UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ISABELA MARIA FORTALEZA NEVES BOMFIM
CULTURAS DE VIGILÂNCIA DE RESISTÊNCIA DE PACIENTES INTERNOS EM UNIDADE DE TERAPIA INTENSIVA DO HOSPITAL REFERÊNCIA EM DOENÇAS
INFECCIOSAS DO RIO GRANDE DO NORTE
NATAL 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Bomfim, Isabela Maria Fortaleza Neves.
Culturas de vigilância de resistência de pacientes internos em unidade de terapia intensiva do hospital referência em doenças infecciosas do Rio Grande do Norte / Isabela Maria Fortaleza Neves Bomfim. - Natal, 2020.
92 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto.
1. Culturas de vigilância epidemiológica - Dissertação. 2. Resistência aos antimicrobianos - Dissertação. 3. Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde - Dissertação. 4. Unidades de Terapia Intensiva - Dissertação. 5. Carbapenêmicos - Dissertação. I. Motta Neto, Renato. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSCB CDU 616-036.22
ISABELA MARIA FORTALEZA NEVES BOMFIM
CULTURAS DE VIGILÂNCIA DE RESISTÊNCIA DE PACIENTES INTERNOS EM UNIDADE DE TERAPIA INTENSIVA DO HOSPITAL REFERÊNCIA EM DOENÇAS
INFECCIOSAS DO RIO GRANDE DO NORTE
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito final para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas na área de concentração de Biologia Parasitária e Microbiologia.
Professor Orientador: Drº. Renato Motta Neto
NATAL 2020
ISABELA MARIA FORTALEZA NEVES BOMFIM
CULTURAS DE VIGILÂNCIA DE RESISTÊNCIA DE PACIENTES INTERNOS EM UNIDADE DE TERAPIA INTENSIVA DO HOSPITAL REFERÊNCIA EM DOENÇAS
INFECCIOSAS DO RIO GRANDE DO NORTE
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas na área de concentração de Biologia Parasitária e Microbiologia.
Orientador: Profº Drº Renato Motta Neto Aprovado em: 13 de julho de 2020.
Banca examinadora:
_____________________________________________________ Professora Doutora Renata Antonacci Gama
Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
______________________________________________________ Professor Doutor Caio Augusto Martins Aires
Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde – UFERSA
______________________________________________________ Professor Doutor Renato Motta Neto
Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
NATAL 2020
Dedico este trabalho para todos
os pacientes que faleceram em
decorrência das Infecções
relacionadas à assistência à
Saúde, em especial ao meu avô,
Antônio Arthur Pampolha
Neves, falecido em novembro de
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente e sempre, a Deus, que em sua infinita bondade e compaixão permitiu que eu chegasse até aqui;
Aos meus pais, em especial à minha Mãe Maria Helena Fortaleza Neves, a pessoa mais doce, guerreira, humana e maravilhosa que já pisou nesta Terra;
Ao meu irmão, Leandro Fortaleza Neves Bomfim, meu irmão de alma, parceiro de todas as horas, companheiro da vida;
Ao amor da minha vida, Elder Santos de Góis, por tornar essa jornada muito mais leve com o nosso amor, carinho e cumplicidade;
Aos meus amigos “Cefetianos”, Jaciara, Phelipe, Vanessa, Hallana e Rayane, por estarem comigo nessa viagem maluca da vida desde 2006;
Minhas amigas do Drº Cursão: Fernanda e Daiany;
Aos amigos que a Biomedicina me deu: Adriane, Marcelle, Luiz, Mayara e Brenna (juntas porque são uma entidade só!), Bia Martins, Ramayana e Lais;
Aos amigos que o mestrado me trouxe: Jorginho, Jully Anne, Bia Gomes, Amanda, Bruna, Emília, Valdiery e Thaisa;
Às minhas ICs que viraram minhas filhas e amigas: Joyce, Yanne, Camila, Carol, Celisa, Brunna;
Sem o apoio de vocês, a amizade, as risadas, a alegria, o companheirismo, eu não teria chegado até aqui!
Ao meu orientador Renato Motta Neto, obrigada pela confiança, incentivo e amizade que construímos;
Aos professores “do condomínio”, nosso corredor tão amado, Fátima Souza, Valter Andrade, Vânia Andrade e Christiane Medeiros, obrigada pela parceria, paciência, ajuda e apoio.
À coordenação do PPGCB pela disponibilidade e atenção, em especial Profº Umberto e Louise, muito obrigada!
Agradeço em especial à CAPES pelo apoio financeiro e por resistir pela ciência brasileira em tempos tão obscuros;
Em suma, a todos que participaram direta ou indiretamente na construção deste trabalho, MUITO OBRIGADA!
RESUMO
As culturas de vigilância epidemiológica são um conjunto de técnicas de isolamento e identificação de microrganismos resistentes aos antimicrobianos em indivíduos colonizados com a finalidade de prevenir surtos e a transmissão desses microrganismos entre pessoas. Neste trabalho, foram coletadas amostras dos sítios retal, axilar e nasal de 24 pacientes da UTI do hospital referência em doenças infecciosas do RN, com o intuito de descrever o perfil bacteriano nessa unidade. Encaminhados para o Laboratório de Micobactérias (LABMIC)/UFRN, os espécimes foram isolados quanto à sua etiologia e resistência bacteriana. Para as cepas de bacilos Gram-negativos (BGN) resistentes aos carbapenêmicos, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) destes frente ao Imipenem e Polimixina B e foram realizadas PCR convencionais com intuito de caracterizar a presença dos genes blaNDM, blaIMP-1, blaIMP-2, blaVIM-1, blaVIM-2, blaOXA-23,bla 0XA-48, blaKPC e mcr-1. Para
os Cocos Gram-positivos (CGP) caracterizados como resistentes à Oxacilina, a determinação da CIM para a Vancomicina foi procedida por Etest®. Como resultado,
foram isoladas e identificadas 62 bactérias com perfil de resistência, sendo 48 (77%) BGN e 14 (23%) CGP. Dentre os BGN, 54% foram produtores de beta-lactamases de espectro estendido. Todos os CGP apresentaram resistência à Oxacilina e sensibilidade para Vancomicina. Dezenove amostras (09 Pseudomonas aeruginosa, 06 Acinetobacter spp. e 04 Klebsiella pneumoniae) apresentaram resistência aos carbapenêmicos (Rcarb). Quanto aos genes Rcarb, 04 (21%) amostras apresentaram o gene blaNDM-1, sendo 01 K. pneumoniae, 01 Acinetobacter spp. e 02 P. aeruginosa.
O gene blaKPC foi encontrado em 08 (42,1%) amostras: 03 K.pneumoniae, 04 P. aeruginosa e 01 Acinetobacter spp. Percebe-se que as características fenotípicas e genotípicas das bactérias isoladas e identificadas no estudo são responsáveis por falhas terapêuticas severas, o que leva a um aumento da morbimortalidade dos pacientes e também demonstra a complexidade da problemática da resistência bacteriana.
Palavras-chave: Culturas de vigilância; Resistência aos antimicrobianos; Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde; Unidades de Terapia Intensiva; Carbapenêmicos.
ABSTRACT
Epidemiological surveillance cultures are a set of techniques for isolation and identification of microorganisms resistant to antimicrobials in colonized individuals in order to prevent outbreaks and their transmission between them. In this work, samples were collected from the rectal, axillary and nasal sites of 24 patients in the ICU of the Rio Grande do Norte state reference hospital in infectious diseases, in order to describe the bacterial profile in this unit. Forwarded to the Mycobacterial Laboratory (LABMIC) / UFRN, the specimens were isolated as to their etiology and bacterial resistance. For Gram-negative bacilli (BGN) strains resistant to carbapenems, their minimum inhibitory concentration (MIC) against Imipenem and Polymyxin B was determined and conventional PCRs were performed in order to characterize the presence of the blaNDM, blaIMP-1, blaIMP-2, blaVIM-1, blaVIM-2, blaOXA-23, blaOXA-48, blaKPC and mcr-1 genes. For Gram-positive cocci (CGP) characterized as resistant to Oxacillin, the determination of the MIC for Vancomycin was performed by Etest®. As a result, 62 bacteria with a resistance profile were isolated and identified, with 48 (77%) BGN and 14 (23%) CGP. Among BGNs, 54% were producers of extended-spectrum beta-lactamases. All CGPs showed resistance to Oxacillin and sensitivity to Vancomycin. Nineteen samples (09 Pseudomonas aeruginosa, 06 Acinetobacter spp. and 04 Klebsiella pneumoniae) showed resistance to carbapenems (Rcarb). For Rcarb genes, 04 (21%) samples presented the blaNDM-1 gene, 01 K. pneumoniae, 01 Acinetobacter
spp. and 02 P. aeruginosa. The blaKPC gene was found in 08 (42.1%) samples: 03 K. pneumoniae, 04 P. aeruginosa and 01 Acinetobacter spp. It is noticed that the phenotypic and genotypic characteristics of the bacteria identified in this work are responsible for severe therapeutic failures, leading to an increase in patients' morbidity and mortality, demonstrating the complexity of the bacterial resistance issue.
