Estudo da privação de sono na conectividade funcional do lobo frontal

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

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Estudo da privação de sono

na conectividade funcional do lobo frontal

Eduardo João Nunes Leal

Mestrado em Biologia Humana e Ambiente

Dissertação orientada por:

Dr. Alberto Leal

Prof. Paulo Fonseca

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AGRADECIMENTOS

O autor deseja agradecer a todas as pessoas e instituições que de alguma forma contribuíram para a elaboração deste trabalho e, em particular:

• Ao Doutor Alberto Leal, pela possibilidade de realização deste projecto, pelo seu incentivo, disponibilidade e apoio que sempre demonstrou;

• Ao Professor Paulo Fonseca pela sua inesgotável disponibilidade, inúmeras sugestões e ensinamentos que me permitiram prosseguir este trabalho;

• Ao Centro Hospitalar Psiquiátrico de Lisboa por todo o apoio prestado durante a realização desta tese;

• Aos colegas e amigos que disponibilizaram do seu tempo, para a recolha de dados necessários a este trabalho, sempre com simpatia e incentivo;

A todas estas pessoas que mencionei, sem o contributo das quais não teria sido possível a realização desta tese, o meu sincero agradecimento.

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RESUMO

O sono é um estado comportamental presente em todos os animais com um sistema nervoso diferenciado, todavia a sua função biológica fundamental permanece incerta.

A investigação sobre o papel do sono tem levado à formulação de variadas hipóteses sobre a sua função que incluem, entre outras, modulação imunitária, conservação de energia metabólica, termorregulação ou consolidação de memórias.

Presentemente, um grupo de hipóteses com especial proeminência tem-se focado na regulação da plasticidade sináptica que sucede durante a vigília, propondo que durante o sono ocorre um conjunto de operações que, em última análise, levam à consolidação de mudanças sinápticas induzidas durante a vigília através da interacção com o ambiente.

A formação de novas memórias na vigília implica a modificação da comunicação entre as redes neuronais, as quais podem ser estudadas ao nível macroscópico através da alteração da conectividade funcional entre elas.

O EEG/MEG é, actualmente, a metodologia com a maior resolução temporal para caracterizar estas interacções e com a facilidade de registo no escalpe associada à sua reduzida interferência com o sono, oferece oportunidades relevantes para estudos experimentais da sua modulação durante as várias fases do ciclo sono-vigília.

Existem numerosas evidências experimentais que associam a conectividade funcional com a interacção entre redes neuronais que constituem a base do processamento cognitivo, com o estudo da interferência do sono na conectividade funcional cerebral a prometer revelar certos aspectos da sua relação com a cognição.

Neste contexto, é importante o estudo da conectividade dos lobos frontais, pois esta aparenta encontrar-se significativamente modificada durante o sono, para além de exercer um controlo cognitivo “top-down” sobre as outras áreas cerebrais. Não existe, no entanto, um modelo descrevendo o mecanismo responsável pelas variações na conectividade funcional dos lobos frontais durante o sono e o seu papel na organização da actividade cerebral.

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ABSTRACT

Sleep is a behavioral state present in all animals with a well differentiated nervous system, however its fundamental biological function remains uncertain.

Research on the role of sleep led to the formulation of numerous hypotheses about its function that include, among others, immune modulation, metabolic energy conservation, thermoregulation or consolidation of memories.

A group of hypotheses with prominence at present focuses on the regulation of synaptic plasticity that takes place in wakefulness, being proposed that during sleep a set of operations occurs that ultimately consolidate the synaptic changes induced in wakefulness by interaction with the environment.

The formation of new memories in wakefulness implies modifying the communication between neuronal networks, which can be studied at the macroscopic level through modification of the functional connectivity between them.

The EEG/MEG is currently the methodology with the highest temporal resolution to characterize these interactions, and the ease of records on the scalp, associated with reduced interference with sleep, offers important opportunities for experimentally study its modulation in the various stages of the sleep-wake cycle.

There is currently large experimental evidence associating functional connectivity with the interaction between neural networks which are the base of cognitive processing. The study of interference of sleep in brain functional connectivity promises to illuminate certain aspects of this relationship with cognition. In this context, it is relevant the study of connectivity of the frontal lobes as it appears prominently modified in sleep, in addition to exercising a ' top-down ' control over the other brain areas in cognition. There is not, however, a model describing the mechanism responsible for variations in functional connectivity of frontal lobe during sleep and its role in organization of brain activity.

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ÍNDICE

LISTA DE FIGURAS ... xiii

LISTA DE ANEXOS ... xvii

LISTA DE ABREVIATURAS ... xix

1. INTRODUÇÃO...1

1.1 Teorias sobre a função do sono ...1

1.2 Papel do sono na regulação da plasticidade cerebral ...3

1.3 Lobos frontais ...4

1.4 EEG ...6

1.5 Conectividade ...9

1.6 A conectividade funcional em EEG como uma medida da interacção entre áreas funcionais cerebrais ...11

1.7 Evidências do efeito da privação do sono na conectividade funcional dos lobos frontais ...12

2. OBJECTIVOS ...13 3. METODOLOGIA ...14 3.1 Participantes ...14 3.2 Protocolo experimental ...14 3.3 Desenho do estudo...16 3.4 Equipamento utilizado ...17

3.5 Análise dos dados ...17

3.6 Criação de segmentos para a conectividade ...18

3.7 Determinação das regiões de interesse ...18

3.8 Cálculo da conectividade funcional...19

3.9 Análise estatística ...20

4. RESULTADOS ...22

4.1 Tarefas comportamentais ...22

4.2 Conectividade associada à tarefa experimental ...26

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4.4 Conectividade associada à sesta ...30

5. DISCUSSÃO ...32

5.1 Desempenho comportamental ...32

5.1.1 Efeito da tarefa comportamental ... 32

5.1.2 Efeito da privação de sono ... 33

5.1.3 Efeito da sesta ... 33

5.2 Conectividade entre áreas cerebrais ...34

5.2.1 Efeito da tarefa experimental... 34

5.2.2 Efeito da privação de sono ... 35

5.2.3 Efeito da sesta ... 36

6. CONCLUSÕES ...37

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...38

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LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 – Idade, sexo e profissões dos participantes. ...14 Tabela 3.2 – Protocolo de fecho e abertura de olhos para medição do EEG em estado de repouso. ....16 Tabela 4.1 – Percentagem de erros cometidos por participante sem e com privação de sono e

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 – Principais áreas cerebrais. ...5

Figura 1.2 – Representação de uma porção da região cortical com a presença de células piramidais. ...6

Figura 1.3 – Representação dos potenciais extracelulares associados à actividade sináptica. ...8

Figura 1.4 – Os potenciais eléctricos no escalpe resultantes da soma de múltiplos dipolos corticais constitui a base do EEG...8

Figura 1.5 – Fases do sono. ...9

Figura 1.6 – EEG realizado ao nível do escalpe. ...10

Figura 1.7 – Representação do modo como a actividade neuronal produzida por uma fonte é captada por diferentes sensores. ...10

Figura 1.8 – Reconstrução de fonte. ...10

Figura 1.9 – EEG de alta resolução. ...11

Figura 3.1 – Montagem de EEG de alta resolução com 82 electrodos utilizada durante a realização da tarefa experimental. ...15

Figura 3.2 – Sequência de eventos durante a avaliação experimental...16

Figura 3.3 – Regiões de interesse. ...19

Figura 3.4 – Bandas de EEG analisadas. ...19

Figura 3.5 – Representação das principais conectividades (esquerda) e matriz de todas as conectividades (direita) entre as ROIs de um participante durante a realização da tarefa experimental. ...20

Figura 4.1 – Número de respostas certas, erradas e falhadas de cada participante sem e com privação de sono, antes da realização de uma sesta. ...22

Figura 4.2 – Percentagem de erros cometidos por cada participante sem e com privação de sono. ...23

Figura 4.3 – Caixas de bigodes dos tempos de reacção. ...24

Figura 4.4 – Hipnogramas das sestas realizadas, com tempo total e percentagem de fase 1 e 2 do sono de cada um dos participantes com privação de sono. ...25

Figura 4.5 – Tempo total de sono e tempo decorrido nas diferentes fases do sono nas sestas realizadas pelos participantes com privação. ...26

Figura 4.6 – Conectividade dos pares de ROIs na condição passiva e activa. ...27

Figura 4.7 – Conectividade dos pares de ROIs sem e com privação de sono. ...28

Figura 4.8 – Correlação entre o aumento de erros em privação de sono e a conectividade Occipito-Frontal. ...29

Figura 4.9 – Correlação entre o aumento de erros em privação de sono e a conectividade Parieto-Frontal. ...30

xv

xvii

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1 – Percentagem de erros sem e com privação de sono e respectiva normalização antes da sesta.

