuem excelentes atividades biológicas. Alguns desses compostos já estão disponíveis para o mercado ou em fase de teste clínico (Tabela 2) (PARVEEN, 2006).. Destaca-se também o avanço no sentido do desenvolvimento de novas. moléculas, especialmente a forma monopeguilada de interferon α-2a (Tabela 2), que foi conjugada com polietilenoglicol através da lisina (FOSER, 2003) observando-se que a proteína peguilada conservava a atividade antiviral, aprimorando os parâmetros farmacocinéticos (ARDUINI, 2004)..

(30) 29. Produto. PEG. Ligação formada. Nome comercial. Laboratório. Status. Indicação. PEG-denosina deaminase. 5 kDa. NI. Adagen®. Enzon Pharmaceuticals. lançado. Imunodeficiência. PEGasparaginase. 5 kDa. Amida. Oncaspar®. Enzon Pharmaceuticals. lançado. Leucemia. PEG-IFNα2a. 40 kDa. Amida. Pegasys®. Hoffmann-La Roche. Fase II. Melanoma e hepatite C. PEG- IFNα2b. 12 kDa. Carbamato. PEG-Intron®. Schering-Plough. lançado. Hepatite C. PEG-arginina deaminase. 20 kDa. NI. Hepacid®. Phoenix Pharmacologics. Fase I. Carcinoma hepático. PEG-hGH. 5 KDa. Amida. Somavert®. Pfizer. lançado. Acromegalia. PEG-hGH = Hormônio humano do crescimento peguilado; IFN= Interferon; NI= Não informado. Tabela 2 - Proteínas peguiladas disponíveis no mercado ou em fases de testes clínicos (PARVEEN, 2006). 3.2.4.1. Prolongamento do tempo de meia vida. O aumento no tempo de residência de proteínas peguiladas no organismo dá-se através de dois efeitos principais: (1) diminuição na taxa de depuração do rim e (2) aumento na proteção contra a degradação proteolítica. PEGs são altamente hidratados, com duas moléculas de água por unidade de etilenoglicol, isto acarreta em um aumento no tamanho molecular do PEG conjugado (HARRIS, 2003). PEGs com peso molecular abaixo de 20 KDa são excretados do organismo pelos rins. Acima de 20 KDa, a filtração renal diminui em favor da excreção hepatobiliar (YAMAOKA, 1994). Para muitas proteínas e peptídeos, a rápida degradação proteolítica por enzimas circulantes representa um dos principais desafios na produção de terapêutica viável. O PEG fornece proteção às biomoléculas protéicas por dificultar o acesso de proteases e peptidases. O modelo mais provável para explicar a proteção contra a proteólise envolve um processo dinâmico no qual o PEG cria um impedimento estérico sobre o domínio da proteína que serve como um substrato da enzima proteolítica, reduzindo a freqüência de colisões favoráveis. Apesar do PEG criar uma obstrução ao domínio da proteína que serve como sítio para o ataque das proteólises, isto não se observa em relação à ligação das biomoléculas protéicas e aos seus receptores biológicos. As duas situações (Figura 2) são distinguidas pela afinidade de interação. Assim, para a protease há uma menor afinidade para uma ligação e a clivagem é feita consideravelmente mais difícil pela presença do domínio PEG (Figura 2). Para a ligação do agonista a molécula-alvo (receptor, substrato da enzima ou macromolécula), a maior afinidade da interação.