Keywords: Surveillance cultures; Antimicrobial resistance; Health Associated Infections (HIAs); Intensive Care Units; Carbapenems.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Fluxograma do método do estudo... 31
FIGURA 2: Teste de sensibilidade aos antimicrobianos ... 355
FIGURA 3: “Zona ghost” representativa de bactéria produtora de ESBL. ... 366
FIGURA 4: Teste do EDTA. O halo identificado com “EDTA” foi 12 mm maior que o halo sem adição do ácido... 377
FIGURA 5: Teste de inibição do carbapenêmico. Bactéria positiva para a produção de carbapenemases. ... 38
FIGURA 6: Microdiluição em caldo para carbapenêmico ... 400
FIGURA 7: Etest® para Vancomicina. ... 40
FIGURA 8: Teste de inibição dos carbapenêmicos. ... 52
FIGURA 9: Eletroforese em gel de agarose 1% denotando os produtos de amplificação por PCR do gene NDM-1. Tamanho 475 pb. MM = Marcador molecular. ... 577
FIGURA 10: Eletroforese em gel de agarose 1% denotando os produtos de amplificação por PCR do gene KPC. Tamanho 1011 pb. MM = Marcador molecular. ... 57
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1: Cepas controle e suas características. ... 33
QUADRO 2: Lista dos Primers utilizados para a pesquisa dos genes de resistência. ... 41
QUADRO 3:Valor da CIM e a sensibilidade ao Imipenem.. ... 54
QUADRO 4: Valor da CIM e a sensibilidade ... 55
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1: Distribuição dos isolados por sítio.. ... 45
GRÁFICO 2:Frequência dos isolados bacterianos por grupo...46
GRÁFICO 3: Diversidade das bactérias isoladas em número absoluto... 47
GRÁFICO 4: Distribuição de frequência das bactérias isoladas por sítio.. ... 48
GRÁFICO 5: Perfil de resistência das Enterobacteriaceae. ... 49
GRÁFICO 6: Perfil de resistência dos bacilos Gram-negativos não fermentadores de açúcares. ... 50
GRÁFICO 7: Perfil de resistência dos cocos Gram-positivos ... 51
GRÁFICO 8: Frequência dos isolados bacterianos por grupo...52
GRÁFICO 9: Distribuição das amostras para concentração inibitória mínima para Imipenem. ... 53
GRÁFICO 10: Distribuição das amostras para concentração inibitória mínima para Polimixina B. ... 55
LISTA DE ABREVIATURAS AMC Amoxicilina com Ácido Clavulânico AmpC Ampicilinases
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária AS Ágar Sangue
ATB Antibiótico
ATCC Coleção Americana de Culturas de Amostras Padrão - do inglês American Type Culture Collection.
ATM Aztreonam
BGN Bacilos Gram-Negativos
BGNNF Bacilo Gram-Negativo Não-Fermentador BHI Brain Heart Infusion
CAZ Ceftazidima
CCIH Comissões de Controle de Infecções Hospitalares CFO Cefoxitina
CFX Cefotaxima
CIM Concentração inibitória mínima CIP Ciprofloxacina
CLI Clindamicina
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMH Caldo Muller-Hinton
CPM Cefepime CRO Ceftriaxona
CTX Cefotaxima
CTX- M Beta-lactamase ativa contra Cefotaxima – Munich
DMP Departamento de Microbiologia e Parasitologia da UFRN DNA Ácido Desoxirribonucleico
EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Ácido Etilenodiamino Tetra-acético)
ESBL β-lactamase de Espectro Estendido IMP Imipenemase
IPM Imipenem
IRAS Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde KPC Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
LABMIC Laboratório de Micobactérias MAC Ágar MacConkey
MBL Metalo-β-lactamase MHA Müller-Hinton agar
MDR Microrganismos multi-droga resistentes
MPM Meropenem
NDM New Dehli Metallo-betalactamase OMS Organização Mundial da Saúde
ORSA Staphylococcus spp. Resistentes à Oxacilina
ORSCN Staphylococcus Coagulase Negativa resistentes à Oxacilina. OXA Oxacilinase
PBP Proteína Ligadora de Penicilina - do inglês Protein Binding Penicillin
PCR Reação em cadeia da polimerase - do inglês Polimerase Chain Reaction
PIT Piperacilina + Tazobactam
SCN Staphylococcus coagulase-negativa
SHV Gene codificante de β-lactamase de Espectro Estendido SPM São Paulo Metallo-betalactamase
SUT Sulfametoxazol + Trimetoprim TBE Tris + Borato + EDTA
TE Tris + EDTA pH 8 TEM Temoneira β-lactamase
TET Tetraciclina
THM Teste de Hodge Modificado
TSA Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos
TSI Ágar Tríplice açúcar ferro - do inglês Triple Sugar Iron UFC Unidade Formadora de Colônia
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte UTI Unidade de Terapia Intensiva
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 17
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO ... 17
1.1.1 INFECÇÕES RELACIONADAS À ASSISTÊNCIA À SAÚDE (IRAS) E AS CULTURAS DE VIGILÂNCIA ... 17
1.1.2 COCOS GRAM-POSITIVOS ... 19
1.1.3 BACILOS GRAM-NEGATIVOS ... 20
1.1.3.1 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE ... 20
1.1.3.2 BACILOS GRAM-NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES DE AÇÚCARES.... 21
1.1.4 ANTIMICROBIANOS ... 22
1.1.4.1 INIBIDORES DA SÍNTESE DE PROTEÍNAS ... 23
1.1.4.2 ATUAM SOBRE ESTRUTURA DO DNA BACTERIANO ... 23
1.1.4.4 ATUAM SOBRE A MEMBRANA CELULAR BACTERIANA ... 24
1.1.4.5 ATUAM SOBRE A PAREDE CELULAR BACTERIANA... 24
1.1.5 RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS ... 25
1.1.6 GENES DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS ... 26
2.0 OBJETIVOS ... 29
2.1 OBJETIVOS GERAIS ... 29
Determinar a frequência de bactérias com perfil de resistência aos antimicrobianos isoladas de culturas de vigilância de pacientes internos em Unidade de Terapia Intensiva do hospital referência em doenças infecciosas do Rio Grande do Norte. . 29
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 29 3.0 METODOLOGIA ... 31 3.1 TIPO DE ESTUDO ... 31 3.2 ASPECTOS ÉTICOS... 32 3.3 CRITÉRIO DE INCLUSÃO ... 32 3.4 COLETA DO ESPÉCIME ... 32 3.4.1 PROCEDIMENTO DE COLETA... 32 3.5 ISOLAMENTO PRIMÁRIO ... 32
3.5.1 IDENTIFICAÇÃO DOS BACILOS GRAM-NEGATIVOS ... 33
3.5.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COCOS GRAM-POSITIVOS ... 33
3.5.3 CEPAS CONTROLE ... 33
3.6 ESTUDO DO PERFIL DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS ... 34
3.7. CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE DETERMINAÇÃO DA RESISTÊNCIA EM BACILOS GRAM-NEGATIVOS ... 35
3.7.1 IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS PRODUTORAS DE BETA-LACTAMASES DE ESPECTRO ESTENDIDO - ESBL ... 36
3.7.2 DETERMINAÇÃO PRESUNTIVA DAS CEPAS PRODUTORAS DE METALO-β-LACTAMASES (MBLs) – TESTE DE BLOQUEIO ENZIMÁTICO... 37
3.7.3 TESTE DE INIBIÇÃO DOS CARBAPENÊMICOS ... 37
3.8. ESTOQUE DAS AMOSTRAS ... 38
3.9 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA POR MICRODILUIÇÃO EM CALDO – IMIPENEM E POLIMIXINA B ... 39
3.10 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA POR ETEST® ... 40
3.11 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS BACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASES E RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B ... 41
3.11.1 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ... 41
3.11.2. EXTRAÇÃO DO DNA ... 42
3.11.3 AMPLIFICAÇÃO DO DNA ... 42
3.11. 4 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE ... 42
4. RESULTADOS ... 45
4.1 CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS BACTERIANAS ... 45
4.2 PERFIL DE RESISTÊNCIA DOS ESPÉCIMES ... 48
4.3 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE DETERMINAÇÃO DA RESISTÊNCIA... 51
4.3.1 PRODUÇÃO DE BETA-LACTAMASES DE ESPECTRO ESTENDIDO ... 51
4.3.2 PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES ... 52
4.3.2.1 TESTE DE INIBIÇÃO DOS CARBAPENÊMICOS ... 52
4.3.2.2 PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES TIPO METALO-β-LACTAMASES (MBL) ... 53
4.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA ... 53
4.4.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA FRENTE AO IMIPENEM (CIM IMIPENEM) ... 53
4.4.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA FRENTE À POLIMIXINA B (CIM POLIMIXINA B)... 54
4.4.3 GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO - ETEST® - PARA VANCOMICINA ... 56
4.5 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS BACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASES ... 56
4.5.1 DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DO GENE mcr-1 ... 58
5. DISCUSSÃO ... 60 6.0 CONCLUSÕES ... 74 7.0 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 76 8.0 REFERÊNCIAS ... 78 9.0 ANEXOS ... 89 9.1 PARECER CEP ... 89
9.2 CARTA DE ACEITE DE ARTIGO ... 91
16
17 1. INTRODUÇÃO
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.1 INFECÇÕES RELACIONADAS À ASSISTÊNCIA À SAÚDE (IRAS) E AS CULTURAS DE VIGILÂNCIA
As Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) são todas as infecções adquiridas após a admissão do paciente em uma unidade hospitalar ou outra unidade de assistência à saúde (KHAN et al., 2017). Essas infecções podem ocorrer durante o processo de internação, bem como após esse período, depois da alta do paciente, quando relacionadas a microrganismos adquiridos no hospital. As IRAS são decorrentes de um desequilíbrio da microbiota normal do paciente e do seu sistema imunológico; estão frequentemente associadas a pacientes em estados mais graves e representam um aumento da morbimortalidade nos pacientes que as adquirem (PEREIRA et al., 2016).
