Estudo da influência dos siRNAS na replicação do vírus da hepatite delta e análise da expressão genética em células infectadas

Texto

(1)Universidade Nova de Lisboa Instituto de Higiene e Medicina Tropical Unidade de Biologia Molecular. Estudo da influência dos siRNAs na replicação do vírus da hepatite delta e análise da expressão genética em células infectadas. Sérgio Miguel Regufe da Mota. Doutoramento em Ciências Biomédicas. Tese orientada por Professor Doutor Celso Vladimiro Cunha e Professora Doutora Ana Maria Varela Coelho. 2009.

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(3) __________________________________________________________________________________________. Agradecimentos. Este trabalho não teria sido realizado sem a indispensável ajuda de muitas pessoas que de várias maneiras contribuíram para a realização desta tese. A todas elas agradeço. No entanto, várias pessoas se destacaram pelo seu contributo durante a realização desta tese. A todas estas pessoas gostaria de endereçar um especial agradecimento. Começo por endereçar um agradecimento especial ao Prof. Dr. Celso Vladimiro Cunha que me recebeu no seu laboratório há mais de seis anos como orientador da minha tese de licenciatura. E que dois anos depois aceitou se orientador desta tese de doutoramento. Agradeço todo o apoio, dedicação, disponibilidade, empenho, orientação científica e amizade dedicadas durante esta longa colaboração. Não posso deixar de agradecer a todos os membros da Unidade de Biologia Molecular que me acompanharam neste percurso. Em especial à Eng. Marta Mendes. Pois o seu trabalho na preparação dos extractos proteicos, na identificação das proteínas diferencialmente expressas na presença dos RNAs e das proteínas virais e na validação dos resultados obtidos por 2DE em muito contribuiu para a conclusão deste trabalho. À Dr. Ana Varela Coelho pela orientação, apoio e por me ter acolhido no seu laboratório. Queria também estender este agradecimento a todas as pessoas que me ajudaram no laboratório de espectrometria de massa em especial à Elisabete Pires e a Catarina Franco. À Dr. Deborah Penque por me ter recebido no seu laboratório com enorme carinho e pela orientação e supervisão durante a realização de uma parte fundamental deste trabalho. Também não posso deixar de referir todas as pessoas que me receberam no laboratório de proteómica e que sempre me encorajaram e apoiaram em especial à Andrea Simas e à Patrícia Alves. Não posso deixar de agradecer aos membros da minha comissão tutorial pela sua orientação durante a realização desta tese e que contribuíram com sugestões e comentários ao desenrolar dos trabalhos. Um agradecimento especial à Prof. Dr. Aida Esteves Cardoso e ao Prof. Dr. Ricardo Parreira.. __________________________________________________________________________________________ i.

(4) __________________________________________________________________________________________. Ao Prof. Dr. Pedro Cravo por toda a ajuda e orientação prestadas durante a realização dos ensaios de real time PCR. À Fundação para a Ciência e Tecnologia pelo financiamento deste trabalho durante estes quatro anos através da atribuição de uma bolsa de doutoramento (SFRH/ BD/12691/2003). Numa nota mais pessoal não posso deixar de agradecer a todos os membros, amigos e colegas do laboratório de biologia molecular que durante este percurso me apoiaram, ajudaram e aconselharam. À Natália Freitas, Marta Mendes, Ana Casaca e Carolina Alves um muito obrigado. À Ana por ter estado sempre ao meu lado e por me sempre apoiar no decorrer deste trabalho. Aos meus pais e ao meu irmão por sempre acreditarem em mim e por me encorajaram e fazer sempre mais e melhor.. __________________________________________________________________________________________ ii.

(5) __________________________________________________________________________________________. Abstract. The hepatitis delta virus (HDV) is the only known human satellite virus and the only member of the floating genus Deltavirus. The replication of the HDV occurs independently of the replication of the helper virus, the hepatitis B virus (HBV), but to form infectious particles it needs the HBV surface proteins. Upon entering the nucleus the HDV single stranded, genomic RNA replicates by a rolling circle mechanism with the production of a complement strain of RNA, the antigenomic RNA. The HDV only encodes for one protein that exists in two forms, the small antigen and the large antigen. The delta antigens share most of their aminoacid sequence however they display different roles in the HDV life cycle. The small antigen is essential for viral replication whereas the large antigen in necessary for viral encapsidation. Despite its simplicity the HDV causes an increase in symptom severity. Thus, in this work we analysed the changes in the cellular proteome caused by the HDV replication. We identified 43 differentially expressed proteins in the presence of the HDV RNPs. Several of these proteins were involved in the replication of other viral hepatitis, namely the molecular chaperone DNA K, the oxygen regulated protein 150kDa and the ribonuclearprotein La. We also identified some proteins related to the cellular defence against viral infection such as the copine I protein and the anfoterin protein. After this primary analysis we also identified differentially expressed proteins in the presence of each of the HDV components. We observed 25 proteins with the expression pattern altered in the presence of the small antigen and the large antigen. Both antigens cause changes in the same number of proteins however these proteins have different functions in the cell. The small antigen causes changes in proteins related the nucleic acid metabolism like the alpha-complex protein 1, the heterogeneous ribonuclear particle protein L and the zinc finger protein 326. Whereas the large antigen causes changes in the expression pattern of proteins related with the cellular transport like the vesicle transport related protein and with the energy pathways of the cell. In the cells that expressed the genomic RNA we observed 14 differentially expressed proteins and we observed 23 differentially expressed proteins in the cells expressing the antigenomic RNA. These proteins were primary related with the protein metabolism and with the energy pathways of the cell.. __________________________________________________________________________________________ iii.