(31) 30 aumenta a probabilidade de uma interação produtiva, e, assim, a eficácia biológica é alcançada; assim, a presença de PEG não cria impedimento estérico para essa interação, e isso se reflete na comparação das moléculas peguiladas com suas moléculas nativas (FISHBURN, 2007).. Figura 2. Figura ilustrativa de um modelo para o mecanismo pelo qual o PEG fornece proteção proteolítica. (A): O acoplamento de uma protease do plasma (azul claro) em uma proteína peguilada (azul escuro) é prejudicado pelo impedimento estérico do domínio PEG (amarelo, com círculos brancos). O domínio PEG móvel gera diferentes configurações que reduzem a probabilidade de uma colisão favorável levando a uma menor interação enzima-substrato (clivagem da proteína). (B): Para a molécula-alvo (receptor) (rosa), a maior afinidade da interação conduz o equilíbrio para aumentar a probabilidade de uma interação produtiva e, portanto, mais configurações são possíveis para conseguir uma eficácia biológica (FISHBURN, 2007). O mesmo efeito estérico da cadeia de PEG que dificulta o acesso de enzimas proteolíticas também paralelamente reduz a imunogenicidade de proteínas peguiladas. A molécula de PEG minimiza a exposição de determinadas proteínas que em algumas pessoas são reconhecidas como antígenos, dessa forma reduzem e impedem a produção de anticorpos neutralizantes. A toxicidade de proteínas, quando peguiladas, também é reduzida. O PEG foi aprovado pelo FDA para uso em alimentos e cosméticos, e é considerado essencialmente atóxico (WEBSTER, 2007).. 3.3. Análise térmica.

(32) 31 Métodos térmicos são técnicas em que as variações de propriedades físicas de uma substância são medidas em função da temperatura. Conceitua-se análise térmica como um conjunto de técnicas que permite medir as mudanças de propriedades físicas de uma substância ou material em função da temperatura ou tempo, enquanto a substância é submetida a uma programação controlada da temperatura (IONASHIRO, 2004). As áreas de aplicação da análise térmica incluem os seguintes estudos: decomposição térmica; determinação de umidade, de voláteis, de resíduos e de teor de cinzas; oxidação térmica; cinética de reação e cristalização; diagrama de fases; determinação de calor específico; determinação de transição vítrea, de fusão, de tempo de armazenamento; dentre outros (MOTHE & AZEVEDO, 2002). As vantagens da Análise Térmica são muitas como, necessidade de uma pequena quantidade de amostra para os ensaios, variedade de resultados em um único gráfico, não há necessidade de preparo da amostra. Sua aplicabilidade ocorre em diversas áreas: alimentícia, catálise, cerâmica, engenharia civil, farmacêutica, inorgânica, petroquímica, polímeros, vidros, dentre outras. Segundo Kent (1971) para uma técnica ser considerada termoanalítica ela deverá atender a três critérios básicos: a) Medir uma propriedade física; b) Expressar a medida em função da temperatura; c) Realizar a medida sob um controle de temperatura.. Os métodos que envolvem mudanças no peso ou na energia se enquadram nesta definição (AULTON, 2005). De acordo com Holler & Niemen (1998), algumas das vantagens que a análise térmica possui em relação a outros métodos analíticos são:  A amostra pode ser estudada sobre ampla grande faixa de temperatura usando vários programas de temperatura;  Quase todas as formas físicas da amostra (sólido, líquido ou gel);  Uma pequena quantidade da amostra (0,1 µm – 10 mg);  A atmosfera na vizinhança pode ser padronizada;  O tempo requerido para completar o período de experimento é de alguns minutos a horas;  Os instrumentos de análise térmica apresentam preços razoáveis..

(33) 32. A implementação da análise térmica na indústria farmacêutica surge como um método analítico, quantitativo e comparativo, capaz de produzir resultados rápidos e reprodutíveis, podendo ser utilizada no controle de qualidade de medicamentos, visando à análise integral do produto final e a determinação de parâmetros de qualidade tecnológica (MACÊDO, 1996; GOMES, 2002). Dentre as técnicas termoanalíticas utilizadas na análise térmica podemos citar a calorimetria exploratória diferencial (DSC), a análise térmica diferencial (DTA) e a termogravimetria (TG).. 3.3.1. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC). A técnica DSC mede a diferença de energia cedida a uma substância e a um material de referência em função da temperatura, quando a substância e a referência são submetidas a um processo térmico controlado. Dependendo do método de medida, podem ser distinguidos dois procedimentos de DSC: com compensação de energia e com fluxo de calor (IONASHIRO, 2004). As amostras de DSC são analisadas em pequenas panelinhas de metal, designadas pela ótima condutividade térmica e reações mínimas com as amostras (por ex., alumínio, platina, prata, liga e aço inoxidável). Os picos da calorimetria exploratória diferencial resultam tanto de modificações físicas como reações químicas induzidas por variações de temperatura da amostra. Os processos físicos endotérmicos incluem fusão, vaporização, absorção e desorção. A adsorção e a cristalização geralmente são exotérmicas. As reações químicas podem ser também exotérmicas ou endotérmicas. As reações exotérmicas incluem oxidação no ar ou na presença de oxigênio, polimerização e reações catalíticas. As reações endotérmicas incluem desidratação, redução em uma atmosfera gasosa e decomposição. I). Vantagens do DSC (MOTHÉ & AZEVEDO, 2002):  Rápido tempo de análise;  Fácil preparo da amostra;  Pode ser aplicado para sólidos e líquidos;  Larga faixa de temperatura;  Medidas quantitativas..