Na microbiota normal do organismo humano encontram-se bactérias com potencial de desenvolver multirresistência aos antimicrobianos; além disso, equipamentos utilizados nos serviços de atenção à saúde aumentam o risco da ocorrência de infecções por microrganismos multirresistentes (MDR) (CORREIA, 2013). As Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) são consideradas pontos críticos e que requerem maior atenção, pois são berços de surtos por bactérias multirresistentes devido à pressão seletiva causada pela utilização exacerbada e, por vezes indiscriminada, de antimicrobianos (CORREIA, 2013).
Nessas unidades, as IRAS são mais graves e frequentes devido aos fatores intrínsecos aos pacientes destas unidades, como a gravidade das doenças; às intensas e invasivas intervenções às quais esses pacientes estão sujeitos; à utilização de imunossupressores; e à pressão seletiva causada pelo uso, por vezes, exacerbado de antimicrobianos, o que favorece a colonização e infecção por MDR (OLIVEIRA et al, 2011; ARCANJO, 2014). Os sítios mais comumente afetados pelas IRAS em UTIs são: sistema circulatório, por meio das infecções da corrente sanguínea; o trato respiratório, por pneumonias e infecções associadas à ventilação mecânica; o trato urinário; e os sítios de incisões cirúrgicas e acessos de cateter (ARCANJO, 2014).
Em países desenvolvidos, a prevalência de IRAS é 7% e nos países em desenvolvimento, estima-se que essa prevalência chegue a 10%. O crescimento das
18 infecções por MDR ao longo dos anos contribui para o aumento do tempo de internação hospitalar, aumento de complicações das internações de longo prazo, aumento da resistência bacteriana, aumento da mortalidade e do impacto socioeconômico das IRAS (KHAN et al., 2017). No Brasil, há uma estimativa de que as IRAS tenham uma prevalência de 15% (PADOVEZE; FORTALEZA, 2014). Contudo, nas UTIs, ela é maior, entre 18 e 54%, e a mortalidade varia de 9 a 38%, podendo alcançar uma taxa de 60% (PEREIRA et al., 2016).
As IRAS afetam um número muito elevado de pessoas ao redor do planeta; são responsáveis por cerca de 40% das mortes em UTIs neonatais, e estudos apontam para o alto impacto econômico dessas infecções (KHAN et al., 2017). No Brasil, constatou-se que os custos relacionados às IRAS em UTI representam um aumento médio de R$735,00 no custeio diário destes pacientes (PEREIRA et al., 2016). Na União Europeia, o custo das IRAS é de mais de 43 milhões de euros por ano (LAMARSALLE et al., 2013).
As culturas de vigilância de resistência bacteriana ou epidemiológica são um conjunto de técnicas de isolamento e identificação de MDR, possibilitando, além da identificação dos patógenos envolvidos e em emergência, dados epidemiológicos e um melhor controle das medidas de contenção das infecções causadas por estes espécimes (MARTINS et al., 2014). A vigilância epidemiológica das infecções por MDR são fundamentais e baseia-se na atenção sistemática e constante da frequência, prevalência e fatores de risco associados à presença destas infecções (SMITH; HUNTER, 2008). Portanto, as culturas de vigilância são fundamentais para a vigilância epidemiológica de MDR.
Com o aumento exponencial e preocupante em escala global dos MDR, a avaliação do perfil de susceptibilidade dos microrganismos frente aos antimicrobianos é fundamental para a prevenção, monitoramento e contingenciamento das IRAS, sendo os programas de vigilância de resistência de suma importância (PAIM; LORENZINI, 2014; MARTINS et al., 2014). As culturas de vigilância são aplicadas especialmente em locais onde há maior risco ou probabilidade de ocorrência de infecções, como as Unidades de Terapia Intensiva, UTIs neonatal, centros de hemodiálise e unidades de atenção a pacientes imunodeprimidos (OPLUSTIL et al., 2010), e os microrganismos pertencentes ao grupo ESKAPE (Enterococcus spp. Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii,
19 Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp.) são os mais comumente implicados nas IRAS (RICE, 2008).
1.1.2 COCOS GRAM-POSITIVOS
As bactérias que compõem o grupo dos Cocos Gram-positivos (CGP) são diversas. Estas apresentam como características em comum a forma esférica, a positividade à coloração de Gram e a ausência de endósporo (MURRAY et al., 2014). Os CGP estão entre os isolados mais frequentes na prática clínica. São comprometidos tanto em infecções locais, quanto sistêmicas em decorrência de exotoxinas expressas por esse grupo. O isolamento desses microrganismos em amostras clinicas sempre deve ser relacionado com a sintomatologia apresentada pelos pacientes, posto que essas bactérias são ubíquas no ambiente e comensais das mucosas e pele humanas, deste modo, garantindo que a patologia realmente seja causada por membros deste grupo (PROCOP et al., 2019). Os mais implicados nas IRAS são os Staphylococcus spp. resistentes à Oxacilina (MRSA) e Staphylococcus spp. resistentes ou com sensibilidade intermediária à Vancomicina (VRSA/VISA) e os Enterococcus spp. Resistentes à Vancomicina (VRE).
O Staphylococcus aureus é o microrganismo patogênico mais importante entre os estafilococos. Fazem parte da microbiota residente, principalmente em dobras da pele e áreas úmidas como axilas, vagina, narinas e intestino. Pessoas com lesões pós-operatórias, acidentadas, imunodeprimidas e com doenças crônicas e/ou em diálise estão mais predispostas às infecções graves por S. aureus (PROCOP et al., 2019). O S. aureus tanto pode causar manifestações menos graves como impetigo, foliculite, carbúnculos e furúnculos, quanto pode levar a doenças mais graves e potencialmente fatais como endocardite, bacteremia, necrose epidérmica tóxica, meningite, osteomielite e a Síndrome do Choque Tóxico Estafilocócico (TONG et al., 2015).
Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) nos últimos anos passaram a ser reconhecidos como importantes patógenos humanos, além de serem reconhecidos como patógenos relevantes nas infecções nosocomiais (WINN JUNIOR et al., 2008). Os SCN estão presentes na microbiota humana, colonizando pele e mucosas, em especial, as axilas, virilha, região perianal e narinas. Staphylococcus epidermidis é o SCN mais isolado. Esse microrganismo causa endocardite de
20 próteses valvares e outras próteses, infecções de feridas cirúrgicas, infecções do trato urinário, oftálmicas e relacionadas à diálise peritoneal e bacteremia. O S. epidermidis em conjunto com o S. haemolyticus e S. lugdunensis formam o grupo S. epidermidis que vem causando agravos em pacientes de UTIs, especialmente em infecções da corrente sanguínea e associadas a dispositivos invasivos (BECKER et al., 2014).
Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium são as espécies mais isoladas nas infecções causadas por esse gênero. Podem acarretar infecções do trato urinário, endocardite infecciosa, bacteremia, infecções intra-abdominais e pélvicas, lesões abdominais supurativas, peritonite, infecções de feridas e tecidos moles, sepse neonatal, meningite e raras infecções pulmonares, geralmente apresentando-se como agentes oportunistas em infecções hospitalares e em pacientes imunocomprometidos (YAMANAKA, 2011; KILLAN, 2012; PROCOP et al., 2019).
Sendo assim, denota-se a importância dos membros do gênero Staphylococcus spp. e Enterococcus spp. devido ao elevado e variado número de patologias provocadas pelo grupo dos cocos Gram-positivos e por sua alta prevalência e importância em infecções relacionas a assistência à saúde (WINN JUNIOR et al., 2008).
1.1.3 BACILOS GRAM-NEGATIVOS
O grupo dos bacilos Gram-negativos é composto por bactérias que compartilham as mesmas características com relação à composição mais complexa e arranjada da parede celular: a membrana externa com a presença de fosfolipídeo, proteínas e lipopolissacarídeo, espaço periplasmático e uma camada delgada de peptídeoglicano. A complexidade da parede celular das bactérias deste grupo determina a negatividade em relação à coloração de Gram (WINN JUNIOR et al., 2008).
1.1.3.1 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
A família Enterobacteriaceae é constituída por microrganismos que são ubiquitários e fazem parte da microbiota da maior parte dos animais, incluindo o homem. São bacilos Gram-negativos, que podem ou não apresentar motilidade, não esporulam e são anaeróbios facultativos. As Enterobacteriaceae caracterizam-se por reduzir nitrato a nitrito, fermentar a glicose e possuir a reação da citocromo-oxidase negativa (HOLANDA et al., 2017). Essa família é responsável por mais de 80% das
21 infecções causadas por Gram-negativos, pois exibe potencial de causar infecções em vários órgãos, tornando-a especialmente importante como agentes causadores de infecções nosocomiais, sendo responsável por mais de 50% desse tipo de infecção (ABBOTT et al., 2007). Os membros desta família têm como característica a facilidade de adquirir e disseminar genes de resistência aos antimicrobianos, dificultando ainda mais o tratamento das infecções causadas por esses patógenos (PROCOP et al., 2019).
Enterobactérias como Salmonella spp. e Shigella spp. sempre estão comprometidas com doenças nos seres humanos, entretanto, outras enterobactérias como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes e Serratia marcescens estão envolvidas em infecções extraintestinais; e a identificação dessas bactérias em diagnósticos de septicemias, infecções de feridas em pacientes diabéticos, endocardite e meningites é bastante frequente (ANSALDI, 2014; HOLANDA et al., 2017).
1.1.3.2 BACILOS GRAM-NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES DE AÇÚCARES Os bacilos Gram-negativos não fermentadores de açúcares (BGNNF) são um grupo de microrganismos aeróbios que obtêm energia por meio da oxidação dos carboidratos. Assim como a família Enterobacteriaceae, são ubíquos no meio ambiente. São patógenos oportunistas e têm despontado como importantes causadores de IRAS (HOLANDA; MOTTA; ARIMATÉIA, 2017; PROCOP et al., 2019). Os principais representantes dos BGGNF são Pseudomonas aeruginosa e o gênero Acinetobacter spp., especialmente o complexo A. calcoaceticus – A. baumannii (GALES et. al, 2012).
As Pseudomonas aeruginosa são distribuídas em todo meio ambiente, causando grande preocupação quando isoladas no ambiente hospitalar; estão presente em alimentos, banheiros, pias, equipamentos de ventilação mecânica, de diálise e, até mesmo, em soluções desinfetantes, sendo o BGNNF mais prevalente nas infecções nosocomiais (WINN JUNIOR et al., 2008; GALES et. al, 2012). A ampla distribuição dessa espécie está relacionada com a sua exigência nutricional pouco robusta, conferindo-lhe a capacidade de sobreviver sob forma de biofilme, resistindo às ações ambientais, de antimicrobianos e do sistema imune do hospedeiro (HOLANDA et al., 2017). Além do mais, as P. aeruginosa emergiram de patógeno
22 oportunista, especialmente em pacientes com queimaduras e doenças pulmonares crônicas, para isolados habituais em IRAS, suscitando apreensão por expressarem inúmeros mecanismos de resistência aos antimicrobianos, que levam a falhas terapêuticas severas e elevação da mortalidade (GALES et al., 2012; ROSSI et al., 2016).
O gênero Acinetobacter spp. é composto por espécies amplamente distribuídas no solo e na água e que têm a capacidade de colonizar superfícies secas, pele e mucosas. Como a diferenciação laboratorial entre as espécies deste gênero é difícil e as diferenças moleculares entre as espécies de relevância clínica são mínimas, estas bactérias foram agrupadas formando o complexo Acinetobacter calcoaceticus – Acinetobacter baumannii (ACB) ou somente complexo A. baumannii, sendo este complexo o de maior frequência nos isolados clínicos(ALMASAUDI, 2016).
Os microrganismos deste grupo são oportunistas e podem causar pneumonia, endocardite, meningite, infecções de pele e feridas, peritonites, infecções do trato urinário e estão implicados nas IRAS graves, acometendo pacientes imunodeprimidos e os internados em UTI, ocasionando, principalmente, bacteremias e infecções relacionadas à ventilação mecânica. O gênero Acinetobacter spp. é um dos mais prevalentes nas unidades de saúde do Brasil, tendo uma taxa de 12,6% de prevalência nestas unidades (ANVISA, 2016).
Esse gênero é capaz de resistir a numerosos agentes antimicrobianos e de desinfecção, fazendo com que o tratamento e controle destas bactérias seja bastante complicado (ALMASAUDI, 2016; ROSSI, et. al, 2016). Ademais, as espécies do complexo A. baumannii expressam intrinsecamente ou de forma adquirida muitos genes de resistência que irão torná-las mais patogênicas, dificultando o tratamento dessas infecções, implicando diretamente na morbimortalidade dos pacientes (ROSSI, et. al, 2016).
1.1.4 ANTIMICROBIANOS
Os antimicrobianos são moléculas químicas com capacidade de se ligar aos receptores proteicos essenciais à homeostasia dos microrganismos. A interação desses fármacos com estas estruturas leva a um abalo na sobrevida do microrganismo, seja por sua destruição ou incapacidade de reprodução. Os antimicrobianos podem ser bacteriostáticos ou bactericidas, sendo os bacteriostáticos
23 aqueles que inviabilizam o crescimento e a reprodução bacteriana e os bactericidas são aqueles que matam as bactérias (TENOVER, 2006; BRUNTON et al., 2012).
A classificação dos antimicrobianos ocorre de acordo com o seu local de ação sobre a bactéria: 1) Inibidores da síntese de proteínas; 2) Atuam sobre estrutura do DNA bacteriano; 3) Atuam sobre o metabolismo bacteriano; 4) Atuam sobre a membrana celular bacteriana; e 5) Atuam sobre a parede celular bacteriana (BRUNTON et al., 2012).
1.1.4.1 INIBIDORES DA SÍNTESE DE PROTEÍNAS
São os antimicrobianos que atuam diretamente sobre a tradução proteica bacteriana, afetando a síntese de proteínas. Esses fármacos agem sobre as unidades ribossomais, 30S ou 50S, causando erros de leitura, paradas antecipadas ou inibição da síntese de cadeias peptídicas. As tetraciclinas e os aminoglicosídeos atuam sobre a unidade 30S do ribossomo. As tetraciclinas quando se ligam à subunidade 30S, impedem a ligação do RNA transportador (RNAt) carreando um aminoácido ao local aceptor no complexo subunidade 30S. Já os aminoglicosídeos ligam-se ao complexo 30S - 50S, levando a erros de leitura do RNA mensageiro (RNAm) e incorporação indevida de aminoácidos (BRUNTON et al., 2012).