...45

Anexo 2 – Tempos de reacção (em milissegundos) das respostas correctas, erradas e respectivos

desvios-padrões dos participantes sem e com privação de sono. ...45

Anexo 3 – Percentagem de erros cometidos pelos participantes com privação de sono antes e após a

sesta. ...46

Anexo 4 – Anova de três vias para o efeito da tarefa experimental sobre a conectividade das regiões

cerebrais seleccionadas. . ...47

Anexo 5 – Anova de três vias para o efeito da privação de sono sobre a conectividade das regiões

cerebrais seleccionadas...47

Anexo 6 – Anova de três vias para o efeito da sesta sobre a conectividade das regiões cerebrais

seleccionadas. ...48

Anexo 7 – Parecer da Comissão Científica e Pedagógica do Centro Hospitalar Psiquiátrico de Lisboa.

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LISTA DE ABREVIATURAS

REM Movimento rápido dos olhos

EEG Electroencefalografia

MEG Magnetoencefalografia

LFP Potencial de Campo Local

PET Tomografia de Emissão de Positrões

ATP Adenosina trifosfato

EPSP Potencial pós-sináptico excitatório

IPSP Potencial pós-sináptico inibitório

DC Corrente contínua

ECG Electrocardiograma

EOG Electroculograma

DTF Direct Transfer Function

FrontOccip Fronto-Occipital

FrontPar Fronto-Parietal

OccipFront Occipito-Frontal

ParFront Parieto-Frontal

BOLD Blood Oxygen-level Dependent (Dependente do Nível de Oxigénio Sanguíneo)

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1

1. INTRODUÇÃO

O sono é um estado fisiológico amplamente disseminado no mundo animal, estando presente em todos os animais com um sistema nervoso diferenciado como, por exemplo, nos vertebrados, mas igualmente em nemátodes, como C. elegans (Raizen et al., 2008) ou artrópodes como a mosca da fruta (Drosófila melanogaster) (Greenspan et al., 2001; Huber et al., 2004). Constitui um processo fisiológico que ocorre ciclicamente, caracterizado do ponto de vista comportamental pela drástica redução da interacção com o meio externo, com marcado aumento do limiar de resposta a estímulos sensoriais, possuindo ainda propriedades homeostáticas (Krueger et al., 2016).

A sua larga disseminação no reino animal sugere uma função importante para estes seres vivos, todavia ainda não existe actualmente uma noção bem estabelecida de qual o seu papel fundamental. Nos mamíferos, o sono parece indispensável à normal regulação do comportamento e homeostasia corporal. Em ratos, a privação de sono causa um aumento significativo do gasto energético, assim como o aparecimento de sintomas semelhantes à má nutrição, tais como anemia ou perda de peso (Everson, 1995). Quando este período é alargado (em média cerca de 21 dias), surgem efeitos fatais, decorrentes de uma menor resistência a infeções por parte do sistema imunitário. Contrariamente, em humanos, a privação de sono não acarreta mortalidade, sendo principalmente caracterizada pela marcada perda de capacidades cognitivas, tais como redução da coordenação motora, fala arrastada, afasia parcial, astereognosia, dificuldades de concentração e no discurso, lapsos de memória, bem como das capacidades funcionais, nomeadamente dificuldade de focagem visual e falta de coordenação (Patrick e Gilbert, 1896; Ross, 1965). Ocorrem igualmente alterações comportamentais, como irritabilidade ou falta de cooperação e, por vezes, sintomatologia psicótica como alucinações visuais (Patrick e Gilbert, 1896).

Deste modo, parece assim haver efeitos diversos ao nível das espécies em relação com a privação do sono, o que tornou historicamente difícil o estabelecimento de uma função única para o mesmo. Ao longo das últimas décadas, têm sido propostas muitas funções para o sono, no entanto, nenhuma delas apresenta uma explicação plenamente satisfatória do ponto de vista biológico.

1.1 Teorias sobre a função do sono

Ao longo dos anos, têm surgido diversas teorias que procuram explicar a função principal do sono. Uma proposta relaciona o mesmo com o sistema imunitário, baseando-se em evidências que o sono desempenha um papel ao nível da modelação de vários parâmetros imunológicos, tais como o aumento do número de células T indiferenciadas e citocinas pró-inflamatórias, a diminuição do número de células T citotóxicas e de citocinas anti-inflamatórias, assim como a facilitação do transporte das células T para os nódulos linfáticos (Besedovsky et al., 2012). Foram igualmente registados aumentos do número de células T auxiliares induzidas imunologicamente na noite após uma vacinação, tendo sido sugerido que o sono lento possa ter papel importante nesse processo (Lange et al, 2011).

2 Outra função postulada para o sono reside na conservação de energia. Esta teoria deriva originalmente da constatação que os animais com maiores períodos de sono possuem taxas metabólicas mais elevadas, assim como uma menor massa corporal (Zepelin e Rechtschaffen, 1974). Deste modo, animais com maiores taxas metabólicas, como por exemplo o rato, dormem cerca de 18 horas por dia, enquanto animais maiores e com taxas mais baixas, como a girafa ou o elefante, dormem apenas 3 a 4 horas. Por outro lado, durante o sono ocorre uma diminuição da taxa metabólica no organismo destes animais, indicando que as reservas de energia gastas durante a vígilia serão recuperadas no sono, de forma a que o organismo consiga ter sempre um fornecimento adequado de energia (Krueger et al., 2016). Todavia, não parece evidente que conservar energia seja a sua função primordial, pois o ganho energético durante o sono é bastante modesto (Chokroverty, 2009), sendo que não são explicados alguns dos seus aspectos fundamentais, como a significativa redução da capacidade de resposta aos estímulos exteriores. Apesar deste baixo ganho energético, é possível que o sono tenha uma função metabólica específica no cérebro. Estudos utilizando PET têm mostrado que o consumo de glucose durante o sono não-REM é inferior ao existente na vigília. Em 2002, numa experiência com 14 indivíduos verificou-se um decréscimo de cerca de 11% no metabolismo da glucose durante o sono não-REM, observando-se igualmente diminuições significativas em grandes regiões do córtex frontal, parietal, temporal e occipital (Nofzinger et al., 2002). Por outro lado, o sono REM parece registar um aumento metabólico relativamente à vigília. Medições da função cerebral utilizando um radioisótopo de oxigénio mostraram que certas regiões do cérebro que eram activadas no sono REM (em relação ao sono não-REM), apresentavam níveis mais elevados que na vigília (Braun et al., 1997).

No contexto do metabolismo cerebral, o glicogénio tem também merecido atenção. Em 1983, num estudo efectuado em ratos, observou-se que os níveis de glicogénio no cérebro após o começo da vigília decresciam substancialmente em relação aos níveis existentes durante o sono, os quais atingiam o seu máximo durante o sono lento (Karnovsky et al., 1983). Esse facto levou à teoria de que o sono lento poderia ter como função restaurar os níveis de glicogénio gastos durante a vigília para produzir ATP (Benington e Heller, 1995). Esta hipótese foi testada em várias espécies com diferentes durações de privação de sono. No entanto, contrariamente ao expectável, os resultados obtidos mostram que o nível de glicogénio se mantém estável durante a privação, observando-se um aumento do seu turnover assim como de moléculas envolvidas na sua produção, como a enzima glicogénio sintetase (Petit e Magistretti, 2015). Isto poderá significar que para além da degradação de glicogénio, o metabolismo promove igualmente a sua síntese, mantendo a concentração a níveis constantes e conservando as suas reservas. Outra tese relativa à função do sono defende o seu papel na termorregulação do organismo, tendo por base evidências de anormalidades na mesma durante a privação de sono, ao passo que durante o sono normal é mantida a homeostase termoregulatória (Chokroverty, 2009). Vários estudos suportam a relação entre os dois processos, ao passo que outros sugerem que poderão ser parcialmente independentes, mostrando que alterações num dos processos não se reflectem sempre em modificações no outro (Bach et al., 2011), sendo por isso ainda desconhecida a sua relação de causalidade.