(34) 33. II). Desvantagens e limitações do DSC:  Redução da sensibilidade quando a linha de base está em inclinação ou curvatura;  Algumas transições observadas são complexas e apresentam dificuldade para interpretação (por exemplo, temperatura de transição vítrea, fusão e cristalização).. III) Principais aplicações:  Determinação do ponto de fusão;  Determinação do calor de fusão;  Determinação de pureza;  Caracterização de polimorfismo;  Caracterização de pseudopolimorfismo;  Estudo de diagramas de fase;  Evaporação e vaporização de substâncias;  Transição vítrea;  Estudo de compatibilidade droga-excipientes;  Estudo de estabilidade térmica;  Estudo da cinética de decomposição.. Pesquisas sobre o efeito dos estudos termoanalíticos em proteínas peguiladas, são praticamente inexistentes, os estudos são normalmente referentes às proteínas isoladas ou em misturas lácteas. Michnik et al (2006). realizaram um estudo. comparativo em relação a desnaturação térmica entre a HSA e a SBA (albumina bovina). O método aplicado foi realizado em temperaturas até 100ºC e as amostras das albuminas foram caracterizadas por DSC em solução aquosa. O estudo demonstrou que a albumina do soro em seres humanos apresentou uma melhor estabilidade térmica em relação à albumina bovina. Michnik et al (2007) estudaram o efeito do etanol sobre a estabilidade do soro de albumina humana em solução aquosa através da utilização de calorimetria diferencial de varredura. Os resultados sugerem que o etanol, em concentrações baixas, estabiliza a estrutura natural da albumina, devido à sua ligação com o estado nativo de proteínas..

(35) 34 Gauche et al (2010) realizaram um estudo comparativo da influência da enzima transglutaminase em proteína de leite por DSC. As amostras, na forma de gel, demonstraram que as proteínas do leite não polimerizadas pela enzima apresentaram uma melhor estabilidade térmica.. 3.3.2. DSC Acoplado a um Sistema Fotovisual O sistema DSC–fotovisual é uma técnica termoanalítica, recentemente introduzida na análise de medicamentos que combina a microscopia por imagem com os dados DSC (LACHMAN, LIEBERMAN & KANIG, 2001). Essa técnica permite visualizar os processos entálpicos em tempo real (SOUZA, 2005). Os estudos realizados com DSC fotovisual demonstram a sua aplicabilidade em controle de qualidade, desde comparações do comportamento térmico entre o fármaco e seus excipientes até diferenças existentes entre uma matéria-prima e outra (MACÊDO, 2001). Muitos pesquisadores têm utilizado o DSC acoplado a um sistema fotovisual para confirmar transições de fase e ponto de fusão ocorrido nas curvas calorimétricas. A determinação da pureza de um fármaco pode ser feita por DSC, pois impurezas numa substância considerada pura podem diminuir seu ponto de fusão (WELLS, 1988). O pico de fusão de uma substância pura, material cristalino, deverá ser exato, mas impurezas ou defeitos na estrutura do cristal ampliarão a faixa de fusão e baixarão o ponto de fusão final para temperaturas mais baixas (FORD, 1989). O DSC também pode ser utilizado para quantificação da cristalinidade de um fármaco, pois se sabe que durante a formação de um fármaco cristalino algumas conversões para formas amorfas podem ocorrer durante o processamento da formulação, o que afetará a estabilidade química e física do fármaco. Outra importante aplicação do DSC é no estudo de compatibilidade fármaco-excipiente, no qual é observado se há ou não interação entre uma mistura ou formulação.. 3.3.3. Análise térmica diferencial (DTA).