(6) __________________________________________________________________________________________. The results obtained by proteomic analysis were confirmed by quantification of the expression of the ribonuclearprotein La and the lamin A/C protein in the presence of the HDV RNPs by western blot. Whereas the results for the proteins: oxygen-regulated protein 150K, triosephosphate isomerase, heterogeneous nuclear ribonuclearprotein D, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H and histone H1-binding protein were confirmed by quantification of the mRNA by qPCR. We used the proteins differentially expressed in the presence of the viral RNPs to construct a protein-protein interactions network. We identified several proteins in this network that interacted with the previously identified proteins that are involved in the replication of several viruses, namely the c-myc protein, and in the development of cancer cells, namely the growth factor receptor-bound protein 2. The second part of this work aimed at analysing the ability of shRNAs in inhibiting the replication of the HDV. We constructed several vectors that expressed shRNAs targeting the different types of viral RNA. Then we analysed the number of cells expressing the viral proteins in the presence of the shRNAs by indirect immunofluorescence. All the sequences used were capable of decreasing the number of cells expressing the delta antigens in about 70%. Finally we quantified the expression of the delta antigens by western blot. Here we observed quite different results because only the sequences that targeted the viral mRNA were capable of inhibiting the expression level of the delta antigens. The small antigen was 30% repressed whereas the large antigen showed a 60% decrease in the expression levels. Interestingly we observed an increase in the levels of the delta antigens when we targeted the antigenomic RNA. Finally we analysed the changes in the viral replication in cells that expressed shRNAs against cellular proteins. In order to understand the importance of these overexpressed proteins, during the presence of the HDV, in the replication of the HDV. We inhibit the expression of these proteins: ribonuclearprotein La, lamin A/C, oxygen-regulated protein 150kDa, molecular chaperone DNA K, chaperonin GroEL and the lamin B2 protein. We then analysed the changes in the HDV mRNA level under these conditions. The results indicated a drastic decrease in the HDV mRNA level in the cells where the expression of the lamin B2 was decreased. Whereas, in the cells in which we repressed the expression of the lamin A/C we observed only a slight increase in the HDV mRNA level. We then analysed the changes in the expression of the HDV antigens by western blot. We observed a decrease in the expression levels of both the HDV antigens only when we repressed the expression of the __________________________________________________________________________________________ iv.

(7) __________________________________________________________________________________________. lamin B2 protein. However the levels of the large antigen were found to be downregulated when we inhibit the expression of the ribonuclearprotein La, the molecular chaperone DNA K, the oxygen-regulated protein 150kDa and the chaperonin GroEL. This work constitutes a first approach to understand the cellular changes that occur during the HDV replication that might explain the increase in symptom severity in HDV infected patients. We identified several proteins involved in the replication of other hepatitis viruses and in the development of carcinoma. Several of the upregulated proteins appear to be important in the HDV replication cycle. Thus providing additional information to further investigate and identify novel therapeutic targets.. __________________________________________________________________________________________ v.

(8) __________________________________________________________________________________________. Resumo. O vírus da hepatite delta (HDV) é o único vírus satélite humano conhecido até à data e membro do género Deltavirus. A replicação do HDV ocorre de forma independente da replicação do vírus da hepatite B (HBV) no entanto para formar partículas infecciosas o HDV necessita das proteínas de superfície do HBV. Após a entrada no núcleo o RNA genómico de cadeia simples do HDV replica por um mecanismo de círculo rolante com a produção da cadeia de RNA complementar, o RNA antigenómico. O HDV apenas codifica uma proteína da qual existem duas formas, o antigénio pequeno e o antigénio grande. Apesar de ambos os antigénios partilharem grande parte da cadeia de aminoácidos eles possuem papéis distintos na replicação do HDV. O antigénio pequeno é essencial para a replicação viral enquanto o antigénio grande é necessário para a formação de partículas infecciosas. Apesar da simplicidade do HDV este provoca um agravamento dos sintomas dos pacientes. Na primeira parte do trabalho pretendeu-se compreender as alterações provocadas pela replicação do HDV no proteoma das células. Verificou-se que a replicação do HDV provoca alterações no padrão de expressão de 43 proteínas celulares. Destas muitas encontram-se também diferencialmente expressas durante a replicação de outros vírus de hepatite como a chaperona molecular K, a proteína regulada pelo oxigénio 105kDa ou a ribonucleoproteína La. Também foram identificadas algumas proteínas relacionadas com a defesa da célula à infecção viral nomeadamente a copina I e a anfoterina. Posteriormente analisou-se as alterações no proteoma das células causadas pela expressão transiente de cada um dos constituintes do HDV. Observou-se alterações no padrão de expressão de 25 proteínas na presença do antigénio pequeno e do antigénio grande. Apesar do número de proteínas com o padrão de expressão alterado ser o mesmo os antigénios delta provocam alterações distintas na célula. O antigénio pequeno altera o padrão de expressão de várias proteínas relacionadas com o metabolismo dos ácidos nucleicos como a proteína 1 do complexo alfa, a proteína ribonuclear heterogénea L ou a proteína zinc finger 326. Enquanto a presença do antigénio grande provocava alterações em proteínas relacionadas com o transporte celular, como a proteína relacionada com o transporte de vesículas e com as vias energéticas. Quando as células expressam o RNA genómico apenas se observam alterações no padrão de expressão de 14 proteínas, a maioria delas envolvida em processos relacionados com o metabolismo celular, transporte enquanto que o RNA antigenómico provoca alterações __________________________________________________________________________________________ vi.

(9) __________________________________________________________________________________________. no padrão de expressão de 23 proteínas relacionadas principalmente com o metabolismo de proteínas e com as vias energéticas. Os resultados obtidos por análise do proteoma foram validados por quantificação da expressão da lamina A/C e da ribonucleoproteína La na presença das RNPs virais por western blot. A validação dos resultados obtidos por 2DE para as proteínas: triosefosfato isomerase, proteína H1 de ligação às histonas, ribonucleoproteína nuclear heterogénea H, ribonucleoproteína nuclear heterogénea D e da proteína de choque térmico 105kDa foi efectuada por quantificação do mRNA utilizando qPCR. As proteínas diferencialmente expressas na presença das RNPs virais foram utilizadas na construção de uma rede de interacções proteína-proteína. Foram identificadas várias proteínas nesta rede, que interagem com as proteínas anteriormente identificadas, que estão envolvidas na replicação de vários vírus, nomeadamente a proteína c-myc, e no desenvolvimento de células cancerosas, nomeadamente a proteína 2 de ligação ao receptor do factor de crescimento. Na segunda parte deste trabalho pretendeu-se analisar a capacidade dos shRNAs em inibir a replicação do HDV. Para isso foram construídos vários vectores que expressam shRNAs dirigidos para os diferentes tipos de RNA do HDV. De seguida quantificou-se o número de células que exprimia os antigénios delta na presença dos shRNAs por imunofluorescência indirecta. Verificou-se que todas as sequências utilizadas eram capazes de diminuir o número de células que exprimia os antigénios delta em cerca de 70%. Posteriormente quantificou-se a expressão dos antigénios delta por western blot. Aqui os resultados foram bastante diferentes pois apenas as sequências que tinham como alvo o mRNA viral conseguiam diminuir os níveis de expressão dos antigénios delta. A diminuição dos níveis de expressão do antigénio pequeno chega a ser de 30% enquanto para o antigénio grande observou-se uma diminuição de 60%. Observou-se mesmo um aumento da expressão dos antigénios quando se utilizava shRNAs dirigidos para o RNA antigenómico. Finalmente, para tentarmos perceber a importância da sobreexpressão de algumas proteínas durante a presença do HDV na célula, analisou-se a capacidade do HDV em replicar em células que exprimiam shRNAs contra proteínas celulares. A expressão da lamina A/C, da ribonucleoproteína La, da chaperona molecular DNA K, da proteína regulada pelo oxigénio 150KDa, da chaperonina GroEL e da lamina B2 foi inibida. De seguida quantificou-se os níveis de mRNA do HDV nestas condições. Verificou-se que a inibição da expressão da __________________________________________________________________________________________ vii.