Por fim, o sono poderá ainda desempenhar um papel ao nível da consolidação das memórias adquiridas. Esta hipótese possui uma longa história abrangendo observações dos efeitos da privação de sono na

3 formação de novas memórias, assim como dos efeitos de um período de sono imediatamente após a realização de uma tarefa. Existem evidências que o seu processamento seja dependente do sono em várias espécies animais, nomeadamente em gatos, ratos, ratinhos, no Homem e noutros primatas (Chokroverty, 2009). Em humanos, os estudos mais antigos centram-se em tarefas de aprendizagem declarativa. Em 1989, De Koninck e os seus colaboradores mostraram que após a aprendizagem intensiva de uma língua estrangeira ocorria um aumento do sono REM, o qual se correlacionou com a aprendizagem obtida. Estes resultados sugerem que o sono REM seria importante para a consolidação da memória, tendo propriedades homeostáticas. No entanto, resultados contrários foram obtidos por Meienberg, que não registou alterações nos parâmetros do sono REM num indivíduo sujeito a este tipo de aprendizagem verbal intensiva durante 3 semanas (Meienberg, 1977).

Encontram-se igualmente documentados efeitos do sono REM ao nível da aprendizagem perceptual. Em 1994, um estudo testou os efeitos da privação de sono lento e sono REM neste tipo de aprendizagem em 6 jovens adultos, não tendo observado melhorias após a privação de sono REM, contrariamente ao sono normal e à privação de sono lento (Karni et al., 1994). Por outro lado, existem experiências que têm atribuído ao sono lento a função de consolidação de memórias declarativas. Um estudo realizado por Gais e Born, em 2004, demonstrou que em tarefas de associação envolvendo conjuntos de pares de palavras, ocorria uma diminuição da performance dos indivíduos com o aumento do nível de acetilcolina durante o sono lento. Adicionalmente, dois anos depois, uma experiência demonstrou que o aumento do sono lento, obtido com recurso ao estímulo das oscilações muito lentas do córtex pré-frontal, permite uma melhor retenção das memórias declarativas (Marshall et al., 2006).

1.2

Papel do sono na regulação da plasticidade cerebral

Nos anos mais recentes, tem havido grande interesse em elucidar de que forma o sono se relaciona com a aprendizagem e consolidação de memórias. É sabido que estes processos envolvem fenómenos de plasticidade cerebral, ou seja, mudanças estruturais e funcionais ao nível das respostas neuronais a diferentes estímulos, que se traduzem em alterações de actividade nas várias regiões do cérebro (Chokroverty, 2009). Actualmente, existem evidências da acção do sono nestes processos, obtidas através de estudos electrofisiológicos que mostram que eventos característicos do sono não-REM e do sono REM parecem estar envolvidos na plasticidade cerebral, por via de mecanismos de potenciação e depressão sináptica. Com efeito, Steriade e os seus colaboradores, em 2001, mostraram que é possível provocar modificações permanentes na resposta de neurónios corticais, estimulando-os em surtos semelhantes aos produzidos por fusos do sono, característicos da fase 2 do sono. Adicionalmente, estudos em ratos mostraram que durante a realização de tarefas espaciais e novas experiências, os padrões de disparo de redes neuronais de várias regiões corticais e sub-corticais do cérebro presentes na vigília, são replicadas durante o sono lento e REM subsequentes (Chokroverty, 2009).

A um nível mais microscópico, o modelo de plasticidade sináptica mais detalhadamente caracterizado e promissor para explicar a aprendizagem e memória nos sistemas nervosos mais complexos consiste no fenómeno de Potenciação de Longa Duração, o qual produz um aumento da resposta pós-sináptica mais eficiente que o mecanismo antagónico de Depressão de Longa Duração, criando um desequilíbrio que se torna necessário controlar (Tononi e Cirelli, 2014). Neste contexto, o sono poderia desempenhar

4 um papel de regulador ao reestabelecer o equilíbrio sináptico perturbado durante a vigília, ao diminuir o ganho na transmissão sináptica de tal forma que as várias sinapses não fiquem saturadas e recuperem o seu potencial de plasticidade no dia seguinte.

Outra forma de avaliar a acção do sono na aprendizagem e consolidação de memórias consiste na realização de estudos neuroimagiológicos. Um dos principais objectivos deste tipo de experiências tem sido procurar perceber se o treino numa determinada tarefa durante a vigília condiciona as características da activação funcional do cérebro durante o sono. Uma forma de observar esse efeito seria pela repetição no sono, de padrões de actividade cerebral característicos da realização dessa tarefa. Um trabalho representativo desta ideia foi feito por Maquet, que demonstrou que durante o sono REM são replicados padrões de actividade motora manifestados durante tarefas motoras na vigília (revisto em Chokroverty, 2009). Além disso, estes investigadores verificaram também que a aprendizagem obtida durante a realização destas tarefas correlacionava-se com o grau de reactivação durante o sono REM. A realização de tarefas espaciais envolvendo labirintos virtuais foi também associada a reactivações de áreas do hipocampo durante o sono lento seguinte, sendo o grau de activação tanto maior quanto melhor a performance dos indivíduos no dia seguinte (Peigneux et al., 2004). Estas observações demonstram que a realização e o nível de aprendizagem obtida numa tarefa, podem modelar a actividade cerebral que ocorre durante o sono, com reactivações que conduzem a melhores performances comportamentais. Outro modo de estudar a plasticidade dependente do sono consiste ainda em comparar padrões de actividade cerebral antes e após uma noite de sono. Recorrendo a ressonância magnética funcional, foi possível, por exemplo, detectar uma maior activação cerebral em determinadas zonas do córtex motor e também do cerebelo durante a realização de tarefas de sequência motora após uma noite de sono (revisto em Chokroverty, 2009).

Em síntese, este tipo de estudos permite compreender melhor a plasticidade cerebral associada à memória/aprendizagem que é dependente do sono, pois nele ocorrem reactivações de padrões de actividade neuronal presentes durante a realização de tarefas na vigília prévia, sendo mais fortes aquando de uma melhor performance pós-sono.

1.3 Lobos frontais

Os lobos frontais (Figura 1.1) constituem uma das principais áreas cerebrais no Homem, definindo aspectos fundamentais da sua personalidade e comportamento (Stuss e Knight, 2002). A sua importância foi controversa durante o século XIX e a primeira metade do século XX, com autores defendendo que o córtex frontal possuia funções cerebrais muito integradoras e com outros afirmando que a sua relevância era diminuta, pois eram poucos os défices associados a lesões no córtex frontal (revisto em Stuss e Knight, 2002). Esta divisão devia-se, em boa parte, ao famoso caso de Phineas Gage (1848), pois este mostrou que danos significativos nos lobos frontais provocavam uma grande alteração no comportamento e personalidade dos indivíduos, mantendo intactas, no entanto, a consciência, a sensibilidade, movimento e a maior parte das funções cognitivas.

5 Ao longo do tempo, este dilema foi sendo resolvido com a melhoria das avaliações clinicas e evolução dos instrumentos neurofisiológicos, permitindo a documentação de casos de pacientes com lesões do córtex frontal que revelavam alterações do foro comportamental, tornando-se profanos, irresponsáveis ou irascíveis, enquanto outros evidenciavam perda de espontaneidade, curiosidade, iniciativa, diminuição da atenção, motivação, criatividade, raciocínio abstrato ou resolução de problemas , entre outros aspectos (Stuss e Knight, 2002). Além disso, foi demonstrado que uma lesão nos lobos frontais pode afectar de forma marcada a capacidade de planear e sequenciar comportamentos complexos, entender o contexto e natureza de situações complexas, resistir à distracção e interferência, seguir instruções com vários passos ou a inibição de respostas imediatas, mas inapropriadas, entre outras (Mesulam, 1986).

A realização de testes neuropsicológicos em pacientes tem revelado uma concordância com o descrito acima, evidenciando deficiências em diversas tarefas (revisto em Stuss e Knight, 2002). No entanto, a grande maioria dos testes de percepção, construção, linguagem e atenção espacial permaneceram normais.

Actualmente, sabe-se que os lobos frontais e em especial o córtex pré-frontal, desempenham um papel preponderante nas funções relacionadas com a organização temporal do comportamento intencional, da linguagem e da razão, obtidos exercendo sobre as outras áreas cerebrais um controlo “top-down” importante (Fuster, 2008). Estas funções, denominadas funções executivas, constituem processos cognitivos complexos envolvidos no controlo e coordenação de acções com vista ao cumprimento de objectivos futuros, incluindo um conjunto de capacidades tais como a capacidade de focar a atenção ignorando estímulos irrelevantes, planear e sequenciar pensamentos e comportamentos, actualizar informação à medida que as condições se alteram, inibir acções inapropriadas, formar conceitos abstratos ou pensar de modo flexível e inovador.

Figura 1.1 – Principais áreas cerebrais. Lobo frontal – azul; Lobo parietal – amarelo; Lobo temporal – verde; Lobo occipital – rosa (Retirado de http://www.drdiagram.com/human-brain-diagram-cerebrum/human-brain-diagram-cerebrum-3/).

6

1.4 EEG

O EEG consiste no registo da actividade eléctrica cerebral ao nível do escalpe, tendo sido realizado pela primeira vez por Berger na década de 20. Apesar da sua aceitação como um método de análise da função cerebral, os mecanismos de geração e a significância funcional do EEG permaneceram controversos durante bastante tempo devido não só à complexidade dos geradores neuronais, mas também à transferência dos sinais da superfície cortical até ao escalpe, que é condicionada pelas diferentes propriedades topológicas e eléctricas dos condutores de volume, nomeadamente o cérebro, líquido cefalorraquidiano, crânio e o escalpe.

O EEG representa a actividade eléctrica conjunta de populações de neurónios, juntamente com uma pequena contribuição de células gliais (Lopes da Silva, 2010). Os neurónios são células excitáveis cuja actividade produz campos eléctricos e também magnéticos. Estes campos podem ser detectados por eléctrodos colocados a pequenas distâncias das fontes (EEG local ou LFP), da superfície cortical (Electrocorticograma) ou a longas distâncias a partir do escalpe (EEG).

Foi demonstrado que, de entre os vários tipos de neurónios, as células piramidais localizadas no córtex são as responsáveis pela geração dos campos eléctricos registados pelo EEG. São células excitatórias que constituem cerca de 80% a 90% dos neurónios do Sistema Nervoso Central, possuindo um corpo celular com uma forma piramidal característica. Estas encontram-se orientadas perpendicularmente à superfície cortical (Figura 1.2), com as dendrites apicais mais próximas da superfície e o corpo celular e axónio estendendo-se na direcção diametralmente oposta. A sua organização em paliçada (Figura 1.2) permite que, quando activadas de forma sincronizada, estas células gerem campos eléctricos dipolares amplos, resultado da soma de um grande número de pequenos dipolos individuais.

Figura 1.2 – Representação de uma porção da região cortical com a presença de células piramidais (Retirado de http://charlesfrye.github.io/FoundationalNeuroscience/02/).

7 A activação neuronal pode ocorrer de duas formas fundamentais: por via de uma despolarização rápida das membranas neuronais gerando potenciais de acção ou através de potenciais sinápticos.

Um potencial de acção consiste numa rápida reversão da polaridade eléctrica de uma região da membrana celular que posteriormente se propaga ao longo do axónio até aos terminais sinápticos sem perda de amplitude. Este envolve a acção de canais iónicos dependentes de voltagem localizados na membrana (canais de sódio e potássio), os quais aumentam a condutância quando a membrana celular atinge um certo limiar de voltagem. No entanto, a brevidade deste tipo de activação neuronal torna-o pouco relevante para o EEG.

Os potenciais pós-sinápticos mais lentos, por outro lado, são os que mais contribuem para o potencial eléctrico observado no EEG. Estes podem ser excitatórios (EPSPs) ou inibitórios (IPSPs), dependendo do neurotransmissor e respectivo receptor pós-sinaptico, assim como da sua interacção com determinados canais iónicos.

Num EPSP, a corrente eléctrica transmembranar é formada pela entrada de iões de sódio (Na+_{) ao nível}

da sinapse, direccionando-se para o meio intracelular.

Num IPSP, essa corrente eléctrica é formada pela entrada de iões de cloro (Cl-_{) ou saída de iões de}

potássio (K+_{) do interior para o exterior do neurónio. Consequentemente, gera-se um potencial negativo}

no meio extracelular no caso de um EPSP e um potencial positivo no caso de um IPSP.

A compreensão de como estes potenciais originam campos detectáveis no escalpe exige o conhecimento de dois factos adicionais:

a) as sinapses excitatórias distribuem-se preferencialmente nas dendrites distais, ou seja, perto da superfície cortical;

b) as sinapses inibitórias distribuem-se mais profundamente, sobretudo junto do corpo celular. Quer se trate de um EPSP ou IPSP, a estimulação das células piramidais origina um pequeno dipolo, cujo polo negativo é superficial e o positivo se encontra na profundidade.

O facto de os estímulos sinápticos ocorrerem de forma sincronizada pela estimulação de vias aferentes contendo múltiplos terminais sinápticos, assim como a orientação paralela dos dipolos individuais (Figura 1.3), leva à soma dos campos elétricos microscópicos que passam a ser detectáveis na superfície do escalpe como EEG (Figura 1.4).

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Figura 1.3 – Representação dos potenciais extracelulares associados à actividade sináptica. E – EPSP; I – IPSP (Adaptado de Mulert e Lemieux, 2010, p.21).

Figura 1.4 – Os potenciais eléctricos no escalpe resultantes da soma de múltiplos dipolos corticais constitui a base do EEG (Adaptado de Nunez e Srinivasan, 2006, p. 5).

Deste modo, o EEG representa a actividade eléctrica resultante da estimulação sináptica sincronizada de múltiplas células piramidais no córtex cerebral. Quando as células neuronais não possuem a organização em paliçada anteriormente referida, como acontece por exemplo, no Tálamo ou no Cerebelo, o seu contributo para o EEG é nulo. A definição dos vários ritmos cerebrais possibilitados pelo EEG serviram de base para estabelecer as diferentes fases existentes no sono (Figura 1.5), sendo ainda actualmente o método de referência.

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Figura 1.5 – Fases do sono (Retirado de https://tigerweb.towson.edu/rburns8/project_02).

1.5 Conectividade

A conectividade cerebral constitui uma medida das interacções entre grupos neuronais de diferentes áreas cerebrais. Considera-se habitualmente 3 tipos de conectividade:

1. Estrutural (ou neuroanatómica), que se refere à distribuição anatómica das fibras ao longo das regiões cerebrais, sendo frequentemente estudada através de técnicas como a Ressonância Magnética Nuclear (Hagmann et al., 2007) ou o Tensor de Difusão (Heuvel et al., 2009).

2. Funcional, que consiste na caracterização das correlações estatísticas entre a actividade temporal gerada pela actividade de grupos neuronais em regiões distintas do cérebro, podendo ser analisada utilizando sinais de Electroencefalografia (Smit et al., 2007), Magnetoencefalografia (Stam et al., 2007), Potenciação de Longo Termo (Ray e Maunsell, 2011), Tomografia de Emissão de Positrões (Grady et al., 2003) ou Ressonância Magnética Funcional (Roy et al., 2009).

3. Efectiva, que mede a influência exercida por um grupo/sistema neuronal sobre outro, ou seja, a causalidade das interacções entre as diferentes regiões cerebrais.

Neste âmbito, o EEG constitui uma óptima opção para o estudo destes tipos de conectividade, pois possui uma resolução temporal na ordem dos milissegundos (He et al., 2011), permitindo calcular as interações entre regiões cerebrais ao longo ao tempo numa ampla gama de frequências. Neste contexto, os registos de EEG mais vantajosos são realizados no escalpe (Figura 1.6), devido à sua natureza não invasiva, no entanto, os campos eléctricos gerados pelas diferentes fontes neuronais apresentam uma

10 elevada dispersão global (Figura 1.7), levando a uma contaminação cruzada significativa do sinal captado pelos diversos sensores (eléctrodos) (Schoffelen e Gross, 2009).

Figura 1.7 – Representação do modo como a actividade neuronal produzida por uma fonte é captada por diferentes sensores (Adaptado de Schoffelen e Gross, 2009).

Este facto limita a utilidade das medidas de conectividade obtidas entre os registos dos vários sensores, tornando a sua interpretação bastante complicada. A imprecisão resultante pode ser minimizada recalculando as fontes na superfície cerebral, por via de métodos de análise de fonte (Astolfi e Babiloni, 2008) (Figura 1.8). Todavia, a tarefa de localizar os geradores intracranianos dos potenciais eléctricos no escalpe é problemática, não só devido à complexa configuração dos campos eléctricos associados, mas também à distorção produzida pelas diferentes condutividades eléctricas do cérebro, crânio e do escalpe (Babiloni et al, 2005).

Figura 1.8 – Reconstrução de fonte (Retirado de http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/~wpenny/research/meeg.html).

Este obstáculo foi minimizado graças ao surgimento do EEG de alta resolução (Figura 1.9), que possibilitou estimar com maior precisão a actividade cortical a partir de medições de EEG não invasivas,

Figura 1.6 – EEG realizado ao nível do escalpe (Retirado de https://www.epilepsysociety.org.uk/what-epilepsy#.Wk5Pit9l8uU).

11 utilizando um número elevado de eléctrodos no escalpe, modelos realistas da cabeça baseados em imagens de Ressonância Magnética Estrutural, assim como metodologias de processamento relacionadas com a solução do problema inverso.

Figura 1.9 – EEG de alta resolução.

Nos últimos anos tem havido grande expansão de métricas de conectividade, instrumentos matemáticos que procuram quantificar o grau de correlação entre as séries temporais registadas da actividade de várias áreas cerebrais. A validação empírica destas métricas encontra-se, no entanto, ainda nas fases iniciais não sendo clara qual a metodologia mais adequada nos diversos contextos.

1.6 A conectividade funcional em EEG como uma medida da interacção

entre áreas funcionais cerebrais

A ideia de que o sono poderia ter uma função na regulação da conectividade entre diferentes redes neuronais surgiu na sequência de evidências relacionando a actividade nas diferentes áreas cerebrais com o tipo de aprendizagem efectuado na vigília prévia (Huber et al., 2004; Marshall et al., 2006). A modulação da actividade sináptica associada à aprendizagem traduz-se, a nível macroscópico, na modificação da sincronização entre a actividade intrínseca das redes neuronais envolvidas, o que origina modificação da conectividade funcional entre elas. O estudo da conectividade funcional entre as diferentes áreas cerebrais seria assim um correlato a nível das redes neuronais da plasticidade sináptica a nível neuronal.

O estudo da conectividade funcional capitaliza no facto de as diversas redes neuronais apresentarem oscilações intrínsecas que se correlacionam com o estado funcional (Schoffelen e Gross, 2009). Em diversos estádios de activação, estas oscilações modificam em amplitude e frequência, podendo apresentar fenómenos de sincronização temporal com outras redes neuronais. Estas sincronizações

12 transitórias entre redes neuronais parecem corresponder a períodos de troca de informação, com importância crucial para compreender o funcionamento cerebral.

Na actualidade, o estudo da conectividade funcional em humanos efectua-se usando primariamente registos neurofisiológicos (EEG e MEG) ou neuro vasculares (Ressonância Magnética), que pela sua natureza não invasiva são adequados a estudos da dinâmica cerebral em condições ecologicamente válidas.

1.7 Evidências do efeito da privação do sono na conectividade funcional dos

lobos frontais

Várias das funções executivas atribuídas aos lobos frontais encontram-se perturbadas de forma proeminente durante a privação do sono, o que sugere uma interferência particularmente importante da mesma no funcionamento destas regiões cerebrais.

A conectividade funcional dos lobos frontais é proeminente com a generalidade das áreas corticais (Fuster, 2008), o que certamente se correlaciona com o referido controlo sobre a restante actividade cerebral. Será, pois, expectável que a degradação cognitiva associada à privação do sono se relacione com perturbações desta conectividade funcional. Permanece, no entanto, pouco claro se esta perturbação se correlaciona com uma degradação difusa da conectividade ou se esta é selectiva para algumas estruturas em particular. Na verdade, alguns estudos enfatizam a importância da conectividade funcional entre os lobos frontais e as áreas parietais como especificamente relevantes (Cui et al., 2015), enquanto outros evidenciam alterações mais difusas (Verweij et al., 2014).

Seria assim importante caracterizar a selectividade das alterações da conectividade funcional fronto-parietal na degradação cognitiva associada à privação do sono, comparando nos mesmos indivíduos, protocolos de avaliação do impacto da privação em diferentes aspectos da cognição.

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2. OBJECTIVOS

O principal objectivo desta tese consiste em caracterizar o impacto da privação completa de uma noite de sono na conectividade funcional entre os lobos frontais, os lobos parietais e as áreas visuais occipitais, assim como no desempenho funcional durante a realização de uma tarefa experimental associada à activação occipital e frontal.

Os objectivos secundários serão:

1. Avaliação do impacto da activação experimental na conectividade frontal. 2. Avaliação do efeito de uma sesta na recuperação funcional.

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3. METODOLOGIA

3.1 Participantes

6 voluntários (5 homens e 1 mulher), de idades compreendidas entre os 25 e os 52 anos, participaram neste estudo (Tabela 3.1). Eram adultos saudáveis com um ciclo de trabalho normalizado, bons hábitos de sono, sem doenças neurológicas ou psiquiátricas e sem problemas associados ao sono. Na semana anterior aos registos não foram reportadas alterações significativas dos hábitos de sono. Adicionalmente, os voluntários negaram a utilização de medicação crónica, estimulantes ou álcool nas 24 horas anteriores ao estudo, tendo preenchido um questionário breve - Escala de Epsworth (Johns, 1991) - para quantificar o nível de sonolência antes de o iniciar.

Tabela 3.1 – Idade, sexo e profissões dos participantes.

Participante Idade Sexo Profissão

P1 52 Masculino Médico

P2 52 Feminino Médica

P3 25 Masculino Estudante

P4 34 Masculino Técnico Neurofisiologia

P5 51 Masculino Militar

P6 33 Masculino Técnico Neurofisiologia

3.2 Protocolo experimental

Cada participante submeteu-se a dois registos experimentais: um após uma noite de privação total de sono (totalizando aproximadamente 34 horas de privação) e outro sem alteração do ritmo circadiano individual. Os registos tiveram lugar durante a semana às 17 horas.

A tarefa experimental consistiu na aplicação de uma variante do protocolo Go-Nogo. que é frequentemente utilizado em estudos de inibição de respostas, uma função executiva dos lobos frontais que consiste na capacidade de um individuo suprimir uma resposta não adaptativa ou inapropriada. Classicamente, este requer a execução de uma resposta motora a um estímulo frequente (Go) e a inibição dessa resposta em face de um estímulo menos frequente (Nogo); na nossa variante é exigida uma resposta motora ao estímulo Go e uma resposta motora alternativa ao estímulo Nogo.

O protocolo foi realizado juntamente com registo de EEG de alta resolução com 82 eléctrodos mais electrocardiograma. Estes eléctrodos, constituídos por cloreto de prata, foram colocadas numa touca contendo as 82 posições de amostragem no escalpe (Figura 3.1), correspondente ao mapa do sistema 10-10 mais os eléctrodos temporais inferiores. Seguidamente foi aplicado gel condutor e aferidas as impedâncias de modo a obter valores inferiores a 5 KΩ em todos os eléctrodos.

A montagem utilizada nos registos foi a referencial, na qual se regista a diferença de potencial eléctrico entre cada eléctrodo e uma referência comum, neste caso localizada sobre o lobo frontal (Fcz) (Figura

15 3.1). O eléctrodo de terra foi colocado 2 centímetros anterior ao eléctrodo AFz, igualmente sobre os lobos frontais.

Os filtros definidos e aplicados a todos os canais de EEG durante a aquisição foram: passa-alto a DC e passa-baixo a 200 Hz, que permite manter as variações dependentes de potenciais electrotónicos e remover oscilações rápidas, por exemplo, causadas por ruído ou por eventos transientes de curta duração sem relevância para a interpretação do EEG. A amostragem foi realizada a 1000 Hz.

Figura 3.1 – Montagem de EEG de alta resolução com 82 electrodos utilizada durante a realização da tarefa experimental. A vermelho encontra-se destacada a referência utlizada nesta montagem (Fcz).

Os participantes encontravam-se confortavelmente sentados face a um monitor colocado a 1,5 metros de distância em que se apresentavam estímulos visuais de forma sequencial, sendo solicitados a dar respostas utilizando uma caixa com botões. Os estímulos apresentados eram números de 0 a 9, que surgiam individualmente durante um período fixo que permitia uma fácil identificação (200 milissegundos) e com intervalos de tempo variáveis (entre 1200 e 1800 milissegundos). O voluntário foi instruído a carregar o mais rapidamente possível num botão com o polegar esquerdo (botão 1), aquando do aparecimento de qualquer número à excepção do número 0 e noutro botão com o polegar direito (botão 2) quando surgisse o número 0 (o estímulo pouco frequente). As respostas eram registadas como eventos no sistema de apresentação de estímulos (STIM), correspondendo a cada um dos tipos de resposta dados (1’ para o botão 1 e 2’ para o botão 2).

16 Em cada avaliação, realizaram-se 6 sessões de estímulos. Cada sessão continha uma sequência diferente de 300 números, sendo 20% deles o número 0. Após 3 sessões de respostas, os voluntários fizeram uma sesta de 30 a 40 minutos, com manutenção do registo EEG, à qual se seguiam as restantes 3 sessões (Figura 3.2).

Figura 3.2 – Sequência de eventos durante a avaliação experimental.

Foi igualmente registado o EEG no estado de repouso antes do início da tarefa experimental e após a sesta, tendo-se pedido a cada participante que fechasse e abrisse os olhos durante certos períodos (Tabela 3.2), de modo a obter dados de referência para o cálculo da conectividade funcional.

OF 5 minutos OA 30 seg. OF 30 seg. OA 30 seg. OF 30 seg. OA 30 seg.

Tabela 3.2 – Protocolo de fecho e abertura de olhos para medição do EEG em estado de repouso. OF - Olhos Fechados; OA – Olhos Abertos.

3.3 Desenho do estudo

O design escolhido para o estudo seguiu o modelo cross-over, onde cada participante faz parte simultaneamente do grupo de intervenção e do grupo de controlo, realizando duas avaliações espaçadas no tempo.

A vantagem fundamental deste modelo é a redução da variabilidade entre o grupo de controlo e de intervenção, o que permite a utilização de amostras mais pequenas, reduzindo os custos inerentes à experiência e a sua duração.

As principais desvantagens são a possível permanência na segunda avaliação, de efeitos causados pela intervenção prévia, assim como a aprendizagem adquirida nos testes realizados. Para minimizar estes riscos, definiu-se um intervalo de, pelo menos, 3 semanas entre as avaliações do mesmo participante, com a intervenção no sono a ser efectuada de forma contrabalançada, ou seja, metade dos participantes realizaram a privação de sono aquando do primeiro registo, enquanto que os restantes a realizaram apenas no segundo registo experimental.

17

3.4 Equipamento utilizado

Para esta tarefa experimental foi utilizado o sistema de apresentação de estímulos sensoriais e registo de respostas STIM 2 (Compumedics - Neuroscan), que possibilitou a apresentação dos estímulos visuais e recolha das respostas motoras. Este sistema encontrava-se conectado ao sistema de registo de EEG, composto por um Electroencefalógrafo digital SYNAMPS 2 (Compumedics – Neuroscan) com 128 canais que possibilitava a inserção sincronizada de triggers sincronizados com o registo de EEG. O programa utilizado para a visualização e registo do EEG foi o SCAN v. 4.5 (Compumedics - Neuroscan).

3.5 Análise dos dados

3.5.1 Dados comportamentais

As variáveis comportamentais seleccionadas para análise foram: respostas certas (estímulo “0”, botão 2), respostas erradas (estímulo “0”, botão 1), tempo de reacção (em milissegundos) e respostas falhadas (não carregar no botão).

Os dados recolhidos em cada registo foram concatenados em Excel em dois grupos, referentes às sessões antes e após a sesta, sendo apenas considerados as respostas ao número 0. Seguidamente, foi contabilizado o número total de respostas certas, erradas e falhadas, assim como os respectivos tempos médios de reacção e desvios padrão de cada voluntário. Para o cálculo dos tempos de reacção, não foram contabilizadas respostas inferiores a 100 milissegundos, consideradas como respostas antecipatórias, nem respostas superiores a 1000 milissegundos, definido como sensivelmente o dobro do tempo máximo de reacção obtido em registos preliminares (450 milissegundos).

3.5.2 Registo EEG

O processamento do registo de EEG decorreu de acordo com os seguintes passos:

1) Aplicação de um filtro passa-alto a 1 Hz sem alteração de fase, seguido de um filtro passa-baixo de 70 Hz igualmente sem alteração;

2) Selecção e interpolação de canais com artefactos (se existissem); 3) Marcação e remoção de segmentos do traçado contendo artefactos;

4) Marcação dos artefactos causados pelo ECG e posterior remoção através da construção e aplicação de um filtro espacial;

5) Marcação dos artefactos causados pelo EOG e posterior remoção através da construção e aplicação de um filtro espacial;

18 O estadiamento do sono durante a sesta foi efectuada por análise visual em épocas de 30 segundos, de acordo com os critérios definidos pelo Manual da Academia Americana de Medicina do Sono para o Estadiamento do Sono e Eventos Associados (Berry et al., 2016).

3.6 Criação de segmentos para a conectividade

Para o cálculo da conectividade funcional, foram seleccionados segmentos de EEG com 30 segundos, com o participante em repouso com os olhos fechados, em repouso com os olhos abertos e durante a realização da segunda sessão de respostas, antes e após a sesta.

A primeira sessão foi excluída com vista a minimizar os efeitos adversos decorrentes da adaptação inicial à tarefa experimental e à inércia do sono após a sesta, enquanto que a terceira sessão foi retirada da análise de modo a reduzir o efeito provocado pelo desgaste acumulado, visto que, em condições de privação de sono, o tempo despendido numa tarefa traduz-se, em geral, num desempenho cognitivo progressivamente pior, independentemente da tarefa em questão (Durmer e Dinges, 2005).

Estas segmentos foram processados no software MATLAB R2015b utilizando a toolbox eConnectome (He et al., 2011). Os canais contendo artefactos foram interpolados e calculou-se uma estimação do potencial eléctrico na superfície cortical pela norma mínima (Schoffelen e Gross, 2009).

3.7 Determinação das regiões de interesse

As regiões de interesse (ROIs) (Figura 3.3) foram estabelecidas com base nos dados da literatura para as áreas corticais activadas nas tarefas de Go-noGo e discriminação visual.

A tarefa experimental implementada requeria a discriminação de um estímulo visual, que trabalhos prévios evidenciaram produzir activação de áreas visuais secundárias, localizadas na região occipital inferior de ambos os hemisférios, pelo que as ROIs occipitais foram colocadas simetricamente nesta área cortical. Por outro lado, as tarefas de inibição e selecção de respostas encontram-se associadas à zona mesial dos lobos frontais, mais concretamente, à área pré-suplementar motora (Mostofsky e Simmond, 2008), sendo assim as ROIs frontais colocadas simetricamente nesta região. As ROIs parietais foram colocadas simetricamente na região lateral.

19 As ROIs são constituídas por áreas circulares na superfície cortical com diâmetros de 3 centímetros nos lobos frontais e occipitais inferiores e de 2 centímetros nos lobos parietais.

3.8 Cálculo da conectividade funcional

A conectividade funcional entre as regiões de interesse foi estimada para as várias bandas de EEG utilizando a métrica DTF (Direct Transfer Function) (Kaminski e Blinowska, 1991). Para cada segmento de EEG foram analisadas as bandas delta (1 Hz – 4 Hz), teta (4 Hz – 7 Hz), alfa (8 Hz – 12 Hz) e beta (12 Hz - 30Hz) (Figura 3.4), tendo-se utilizado a toolbox eConnectome (He et al., 2011) para calcular a DTF. A significância estatística das determinações foi determinada através de testes de permutação (N = 1000, p < 0.05), utilizando o mesmo software.

Figura 3.4 – Bandas de EEG analisadas (Retirado de http://econtact.ca/14_2/ortiz_biofeedback.html). Figura 3.3 – Regiões de interesse (construído com a toolbox eConnectome do software MATLAB R2015b).

20 Foram calculadas as conectividades entre as ROI dos lobos frontais, occipitais e parietais (Figura 3.5). Apesar de as determinações terem sido efectuadas entre ROIs localizadas nos dois hemisférios, para efeitos estatísticos seleccionaram-se os maiores valores de conectividade entre as ROIs frontais, occipitais e parietais, independentemente da lateralidade das mesmas.

3.9 Análise estatística

Foi efectuada a análise estatística tendo em vista comparar as variações na conectividade entre as regiões corticais de interessesem e com privação de sono (objectivo principal), em repouso passivo vs execução experimental (objectivo secundário), antes e após a sesta (objectivo secundário).

Para cada uma das comparações, foi efectuada uma ANOVA de 3 vias em que os factores foram: a banda espectral do EEG (delta, teta, alfa e beta); pares de regiões de interesse (Fronto-Occipital, Occipito-Frontal, Fronto-Parietal e Parieto-Frontal); execução da tarefa experimental / privação de sono / sesta.

Figura 3.5 – Representação das principais conectividades (esquerda) e matriz de todas as conectividades (direita) entre as ROIs de um participante durante a realização da tarefa experimental. Cada número na matriz corresponde a uma determinada região cerebral: 1- região frontal esquerda; 2 - região frontal direita; 3 – região parietal esquerda. 4 – região parietal direita; 5- região occipital esquerda; 6 – região occipital direita. A matriz é lida no sentido ji. Os valores das conectividades variam entre 0 (sem conectividade) e 1 (conectividade máxima). Construído com a toolbox eConnectome do software MATLAB R2015b.

21 A variável independente foi a conectividade cortical. Foram efectuados testes de Tukey pós-hoc para avaliar a significância estatística da diferença de médias individuais.

Foram efectuadas análises de correlação linear entre as variações de conectividade e a variação dos erros comportamentais, com a privação de sono. O software usado para processamento estatístico foi o OriginalLab Pro 2017.

22

4. RESULTADOS

4.1 Tarefas comportamentais

As tarefas experimentais do paradigma Go-Nogo foram executadas sem problemas, tendo havido uma boa adesão dos participantes, assim como um número reduzido de respostas falhadas (Figura 4.1). Os níveis de sonolência apurados aquando do seu início revelaram-se adequados, com os participantes a registarem uma pontuação média na Escala de Epsworth de 4,8 (valor normal ≤ 10) após uma noite normal e de 14,3 com privação de sono.

Figura 4.1 – Número de respostas certas, erradas e falhadas de cada participante sem e com privação de sono, antes da realização de uma sesta.

O desempenho comportamental evidenciou que a proporção de respostas erradas de cada participante possuía uma marcada variabilidade inter-individual, pelo que o efeito da privação foi avaliado normalizando os erros segundo o valor sem privação(Figura 4.2 e Anexo 1).

117 174 112 134 140 158 60 5 59 46 32 19 3 ₁ 9 ₀ 8 3 121 174 113 122 113 149 50 6 67 54 ₅₁ 30 9 0 0 4 16 1 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 P1 P2 P3 P4 P5 P6

Respostas comportamentais

Correctas sem privação Erradas sem privação Falhadas sem privação Correctas com privação Erradas com privação Falhadas com privação

23

Figura 4.2 – Percentagem de erros cometidos por cada participante sem e com privação de sono.

Observou-se um aumento médio de 23% nos erros com a privação de sono sendo, no entanto, ainda aparente apreciável variabilidade (Tabela 4.1), com um dos participantes a apresentar mesmo uma redução dos erros após a privação (P1).

Tabela 4.1 – Percentagem de erros cometidos por participante sem e com privação de sono e respectiva variação.

Participante sem privação com privação Variação

P1 34% 29% -14% P2 3% 3% 0% P3 35% 37% 8% P4 26% 31% 20% P5 19% 31% 67% P6 11% 17% 56% Média 21% 25% 23% 34% 3% 35% 26% 19% 11% 29% 3% 37% 31% 31% 17% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% P1 P2 P3 P4 P5 P6

Erros sem e com privação de sono

sem privação com privação

24 Sem privação de sono, o tempo de reacção médio para as respostas certas foi de 365 milissegundos, e para as respostas erradas de 270 milissegundos. Após a privação, o tempo de reacção para respostas certas foi de 363 milissegundos e para as erradas 262 milissegundos (Anexo 2).

A diferença das médias não atingiu significância estatística (p > 0,05) , não suportando assim a existência de um efeito significativo da privação de sono nestas variáveis (Figura 4.3).

Figura 4.3 – Caixas de bigodes dos tempos de reacção.

Globalmente, os anteriores resultados evidenciam que a privação de uma noite de sono produziu a nível do desempenho um aumento do número de erros, consentâneo com uma diminuição da capacidade de monitorização, mas sem significativa modificação dos tempos de reacção nas respostas individuais. Foram ainda analisados os erros cometidos antes e após a sesta. Os participantes dormiram em média cerca de 19 minutos, encontrando-se 59,6 % do tempo em fase 1 do sono e 40,4 % em fase 2(Figuras 4.4 e 4.5). 150 200 250 300 350 400 450

Correctos sem privação Correctos com privação Erros sem privação Erros com privação

25

Figura 4.4 – Hipnogramas das sestas realizadas, com tempo total e percentagem de fase 1 e 2 do sono de cada um dos participantes com privação de sono. W- Vigília; 1 – fase 1; 2 – fase 2; 3 – fase 3.

sono 6,5 minutos Fase 1 61,5% Fase 2 38,5% sono 20,5 minutos Fase 1 80,5% Fase 2 19,5% Sono 27 minutos Fase 1 20,4% Fase 2 79,6% sono 14,5 minutos Fase 1 62,1% Fase 2 37,9% sono 16 minutos Fase 1 90,6% Fase 2 9,4% sono 27 minutos Fase 1 42,6% Fase 2 57,4% W 1 2 3 P3 W 1 2 3 P4 W 1 2 3 P6 W 1 2 3 P5 W 1 2 3 P1 W 1 2 3 P2

26

Figura 4.5 – Tempo total de sono e tempo decorrido nas diferentes fases do sono nas sestas realizadas pelos participantes com privação.

Os erros cometidos antes e após a sesta nos participantes com privação de sono atingiram valores médios de 25% e 23% respectivamente (Anexo 3), não suportando a existência de um efeito significativo da sesta no desempenho dos participantes (p > 0,05).

4.2 Conectividade associada à tarefa experimental

A fim de avaliar o efeito da tarefa experimental na conectividade entre as áreas cerebrais seleccionadas, efectuou-se uma ANOVA de três vias (Anexo 4), usando como factores as bandas espectrais (delta, teta, alfa e beta), os pares de ROIs (OccipFront, FrontOccip, ParFront e FrontPar) e a condição experimental (Passiva, Activa), sendo a variável independente a conectividade.

Esta análise evidenciou os seguintes resultados:

a) As médias das conectividades das bandas espectrais não são significativamente diferentes (p = 0,88), não sendo demonstráveis diferenças de conectividade ao nível das bandas;

b) As médias de conectividade entre ROIs são significativamente diferentes (p < 0,05), o que suporta a existência de conectividades distintas entre as ROIs;

c) As médias de conectividade entre a condição passiva (repouso) e activa não são significativamente diferentes (p = 0,68), o que sugere não existir variação relevante;

0 5 10 15 20 25 30 P1 P2 P3 P4 P5 P6 Te mpo ( min utos )

Tempos de sono total e suas fases

27 O teste de Tukey para comparação de pares de médiasevidencia que nas conectividades entre ROIs, as postero-anteriores (Occipito-Frontal e Parieto-Frontal) são significativamente maiores que a antero-posteriores (Fronto-Occipital e Fronto-Parietal) (p < 0,05).

A interacção da condição experimental (Passiva e Activa) com os pares de ROIs, (Figura 4.6), evidencia que na condição activa as conectividades Parieto-Frontal, Fronto-Parietal e Fronto-Occipital diminuem ligeiramente, aumentando somente a Occipito-Frontal. Adicionalmente, a comparação da conectividade média Parieto-Frontal com a Occipito-Frontal na condição passiva é estatisticamente significativa (teste Tukey), mas não significativa na condição activa.

Estes resultados suportam a existência de um aumento relativo da conectividade entre as áreas visuais secundárias e as áreas meso-frontais com a realização da tarefa experimental visuo-motora.

Figura 4.6 – Conectividade dos pares de ROIs na condição passiva e activa.

4.3 Conectividade associada à privação do sono

Foi avaliado o efeito da privação de sono na conectividade entre as áreas cerebrais seleccionadas por meio de uma ANOVA de 3 vias (Anexo 5), utilizando como factores as bandas espectrais (delta, teta, alfa e beta), os pares de ROIs (OccipFront, FrontOccip, ParFront e FrontPar) e a condição experimental (sem e com privação de sono), sendo a variável independente a conectividade.

Passiva Activa 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 Conec tividade parROI FrontOccip OccipFront FrontPar ParFront

28 Obtiveram-se os seguintes resultados:

a) As médias de conectividade das bandas espectrais não são significativamente diferentes (p = 0,89), pelo que não existe diferenças entre bandas ao nível da conectividade;

b) As médias de conectividade dos pares de ROIs são significativamente diferentes (p < 0,05), o que suporta a existência de conectividades distintas entre ROIs;

c) As médias de conectividade globais sem e com privação de sono são significativamente diferentes (p < 0,05), logo a privação influencia os níveis de conectividade entre as diferentes áreas cerebrais;

O teste de Tukey evidencia que nas conectividades entre ROIs, as conectividades postero-anteriores são significativamente maiores do que as antero-posteriores (p < 0,05). A conectividade Parieto-Frontal é significativamente maior que a Occipito-Frontal (p < 0,05), porém não existe diferença significativa entre as conectividades antero-posteriores (p > 0,05). A interacção entre as conectividades dos pares de ROIs evidencia uma tendência geral de aumento da conectividade com a privação, com a conectividade Parieto-Frontal a registar o maior aumento (Figura 4.7).

Efectuando uma comparação das médias das conectividades Parieto-Frontal e Occipito-Frontal antes e após privação (teste de Tukey), apenas se observa uma diferença estatisticamente significativa com a privação, suportando a existência de um aumento relativo da conectividade Parieto-Frontal em relação à Occipito-Frontal com a privação de sono.

Figura 4.7 – Conectividade dos pares de ROIs sem e com privação de sono.

sem com 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 Conec tividade Privação parROI FrontOccip OccipFront FrontPar ParFront

29 Verificou-se também a relação entre os erros cometidos durante a tarefa experimental e as conectividades mais elevadas antes e após a privação de sono, nomeadamente a conectividade Occipito-Frontal e Parieto-Occipito-Frontal, através de análise de correlação linear. A conectividade Occipito-Occipito-Frontal não apresentou qualquer correlação significativa com os erros cometidos (r de Pearson = - 0.01) (Figura 4.8),ao passo que a conectividade Parieto-Frontal apresentou uma correlação negativa (r de Pearson = - 0.643) (Figura 4.9).

Estes resultados evidenciam que o aumento selectivo desta conectividade com a privação do sono está associado a uma menor percentagem de erros, com os participantes que registaram menores acréscimos de erros com a privação do sono, a ser os que mais aumentaram a conectividade Parieto-Frontal.

Figura 4.8 – Correlação entre o aumento de erros em privação de sono e a conectividade Occipito-Frontal.

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,0 0,5 Variaç ão da c onectividade Occ ipFr ont Erros Equation y = a + b*x Plot OccipFront Conect var Weight No Weighting Intercept 0,05263 ± 0,20267 Slope -0,01149 ± 0,54449 Residual Sum of Squares 0,61227 Pearson's r -0,01055 R-Square(COD) 1,11364E-4 Adj. R-Square -0,24986

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Figura 4.9 – Correlação entre o aumento de erros em privação de sono e a conectividade Parieto-Frontal.

4.4 Conectividade associada à sesta

Foi avaliado o efeito de uma sesta na conectividade entre as áreas cerebrais seleccionadas por meio de uma ANOVA de 3 vias (Anexo 6), utilizando como factores as bandas espectrais (delta, teta, alfa e beta), os pares de ROIs (OccipFront, FrontOccip, ParFront e FrontPar) e a condição experimental (antes e após a sesta), sendo a variável independente a conectividade.

Obtiveram-se os seguintes resultados:

a) As médias de conectividade das bandas espectrais não são significativamente diferentes entre si (p = 0,92), pelo que não existe diferenças entre bandas ao nível da conectividade;

b) As médias de conectividade dos pares de ROIs são significativamente diferentes (p < 0,05) sendo assim a especificidade dos ROIs um factor relevante para a variação da conectividade;

c) As médias de conectividade globais antes e após a sesta não são significativamente diferentes (p = 0,44), logo a sesta não aparenta influenciar a conectividade global entre as diferentes áreas cerebrais. -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,0 0,5 Variaç ão da c onectividade ParF ront Erros Equation y = a + b*x Plot ParFront Conect var Weight No Weighting Intercept 0,32262 ± 0,14411 Slope -0,65154 ± 0,38715 Residual Sum of Squares 0,30955 Pearson's r -0,64384 R-Square(COD) 0,41453 Adj. R-Square 0,26816

31 O teste de Tukey evidencia que as conectividades postero-anteriores são significativamente maiores que as antero-posteriores nas duas condições experimentais (p < 0,05). Adicionalmente, a conectividade Parieto-Frontal é significativamente maior que a Occipito-Frontal antes da realização da sesta (p < 0,05). A interacção da condição experimental (antes e após a sesta) com os pares de ROIs, (Figura 4.10), evidencia que a conectividade Parieto-Frontal é a que regista a maior variação, diminuindo após a sesta. No entanto, a mesma não atinge significância estatística (p > 0,05).

Figura 4.10 – Conectividade dos pares de ROIs antes e depois da sesta.

Efectuando uma comparação das médias das conectividades Parieto-Frontal e Occipito-Frontal antes e após a sesta (teste de Tukey) apenas se observa uma diferença estatisticamente significativa antes da sesta, verificando-se uma diminuição selectiva da conectividade Parieto-Frontal em relação à Occipito-Frontal. A sesta parece assim provocar uma variação inversa à da privação de sono na conectividade Parieto-Frontal. pre pos 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 Conec tividade Sesta parROI FrontOccip OccipFront FrontPar ParFront