(36) 35 A diferença de temperatura entre a amostra e uma substância de referência é medida em função da temperatura. Enquanto a amostra e a referência são submetidas a um programa de temperatura controlada (SKOOG, HOOLER & NIEMAN, 1998). Um instrumento de DTA típico compreende um forno, tendo célula de amostra e referência, um controlador do diferencial de temperatura com amplificador associado e sistema de registro com controle de temperatura e atmosfera programada do forno (FORD & TIMMINS, 1989). A referência utilizada é a α-alumina, substância termicamente inerte, que não exibe mudanças de fase com variações de temperaturas. Os primeiros trabalhos termoanalíticos fizeram uso do DTA com o objetivo de avaliar a compatibilidade farmacêutica, uma vez que esta técnica permite detectar diversas situações de interações físicas e químicas (SHATTAWY, KILDSIG & PECK, 1982). O DTA é utilizado na determinação do comportamento térmico e composição de produtos industrializados. Como também, na formação de diagramas de fase e no estudo de transições de fase. Esse método também fornece um caminho simples e preciso para determinação do ponto de fusão, ebulição e decomposição de compostos orgânicos (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 1998).. 3.3.4. Termogravimetria (TG). É uma técnica termoanalítica na qual se analisa continuamente a massa da amostra, em uma atmosfera controlada, em função da temperatura ou do tempo. O método termogravimétrico fornece informações sobre decomposição e oxidação, e de processos físicos como vaporização, sublimação e desorção (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 1998; HATAKEYAMA & QUINN, 1997). O registro de análise é representado pela curva TG ou termogravimétrica, sendo a massa colocada no eixo das ordenadas, com valores decrescentes de cima para baixo e o tempo (t) ou temperatura (T) no eixo das abscissas, com valores crescentes da esquerda para a direita (SOUZA, 2001). As curvas de variação de massa em função da temperatura permitem tirar conclusões sobre a estabilidade térmica da amostra e sobre a composição do resíduo (IANOSHIRO, 1996)..

(37) 36 O equipamento termogravimétrico possui uma termobalança moderna, a qual consiste em uma microbalança eletrônica, um programador de temperatura, um suporte para a amostra, um acessório para estabelecer a atmosfera adequada e um registrador. A sensibilidade da balança é em torno de microgramas, com uma capacidade total em torno de cem miligramas. O forno pode ser programado a temperatura de até 1.000ºC, com velocidade de aquecimento de até 100ºC/minuto. A atmosfera do forno é controlada, principalmente, para garantir que o ambiente seja o mais constante possível durante o experimento. Os materiais do suporte da amostra comumente utilizados incluem: platina, sílica e alumina (UNITED STATES PHARMACOPOEIA, 2006). Uma curva da termogravimetria em preparações farmacêuticas pode demonstrar:  Componentes voláteis, como misturas, solventes, etc;  Perda de água de cristalização;  Decomposição;  Resíduos (como cinzas), resíduos carbonáceos enegrecidos, formados durante a decomposição numa atmosfera inerte (MEDEIROS, 2001).. 3.3.4.1. Classificação. Os métodos termogravimétricos são classificados em: A. Termogravimetria Dinâmica ou Não-Isotérmica – Faz-se uma avaliação da massa, de forma contínua, à medida que vai ocorrendo aumento da temperatura (KENT, 1971). Este método tem sido muito utilizado para o estudo de decomposição térmica de sólidos (MEDEIROS, 2001). B. Termogravimetria Isotérmica – A medida da variação de massa da amostra é registrada em função do tempo, mantendo-se a temperatura constante (CONCEIÇÃO, 2000). Permite o cálculo da energia de ativação desde que se utilize repetição em diferentes temperaturas (MEDEIROS, 2001). C. Termogravimetria Quase-isotérmica – A partir do momento em que começa a perda de massa da amostra, a temperatura é mantida constante até que a massa se estabilize.