Em contrapartida, os macrolídeos e cetolídeos, lincosamidas, clindamicina, estreptograminas, bacitracina, mupirocina e oxazolidinonas são fármacos que atuam na subunidade 50S, impedindo a síntese proteica por inibição da transferência de aminoácidos do local aceptor para o local onde se forma a cadeia peptídica, o que bloqueia o alongamento da cadeia ou a formação do complexo iniciador da síntese proteica na subunidade 50S (BRUNTON et al., 2012; BECKER, 2013).
1.1.4.2 ATUAM SOBRE ESTRUTURA DO DNA BACTERIANO
Os fármacos que atuam sobre a estrutura do DNA bacteriano são os que têm a capacidade de agir diretamente sobre esta molécula. Representam essa classe a rifampicina e as quinolonas. A rifampicina atua sobre a enzima RNA polimerase, impedindo a síntese do RNA, assim, a transcrição do material genético será afetada. É uma das drogas de escolha no tratamento da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) (BRUNTON et al., 2012).
24 As quinolonas agem sobre a DNA-girase e a topoisomerase IV bacterianas. Esses fármacos inibem a atividade de corte e selamento da fita de DNA da DNA-girase e a capacidade de separar as fitas de DNA da topoisomerase IV. Para Gram-positivas, sua ação é na topoisomerase IV; para as Gram-negativas, sua atividade é, principalmente, sobre a DNA-girase (BRUNTON et al., 2012).
1.1.4.3 ATUAM SOBRE O METABOLISMO BACTERIANO
Os fármacos que atuam sobre o metabolismo bacteriano são as sulfonamidas e trimetoprima. Estes são antibacterianos que agem sobre a síntese de folato, que é essencial para as bactérias que não possuem capacidade de absorvê-lo do meio e é fundamental para a síntese de purinas. As sulfonamidas impedem que o PABA (ácido p-aminobenzico) seja incorporado à via de síntese do folato. Já a trimetoprima atua inibindo a diihidrofolatoredutase, que age reduzindo o folato a tetrahidrofolato, e essa forma reduzida é utilizada para reações que envolvem transferência de carbono. Na prática clínica são utilizados esses compostos associados, pois são mais eficazes e atuam sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (BECKER, 2013; BRUNTON et al., 2012).
1.1.4.4 ATUAM SOBRE A MEMBRANA CELULAR BACTERIANA
As Polimixinas são produzidas pelo Bacillus polymyxa e a Colistina ou Polimixina E é produzida pelo Bacillus colistinus. As polimixinas são detergentes catiônicos que interagem com os fosfolipídeos da membrana celular das bactérias, desestabilizando-a e, consequentemente, acarretando a morte bacteriana por perda de sua permeabilidade seletiva. Seu espectro de ação é sobre bactérias Gram-negativas, como Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., P. aeruginosa e Acinetobacter spp. (BECKER, 2013; BRUNTON et al., 2012).
1.1.4.5 ATUAM SOBRE A PAREDE CELULAR BACTERIANA
Os antibacterianos que atuam sobre a parede celular bacteriana são os β-lactâmicos e os glicopeptídeos (BRUNTON et al., 2012). Os β-β-lactâmicos são os antibacterianos mais comumente prescritos e são representados pelas penicilinas, cefalosporinas, monobactâmico e os carbapenêmicos. São fármacos que possuem a presença do anel β-lactâmico em comum em suas estruturas. Os β-lactâmicos atuam
25 ligando-se às PBP, que são proteínas de ligação à penicilina (do inglês Penicilin binding protein) e nas transpeptidases, o que inibe a reação de transpeptidação. Assim, impedem a ligação dos tetrapeptídeos do proteoglicano à cadeia de glicinas bloqueando, portanto, a formação de ligações peptídicas cruzadas e, consequentemente, da parede celular bacteriana. Em suma, obstruem a ocorrência das ligações cruzadas que unem os glicopeptídeos (BRUNTON et al., 2012).
As penicilinas atuam bem contra bactérias Gram-positivas. Em associação com inibidores de β-lactamase, têm seu espectro de ação acentuado. As cefalosporinas são classificadas por geração, de 1ª a 5ª, e no decorrer das gerações sua atividade vai sendo melhorada (ANDRADE; DARINI, 2017). As de 1ª geração funcionam muito bem contra bactérias Gram-positivas e fracamente contra Gram-negativas. As de 2ª geração atuam sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As de 3ª geração têm uma menor atividade sobre bactérias Gram-positivas quando comparadas com as de 1ª geração, entretanto seu espectro de ação sobre bactérias Gram-negativas é muito maior, inclusive atuando sobre Enterobacteriaceae e cepas produtoras de β-lactamase. Já as de 4ª e 5ª geração agem sobre cocos Gram-positivos, Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa e resistem melhor às de β-lactamases. Os carbapenêmicos são β-lactâmicos que possuem espectro de ação muito maior do que as penicilinas e cefalosporinas. São mais resistentes às de β-lactamases e atuam sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas aeróbias e anaeróbias (BRUNTON et al., 2012; BECKER, 2013; ANDRADE; DARINI, 2017).
Os glicopeptídeos são representados pela vancomicina e teicoplanina. Esses fármacos possuem atividade de amplo espectro contra bactérias Gram-positivas. Atuam inibindo a síntese de parede celular por se ligar à subunidade estrutural D-alanil-D-alanina, o que impede a polimerização do peptideoglicano. Recentemente, uma modificação na estrutura da vancomicina a tornou, em testes in vitro, mil vezes mais eficaz do que a vancomicina não modificada, inclusive contra cepas antes resistentes (CASTLE, 2017).
1.1.5 RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS
As bactérias são capazes de expressar resistência aos antimicrobianos de duas formas: intrínseca ou adquirida. A resistência intrínseca significa que uma determinada bactéria será resistente a um composto sem que haja qualquer alteração
26 genética adicional (NORMARK, 2002). Em contrapartida, a resistência adquirida ocorre por meio de mutações ou transferência horizontal de elementos genéticos móveis (RICE, 2012). Devido ao curto tempo de geração e grande tamanho das populações bacterianas, essas mutações são uma fonte contínua de variação genética, o que lhes confere grande adaptabilidade ao meio. Dessa forma, as populações com maior capacidade de sobreviver a certo antibacteriano adquirem uma vantagem reprodutiva e se multiplicam, resultando em resistência e maior frequência desse patógeno na população (RICE, 2012).
Os principais mecanismos de resistência bacteriana são: superexpressão dos sistemas de efluxo; alterações dos sítios de ação dos fármacos; alteração da permeabilidade da membrana celular e inativação enzimática dos fármacos (BRUNTON et al., 2012). Vários antibióticos atuam inibindo a síntese proteica ou inibindo a síntese da parede celular ao se ligar às PBPs (proteínas de ligação da penicilina). Mudanças deste sítio-alvo levam à inatividade do fármaco; um exemplo deste feito são os Staphylococcus spp. resistentes à Oxacilina, que produzem novas PBPs nas quais à penicilina semi-sintética Oxacilina não é capaz de atuar. No mecanismo de superexpressão dos sistemas de efluxo, proteínas na membrana plasmática de bactérias Gram-negativas formam complexos macromoleculares que são bombas que expelem os antibióticos, impedindo que alcancem uma concentração efetiva; um exemplo deste mecanismo é a resistência à Tetraciclina em E. coli. E por fim, a inativação enzimática dos fármacos. Nesse caso, a estrutura do fármaco sofre uma ação enzimática, impedindo que este se ligue ao seu sítio-alvo, como por exemplo as beta-lactamases que destroem a porção amida do anel beta-lactâmico e este não se liga às PBP, que, assim, são bloqueadas de exercer sua função de impedir a síntese da parede celular bacteriana. As bactérias Gram-negativas são o grupo que mais apresenta esse tipo de mecanismo. Um exemplo são as K. pneumoniae produtoras de carbapenamases (GOLL; FARIA, 2014; BRUN BRUNTON et al., 2012).
1.1.6 GENES DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS
As pesquisas acerca dos genes de resistência aos antimicrobianos vêm sendo amplamente performadas devido à preocupação mundial causada pela disseminação destes genes, visto que a expressão destes traz à tona os preocupantes fenótipos de
27 bactérias resistentes (BELLO; DINGLE, 2018). A identificação destes genes é o padrão-ouro para a vigilância da resistência, visto que desta forma obtêm-se informações importantes para compreensão, prevenção e tratamento de patógenos que expressam este fenótipo. Por conta disso, o estudo da biologia molecular dessas bactérias auxilia em todas as etapas de controle da resistência bacteriana (KAHN, 2017).
Os mais importantes patógenos bacterianos multirresistentes são: Enterobacteriaceae produtores de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL), P. aeruginosa, Acinetobacter spp. e Enterobacteriaceae resistentes aos carbapenêmicos, em especial as cepas produtoras de KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) devido a disseminação global desta carbapenemase (KHAN et al., 2017). Em 2017, com o intuito de alertar e orientar pesquisas para tratamentos eficazes contra as bactérias com esses fenótipos de resistência mais frequentes e preocupantes, a Organização Mundial da Saúde estabeleceu uma lista com esses patógenos a partir do seu perfil de criticidade e prioridade para tratamento, pesquisa e contenção de surtos.
As IRAS são um grave problema de saúde pública e acarretam, além do aumento da morbimortalidade entre os pacientes, ônus sociais e financeiros às comunidades que enfrentam surtos por essas infecções. As culturas de vigilância são ferramentas essenciais no combate à resistência bacteriana, promovendo o conhecimento dos microrganismos e políticas para o combate e enfrentamento das infecções por MDR. Baseado nisso, este estudo visa contribuir com informações acerca do contexto da resistência bacteriana e dos patógenos bacterianos mais frequentes na UTI do hospital estadual referência em doenças infecciosas no Rio Grande do Norte, determinar quais os mecanismos de resistência expressos por essas bactérias e servirá como fonte de dados para a comunidade médico-científica na luta contra a resistência bacteriana.
28
29 2.0 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
Determinar a frequência de bactérias com perfil de resistência aos antimicrobianos isoladas de culturas de vigilância de pacientes internos em Unidade de Terapia Intensiva do hospital referência em doenças infecciosas do Rio Grande do Norte.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
▪ Determinar a frequência de cocos positivos (CGP) e bacilos Gram-negativos (BGN);
▪ Definir fenotipicamente o padrão de resistência dos CGP (Resistência à Oxacilina) e dos BGN (ESBL, MBL e produção de carbapenemases); ▪ Precisar a concentração inibitória mínima das bactérias fenotipicamente
resistentes aos carbapenêmicos frente ao Imipenem;
▪ Estabelecer a concentração inibitória mínima das bactérias resistentes aos carbapenêmicos frente à Polimixina B;
▪ Determinar a concentração inibitória mínima dos CGP frente à Vancomicina;
▪ Demonstrar a frequência dos genes de resistência aos carbapenêmicos blaKPC, blaIMP, blaVIM, blaOXA-23, blaOXA-48 e blaNDM-1;
30
31 COLETA
SWABS SÍTIOS
RETAL NASAL AXILAR
TRANSPORTE
MEIO CARY BLAIR
AGAR SANGUE ISOLAMENTO AGAR MACCONKEY ISOLAMENTO COLORAÇÃO DE GRAM PROVAS BIOQUÍMICAS IDENTIFICAÇÃO
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBIOTICOS
TESTES FENOTIPICOS DE DETERMINAÇÃO DA RESISTENCIA
TESTES MOLECULARES
ENRIQUECIMANTO EM CALDO BHI
3.0 METODOLOGIA 3.1 TIPO DE ESTUDO
Trata-se de um estudo descritivo de vigilância de resistência realizado em pacientes internos em unidades de terapia intensiva do hospital referência em doenças infeciosas, localizado no município de Natal – Rio Grande do Norte.
32 3.2 ASPECTOS ÉTICOS
O estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande sob o CAAE 45184115.5.0000.5537 (em anexo).
3.3 CRITÉRIO DE INCLUSÃO
Pacientes internos na Unidade de Terapia Intensiva do hospital de referência em doenças infecciosas do RN por um período igual ou superior a sete dias.
3.4 COLETA DO ESPÉCIME
Foram coletadas amostras de 24 pacientes internados na UTI do hospital de doenças infecciosas do RN, totalizando 54 swabs dos sítios nasal, axilar e retal. As coletas foram realizadas em pacientes de todas as idades e sob quaisquer condições clínicas, contanto que atendessem ao critério de inclusão.
3.4.1 PROCEDIMENTO DE COLETA
Para a coleta dos swabs nos sítios nasal e retal, estes foram embebidos em solução salina estéril, introduzidos por 1cm na narina ou no reto realizando movimentos circulares nas mucosas. Já para o sítio axilar, o swab embebido em solução salina estéril foi friccionado na axila, em movimentos rotacionais que compreendessem uma área aproximada de 2 cm² (RIMLAND; ROBERSON, 1986).
Os espécimes foram coletados no período de agosto de 2018 a março de 2019. Após coleta, os swabs de cada sítio foram acondicionados em meio de transporte Cary-Blair (HIMEDIA) e transportados para processamento no Laboratório de Micobactérias (LABMIC)/DMP/UFRN.
3.5 ISOLAMENTO PRIMÁRIO
Os swabs foram transferidos para caldo BHI (Brain Heart Infusion) (SIGMA) e acondicionados em estufa bacteriológica a 35ºC até visualização de turvação macroscópicas, aproximadamente 8 horas. Passado esse período, os caldos foram
33 semeados para Ágar Sangue de carneiro 5% e Ágar MacConkey (KASVI), sendo novamente mantidos em estufa bacteriológica a 35ºC. Transcorridas 24 horas de repique, as colônias formadas na base dos meios foram identificadas através de suas características macroscópicas morfotintoriais (coloração de Gram) e provas bioquímicas para identificação até espécie (KONEMAN et al., 2008).
3.5.1 IDENTIFICAÇÃO DOS BACILOS GRAM-NEGATIVOS
Após confirmação de colônias de bacilos Gram-negativos, essas foram submetidas às provas bioquímicas recomendadas por Koneman et al (2008): crescimento em ágar tríplice açúcar-ferro (TSI); prova da produção de sulfeto - indol - motilidade (SIM); utilização de Citrato; prova da descarboxilação dos aminoácidos lisina, ornitina e arginina; produção de urease, prova da fenilalanina desaminase; prova do Vermelho de Metila (VM); produção de pigmento e atividade de citocromo-oxidase (para identificação de bactérias não fermentadoras de açúcares).
3.5.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COCOS GRAM-POSITIVOS
A identificação dos cocos Gram-positivos ocorreu pela confirmação das características morfotintoriais por meio da análise dos aspectos coloniais e coloração de Gram, seguidos de semeio em Ágar Manitol salgado (Plastlabor), provas da catalase e coagulase, crescimento em caldo hipercloretado 6,5% e prova da bile-esculina (identificação de Enterococcus spp.). As colônias do gênero Staphylococcus negativas no teste da coagulase foram classificadas como Staphylococcus coagulase negativa (SCN) (JACOBS; ALVES, 2014).
3.5.3 CEPAS CONTROLE
As cepas controles usadas neste estudo estão descritas no Quadro 1 a seguir
34 Procedência das cepas controle: a: Adquiridas comercialmente; b: Doadas pelo Laboratório de
Pesquisa em Infecção Hospitalar/LAPIH – Fiocruz/RJ.
3.6 ESTUDO DO PERFIL DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS
O estudo do perfil de sensibilidade a antimicrobianos foi realizado com as cepas isoladas e identificadas por meio do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) ou antibiograma utilizando a técnica de disco-difusão em ágar (Kirby-Bauer), acatando as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI 2018.
A partir de uma cultura pura, com uma alça microbiológica, foi tocada a superfície de 4 a 5 colônias bacterianas de aspecto similar, e esse inóculo foi transferido para um tubo contendo 5ml de solução salina estéril com turvação ajustada para 0,5 da escala MacFarland (PROBAC), correspondente a, aproximadamente, 108 UFC/ml. Então, um swab foi submerso nessa suspensão e
semeado por distensão em Ágar Müller-Hinton (MH) (HIMEDIA). Os discos de antibióticos foram escolhidos obedecendo aos critérios do CLSI 2018 e colocados manualmente sobre a superfície do ágar MH (figura 01). As placas foram incubadas a 35°C± 2°C em estufa bacteriológica por 18 horas. Após esse período, com uma régua ou paquímetro, foram realizadas a mensuração dos diâmetros da zona de inibição do crescimento ao redor de cada disco de antibiótico e classificamos como sensível, intermediário ou resistente conforme o CLSI 2018.
Seguindo o CLSI 2018, para a família Enterobacteriaceae foram utilizados os seguintes discos : Imipenem (10µg), Ciprofloxacina (05 µg), Meropenem (10 µg), Aztreonam (30 µg), Cefuroxima (30 µg), Amoxicilina com ácido clavulânico (30 µg), Ampicilina (10 µg), Ceftriaxona (30 µg), Cefotaxima (30 µg), Cefoxitina (30 µg), Cefepime (30 µg), Ceftazidima (30 µg), Tetraciclina (30 µg) e Gentamicina (10 µg).
Para Pseudomonas aeruginosa: Piperacilina com tazobactam (110 µg), Ceftazidima (30 µg), Cefepime (30 µg), Aztreonam (30 µg), Imipenem (10 µg),
Cepa Características
Escherichia coli ATCC 25922a
Controle de testes de sensibilidade Klebsiella pneumoniae
CCBH 4955b Cepa blaKPC positiva Staphylococcus aureus
ATCC 25923a
Controle de testes de sensibilidade
35 FIGURA 2: Teste de sensibilidade aos antimicrobianos.
Meropenem (10 µg), Ciprofloxacina (05 µg), Gentamicina (10 µg), Tobramicina (10 µg), Amicacina (30 µg) e Tetraciclina (30 µg).
Nos Acinetobacter spp. os discos de antibióticos utilizados foram Piperacilina com tazobactam (110 µg), Ceftazidima (30 µg), Ceftriaxona (30 µg), Cefotaxima (30 µg), Cefepime (30 µg), Imipenem (10 µg), Meropenem (10 µg), Gentamicina (10 µg), Amicacina (30 µg), Tobramicina (10 µg), Ciprofloxacina (05 µg), Sulfametoxazol com trimetroprin (25 µg) e Tetraciclina (30 µg).
Para os cocos Gram-positivos utilizamos Penicilina (10 UI), Cefoxitina (30 µg), Eritromicina (15 µg), Azitromicina (15 µg), Tetraciclina (30 µg), Ciprofloxacina (05 µg), Clindamicina (02 µg), Sulfametoxazol com trimetroprin (25 µg) e Linezolida (30 µg). Todos os discos utilizados neste trabalho foram da empresa DME.
Fonte: LABMIC/DMP – UFRN/2019.
3.7. CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE DETERMINAÇÃO DA RESISTÊNCIA EM BACILOS GRAM-NEGATIVOS
As bactérias que apresentaram halos de inibição com pontos de corte presuntivos para resistência aos carbapenêmicos testados, Meropenem 10μg e
36 Imipenem 10μg, foram submetidas aos testes fenotípicos de detecção da produção de carbapenemases: teste de bloqueio enzimático para avaliação da produção de metalo- β – lactamases (CLSI, 2018) e teste de inibição dos carbapenêmicos (Schouls et al., 2015). Os microrganismos referidos também foram submetidos à determinação da concentração inibitória mínima para o Imipenem e para a Polimixina B. O controle de qualidade do teste foi feito por meio da cepa E.coli ATCC 25922.
3.7.1 IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS PRODUTORAS DE BETA-LACTAMASES DE ESPECTRO ESTENDIDO - ESBL
Quando detectada no teste de sensibilidade aos antimicrobianos a resistência de enterobactérias a, pelo menos, uma cefalosporina de 3ª geração, com sensibilidade a carbapenêmico, o teste fenotípico de disco aproximação para detecção de ESBL foi conduzido (CLSI, 2018). O procedimento segue a metodologia do item 4.6, entretanto foram adicionados à placa de ágar Müller-Hinton (HIMEDIA) os discos de Amoxicilina com Ácido clavulânico (AMC) no centro, a distância de 20mm dos discos de Aztreonam (ATM), Ceftazidima (CAZ), Cefotaxima (CTX) e Cefepime (CPM) (todos da marca DME), de maneira a, assim, obedecer aos critérios do CLSI 2018. Após a incubação da placa por 18h a 35 ± 2ºC, interpretava-se o teste. Foram consideradas positivas para produção de ESBL as amostras que apresentavam a “zona ghost” no espaço entre pelo menos um dos discos periféricos e o disco central de AMC (figura 02).
FIGURA 3: “Zona ghost” representativa de bactéria produtora de ESBL.
Fonte: LABMIC/DMP – UFRN/2019. Zona “Ghost”
37 3.7.2 DETERMINAÇÃO PRESUNTIVA DAS CEPAS PRODUTORAS DE METALO-β-LACTAMASES (MBLs) – TESTE DE BLOQUEIO ENZIMÁTICO
Os bacilos Gram-negativos que apresentaram halos de inibição com pontos de corte presuntivos para resistência aos carbapenêmicos testados, Meropenem 10μg e Imipenem 10μg, foram submetidas aos testes fenotípicos de detecção da produção de carbapenemases: teste de bloqueio enzimático para avaliação da produção de metalo-β-lactamases e teste de inibição dos carbapenêmicos. O controle de qualidade do teste foi feito por meio da cepa E.coli ATCC 25922.
No teste para produção de MBL, o EDTA tem por função quelar o metal do cofator enzimático e, desta forma, inativá-la. Assim, foram colocados dois discos de carbapenêmicos em uma placa e em um deles foi adicionada a solução de EDTA 0,5 M. (figura 03).
FIGURA 4: Teste do EDTA. O halo identificado com “EDTA” foi 12 mm maior que o halo sem adição do ácido.
Fonte: LABMIC/DMP – UFRN/2019.
3.7.3 TESTE DE INIBIÇÃO DOS CARBAPENÊMICOS
Para o teste de inibição dos carbapenêmicos, foi utilizado o protocolo de Schouls et al., 2015. Em um microtubo contendo 400 µl de solução fisiológica estéril foram adicionados, na sequência, uma alçada de 10 µl da bactéria a ser testada e um
38 disco de carbapenêmico (utilizamos o disco de Imipenem 10 µg da marca DME). A solução foi incubada em estufa bacteriológica por, pelo menos, 2 horas a 35 ± 2ºC. Transcorrido esse intervalo de tempo, foi feito o semeio por distensão da bactéria E. coli ATCC 25922 (sensível aos carbapenêmicos) a 0,5 MacFarland em Ágar Müller-Hinton (HIMEDIA) e colocou-se na placa o disco de Imipenem e o disco que estava na solução bacteriana. Os resultados são positivos para produção de carbapenemases quando não há formação do halo de inibição ao redor do disco que esteve incubado em solução bacteriana, pois denota que este carbapenêmico foi inativado pelas carbapenemases da bactéria testada (figura 04) (SCHOULS et al., 2015).
FIGURA 5: Teste de inibição do carbapenêmico. Bactéria positiva para a produção de carbapenemases.
Fonte: Schouls et al., 2015. 3.8. ESTOQUE DAS AMOSTRAS
Logo após terem sido isoladas e identificadas, as cepas foram todas estocadas. Inóculos pesados das colônias isoladas do microrganismo previamente identificado foram ressuspendidos em microtubo tipo eppendorf contendo 1,5 ml de caldo BHI (Brain Heart Infusion) (SIGMA) 10% de glicerol (QUIMIS) e um disco de Ampicilina 10 mcg (DME), para conservação da estrutura bacteriana durante o congelamento e promoção de uma pressão seletiva positiva para conservação dos genes de
+ Produção de carbapenemase
- Não produtora de carbapenemase
39 resistência. Subsequentemente, essas amostras foram armazenadas em freezer à temperatura de -20⁰ C.
3.9 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA POR MICRODILUIÇÃO EM CALDO – IMIPENEM E POLIMIXINA B
As cepas que apresentaram no teste de sensibilidade (técnica de ágar disco-difusão) aos antimicrobianos um perfil de resistência aos carbapenêmicos testados passaram pelos testes de determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para o Imipenem e para a Polimixina B.
A concentração inibitória mínima foi determinada, em duplicata, através da microdiluição em caldo, seguindo as recomendações do CLSI 2018. Nessa técnica, as cepas foram distribuídas em placas de microtitulação contendo diferentes concentrações dos sais dos antibióticos Imipenem hidratado (Cayman Industries) e da Polimixina B (SIGMA).
Uma solução inicial na concentração de 5120 μg/ml dos fármacos (Polimixina B e Imipenem) foi preparada e, a partir dela, foram realizadas diluições seriadas em caldo Müller-Hinton (CMH) (HIMEDIA). Para a CIM da Polimixina B utilizou-se o CMH com ajuste de cátions, conforme preconizado pelo CLSI. Para o Imipenem, as diluições foram de 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml, 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml e 0,5 μg/ml. Para a Polimixina B, as diluições foram 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml, 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml e 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml (CLSI, 2018).
Em seguida, após identificação, 50 μl de cada concentração foi distribuída em placa de microtitulação de 96 poços. O inóculo das bactérias de interesse foi feito a partir do crescimento overnight em meio Ágar Nutriente (HIMEDIA). Desses semeios, foi feita a suspensão bacteriana na escala 0,5 MacFarland em solução salina estéril e a diluição 1:10 em caldo Müller-Hinton para obtenção de uma concentração 107
UFC/mL. Feito isto, 50 μL da suspensão bacteriana caldo Müller-Hinton 1:10 foi distribuída nos poços já contendo as diferentes concentrações do fármaco a ser testado. As placas foram incubadas a 35 ± 2°C por 18 horas e logo procedeu-se à leitura visual. A cepa E. coli ATCC 25922 foi o controle negativo.
40 FIGURA 6: Microdiluição em caldo para carbapenêmico
Fonte: LABMIC/DMP – UFRN/2019.
3.10 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA POR ETEST®
As amostras de cocos Gram-positivos que apresentaram resistência à Cefoxitina (teste representativo para resistência à Oxacilina) no Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos foram submetidas à determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para Vancomicina por meio do teste do gradiente de concentração ou teste episilométrico, conhecido popularmente pela marca ETEST® (AB Biodisk) (CLSI,2018).
O procedimento deste teste é o mesmo do item 4.6, porém foi adicionada na região central da placa de Müller-Hinton a fita do Etest® para a Vancomicina (Biomèrieux). A placa, na sequência, foi incubada em estufa bacteriológica a 35 ± 2°C por 24 horas. Essa fita possui uma graduação de diferentes concentrações do antibiótico de interesse e a interpretação da CIM é feita a partir da visualização do ponto de intersecção da fita e da zona de crescimento bacteriano
FIGURA 7: Etest® para Vancomicina.
41 3.11 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS BACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASES E RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B
As cepas que apresentaram no Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA) resistência aos carbapenêmicos testados foram submetidas à caracterização molecular, com a intenção de determinar a presença do gene de resistência. As amostras que apresentaram no teste de concentração inibitória mínima resistência à Polimixina B foram testadas para a presença do gene mcr-1.
3.11.1 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Foi realizada a reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) PCR - para a pesquisa dos genes que codificam as carbapenemases tipo metalo-β-lactamases IMP-1, IMP-2, VIM-1, VIM-2 e NDM-1; das oxacilinases 23 e OXA-48; e da serino-carbapenemase KPC. Também foi realizada a pesquisa do gene mcr-1 para as bactérias que apresentaram resistência à Polimixina B (quadro 2).
QUADRO 2: Lista dos Primers utilizados para a pesquisa dos genes de resistência.
Genes –
Primers Sequência Nucleotídica
Tamanho do Amplicon Referência blaOXA-23 F* 5'-GGAATTCCATGAATAAATATTTTAC TTGC-3' 200 pb Mugnier et al., 2009 blaOXA-23 R** 5'-CGGGATCCCGTTAAATAATATTCA GGTC-3' blaOXA-48 F 5'-TTGGTGGCATCGATTATCGG-3' 743 pb Brink et al., 2012 blaOXA-48 R 5'-GAGCACTTCTTTTGTGATGGC-3'
bla IMP-1 F 5'-TGAGCAAGTTATCTGTATTC-3'
740 pb Franco et al., 2010
bla IMP-1 R 5'-TTAGTTGCTTGGTTTTGATG-3'
bla IMP-2 R 5'-GGCAGTCGCCCTAAAACAAA-3'
737 pb Franco et al., 2010
bla IMP-2 F 5'- TAGTTACTTGGCTGTGATGG -3'
bla VIM -1 F 5'-ATGTTAAAAGTTATTAGTAGTTTAT TG-3' 801 pb Juan et al., 2008
bla VIM-1 R 5'-CTACTCGGCGACTGAGC-3'
bla VIM-2 F 5'-ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG-3'
801 pb Juan et al., 2008
bla VIM-2 R 5'-CTACTCAACGACTGAGCG-3'
bla NDM-1 F 5'-GGGCAGTCGCTTCCAACGGT-3'
475 pb Gupta et al., 2014
bla NDM-1 R 5'-GTAGTGCTCAGTGTCGGCAT-3'
42 bla KPC R 5'- CTCAGTGCTTACAGAAAAACC-3' Ygiti et al., 2001 mcr-1 F 5ʹ-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3 309 pb Liu et al., 2016 mcr-1 R 5ʹ-CTTGGTCGGTCTGTA GGG-3
*F: Primers forward **R: Primer reverse
3.11.2. EXTRAÇÃO DO DNA
Para obtenção do DNA bacteriano dos isolados, utilizou-se a metodologia de lise térmica, seguindo o protocolo de Ribeiro Junior et al. (2016). Em um microtubo tipo eppendorf foi feita uma suspensão densa de colônias puras dos isolados crescidos por 24 horas em Ágar nutriente (HIMEDIA) em 500 μl de solução tampão TE (Tris + EDTA pH 8) e centrifugada a 3000 rpm por 5 min. Transcorrido esse tempo, o preciptado obtido foi ressuspenso em 200 μl do tampão TE e incubado em banho-maria a 100°C por 5 min. A seguir, as amostras foram congeladas por 10 min no freezer a -20°C e centrifugadas por 5 min a 13000 rpm (MicroCL 17R Centrifuge – Thermo Fischer Scientific). Uma alíquota de 100 μl do sobrenadante, contendo o DNA bacteriano foi, então, transferida para outro microtubo estéril e estocada a -20°C até a sua utilização.
3.11.3 AMPLIFICAÇÃO DO DNA
Para a amplificação do DNA foram utilizados 1 μl do DNA extraído, 22,5 μl do PCR SuperMix (Invitrogen, ThermoFischer Scientific), e 0,75 μl dos primers forward e reverse, totalizando um volume final de 25 μl. Os parâmetros de termociclagem e a sequência nucleotídica dos primers foram aplicados de acordo com os autores referenciados na tabela 2.
3.11. 4 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
Para visualização dos fragmentos amplificados pela PCR, operou-se eletroforese em gel de agarose (Ludwing) 1% em tampão TBE 10% (TRIS – Borato – EDTA). As corridas de eletroforeses foram realizadas em tampão TBE 10% sob uma corrente elétrica de 100 Volts por 80 minutos. Em cada poço foram adicionados 5 μl do produto de PCR, 2,5 μl de GelRed (Invitrogen, ThermoFischer Scientific) e 2,5 μl
43 de Orange Blue, com exceção do poço destinado ao marcador molecular (ladder) que recebe 5 μl de GeneRuller 2000 pb DNA Ladder (Fermentas) e 2,5 μl de GelRed e 2,5 μl de Orange Blue. Após a corrida os géis foram lidos em luz ultravioleta no Transiluminador L-Pix EX Loccus (Loccus Biotecnologia).
44
45 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 RETAL NASAL AXILAR TOTAL IS O LAD O S P O R S ÍTI O Total de isolaodos
ISOLADOS POR SÍTIO
4. RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS BACTERIANAS
Dos 24 pacientes amostrados neste estudo foram isoladas 62 bactérias dos sítios nasal, axilar e retal, sendo 24 (38,7%) bactérias do sítio axilar, 29 (46,7%) do sítio nasal e 09 (14,5%) do sítio retal (gráfico 1). Deste total, foram encontrados 48 (77%) bacilos Gram-negativos, dentre membros da família Enterobacteriaceae e bacilos negativos não fermentadores de açúcares, e 14 (23%) Cocos Gram-positivos (gráfico 2).
46 GRÁFICO 2: Frequência dos isolados bacterianos por grupo.
Dentre os espécimes encontrados, 04 espécies pertenciam a família Enterobacteriaceae: K. pneumoniae, sendo 27 isolados (43,5%); C. freudii e E. coli, cada uma com um único isolado (1,61% cada) e P. vulgaris e P. mirabilis, também com um isolado cada (1,61% cada). Para os bacilos Gram-negativos não fermentadores de açúcares foram isolados 09 (14,5%) P. aeruginosa e 08 (13%) Acinetobacter spp. Por fim, foram isolados 07 (11,3%) Staphylococcus coagulase-negativa, 03 (4,8%) Staphylococcus aureus e 04 (6,5%) Enterococcus spp. (gráfico 03).
23%/14
77%/48