(10) __________________________________________________________________________________________. lamina B2 provocava uma diminuição drástica nos níveis de mRNA do HDV enquanto a diminuição da expressão da lamina A/C provocava um ligeiro aumento nos níveis do mRNA viral. Analisou-se ainda a expressão dos antigénios delta por western blot. Aqui verificou-se que apenas a inibição da expressão da lamina B2 provocava uma diminuição da quantidade de antigénio pequeno presente na célula. No entanto, os níveis do antigénio grande diminuíam durante a inibição da expressão da ribonucleoproteína La, da chaperona molecular DNA K, da proteína regulada pelo oxigénio 150kDa e da chaperonina GroEL. Este trabalho constitui uma primeira abordagem na compreensão das alterações celulares causadas pela replicação do HDV. Permitindo a identificação de várias proteínas envolvidas em carcinomas ou na replicação de outros tipos de hepatite. Foram também identificadas várias proteínas celulares sobreexpressas durante a replicação do HDV que parecem desempenhar um papel importante no ciclo de replicação do vírus. Este trabalho possibilita o desenvolvimento de novas abordagens de modo a investigar e identificar novos alvos terapêuticos.. __________________________________________________________________________________________ viii.

(11) __________________________________________________________________________________________. Publicações. Artigos publicados:. Proteome analysis of human liver carcinoma Huh7 cells expressing hepatitis delta virus ribonucleoproteins. Sérgio Mota, Marta Mendes, Deborah Penque, Ana Coelho, Celso Cunha. Publicado na Journal of Proteomics. doi:10.1016/j.jprot.2007.12.002. Celso Cunha, Natália Freitas, Sérgio Mota: Developments in Hepatitis Delta Research. The Internet Journal of Tropical Medicine. 2003. Volume 1 Number 2.. Manuscritos submetidos para publicação:. Changes in the proteome of Huh7 cells induced by transient expression of hepatitis D virus RNA and antigens. Sérgio Mota, Marta Mendes, Deborah Penque, Ana Coelho, Celso Cunha. Submetido no Journal of Proteome Research.. Manuscritos em preparação:. Cellular requirements for the HDV replication and repression of viral replication using shRNAs. Sérgio Mota, Celso Cunha.. __________________________________________________________________________________________ ix.

(12) __________________________________________________________________________________________. Lista de abreviaturas. β2MG. β-2-microglobulina. 2’-5’AS. 2’-5’ oligodenilato sintétase. 2DE. separação bidimensional das proteínas num gel de acrilamida. ACN. Acetonitrilo. ADAR. Deaminase de adenosina 1 que actua no RNA. ALT. Aminotransferases de alanina. B3. Anticorpo policlonal de coelho anti-antigénio delta. BLAST. Basic local alignment search tool. DNA. Ácido desoxirribonucleico. dsRNA. RNA de cadeia dupla. elF2α. Subunidade alfa do factor de iniciação da tradução 2. FITC. Fuoresceína isotiocianato. GAPDH. Proteína 3-fosfato desidrogenase. HBsAg. Antigénio de superfície do vírus da hepatite B. HBV. Vírus da hepatite B. HCV. Vírus da hepatite C. HDV. Vírus da hepatite delta. HIV. Vírus da imunodeficiência humana. hnRNP D. Ribonucleoproteína nuclear heterogénea D. hnRNP H. Ribonucleoproteína nuclear heterogénea H. HSP105. Proteína de choque térmico 1 de 105kDa. HSP27. Proteína de choque térmico 27. IRES. Local interno de entrada do ribossoma. miR-122. microRNA 122. miR-32. microRNA 32. miRISC/miRNP. Complexo silenciador induzido por microRNAs. miRNAs. microRNAs. mRNA. RNA mensageiro. NASP. Proteína de ligação às histonas H1. NESI. Proteína de interacção com o sinal de exportação nuclear. __________________________________________________________________________________________ x.

(13) __________________________________________________________________________________________. NLS. Sinal de localização nuclear. NoV. Vírus nodamura. nt. Nucleótidos. PAGE. Electroforese em gel de poliacrilamida. PBS. Solução salina tamponada por fosfatos. PCR. Reacção em cadeia da polimerase. PFA. Paraformaldeído. PFV-1. Retrovírus de primata foamy 1. PKR. Cinase dependente de RNA. PMF. Peptide mass fingerprint. PSF. Factor de splicing associado a proteínas. PTB. Proteína do tracto de ligação à polipirimidina. qPCR. Reacção em cadeia da polimerase em tempo real. rasiRNAs. Pequenos RNAs de interferência associados a repetições de sequência. RISC. Complexo silenciador induzido por RNA. RNA. Ácido ribonucleico. RNAi. RNA de interferência. RNase. Ribonuclease. RNP. Ribonucleoproteína. SDS. Dodecilsulfato de sódio. shRNAs. Short hairpin RNAs. siRNAs. Pequenos RNAs de interferência. TFA. Ácido fluoroacético. TNF-alfa. Tumour necrosis factor alfa. TPI. Triosefosfato isomerase. Tween 20. Monolaurato de polioxietileno-sorbitano. VA. RNAs associados a vírus. VSR. Supressores virais do mecanismo de RNAi. __________________________________________________________________________________________ xi.

(14) __________________________________________________________________________________________. Índice. Agradecimentos .......................................................................................................................... i Abstract ...................................................................................................................................... iii Resumo ....................................................................................................................................... vi Publicações ................................................................................................................................. ix Lista de Abreviaturas ..................................................................................................................x Índice .......................................................................................................................................... xii Índice de figuras ......................................................................................................................... xv Índice de gráficos........................................................................................................................ xvii Índice de tabelas ......................................................................................................................... xviii. Capítulo I - Introdução Geral I.1 – Vírus da hepatite delta: aspectos clínicos e epidemiológicos ............................................ 3 I.2 – Vírus da hepatite delta: aspectos biológicos....................................................................... 6 I.3 – Ciclo de replicação do HDV .............................................................................................. 10. Capítulo II – Análise das alterações no proteoma do fígado humano causadas pela replicação do HDV II.1 – Introdução ......................................................................................................................... 17 II.1.1 – Ferramentas para o estudo do proteoma ........................................................................ 17 II.1.2 – Estudos do proteoma do fígado normal, de hepatoma e de fígado infectado pelo HCV.................................................................................................................................................. 19 II.1.3 – Interacções conhecidas entre o HDV e proteínas celulares ........................................... 20 II.2 – Objectivos ......................................................................................................................... 25 II.3 – Materiais e Métodos ......................................................................................................... 27 II.3.1 – Cultura de células .......................................................................................................... 27 II.3.2 – Preparação dos extractos proteicos ................................................................................ 28 II.3.3 – Detecção dos RNAs genómico e antigenómico do HDV por hibridação in situ.......... 30 __________________________________________________________________________________________ xii.

(15) __________________________________________________________________________________________. II.3.4 – Separação bidimensional das proteínas em géis de poliacrilamida ............................... 31 II.3.5 – Análise estatística do padrão de expressão das proteínas nas diferentes amostras ........32 II.3.6 – Identificação das proteínas diferencialmente expressas................................................. 34 II.3.7 – Síntese de cDNA a partir do mRNA das proteínas diferencialmente expressas ........... 35 II.3.8 – Quantificação do mRNA das proteínas diferencialmente expressas por qPCR ............ 35 II.3.9 – Validação dos resultados obtidos pela análise proteómica por quantificação relativa da expressão das proteínas ................................................................................................................... 36 II.4 – Resultados ......................................................................................................................... 39 II.4.1 – Optimização das condições de transfecção para a preparação dos extractos proteicos .......................................................................................................................................................... 39 II.4.2 – Resultados obtidos por 2DE e PMF ...............................................................................40 II.4.3 – Identificação das proteínas diferencialmente expressas durante a replicação do HDV .......................................................................................................................................................... 43 II.4.4 – Identificação das proteínas diferencialmente expressas durante a expressão do antigénio pequeno do HDV ............................................................................................................................. 50 II.4.5 – Identificação das proteínas diferencialmente expressas durante a expressão do antigénio grande do HDV ................................................................................................................................54 II.4.6 – Identificação das proteínas diferencialmente expressas durante a expressão do RNA genómico do HDV ........................................................................................................................... 56 II.4.7 – Identificação das proteínas diferencialmente expressas durante a expressão do RNA antigenómico do HDV ..................................................................................................................... 58 II.4.8 – Validação dos resultados obtidos pela análise proteómica por quantificação relativa da expressão das proteínas e por quantificação do mRNA das proteínas diferencialmente expressas .......................................................................................................................................................... 62 II.5 – Discussão .......................................................................................................................... 69. Capítulo III – Análise da replicação do HDV em células que expressam shRNAs dirigidos para o HDV e para proteína celulares III.1 – Introdução ........................................................................................................................ 83 III.1.1 – Mecanismo de RNA de interferência ........................................................................... 83 III.1.2 – Interacções entre os vírus e o mecanismo de RNA de interferência ............................ 87 III.1.3 – Estudo da importância das proteínas celulares na replicação viral por inibição da sua expressão utilizando RNAi .............................................................................................................. 91 __________________________________________________________________________________________ xiii.

(16) __________________________________________________________________________________________. III.2 – Objectivos ........................................................................................................................ 93 III.3 – Materiais e Métodos ........................................................................................................ 85 III.3.1 – Sistema para indução de RNAi contra sequências do HDV ........................................ 95 III.3.2 – Escolha das sequências alvo ......................................................................................... 96 III.3.3 – Construção e selecção dos vectores recombinantes pSIREN-RetroQ ..........................98 III.3.4 – Cultura e transfecção da linha celular Huh7-D12 ........................................................ 100 III.3.5 – Detecção dos antigénios do HDV por imunofluorescência indirecta ...........................100 III.3.6 – Quantificação relativa da expressão dos antigénios delta e das proteínas celulares .... 101 III.3.7 – Validação do silenciamento das proteínas celulares por quantificação do mRNA ...... 102 III.3.8 – Quantificação dos níveis de mRNA do HDV .............................................................. 103 III.4 – Resultados ....................................................................................................................... 105 III.4.1 – Quantificação, por imunofluorescência, do número de células que exprime os antigénios virais durante a expressão de shRNAs dirigidos para o HDV.............................. 105 III.4.2 – Quantificação, por western blot, da expressão dos antigénios delta durante a. expressão de shRNAs dirigidos para o HDV ..................................................................... 112 III.4.3 – Validação do silenciamento das proteínas celulares por expressão de shRNAs .......... 117 III.4.4 – Análise das alterações no mRNA e na expressão das proteínas do HDV durante o silenciamento de proteínas celulares ............................................................................................... 122 III.5 – Discussão ......................................................................................................................... 127. Capítulo IV – Conclusões finais e perspectivas futuras IV.1 – Conclusões finais e perspectivas futuras ......................................................................... 135. Anexos Anexo I ....................................................................................................................................... 141 Anexo II ...................................................................................................................................... 145 Anexo III .................................................................................................................................... 147 Anexo IV .................................................................................................................................... 159. Bibliografia ................................................................................................................................163 __________________________________________________________________________________________ xiv.

(17) __________________________________________________________________________________________. Índice de figuras. Figura I.1 – Distribuição geográfica da infecção pelo vírus da hepatite delta ........................... 4 Figura I.2 – Diferentes formas do RNA do vírus da hepatite delta ............................................ 7 Figura I.3 – Domínios estruturais dos antigénios do vírus da hepatite delta ..............................8 Figura I.4 – Representação esquemática do ciclo de replicação do HDV ................................. 13 Figura II.1 – Distribuição do RNA genómico (A) e antigenómico (B) do HDV no núcleo das células Huh7 transfectadas com o vector pDL542 and pDL481, respectivamente ......................... 40 Figura II.2 – Exemplo dos géis bidimensionais utilizados na identificação das proteínas diferencialmente expressas .............................................................................................................. 41 Figura II.3 – Espectro de massa adquirido num MALDI-TOF para o spot 757 utilizado na identificação da proteína triosefosfato isomerase ............................................................................ 42 Figura II.4 – Localização, num gel 2DE, dos spots 188 e 710 identificados como o factor de elongação 2....................................................................................................................................... 47 Figura II.5 – Localização, num gel 2DE, dos spots identificados como a ribonucleoproteína La...................................................................................................................................................... 62 Figura II.6 – Resultados obtidos por western blot e utilizados na quantificação da expressão da lamina A/C e da ribonucleoproteína La ...........................................................................................63 Figura II.7 – Proteínas diferencialmente expressas na presença das RNPs do HDV identificadas neste trabalho (○) que se encontram envolvidas na replicação do HBV, do HCV e em carcinomas ou hepatomas (□)................................................................................................................................... 70 Figura II.8 – Interacções proteína-proteína entre as proteínas diferencialmente expressas na presença do HDV visualizadas na plataforma Cystoscape ..............................................................73 Figura II.9 - Interacções proteína-proteína entre proteínas sobreexpressas na presença do HDV visualizadas na plataforma Cystoscape ........................................................................................... 74 Figura II.10 - Interacções proteína-proteína entre algumas das proteínas subexpressas na presença do HDV visualizadas na plataforma Cystoscape .............................................................................77 Figura II.11 - Interacções proteína-proteína entre algumas das proteínas diferencialmente expressas na presença do HDV visualizadas na plataforma Cystoscape ......................................................... 79 Figura III.1 – Modelo de acção da Dicer ....................................................................................85 Figura III.2 – Representação do mecanismo de RNAi ............................................................... 86 Figura III.3 – Interacções de vírus com o mecanismo de RNAi ................................................ 88 Figura III.4 – Genes celulares que afectam a replicação do HCV ............................................. 92 __________________________________________________________________________________________ xv.

(18) __________________________________________________________________________________________. Figura III.5 – Representação esquemática do vector pSIREN-RetroQ ...................................... 95 Figura III.6 – Representação esquemática dos oligonucleótidos sintetizados e clonados no vector pSIREN-RetroQ .............................................................................................................................. 96 Figura III.7 – Detecção do antigénio delta em células transfectadas com o vector pSIREN-RetroQ luc por imunofluorescência indirecta .............................................................................................. 106 Figura III.8 – Resultados obtidos por western blot e utilizados na quantificação da expressão dos antigénios delta em células que exprimiam shRNAs contra o HDV após um período de selecção das células transfectadas de 5 dias ......................................................................................................... 113 Figura III.9 – Resultados obtidos por western blot e utilizados na quantificação da expressão dos antigénios delta em células que exprimiam shRNAs contra o HDV após um período de selecção das células transfectadas de 2 dias ......................................................................................................... 116 Figura III.10 – Análise por western blot da expressão da ribonucleoproteína La durante a expressão de shRNAs ....................................................................................................................................... 118 Figura III.11 – Análise por western blot da expressão da lamina A/C durante a expressão de shRNAs ............................................................................................................................................119 Figura III.12 – Análise por western blot da expressão dos antigénios delta expressão de shRNAs dirigidos para proteínas celulares .................................................................................................... 124. __________________________________________________________________________________________ xvi.

(19) __________________________________________________________________________________________. Índice de gráficos. Gráfico II.1 – Quantificação da expressão da lamina A/C (HDV A/C) e da ribonucleoproteína La (HDV La) na presença das RNPs virais utilizando os resultados obtidos por western blot ........... 64 Gráfico II.2 – Eficiências dos primers utilizados para quantificação do mRNA de várias proteínas celulares ........................................................................................................................................... 65 Gráfico II.3 – Quantificação dos níveis de mRNA de várias proteínas celulares pelo método ∆∆Ct .. .......................................................................................................................................................... 66 Gráfico III.1 – Percentagem de células que exprime os antigénios delta após um período de incubação com puromicina de 5 dias ...............................................................................................107 Gráfico III.2 – Percentagem de células que exprime os antigénios delta, após tranfecção com 2 ou mais vectores, com um período de incubação com puromicina de 5 dias ....................................... 110 Gráfico III.3 – Percentagem de células que exprime os antigénios delta após um período de incubação com puromicina de 2 dias ...............................................................................................112 Gráfico III.4 – Percentagem de expressão dos antigénios delta em células transfectadas com vectores que exprimem shRNAs contra o HDV após um período de selecção das células transfectadas de 5 dias ........................................................................................................................................... 115 Gráfico III.5 – Percentagem de expressão dos antigénios delta em células transfectadas com vectores que exprimem shRNAs contra o HDV após um período de selecção das células transfectadas de 2 dias ........................................................................................................................................... 116 Gráfico III.6 – Quantificação da expressão da ribonucleoproteína La utilizando os resultados obtidos por western blot .................................................................................................................. 118 Gráfico III.7 – Quantificação da expressão da lamina A/C utilizando os resultados obtidos por western blot ..................................................... ............................................................................... 120 Gráfico III.8 – Eficiências dos primers utilizados para quantificação do mRNA de várias proteínas celulares ........................................................................................................................................... 121 Gráfico III.9 – Quantificação dos níveis de mRNA de várias proteínas celulares durante a expressão de shRNAs ...................................................................................................................... 121 Gráfico III.10 – Quantificação dos níveis de mRNA do HDV durante o silenciamento de várias proteínas celulares ........................................................................................................................... 123 Gráfico III.11 – Percentagem de expressão dos antigénios delta em células transfectadas com vectores que exprimem shRNAs contra as proteínas celulares ....................................................... 126. __________________________________________________________________________________________ xvii.

(20) __________________________________________________________________________________________. Índice de tabelas. Tabela II.1 – Lista dos vectores utilizados para transfectar a linha celular Huh7 e que apenas expressam um dos constituintes do HDV ........................................................................................ 27 Tabela II.2 – Protocolo utilizado para a separação das proteínas por IEF ................................. 30 Tabela II.3 – Primers sintetizados para a amplificação do cDNA ... ......................................... 35 Tabela II.4 – Número de spots detectados em cada gel utilizado na análise comparativa do proteoma da linha celular Huh7, Huh7-D12 e da linha celular Huh7 transfectada com vectores que expressam apenas um dos constituintes do HDV............................................................................. 41 Tabela II.5 – Proteínas diferencialmente expressas durante a replicação do HDV ................ 44 Tabela II.6 – Proteínas diferencialmente expressas durante a expressão do antigénio pequeno do HDV ................................................................................................................................................ 52 Tabela II.7 – Proteínas diferencialmente expressas durante a expressão do antigénio grande do HDV ................................................................................................................................................ 55 Tabela II.8 – Proteínas diferencialmente expressas durante a expressão o RNA genómico do HDV .......................................................................................................................................................... 57 Tabela II.9 – Proteínas diferencialmente expressas durante a expressão o RNA antigenómico do HDV ................................................................................................................................................ 59 Tabela II.10 – Proteínas identificadas como diferencialmente expressas em mais do que uma análise efectuada .. ........................................................................................................................... 61 Tabela III.1 – Sequências alvo utilizadas para a construção dos vectores de expressão de shRNAs contra o HDV e as proteínas sobreexpressas na presença do HDV ................................................ 98 Tabela III.2 – Primers sintetizados para a amplificação do cDNA de cada proteína analisada .......................................................................................................................................................... 103 Tabela III.3 – Primers sintetizados para a amplificação do cDNA do HDV ............................. 103 Tabela III.4 – Resultados obtidos na análise do número de células que expressa os antigénios delta durante a expressão de shRNAs dirigidos para o HDV, com um período de incubação de 5 dias .......................................................................................................................................................... 107 Tabela III.5 – Resultados obtidos na análise do número de células que expressa os antigénios delta durante a expressão de shRNAs dirigidos para várias sequências do HDV ....................................109 Tabela III.6 – Resultados obtidos na análise do número de células que expressa os antigénios delta durante a expressão de shRNAs dirigidos para o HDV, com um período de incubação de 2 dias .......................................................................................................................................................... 111 Tabela III.7 – Calculo da percentagem de células que expressa os antigénios delta em células que expressam shRNAs.......................................................................................................................... 114 __________________________________________________________________________________________ xviii.

(21) __________________________________________________________________________________________. Tabela III.8 – Resultados obtidos pela quantificação da expressão da ribonucleoproteína La em células que expressam shRNAs ....................................................................................................... 118 Tabela III.9 – Resultados obtidos para a quantificação da expressão da lamina A/C em células que expressam shRNAs .......................................................................................................................... 120 Tabela III.10 – Resultados obtidos pela quantificação da expressão dos antigénios delta em células que expressam shRNAs.................................................................................................................... 125. __________________________________________________________________________________________ xix.

(22) __________________________________________________________________________________________. __________________________________________________________________________________________ xx.

(23) Capítulo I – Introdução Geral. Capítulo I. Introdução Geral. __________________________________________________________________________________________ 1.

(24) Capítulo I – Introdução Geral. __________________________________________________________________________________________ 2.

(25) Capítulo I – Introdução Geral. I – Introdução Geral. I.1 – Vírus da hepatite delta: aspectos clínicos e epidemiológicos. O vírus da hepatite delta (HDV) foi descoberto em 1977 pelo gastroenterologista italiano Mário Rizzetto, ao estudar pacientes com hepatites crónicas causadas pela infecção pelo vírus da hepatite B (HBV; Rizzetto et al., 1977). Mais tarde foi demonstrado que o HDV é um agente infeccioso responsável pelo agravamento dos sintomas de doentes infectados com o HBV (Rizzetto et al., 1980; Gorinvadaranjan et al., 1984). O HDV, é portanto, considerado um vírus satélite do HBV pois necessita deste para formar partículas infecciosas capazes de estender a infecção a outras células. Esta associação decorre do facto das proteínas do envelope do HDV serem as proteínas de superfície do HBV (Smedile et al., 1984). Assim, o HDV apenas é capaz de provocar uma infecção transmissível quando na presença do HBV. Seis anos após a descoberta do antigénio delta, em Itália, este já tinha sido identificado em todos os continentes populados (Rizzeto et al., 1993). O HDV foi considerado suficientemente único de modo a ser designado como um vírus distinto: o vírus da hepatite delta e a doença por ele causada passou a se designar por delta ou hepatite tipo D (revisto em Purcell & Guerin, 1996). A infecção pelo HDV pode ocorrer por coinfecção com o HBV ou por superinfecção de um indivíduo que possui uma infecção crónica de HBV (Rizzetto et al., 1984). No primeiro caso a infecção decorre de uma forma semelhante à infecção apenas com o HBV e a eliminação deste resulta na eliminação do HDV. A superinfecção resulta no desenvolvimento de uma infecção crónica do HDV em mais de 80% dos casos. Esta rapidamente progride para cirrose hepática ou hepatoma (Fattovich et al., 1987). O percurso clínico da superinfecção pode ser dividido em 3 fases. Na primeira, a fase aguda, ocorre a replicação activa do HDV e a supressão do HBV com níveis altos de aminotransferases de alanina (ALT). Durante a segunda fase, a fase crónica, e em cerca de 70% dos casos, observam-se os primeiros sintomas que incluem fadiga, letargia, anorexia e náuseas. Nesta fase ocorre uma diminuição da replicação do HDV e um aumento da replicação do HBV com níveis flutuantes de ALT. Em muitos casos a fase crónica antecede o desenvolvimento de cirroses hepáticas e de hepatomas. No entanto, nem todos os pacientes progridem para a fase crónica. Em alguns __________________________________________________________________________________________ 3.

(26) Capítulo I – Introdução Geral. casos pode ocorrer a eliminação do HDV ou do HBV e HDV (Wu et al. 1995). Cerca de 60% a 70% dos doentes com hepatite delta crónica desenvolvem cirrose hepática. Esta frequência é três vezes superior à observada em doentes com hepatite B ou C (Rizzetto et al., 1983). Estudos de seroprevalência de anticorpos anti-HDV em indivíduos positivos para a presença dos antigénios de superfície do HBV têm mostrado uma distribuição generalizada mas não uniforme por todo o mundo (Ponzetto et al., 1985). As áreas descritas como sendo de maior prevalência incluem alguns países da Europa de leste, a bacia do Amazonas, alguns países de África subsarianos (Figura I.1). Cerca de 5% a 10% dos indivíduos infectados com o HBV são também portadores do HDV. No entanto, esta percentagem pode chegar até aos 25% em pacientes com infecção crónica de HBV (Center for Disease Control, Atlanta). Em Portugal alguns estudos apontam para uma prevalência de 17% em portadores crónicos de HBV (Ramalho et al., 1987), sendo que cerca de 8% de todas as hepatites virais parecem estar associadas ao HDV (Velosa et al., 1993).. Prevalência do HDV Alta Intermediaria Baixa Muito baixa. Figura I.1 – Distribuição geográfica da infecção pelo vírus da hepatite delta. Adaptado de Center for Disease Control, Estados Unidos da América, 2006.. Apesar de o HDV exibir uma enorme variabilidade genética apenas 3 genótipos foram caracterizados com base num número pequeno de sequências completas do genoma (Casey et al., 1993, Imazeki et al., 1991, Wang et al., 1986). Estes, denominados de genótipo I, II e III, são mais frequentes em diferentes regiões do globo. Assim, o genótipo I é mais frequente na América do Norte, na Europa, no norte de África e na Rússia enquanto o genótipo II é mais. __________________________________________________________________________________________ 4.

(27) Capítulo I – Introdução Geral. frequente na Ásia nomeadamente no Japão e Taiwan. O genótipo III aparenta estar confinado a América do Sul. Recentemente estudos filogenéticos baseados no estudo da sequência codificante do HDV e no estudo do RNA genómico do HDV sugerem uma maior e mais complexa variabilidade genética do que inicialmente previsto. Assim as diferentes sequências do HDV foram agrupadas em oito clades sendo que as sequências do clade 4 correspondem às sequências previamente atribuídas ao genótipo IIb, enquanto quatro novos clades incluem sequências encontradas em África (revisto em Deny, 2006). Não existe, hoje em dia, um tratamento específico para a hepatite delta. A terapia imunossupressora não demonstrou possuir qualquer valor clínico à semelhança do que acontece para outras formas agudas e crónicas de hepatites virais (Rizzetto et al., 1983). O uso de interferão mostrou inibir a replicação viral (Hoofnagle et al., 1987; Rizzetto et al., 1986; Thomas et al., 1987) mas, à semelhança do que acontece com o HBV, o seu efeito benéfico é transitório. No entanto, já foi descrita a cura de um doente com hepatite delta crónica após doze anos de tratamento com interferão alfa (Lau et al., 1999a). Mais recentemente verificou-se a redução dos níveis de ALT e de RNA do HDV no soro de 20% dos doentes com Hepatite Delta crónica após tratamento durante 48 semanas com o interferão alfa-2b (Niro et al., 2006). Por outro lado, o tratamento com interferão alfa pode, por vezes, estar associado a um agravamento de sintomas nalguns doentes (Crosignani et al., 1999). Foi também descrito o uso de ribozimas no tratamento de hepatites por HBV, tendo-se verificado uma redução de 83% no número de partículas virais no fígado de doentes (Welch et al., 1997). Também a ribozima do HDV, apesar da falta de um conhecimento preciso sobre a sua estrutura secundária e terciária, tem vindo a ser modificada in vitro de modo a poder actuar em trans e ser potencialmente usada em terapia génica (Been, 1994; Kawakami et al., 1996). Algumas drogas antivirais têm sido testadas in vitro e em portadores crónicos de HDV. De entre todas, é de realçar a lamivudina (3-tiacitidina), um análogo de nucleótidos que parece inibir a replicação do HDV (Lau et al., 1999b). No entanto, tem sido paralelamente descrito o aparecimento de mutantes resistentes a esta droga (Rizzetto, 1999). Alguns estudos apontam como possível tratamento o recurso a inibidores da actividade farnesiltransferase. O uso destes químicos com actividade inibitória impede a formação de partículas virais infecciosas (Bordier et al., 2002). Uma terapia combinada de lamivudina com outras drogas antivirais __________________________________________________________________________________________ 5.

(28) Capítulo I – Introdução Geral. poderá vir a trazer alguns benefícios, mas neste momento, não existe uma terapia válida para a hepatite delta. Neste contexto, a busca de uma estratégia terapêutica anti-viral específica, poderá assumir particular importância.. I.2 – Vírus da hepatite delta: aspectos biológicos. Numa tentativa de classificação do HDV verificou-se que este não apresenta as características necessárias para a sua inclusão no grupo dos Hepadnaviridae. As características do HDV assemelham-se mais a outros grupos de agentes infecciosos em que os hospedeiros não pertencem ao reino animal. O HDV possui semelhanças com alguns grupos de agentes infecciosos transmissíveis às plantas superiores, nomeadamente vírus satélite, RNAs satélite e viróides (Taylor, 1995; Diener, 1985). O genoma do HDV não apresenta qualquer semelhança com o genoma do HBV afastando assim a hipótese do HDV ser um vírus com origem no HBV mas defectivo para as proteínas do invólucro. O HDV possui uma estrutura esférica de cerca de 36 nm de diâmetro. O invólucro viral é constituído por lípidos celulares e pelas três proteínas de superfície do HBV designadas de proteína L, M e S (Tiollais et al., 1985). A formação de partículas infecciosas do HBV é muito ineficiente, mesmo na ausência do HDV, pois a maioria das partículas formadas não contêm o nucleocápside viral ou o genoma do HBV (Ganem, 1991). O HDV utiliza o excesso de proteínas de superfície produzidas pelo HBV na montagem das suas partículas virais inserindo o RNA genómico e várias moléculas de antigénio nas partículas do HBV contendo as proteínas L, M e S. A parte interna do virião do HDV corresponde à porção ribonucleoproteica e os seus componentes são codificados pelo genoma viral. O genoma do HDV é constituído por uma molécula de RNA de cadeia simples, com polaridade negativa, circular, com 1679 nucleótidos (nt). O RNA viral possui um elevado número de sequências intramoleculares complementares, cerca de 70% do genoma total, resultando na ocorrência de emparelhamentos internos que culminam na formação de uma estrutura em bastonete semelhante à dos viróides das plantas (Taylor, 1992). Durante a replicação viral, que ocorre sem a produção de intermediário de DNA (Chen et al., 1986), são produzidos 3 tipos de RNA. È produzida uma cadeia circular de RNA genómico, a sua cadeia complementar (o RNA __________________________________________________________________________________________ 6.

(29) Capítulo I – Introdução Geral. antigenómico) e uma cadeia de RNA mensageiro (mRNA) (figura I.2). Dos diferentes tipos de RNA apenas o mRNA, com aproximadamente 800 nt, é poliadenilado. Os diferentes RNAs virais existem na célula em diferentes quantidades. Assim, numa célula infectada existem cerca de 300 mil copias do RNA genómico enquanto existem cerca de 50 mil cópias de RNA antigenómico. O mRNA do HDV é o RNA viral menos representado pois existem apenas 600 cópias por célula deste RNA que é responsável pela expressão dos antigénios delta (Chen et al., 1986). Durante a replicação, por circulo rolante, do HDV são produzidas formas multiméricas do RNA viral. Este possui actividade de ribozima que resulta no corte do RNA multimérico em intervalos regulares de forma a originar a forma monomérica do RNA viral. Esta actividade de ribozima é essencial para que ocorra a formação de partículas virais infecciosas (Macnaughton et al., 1993; Jen et al., 1996).. Figura I.2 – Diferentes formas do RNA do vírus da hepatite delta. Adaptado de Taylor (2006).. O RNA genómico possui uma única grelha de leitura da qual derivam duas formas de uma única proteína, o antigénio delta. Assim, da transcrição do genoma resulta a formação de um mRNA de 800 nt cuja tradução tem como consequência a produção de uma das formas do antigénio delta, a forma pequena (δAg-S, S-HDAg, p24). A forma pequena do antigénio delta é uma proteína com 195 aminoácidos e cerca de 24 kDa necessária para o início da replicação viral (Chao et al., 1990), processo que ocorre no núcleo da célula hospedeira.. __________________________________________________________________________________________ 7.

(30) Capítulo I – Introdução Geral. Durante a replicação do vírus, no núcleo, ocorre um mecanismo de editing do RNA através do qual um codão stop UAG é convertido num codão triptofano UGG. Esta modificação tem como consequência a extensão da grelha de leitura por mais 19 aminoácidos. O editing do RNA ocorre no RNA antigenómico, por acção de uma deaminase de adenosina celular, ADAR 1, que é responsável pela conversão da adenosina do codão stop UAG numa inosina (Casey e Gerin, 1995). Deste modo, é traduzida uma proteína de 214 aminoácidos e cerca de 27 kDa, a forma grande do antigénio delta (δAg-L, L-HDAg, p27; Taylor, 1992; Monjardino e Lai, 1993). Tal como a forma pequena, também a forma grande do antigénio delta se localiza no núcleo das células. Resumindo, ambos os antigénios apresentam a mesma localização celular e partilham a mesma sequência de aminoácidos, com excepção dos 19 aminoácidos da extremidade carboxílica que a forma grande possui adicionalmente. Na figura I.3 podemos observar os diferentes domínios que constituem os antigénios do HDV. Ambos os antigénios delta possuem domínios estruturais específicos, nomeadamente um sinal de localização nuclear (NLS), domínios de ligação a RNA e um domínio de dimerização. O NLS está localizado entre os aminoácidos 68 e 88 e consiste numa sequência bipartida rica em aminoácidos básicos (Xia et al., 1992). No entanto, resultados recentes indicam que o NLS para ser funcional apenas necessita dos aminoácidos 66 ao 75 (Alves et al., 2007).. Figura I.3 – Domínios estruturais dos antigénios do vírus da hepatite delta. Adaptado de Cunha et al., 2003.. O domínio de dimerização desempenha um papel importante na função biológica dos antigénios. A inibição da replicação do antigénio grande depende da capacidade deste se ligar ao antigénio pequeno, este domínio é também importante para a formação das partículas virais (Taylor, 1999). Mutações neste domínio resultam na diminuição da capacidade do __________________________________________________________________________________________ 8.

(31) Capítulo I – Introdução Geral. antigénio pequeno em funcionar como um activador da replicação viral (Chang et al., 1994 e Chang et al., 1993). O domínio de ligação ao RNA consiste em dois segmentos ricos em arginina (nt 97 a 107 e nt 136 a 146) sendo que ambos são necessários para a ligação in vitro ao RNA do HDV. Foi demonstrado que as propriedades de ligação ao RNA por parte dos antigénios delta parecem ser específicas para a estrutura secundária do RNA do HDV e que essas propriedades são necessárias para a activação da replicação viral (Lee et al., 1993). Dos 19 aminoácidos da extremidade carboxílica que o δAg-L possui adicionalmente, os 4 últimos constituem um sinal para isoprenilação (Monjardino e Lai., 1993). Estes 19 aminoácidos terminais são necessários para a interacção com os HBsAg e determinantes para a formação de partículas infecciosas. Experiências em que estes 19 aminoácidos foram adicionados à proteína c-Hras permitiram que esta se tornasse co-secretável com os HBsAg. No entanto, a proteína c-Hras não se tornou secretável quando a adição se limita aos 4 aminoácidos que constituem o sinal de isoprenilação (Lee et al., 1994, 1995). O antigénio grande tem um papel fundamental no empacotamento e na montagem dos viriões (Chang et al., 1991; Ryu et al., 1992). Pois o antigénio pequeno apenas é empacotado no virião na presença do antigénio grande, sugerindo que seja este último que estabelece o contacto directo com os HBsAg (Chen et al., 1992). Apesar de todas as semelhanças, quer de sequência quer de estrutura, os dois antigénios delta exibem funções biológicas distintas em relação à replicação do vírus. O antigénio pequeno do HDV é essencial para a replicação viral (Kuo et al., 1989). Estudos anteriores permitiram verificar que o motivo fecho de leucina, existente nos antigénios delta, entre os aminoácidos 108 e 122, encontra-se envolvido na ligação do antigénio pequeno ao RNA do HDV e na transactivação da replicação viral (Chang et al., 1993). Paralelamente, a análise da replicação viral com formas truncadas ou modificadas do antigénio pequeno resultou na não expressão do genoma viral (Dingle et al., 1998). Ao contrário do observado para o antigénio pequeno o antigénio grande não parece suportar a replicação do genoma e, de facto, em certas condições é capaz de actuar como um mecanismo supressor dominante em trans (Chao et al., 1990). No entanto, estudos recentes parecem vir contestar a ideia que o antigénio grande inibe a replicação. Este antigénio apenas é expresso numa fase tardia do ciclo viral resultante de um mecanismo de editing do RNA antigenómico. No entanto, após o estabelecimento da replicação do RNA, o antigénio grande não é capaz de suprimir a replicação (Macnaughton et al., 2002a). Por outro lado, este apenas __________________________________________________________________________________________ 9.

(32) Capítulo I – Introdução Geral. parece possuir potencial para inibir a síntese de RNA genómico não inibindo a síntese de RNA antigenómico (Modahl et al., 2000a). Ambas as formas do antigénio foram descritas como fosfoproteínas nucleares (Chang et al., 1988). No entanto, a forma grande encontra-se cerca de seis vezes mais fosforilada do que a forma pequena (Hwang et al., 1992). Os antigénios também possuem uma actividade de chaperonas de RNA, esta actividade encontra-se no domínio coiled de dimerização rico em resíduos de lisina. No entanto, o domínio de ligação ao RNA não é necessário para a actividade de chaperona. As chaperonas de RNA são proteínas que auxiliam no processo de formação da estrutura secundária do RNA impedindo a formação de conformações anormais e corrigindo as conformações anómalas. Como a estrutura secundária do RNA assume um papel muito importante na replicação do vírus a actividade de chaperona dos antigénios pode ter um papel importante na regulação da replicação (Huang e Wu, 1998). Se procurarmos relacionar a estrutura dos antigénios com a respectiva função, podemos dizer que o segundo domínio de ligação ao RNA do antigénio pequeno é necessário para iniciar a replicação (Lazinski e Taylor, 1993; Lee et al., 1993) enquanto que o primeiro domínio de ligação ao RNA do antigénio grande é o responsável pela possível inibição da replicação (Lee et al., 1995). Outra das características dos antigénios delta diz respeito a uma possível indução de um efeito citopático. Num dos estudos pioneiros realizados nesta área (Macnaughton et al., 1990) demonstrou-se que a sobreexpressão isolada dos antigénios delta, na ausência de replicação viral, tem efeitos citotóxicos sobre as células. No entanto, outros estudos demonstraram que estes efeitos eram restritos à fase inicial da cultura de células.. I.3 – Ciclo de replicação do HDV. A replicação do HDV é totalmente independente de quaisquer informação genómica e/ou funções fornecidas pelo HBV. A localização predominantemente nuclear das proteínas e do RNA do HDV sugerem que a replicação do vírus ocorre no núcleo da célula hospedeira (Gowans et al., 1988). Após entrada na célula, as ribonucleoproteínas (RNPs) do HDV são transportadas para o núcleo e o RNA é replicado por uma ou mais RNA polimerases celulares __________________________________________________________________________________________ 10.