(38) 37 novamente, assim recomeça-se o aquecimento e este procedimento pode ser repetido em cada etapa da decomposição (YOSHIDA, 1993).. 3.3.4.2. Aplicações As principais aplicações da Termogravimetria são as seguintes (MEDEIROS, 2001):  Estudo da decomposição e da estabilidade térmica de substâncias orgânicas e inorgânicas, de fármacos, minerais, metais, polímeros, produtos alimentícios entre outros;  Determinação da pureza e da estabilidade térmica de reagentes analíticos, inclusive padrões primários e secundários;  Desenvolvimento de processos analíticos gravimétricos;  Estudo sobre a velocidade de destilação e evaporação de líquidos por diferentes gases e em faixas amplas de temperatura;  Estudos sobre a velocidade de destilação e evaporação de líquidos e da sublimação de sólidos;  Estudo cinético de reações no estado sólido;. Os estudos termogravimétricos referentes a compostos de origem protéica são escassos. Lu et al (2007) demonstraram, através de termogravimetria, que misturas de proteínas. a excipientes como sacarose e trealose, após liofilização, mantinham a. estabilidade física das proteínas em formulações. Ciesla et al (2010) avaliaram, por termogravimetria, a influência de radiação gama em alfa e beta globulina. Tal estudo demonstrou que a decomposição térmica das globulinas, em suspensão aquosa, ocorre em temperaturas mais elevadas do que quando comparado com a suspensão não irradiada..

(39) CAPÍTULO II Patente TÍTULO: Desenvolvimento de Processo de Obtenção de Peguilado de Albumina Humana (HSA) Depósito de pedido de Patente ao Instituto Nacional de Propriedade Industrial INPI..

(40) 39 RELATÓRIO DESCRITIVO DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA (HSA) 5. 1. Estado da arte. No final dos anos 50, a modificação de proteínas tornou-se uma prática comum e foram desenvolvidas técnicas para facilitar a análise das relações entre estrutura e atividade das moléculas de proteína. Existem resíduos de aminoácidos com diferentes reatividades em 10 uma proteína, dependendo de sua localização na estrutura da proteína nativa1. Desde 1970 foram publicados diversos artigos referentes à modificação química das proteínas pela conjugação com macromoléculas sintéticas, que são derivadas do polietilenoglicol (PEG)1. Os objetivos destas modificações protéicas incluíram a redução da imunoreatividade ou da imunogenicidade e a supressão da produção de 15 imunoglobulina. Provavelmente, uma das características mais marcantes da modificação molecular usando o PEG é o aumento do tempo de meia vida e da concentração das proteínas terapêuticas no plasma sanguíneo. Estas características podem ser atribuídas, em parte, pelo aumento do peso molecular da molécula conjugada com o PEG, alterando o sistema de filtração renal e também pela redução da proteólise enzimática2. As reações 20 de peguilação estão sendo aplicadas em compostos de natureza protéica que possuem excelentes atividades biológicas. Alguns desses compostos já estão disponíveis para o mercado ou em fase de teste clínico3. Destaca-se também o avanço no sentido do desenvolvimento de novas moléculas, especialmente a forma monopeguilada de interferon α-2a, que foi conjugada com polietilenoglicol através da lisina4 observando-se 25 que a proteína peguilada conservava a atividade antiviral, aprimorando os parâmetros farmacocinéticos5. Tais modificações também foram aplicadas na catalase na qual apresentaram redução da imunoreatividade para anticorpos1. A proteína utilizada neste trabalho foi a albumina sérica humana (HSA), amplamente estudada no campo da bioquímica. A HSA é a proteína mais abundante no 30 plasma sanguíneo, bem como contribui para a regulação da pressão coloidal osmótica do sangue e também para o transporte de outros compostos endógenos e exógenos. A estrutura secundária da HSA contém muitos resíduos de cisteína e são helicoidais em grande parte da cadeia. Apresenta fácil isolamento em grandes quantidades favorecendo sua alta estabilidade e solubilidade em água. Consiste em um monômero com uma massa molecular de 66 KDa9..

(41) 40 A HSA passa por notáveis mudanças reversíveis na conformação, usualmente sob condições não fisiológicas6. Derivados peguilados na forma de amina foram desenvolvidos para reagir com carbonilas de albumina bovina por amidação em pH alcalino7. 5. A utilização de aldeídos peguilados na literatura é encontrada para reação com o Nterminal alfa-amino de fatores de estimulação de granulócitos em condições ácidas. Tal síntese é uma reação de substituição nucleófílica e não há relato na literatura dessa síntese com o grupamento alfa-amino dos resíduos de aminoácido da HSA.. 10 2. Descrição do evento. Este pedido de patente aplica-se a um processo inédito de preparação da albumina humana peguilada (HSA-PEG) através de uma reação de substituição nucleofílica, uma vez que não há relato na literatura dessa síntese com o grupamento alfa-amino dos 15. resíduos de aminoácido da HSA. A síntese ocorre a partir do metoxipolietilenoglicol propionaldeído (8) e HSA em meio ácido com o agente redutor hidreto de metal complexo. A preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído (8) deu-se da seguinte maneira: Primeiramente ocorre uma reação ácido-base entre o PEG 2000 (1) e o tert-butóxido de. 20. potássio 95% (tBuOK)(6) com formação de um nucleófilo (2). Preferencialmente podese utilizar como catalisador para a reação SN2 um haleto metálico adicional. O nucleófilo haleto substitui o bromo na molécula do 2-(2-bromoetil)-1,3-dioxalano (3), originando o 2-(2-haloetil)-1,3-dioxalano(4), mais reativo. O haleto formado é melhor grupo abandonador, favorecendo a reação com o alcóxido originando o acetal (5). O. 25. acetal (5) é então hidrolisado em ácido mineral aquoso resultando no aldeído (8). A síntese da albumina humana peguilada (HSA-PEG) ocorre através do ataque dos resíduos amina nucleofílicos (7) (pares de elétrons disponíveis no nitrogênio do resíduo alfa-amino dos aminoácidos livres da proteína) no carbono eletrofílico do aldeído peguilado (8) com formação de um intermediário deficiente de elétrons no nitrogênio. 30. (9), que sofre eliminação de água com a formação de um intermediário estável imina (10). Esta sofre uma redução pela ação do cianoboridreto de sódio em meio ácido e resultando na amina peguilada (11). 3. Detalhes do procedimento experimental químico.

(42) 41. 3.1. Preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído. 2g de metoxipolietilenoglicol (2000 KDa) (mPEG) (1) foram dissolvidos em 25 mL de solvente dipolar aprótico não-nitrogenado e adicionados em pequenas porções sob agitação magnética vigorosa 0,308 g de tert-butóxido de potássio 95% (tBuOK) (6) à temperatura ambiente. Após 2 horas o solvente foi removido em rotaevaporador e bomba de vácuo. O sólido obtido foi solubilizado com igual volume de solvente dipolar aprótico não-nitrogenado e foram adicionados 0,15 mL de 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano 96% (3), e 0,018 g de haleto metálico. A mistura reacional ficou em temperatura ambiente e sob agitação magnética durante 5 horas. O solvente foi rotoevaporado e o sólido obtido foi dissolvido em diclorometano (50 mL). Fez-se três extrações de 10 mL de água, e o extrato orgânico submetido à secagem com sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado em rotaevaporador. O produto foi cromatografado em coluna flash com clorofórmio-metanol 95:5. A formação do acetal (5) (rendimento 80 %) foi acompanhada em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHCl 3 95: MeOH 5 e o consumo do mPEG foi acompanhado com auxílio do revelador de vanilina. O acetal (5) purificado foi solubilizado em 10 mL de etanol P.A. e submetido a hidrólise sob refluxo com 1 mL de ácido mineral aquoso 10% e leve aquecimento (30-40oC) até a formação do aldeído (8). A formação do aldeído peguilado (8) (75% de rendimento) foi acompanhado em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHCl3 95: MeOH 5 e revelador DNPH (2,4 dinitrofenilhidrazina 0.1% w/v em HCl 0.4% v/v). Tal síntese foi desenvolvida para aumentar o rendimento do metoxipropionaldeído peguilado8.. 3.2. Preparação da albumina humana peguilada. 1 a 10 mM de metoxipolietilenoglicol propionaldeído (8) foram solubilizados em 10 mL de tampão fosfato de sódio (0,1M) (pH= 4,0) e adicionados 1mM de albumina humana (7) e 20 mM de NaCNBH3, a qual ficaram sob agitação magnética durante 3 horas e sob temperatura ambiente. A peguilação foi realizada com uma razão molar de 1 e 10 do aldeído (8). A formação da HSA-PEG (11) foi acompanhado pelo consumo do aldeído peguilado em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHCl 3 95: MeOH 5 e revelador DNPH ( 2,4 dinitrofenilhidrazina 0.1% w/v em 0.4% HCl v/v)..

(43) 42 Posteriormente a mistura reacional foi liofilizada. Os rendimentos da reação foram obtidos em torno de 45 a 90%. Os produtos peguilados foram caracterizados por RMN1H e RMN13C. Os dados dos principais deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCl3) e RMN13C (200 MHz, =ppm, CDCl3) estão listados na tabela 1. 5 4. REFERÊNCIAS. 1. KODERA, Y.; MATSUSHIMA, A.; HIROTO,M.; NISHIMURA, H.; ISHII, A.; UENO, T.; INADA, Y. PEGylation of proteins and bioactive substances for medical and 10. technical applications. Progress Polymer Science, v.23, p. 1233-1271, 1998.. 2. GRENNWALD, R. B. PEG drugs: an overview. Journal of Controlled Release. v. 74, p.159-171, 2001.. 15. 3. PARVEEN, SUPHIYA; SAHOO, SANJEEB K. Clinical Applications of Polyethylene Glycol Conjugated Proteins and Drugs. Clinical Pharmacokinet. v. 45 (10), p. 965-988. 2006.. 4. FOSER, S.; SCHACHER, A.; WEYER, K. A.; BRUGGER, D.; DIETEL, E.; MARTI, 20. S.; SCHREITMÜLLER, T. Isolation, structural characterization, and antiviral activity of positional isomers of monopegylated interferon α-2a (PEGASYS). Protein Expression and Purification. v.30, p. 78-87, 2003.. 5. ARDUINI, R. M.; LI, Z.; RAPOZA, A.; GRONKE, R.; HESS, D. M.; WEN, D.; 25. MIATKOWSKI, K.; COOTS, C.; KAFFASHAN, A.; VISEUX, N.; DELANEY, J.; DOMON, B.; YOUNG, C. N.; BOYNTON, R.; CHEN, L. L.; CHEN, L.; BETZENHAUSER, M.; MILLER, S.; GILL, A.; PEPINSKY, R. B.; HOCHMAN, P. S.; BAKER, D. P. Expression, purification, and characterization of rat interferon-β and preparation of an N-terminally PEGylated form with improved pharmacokinetic. 30. parameters. Protein Expression and Purification. v. 34, p. 229-242, 2004.. 6. NAKAMURA, K.; ERA, S.; OZAKI, Y.; SOGAMI, M.; HAYASHI, T.; MURAKAMI, M. Conformation changes in seventeen cystine disulfide bridges of.

(44) 43 bovine serum albumin proved by raman spectroscopy. Federation of European Biochemical Societies Letters. v. 417, p.375-378, 1997.. 7. WANG, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. 5. International Journal of Pharmaceuticals. v. 203, p. 1-60, 2000.. 8. ZHAO, YONG-JIANG, ZHAI, YAN-QIN. SU. ZHI-GUO. Kinetic analysis and improvement of the Williamson reaction for the synthesis of (polyethylene glycol) propionaldehyde. Journal of Applied Polymer Science, vol.111, p. 1638-1643. 2009 10 9. GHUMAN J, ZUNSZAIN PA, PETITPAS I, BHATTACHARYA AA, OTAGIRI M, AND CURRY S. Structural basis of the drug-binding specificity of human serum albumin. Journal Molecular Biological. v. 353, p. 38-52, 2005..

(45) 44 5. Reivindicações. 5. A. Uso do processo de obtenção da albumina (HSA) peguilada com metoxipolietilenoglicol propionaldeído nas proporções de 1 a 10 M do aldeído para 1 M da HSA; B. Uso da tecnologia de liofilização para a obtenção da HSA peguilada com o metoxipolietilenoglicol propionaldeído;. 10. C. Uso do produto liofilizado do HSA peguilado obtido com o metoxipolietilenoglicol propionaldeído e HSA nas proporções de 1 a 10M do aldeído para 1 M de HSA. D. Uso do catalisador haleto metálico na etapa de substituição nucleofílica para aumentar o rendimento da alquilação do mPEG com 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano..