UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Flávia Karina Delella
EFEITO DA FINASTERIDA SOBRE A INTERAÇÃO EPITÉLIO-ESTROMA NOS DIFERENTES LOBOS DA PRÓSTATA DE RATO
Tese apresentada ao Instituto de Biologia para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Celular e Estrutural na área de Biologia Celular.
Dedicatória
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Dedicatória
Dedicatória
Dedico a elaboração deste trabalho à
pessoa mais importante da minha vida, minha
Agradecimentos
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"A sabedoria não nos é dada. É preciso descobri-la por nós mesmos, depois de uma viagem que ninguém nos pode poupar ou fazer por nós". Marcel Proust - Escritor francês
Ao meu orientador, Prof. Dr. Sérgio Luis Felisbino, por ter aceito o convite para me orientar no mestrado. Sua dedicação, interesse e valiosa contribuição técnico-científica me possibilitaram um crescimento, não só profissional, como também pessoal. Obrigada por ter acreditado e orientado de forma brilhante esta dissertação.
Ao amigo e “co-orientador” Luis Antonio Justulin Junior, pela paciência no ensino da técnica de zimografia e por toda a ajuda no processo experimental.
Ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga, por ter me apresentado ao fantástico mundo da Biologia Celular, como orientador em meu projeto de Iniciação Científica, e pela disposição de seu laboratório para a execução de algumas técnicas citoquímicas presentes neste trabalho.
Aos membros da pré-banca e da banca examinadora, Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga, Profa. Dra. Renée Laufer Amorim, Profa. Dra. Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, pela avaliação minuciosa, contribuindo de maneira expressiva para o enriquecimento deste trabalho.
Aos professores Dr. Edson Rosa Pimentel, Dra. Karina Mancini, Dra. Evanisi Teresa Palomari, pela participação valiosa, de cada um, na fase de minha qualificação.
Aos professores do curso de pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural da Unicamp. Parabéns pela dedicação ao curso e para com os alunos.
À secretária Líliam Alves Senne Panagio, pela atenção e dedicação dispensadas a todos os alunos da PG, principalmente aqueles que desenvolvem a pesquisa em outras cidades, possibilitando assim que tudo seja entregue de forma correta e dentro dos prazos exigidos.
Ao Departamento de Morfologia da UNESP de Botucatu e a todos os seus funcionários, pela disponibilidade dos laboratórios para a execução deste trabalho.
À técnica laboratorial da Morfologia da Unesp de Botucatu Sueli Cruz Michelin, pela sua amizade, desde o meu início em Botucatu e pela sua importante contribuição neste trabalho.
Ao técnico do Laboratório de Microscopia e Microanálise da Unesp de São José do Rio Preto e amigo desde a Iniciação Científica, Luiz Roberto Falleiros Jr., pela ajuda imensurável na técnica da Reticulina e pela torcida positiva!
Aos amigos do Laboratório de Microscopia e Microanálise da Unesp de São José do Rio Preto, Ana Maria, Fernanda, Cristiane, Lara, Sérgio, Silvana, Daniele, Maê, Wellerson e Renato. Aprendi muito com vocês!
Aos amigos do Departamento de Morfologia da Unesp de Botucatu, Marcos, Francis, Robson, Gisele, Aline, Fernanda Losi, Fernanda Carani, Danilo Aguiar, Kelly, Paulo, Alexandre, Lucas, Wiliam, Rafael, Raquel, Cicilia, Carol, Juliana, Camila, Fernando, Olga, Glaura, Gislaine, Danillo Pinhal, pelos momentos vividos dentro do
departamento e, principalmente, pelos momentos de descontração. Viva a noite!!!
Aos meus grandes amigos da graduação, turma de Ciências Biológicas 2000/2003 da Unesp de São José do Rio Preto: Marco, André, Otávio, Dani, Cris, Ana Flávia, Mariana, Renato, Gustavo, Maricy, Sabrina, Juliana, Telma. Um brinde a todos nós que, cada um em sua área biológica de afinidade, está buscando e alcançando o sucesso merecido.
Agradecimentos Especiais
Agradecimentos Especiais
Agradecimentos Especiais
Agradecimentos Especiais
A Deus. Obrigada Senhor pela vida, pela minha família maravilhosa e pelos meus amigos.
Aos meus pais, Sonia e Rubens, pela educação transmitida com sabedoria, por sempre acreditarem em mim e por respeitarem as minhas decisões profissionais. O mérito dessa conquista também é de vocês!
Aos meus irmãos e melhores amigos, Luciana e Junior. Obrigada pelo incentivo constante e por serem os melhores exemplos a serem seguidos, desde a minha infância!
À minha cunhada Mónica e ao meu cunhado Luiz Claudio, pela força e pelo carinho que vocês dispensam a mim.
Às minhas lindas sobrinhas Barbara e Valentina, pela energia que vocês transmitem quando estamos juntas e pela magia de cada sorriso que me faz ser a “tia coruja” que sou.
À maior paixão da minha vida, minha avó Marica, por seu constante interesse na minha vida profissional e por cumprir tão bem o seu papel de avó, sempre meiga, amável e amiga !
À amiga e companheira de república Kelly Silva Furtado, pela amizade e pelos auxílios no laboratório.
Ao querido Danillo Pinhal, pelo companheirismo e dedicação constantes.
Sumário
Sumário
Sumário
Sumário
Resumo... 1 Abstract... 3 1. Introdução... 5Glândula prostática e interação epitélio-estroma... 5
Andrógenos e fisiologia prostática normal e patológica...... 8
Privação androgênica e finasterida... 12
Metaloproteinases de matriz... 15
2. Justificativa e Objetivos... 21
Artigo 1... 22
Artigo 2... 56
3. Conclusões Gerais... 73
Resumo
Resumo
Resumo
Resumo
As células do câncer prostático são geralmente dependentes, para o seu crescimento e sobrevivência, do estímulo androgênico mediado pelos receptores de andrógeno (RA). Conseqüentemente, a manipulação hormonal, como a castração e/ou o uso de antagonistas de RA, resulta na regressão do câncer. Entretanto, esses tratamentos raramente levam à cura da doença em estágios mais avançados e o câncer, conseqüentemente, torna-se independente de andrógeno. Importantes evidências sustentam a hipótese de que as metaloproteinases de matriz (MMPs) têm papel fundamental nos múltiplos passos da progressão tumoral, incluindo a promoção tumoral, angiogênese, invasão e metástase. As MMPs constituem uma ampla família de endopeptidases dependentes de zinco e cálcio e atuam na degradação da matrix extracelular e da membrana basal. Dois importantes membros da família das MMPs, MMP-2 e MMP-9, pertencentes à subfamília das gelatinases, são conhecidas por degradarem especificamente o colágeno do tipo IV, principal componente das membranas basais. Recentemente, o PCPT (Prostate Cancer Prevention Trial) mostrou que a finasterida, um inibidor da enzima 5α-redutase amplamente usado no tratamento da hiperplasia prostática benigna, diminuiu significativamente a incidência do câncer prostático quando comparado ao grupo que recebeu apenas placebo. Porém, tumores com gradação de Gleason entre 7 e 10 foram significativamente mais comuns no grupo tratado com finasterida que no grupo placebo. Nesse sentido, o papel da finasterida na quimioprevenção do câncer prostático necessita de mais investigação. Assim, este trabalho examinou se as alterações induzidas pela finasterida na morfologia e na fisiologia prostáticas têm impacto na expressão e atividade das MMPs 2 e 9. Ratos machos Wistar (90 dias de idade) foram tratados diariamente com injeções subcutâneas de finasterida (25mg/Kg) durante 3, 7, 30 e 90 dias. Um grupo de animais controle recebeu diariamente injeções subcutâneas do veículo farmacológico (óleo de milho). Os lobos ventrais (PVs), dorsolaterais (PDLs) e anteriores (PAs) foram dissecados, pesados e processados para as análises citoquímicas, imunocitoquímicas,
progressiva no compartimento epitelial e luminal, redução na altura e na proliferação das células epiteliais e aumentou o índice apoptótico e a área estromal dos três lobos prostáticos. A análise das zimografias mostrou que o tratamento com finasterida altera de modo lobo específico o padrão gelatinolítico da próstata do rato, com o aumento da MMP-9 no dia 30 e da forma ativa da MMP-9 nos dias 30 e 90 na PV, aumento da pró-MMP-9 na PDL nos dias 7 e 30 e o aumento da forma intermediária da MMP-2 na PA no dia 7. Porém, a atrofia induzida pela finasterida não promoveu um aumento significativo na atividade das MMPs, em contraste com o que é encontrado na ablação hormonal pela castração. Isso se deve, provavelmente, ao fato das alterações promovidas pela finasterida na próstata constituírem um processo mais lento em comparação com a castração. Assim, os nossos resultados sugerem que a finasterida é eficaz no tratamento das afecções prostáticas sem promover um ambiente favorável para o crescimento de tumores invasivos e metástase.
Abstract
Abstract
Abstract
Abstract
Prostate cancer cells are generally dependent on androgen stimulation mediated by the androgen receptor (AR) for growth and survival. Therefore, hormonal manipulation, such as castration and/or the use of AR antagonists, results in a regression of the cancer. However, these treatments very rarely lead to the ‘‘cure’’ of advanced disease and cancer eventually become androgen-independent. A substantial amount of evidence supports the hypothesis that Matrix Metalloproteinases (MMPs) play a key role in multiple steps of tumor progression, including tumor promotion, angiogenesis, invasion, and metastasis. MMPs constitute a broad family of zinc-binding endopeptidases that play a key role in degradation of the extracellular matrix and basement membrane. Two important members of the MMP family, MMP-2 and MMP-9, belonging to the gelatinase subfamily, are known to specifically cleave type IV collagen, the major component of basement membranes. Recently, The Prostate Cancer Prevention Trial (PCPT) showed that finasteride, a 5 alpha-reductase inhibitor widely employed in the treatment of benign prostatic hyperplasia, significantly decreased the incidence of prostate cancer versus placebo. However, Gleason score 7-10 tumors were significantly more common in the finasteride versus the placebo group. In this sense, the role of finasteride for prostate cancer chemoprevention needs further examination. Thus, this study examined whether the finasteride-induced changes on prostate morphology and phisiology has an impact on MMP-2 and MMP-9 expression and activity. Male Wistar rats (90 days of age) were treated daily with finasteride subcutaneously injected (25mg/Kg) during 3, 7, 30 and 90 days. A control group of animals received daily doses of vehicle (corn oil). The ventral (VPs), dorsolaterals (DLPs) and anterior (APs) lobes had been dissected, weighed and processed for citochemistry, immunocitochemistry, morphometric-stereological, and zymography analyses. Finasteride promoted a progressive involution in the epithelium and lumen compartments, reduced of the epithelial cell heights and proliferation and increased apoptosis and the stromal area in the three prostatic lobes. Gelatin zymography analysis showed that finasteride treatment changed the gelatinolitic profile in the prostatic lobes, with an increase in the pro-MMP-9
DLP at days 7 and 30 and an increase in the intermediate-MMP-2 in PA at day 7. However, finasteride induced-atrophy did not cause a significant increase in MMPs activity, in contrast with is found in androgen ablation by castration. This is probably due to the fact that finasteride changes in prostate are a slow process in comparison with castration. Take together, our results suggest that finasteride is effective in treating prostate diseases without creating a most favorable environment for tumor growth invasion and metastasis.
1.Introdução
1.Introdução
1.Introdução
1.Introdução
Glândula prostática e a interação epitélio-estromaA próstata é um órgão andrógeno-dependente e o seu crescimento, manutenção estrutural e funcional necessitam de níveis constantes de andrógenos circulantes (Isaacs, 1984). No organismo masculino, a próstata permanece rudimentar até a puberdade, fase em que ocorre considerável aumento da produção de andrógenos e desenvolvimento da glândula (Nazian, 1986).
A glândula prostática secreta parte do líquido seminal, um fluido fino e viscoso que contém cálcio, íon citrato, íon fosfato e profibrinolisina. Uma característica importante do fluido prostático, que irá compor o sêmen, é ser levemente alcalino. O pH acima de 7 é fundamental para a motilidade dos espermatozóides e para que a fecundação do óvulo ocorra com sucesso (Guyton & Hall, 2000).
A próstata humana adulta possui uma estrutura bastante compacta, sem lobos distintos, pesa entre 30g e 50g e situa-se abaixo da bexiga urinária, envolvendo a uretra. A organização da próstata humana é dividida em três conjuntos de glândulas túbulo-alveolares: 1) glândulas da zona central ou periuretrais ou da mucosa; 2)glândulas da zona periférica ou glândulas principais; 3) glândulas da zona de transição ou da submucosa (McNeal, 1981).
Os modelos de roedores têm sido muito utilizados nos estudos da fisiologia prostática normal e patológica (Roy-Burman et al., 2004).
Nos ratos sexualmente maduros, a próstata é uma glândula multilobar, organizada ao redor da uretra, na base da bexiga urinária. É composta por um par de lobos ventrais (PV), um par de lobos dorsolaterais (PDL) e um par de lobos anteriores (PA) ou glândula de coagulação, que estão associados às vesículas seminais. Devido às diferenças morfogenéticas lobo-específicas, a morfologia final de cada lobo é distinta. No aspecto histológico, a próstata anterior apresenta inúmeras dobras epiteliais, a próstata dorsolateral exibe algumas dobras no epitélio e a próstata ventral apresenta epitélio contínuo, com o mínimo de dobras (Hayashi et al., 1991; Marker et al., 2003) (Figura 1).
Figura 1: Ilustração dos pares de lobos prostáticos de rato adulto. No detalhe são
mostradas micrografias de luz, coradas por Hematoxilina/Eosina, destacando o aspecto morfológico do epitélio da próstata anterior (AP), próstata dorsolateral (DLP) e próstata ventral (VP). Esquema proposto por Marker e colaboradores (2003).
Em termos de homologia com porções da próstata humana, os lobos anteriores são considerados análogos às glândulas da zona central (raramente acometido por neoplasias), enquanto os lobos dorsolaterais são considerados análogos às glândulas da zona periférica da próstata humana (zona onde surge a maioria dos carcinomas prostáticos). Os lobos ventrais do rato não têm um homólogo humano e a zona de transição humana não possui homologia com nenhuma estrutura na próstata do rato (Roy-Burman et al., 2004).
Os ductos prostáticos desenvolvidos são compostos por uma porção epitelial e uma porção estromal. O epitélio é constituído por três tipos celulares principais: 1) Células
epiteliais luminais secretoras: são as células predominantes e secretam proteínas e fluidos
prostáticos; 2) Células epiteliais basais: encontram-se entre as células epiteliais luminais secretoras e a membrana basal. As células epiteliais basais constituem a principal
Próstata Ventral
Próstata Dorsolateral
Próstata Anterior
neuroendócrinas: aparecem em menor quantidade e secretam uma variedade de fatores de
crescimento que, possivelmente, afetam o desenvolvimento e a manutenção do tecido prostático (Garabedian et al., 1998; Marker et al., 2003). A camada estromal que envolve os ductos da próstata humana e de roedores é composta em grande parte por musculatura lisa, além de fibroblastos, terminações nervosas, células linfóides e endoteliais (Marker et al., 2003).
Existem algumas diferenças e similaridades entre a morfologia prostática humana e de roedores e elas devem ser levadas em consideração, principalmente quando modelos roedores são usados para o estudo de afecções prostáticas humanas. Ambos possuem células epiteliais colunares secretoras, que secretam proteínas prostáticas e fluidos da sua superfície apical em direção ao lúmen (Roy-Burman et al., 2004). Humanos possuem uma camada contínua de células basais entre as células secretoras e a membrana basal, enquanto os roedores possuem menos células basais que constituem uma camada descontínua ao redor da glândula (Marker et al., 2003). As células neuroendócrinas são escassas na próstata humana e nos roedores (Garabedian et al., 1998). As próstatas de ambos animais são formadas por glândulas e ductos, mas existem diferenças na composição estromal. A próstata humana tem um estroma fibromuscular denso, com abundância em musculatura lisa, fibroblastos e colágeno, que circundam os elementos glandulares. O estroma prostático dos roedores é menos fibromuscular e é grandemente preenchido por tecido conjuntivo frouxo (Roy-Burman et al., 2004).
O desenvolvimento de órgãos como a próstata, útero ou glândulas mamárias, que são formados por um epitélio parenquimal, depende de uma interação epitélio-mesenquimal (Cunha et al. 2004). Essas interações são importantes em diversos estágios da morfogênese, na diferenciação celular e na função geral dos epitélios glandulares (Hall, 1978; Hay, 1981; Lin & Bissel, 1993). Na próstata, o estroma é responsável pelo desenvolvimento e manutenção da diferenciação do epitélio (Hall, 1978; Lin & Bissel, 1993; Vilamaior et al., 2000). No tecido embrionário, o mesênquima especifica a diferenciação funcional e a produção de proteínas epiteliais secretoras ou a expressão da especificidade de proteínas do citoesqueleto e de membrana (Cunha et al., 2004).
A função secretora do epitélio prostático é regulada por andrógenos, que participam na diferenciação e na manutenção do estado ativo da glândula (Cunha et al., 1985; Donjacour & Cunha, 1993). Alguns estudos mostram que as células estromais são essenciais, e não apenas um estímulo androgênico, para a diferenciação e organização arquitetural do epitélio da próstata, pois na ausência de células estromais, mas na presença de andrógenos, a organização epitelial e a função glandular não são produzidas (Hayward et al., 1992). Sugimura e colaboradores (1986) e Nemeth e Lee (1996) sugerem que o estroma seja o primeiro alvo da ação dos andrógenos, sendo a reação do epitélio mediada por fatores estromais. Além disso, tanto o seio urogenital quanto os brotos prostáticos não apresentam receptores androgênicos em níveis detectáveis, enquanto o mesênquima do seio urogenital e o estroma da próstata em formação apresentam grandes quantidades desses receptores. Isso sugere que a ação de andrógenos na morfogênese prostática deva ser indireta, atuando via estroma, uma vez que parte significativa do crescimento epitelial (que é dependente do estímulo androgênico) ocorra na fase em que as células epiteliais não apresentam receptores para andrógenos (Donjacour e Cunha, 1988).
Andrógenos e fisiologia prostática normal e patológica
A testosterona (T) é o principal andrógeno atuante na próstata e sua demanda no organismo origina-se da produção testicular (95%) e da produção das glândulas adrenais
(5%) (Aumüller & Seitz, 1990). Esse andrógeno é convertido, pela ação da enzima 5 α-redutase, em um composto mais funcional, a diidrotestosterona (DHT). Embora a T e a DHT produzam respostas biológicas distintas, esses andrógenos interagem com o mesmo receptor androgênico. Porém, a DHT tem de 5-10 vezes mais afinidade pelos receptores de
andrógenos que a T (Sugimura et al., 1986; Prins, 1991).
O controle das funções sexuais masculinas inicia-se com a secreção do hormônio liberador de gonadotrofinas (LHRH) pelo hipotálamo. Esse hormônio estimula a hipófise a secretar três outros hormônios: hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo-estimulante (FSH) e o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). O LH estimula as células de Leydig dos
síntese e a liberação do hormônio deidroepiandrosterona (DHEA), que é convertido em testosterona na próstata e em outros órgãos alvos (Figura 2) (Guyton & Hall, 2000).
Figura 2: Esquema dos eixos: hipotalâmico-hipofisário-testicular (setas azuis) e
hipotalâmico-hipofisário-adrenal (setas verdes). LHRH = hormônio liberador de gonadotrofina; LH = hormônio luteinizante; ACTH = hormônio adrenocorticotrófico; DHEA = hormônio deidroepiandrosterona; 5 α-redutase = enzima 5 α-redutase; DHT = diidrotestosterona.
As funções da DHT e da T na próstata são mediadas por proteínas que funcionam como receptores de andrógenos (AR). Na próstata, a DHT liga-se ao AR para formar o complexo intracelular DHT-AR, que então se liga aos componentes de resposta androgênica no DNA prostático, induzindo a síntese de DNA e a proliferação celular (Hsing et al., 2002).
Ávila e colaboradores (1998) demonstraram, por PCR - expressão diferencial, distintas classes de genes expressos diferentemente em situações de ausência de T e DHT e na ausência de DHT somente, sugerindo outras diferenças de atuação destes hormônios.
A concentração de DHT no plasma é de apenas um décimo da concentração de T, enquanto que a concentração de DHT no tecido prostático é várias vezes maior que a de T, sugerindo que os níveis de DHT no tecido são importantes para o desenvolvimento do órgão e tumorigênese (Hsing et al., 2002).
A enzima 5α-redutase é responsável pela conversão da T em DHT. Existem dois tipos de isoenzimas 5α-redutase responsáveis por essa conversão nos homens e nos animais: a 5α-redutase do tipo 1, expressa na pele e no fígado, e a 5α-redutase do tipo 2, expressa na próstata, especificamente nas células musculares lisas do estroma e nas células epiteliais basais, no fígado e nos folículos pilosos (Azzolina et al., 1997; Steers, 2001). A DHT produzida pelas células estromais e basais na próstata atuam via parácrina nas células epiteliais luminais secretoras (Steers, 2001). Na próstata humana a enzima 5α-redutase de ambos os tipos, está presente nas células epiteliais e estromais, mas a tipo 2 é mais abundante nas células estromais (Russel & Wilson, 1994). Ambas isoenzimas são encontradas na hiperplasia prostática benigna (HPB) e câncer prostático, assim como nas células tumorais prostáticas da linhagem LNCap, revelando que a ação da DHT, junto a outros fatores, contribui para o desenvolvimento dessas lesões (Delos et al., 1998).
Mutações no gene codificante da enzima 5α-redutase do tipo 2 induz o pseudo-hermafroditismo masculino. Os indivíduos acometidos por essa anomalia apresentam altos níveis séricos de T e baixa concentração de DHT no plasma. Além disso, possuem a genitália externa ambígua. Contudo, a diferenciação do ducto de Wolffian ocorre normalmente e por isso esses indivíduos apresentam epidídimos, canais deferentes e vesículas seminais normais. A próstata no organismo adulto é pequena e rudimentar. A análise genética, molecular e bioquímica da deficiência da enzima 5α-redutase do tipo 2 ilustra a importância da DHT na diferenciação sexual e nos processos patológicos e fisiológicos do genital masculino (Imperato McGinley et al., 2002).
estão entre as doenças que mais freqüentemente atingem a próstata. Os hormônios androgênicos, juntamente com outros fatores, exercem papel importante na etiologia dessas lesões (Hayward et al., 1997; Hsing, 2002).
A DHT apresenta papel fundamental no desenvolvimento prostático, mas também tem importância no desenvolvimento da HPB, afecção que se caracteriza por um aumento estromal e hiperplasia epitelial e acomete principalmente os indivíduos idosos (Carson & Rittmaster, 2003). Os mecanismos da HPB são multifatoriais e ainda não estão definitivamente estabelecidos. Porém, estudos em humanos e animais sugerem que o desenvolvimento da HPB vincula-se a um desequilíbrio da homeostase, mantida pela DHT, entre proliferação e morte celular, com os processos proliferativos predominando em relação aos apoptóticos (Griffiths et al., 1997, Carson & Rittmaster, 2003).
A HPB está presente em, aproximadamente, 20% dos homens na faixa etária de 40 anos, com um aumento para 70% na faixa etária dos 60 anos (Isaacs, 1994). Alguns dos principais sintomas da HPB são: hipertrofia da bexiga urinária, infecção no trato urinário e retenção urinária (Untergasser et al., 2005).
Histologicamente, a HPB é caracterizada por uma progressiva hiperplasia das regiões glandulares e estromais ao redor da uretra. No nível celular, ocorrem alterações incluindo a hipertrofia de células basais, aumento da massa estromal (particularmente das células musculares lisas), aumento da deposição de elementos da matriz extracelular, redução do tecido elástico, aumento na infiltração de linfócitos ao redor dos ductos, hipertrofia acinar e maior quantidade de corpos amiláceos no lúmen (Bostwick et al., 1992). O câncer de próstata é a segunda causa de óbitos por câncer em homens, afetando um em cada seis indivíduos, sendo superado apenas pela neoplasia pulmonar. Em 2006, estima-se a ocorrência de 47.280 casos novos para este tipo de câncer no Brasil. O aumento observado nas taxas de incidência pode ser parcialmente justificado pela evolução dos métodos diagnósticos, pela melhoria na qualidade dos sistemas de informação do país e pelo aumento na expectativa de vida do brasileiro (INCA, 2006). Os adenocarcinomas da próstata humana correspondem às lesões malignas resultantes da transformação das células epiteliais de ácinos ou ductos. Nas fases iniciais da carcinogênese prostática, o epitélio
diferenciação e proliferação celular e resistência à morte celular andrógeno dependente (Flórez et al., 2005). O estroma dos tumores prostáticos malignos sofre transformações que derivam da alteração do tecido conjuntivo da glândula, provocada principalmente pela intensa angiogênese e desintegração das fibras colágenas e elásticas, favorecendo o crescimento do carcinoma e o seu potencial invasivo (Morrison et al., 2000; Taboga & Vidal, 2003; Vilamaior et al., 2003).
Privação androgênica e finasterida
Os andrógenos são requisitados pelo organismo para o desenvolvimento e manutenção da próstata normal (Cunha et al. 1987). Células andrógeno-sensíveis necessitam da presença de andrógeno para exercer a sua função e na ausência androgênica essas células podem sofrer o processo de apoptose (Galbraith et al., 1997).
A depleção experimental de andrógenos no indivíduo adulto (por orquiectomia bilateral, por antiandrógenos ou pela união desses eventos) causa a atrofia da próstata. Esse processo de redução em tamanho e/ou perda de função denomina-se involução (Lee, 1981). A notável redução do tamanho e peso do órgão é decorrente de uma série de eventos, inicialmente marcada por uma diminuição do fluxo sangüíneo prostático, uma parada na síntese e uma acelerada liberação da secreção luminal, seguida pela diminuição na altura e no número das células epiteliais por processos de morte celular programada, resultando em lobos reduzidos com células epiteliais baixas e um aumento relativo do estroma glandular (Brandes, 1966). Todas estas alterações são revertidas pela administração de testosterona (Justulin et al., 2006).
Estudos baseados na privação androgênica mostram que a síntese e organização dos componentes da matrix extracelular (MEC), juntamente com as células da musculatura lisa (CML), apresentam respostas adaptativas a diversas situações hormonais, sendo, em grande parte, moduladas por andrógenos (Horsfall et al., 1994). Na próstata ventral de ratos submetidos à castração houve aumento e remodelação dos componentes estromais prostáticos, principalmente colágeno e elastina (Carvalho et al., 1997).
flutamida, bloqueia a ação da T ou DHT por competirem pelo receptor de andrógeno (Naslund et al., 1988; Imperato-McGinley et al., 1992). A administração de inibidores da produção de DHT, como a finasterida, aumenta a concentração de T intraprostática e reduz os níveis de DHT (Prahalada et al., 1994). Já a castração cirúrgica reduz a concentração de T e DHT na próstata a níveis baixíssimos, não detectáveis. Em termos de alterações prostáticas relacionadas à falta de estímulo androgênico, a castração cirúrgica é a que provoca a maior involução glandular, seguida pela flutamida e, por fim, pela finasterida (Rittmaster et al., 1995).
Drogas antiandrogênicas, competidoras dos andrógenos pela ligação aos RA e drogas que bloqueiam enzimas importantes para a potencialização da ação de hormônios na próstata, têm se revelado um importante instrumento para tratamentos de algumas doenças prostáticas (Galbraith & Duchesne, 1997).
O tratamento com finasterida (Figura 3), a primeira droga aprovada para tratar HPB, promove o aumento do fluxo urinário e alivia os sintomas em muitos homens afetados (Marks et al., 1997).
A finasterida é muito seletiva na sua ação: trata-se de um eficiente inibidor competitivo da enzima 5α-redutase do tipo 2, que impede a conversão da T em DHT, mas não afeta a ligação da T ao seu RA, evitando efeitos feminizantes e não influindo na fertilidade masculina (Prahalada et al., 1994; Rittmaster, 1994; Griffiths et al., 1997; Prahalada et al., 1998). Essa droga é capaz de inibir de 80% a 90% a enzima 5α-redutase do tipo 2 e reduzir o tamanho prostático para 30%-40%. Os níveis séricos de T são ligeiramente elevados em homens e animais após a administração de finasterida, enquanto que os níveis de DHT diminuem para 80%-90% em relação aos níveis controle (Span et al., 1999). Os 20% restantes de DHT no plasma ocorrem devido à inabilidade da finasterida em bloquear as duas formas da enzima 5α-redutase (Steers, 2001).
Figura 3: Estrutura molecular do inibidor da enzima 5α-redutase do tipo 2, finasterida,
cuja fórmula empírica é C23H36N2O2. Retirado do site www.drugs.com
Estudos em roedores tratados com finasterida mostram que, além do aumento nos níves de T e da diminuição nos níveis de DHT, a inibição da enzima 5α-redutase na próstata diminui o volume da glândula, a altura das células epiteliais, a área ocupada pelo lúmen, promove morte celular por apoptose, sugerindo a diminuição da atividade secretória, além de promover a reorganização do estroma, principalmente pelo acúmulo de fibrilas colágenas (Rittmaster et al., 1995; Prahalada et al., 1998; Corradi et al., 2004). O tratamento com finasterida da próstata normal ou acometida por afecções promove extensa reorganização do compartimento estromal, além de regressão epitelial, provavelmente causados pela disrupção da interação epitélio-estroma, mantida pelo equilíbrio hormonal prostático (Corradi et al., 2004).
Embora não exista um método definitivo para selecionar os pacientes mais apropriados ao tratamento com a finasterida, uma meta análise de várias triagens de pacientes sugeriu que homens com próstatas maiores do que o normal podem responder melhor ao tratamento do que aqueles com as próstatas menores. Uma explicação para a variação da resposta à finasterida é a variação na composição do tecido prostático encontrada nos diferentes indivíduos. As células epiteliais são mais sensíveis que os outros elementos teciduais aos agentes de privação hormonal, incluindo a finasterida. Sabe-se que a porção epitelial, medida por morfometria, ocupa um volume da glândula prostática que varia de 5 a 23%. Teoricamente, um indivíduo com uma próstata rica em epitélio
responderia mais positivamente à finasterida que um indivíduo com uma próstata pobre em epitélio (Marks, 1997).
Além dos efeitos comprovadamente benéficos no alívio dos sintomas da HPB pela finasterida (Jimenez et al., 2003), alguns autores sugerem que essa droga tenha efeitos no tratamento e prevenção do câncer de próstata (Reddy, 2004), entretanto seus efeitos sobre as glândulas periféricas ainda são motivos de discussão.
Recentemente, Thompson e colaboradores (2003) realizaram uma triagem com 18.882 homens com mais de 55 anos e demonstraram que, entre 4368 homens que receberam finasterida (5mg por dia) durante 7 anos, 803 (18,4%) desenvolveram câncer, contra 1147 (24,4 %) entre 4692 pacientes que receberam placebo. Entretanto, uma maior incidência de tumores com graus de Gleason 7, 8, 9 e 10 foi encontrada nos pacientes que receberam finasterida (37 %) contra 22,2% nos pacientes que receberam placebo. Estes autores concluíram que embora a finasterida previna ou atrase o aparecimento do câncer, ela aumenta o risco de câncer de próstata de alto-grau.
Metaloproteinases de matriz
As metaloproteinases de matriz (MMPs) são endopeptidases dependentes de metais, principalmente zinco e cálcio, capazes de degradar os componentes da matriz extracelular, como colágeno, elastina, laminina, fibronectina e proteoglicanos. Essas enzimas são secretadas na forma de um precursor latente, chamadas de zimógeno ou pró-MMPs. As MMPs latentes necessitam de uma ativação antes de se tornarem capazes de clivar os elementos da matriz extracelular. O processo de ativação ocorre no espaço extracelular por outras enzimas, tais como a plasmina, triptase e a quimase e também por outras metaloproteinases ou por autoclivagem e auto-ativação (Stamenkovik, 2000).
Estudos recentes ajudaram a elucidar os mecanismos que envolvem as células tumorais e o processo da metástase. O evento mais crítico na metástase é o estabelecimento de uma relação entre as células tumorais e os componentes estromais do tecido invadido, para o estabelecimento da colônia tumoral. Uma característica das células tumorais em adaptar-se a diferentes tecidos é a habilidade em remodelar os componentes da matriz
extracelular (MEC) do tecido invadido. Essa característica é atribuída à secreção de uma variedade de proteases, principalmente as MMPs (Stamenkovik, 2000).
De acordo com a organização dos domínios, substrato que degradam e similaridade seqüencial, as MMPs são divididas em 5 grupos principais: 1) as colagenases intersticiais, 2) as gelatinases, 3) as estromelisinas, 4) as metaloproteinases de membrana e 5) as MMPs que não se enquadram em nenhum dos grupos anteriores (Quadro 1).
Quadro 1. Principais MMPs e suas características.
Grupo de
Grupo de
Grupo de
Grupo de
MMPs
MMPs
MMPs
MMPs
Número daMMP
Nome comum
Nome comum
Nome comum
Nome comum
Peso molecular relativo da pro-enzima Peso molecular relativo da enzima ativa MMP-1 Colagenase 1 ou Colagenase
de fibroblasto 57 kDa 42/46 kDa MMP-8 Colagenase 2 ou Colagenase
de neutrófilo 85 kDa 67 kDa
Colagenases Intersticiais
MMP-13 Colagenase 3 ou Colagenase
de osteoblasto 60 kDa 48 kDa
MMP-2 Gelatinase A 72 kDa 66 kDa
Gelatinases ou Gelatinases tipo IV
MMP-9 Gelatinase B 92 kDa 78 kDa
MMP-3 Estromelisina 1 57 kDa 48 kDa
MMP-10 Estromelisina 2 57 kDa 47 kDa
Estromelisinas MMP-11 Estromelisina 3 - - MMP-14 MT1-MMP 65 kDa 63 kDa MMP-15 MT2-MMP 70 kDa - MMP-16 MT3-MMP - - MMP-17 MT4-MMP - - MMP-24 MT5-MMP - - Metaloproteinases de Membrana MMP-25 MT6-MMP ou Leucolisina - -
MMP-7 Matrilisina 28 kDa 19 kDa
MMP-12 Elastase de macrófago 48 kDa 22 kDa
MMP-18 Colagenase 4 - -
MMP-20 Esmaltelisina 54 kDa 25 kDa
MMP-21 - - -
MMP-22 - - -
MMP-23 - - -
MMP-26 Endometase humana / endométrio - - Outras
Metaloproteinases
As MMPs estão envolvidas em processos fisiológicos, tais como a reabsorção da cauda dos girinos nos anfíbios, a ovulação, a embriogênese, a erupção dental e a remodelação e renovação dos componentes da matriz extracelular (Heikinheimo & Salo, 1995; Bagavandoss, 1998; Tanney et al., 1998; Ishizuya-Oka et al., 2000; Quaranta, 2000). O crescimento embriogênico e a morfogênese tecidual são eventos fundamentais que exigem o rompimento de regiões da matrix extracelular e assim permitem a migração de células e a remodelação de microambientes da matrix (Folgueras et al., 2004).
Na angiogênese, por exemplo, o papel das MMPs é um processo amplo e complexo. Muitas MMPs são produzidas por células endoteliais e têm sido descritas como sendo fundamentais na formação de novos vasos sanguíneos em condições fisiológicas e patológicas. Nesse caso, a MMP-2 associa-se com a integrina ανβ3 e essa interação é essencial para a localização da enzima na superfície de vasos recém formados. Outros estudos que analisaram a ligação entre a MMP-2 e o processo de angiogênese, mostraram que ratos Knockout para MMP-2 apresentaram reduzida vascularização quando comparados a ratos normais (Revisado por Folgueras et al., 2004).
A atividade das MMPs pode ser controlada por uma série de inibidores endógenos. Esses inibidores, secretados pelas próprias células, são conhecidos como inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs). Assim, a atividade e a produção dessas enzimas são controladas através de sua ativação ou inibição (Matrisian, 1990). O balanço entre as MMPs e os TIMPs é, em grande parte, responsável pelo controle da degradação dos elementos formadores da matriz extracelular. Um desequilíbrio entre essas duas moléculas é responsável por diversas condições patológicas, como por exemplo, a artrite reumatóide, a progressão do câncer e doenças cardiovasculares agudas e crônicas (Bode et al., 1999).
Quatro TIMPs foram identificados em mamíferos: TIMP-1, TIMP-2 e TIMP-4 são proteínas secretadas, enquanto o TIMP-3 encontra-se ancorado na MEC. A expressão dos TIMPs é regulada durante o desenvolvimento e remodelação tecidual e o mecanismo de inibição parece ocorrer devido à ligação do domínio N-terminal do TIMP ao domínio catalítico da MMP (Visse & Nagase, 2003). Algumas proteínas recém descobertas contêm uma seqüência similar ao domínio N-terminal dos TIMPs e podem funcionar como
RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) localizada na membrana plasmática (Revisado por Folgueras et al., 2004). Essas observações refletem a diversidade de inibidores endógenos de MMPs e as suas possíveis atividades em condições fisiológicas e patológicas, incluindo o câncer.
Condições patológicas associadas com o desbalanço na atividade das MMPs (Figura 4) e alterações nos níveis dos TIMPs devem ser consideradas importantes porque eles afetam diretamente a atividade das MMPs (Visse & Nagase, 2003). O TIMP-2 (21 KDa) é o único membro da família dos TIMPs que, além de inibir MMPs, interage seletivamente com MT1-MMP para facilitar a ativação na superfície celular da pró-MMP-2. Além disso, em muitos tipos celulares, a expressão do TIMP-2 é constitutiva, enquanto a expressão do TIMP-1 e do TIMP-3 pode ser induzida por uma variedade de fatores de crescimento e citocinas. A expressão constitutiva do TIMP-2 é alta em todos os tecidos de camundongos adultos, demonstrando que a expressão dos outros 3 tipos de TIMPs possuem padrões de distribuição tecidual mais seletivos (para revisão Stetler-Stevenson e Seo, 2005).
Figura 4: Paradoxo das MMPs. As MMPs são responsáveis por inúmeras funções
fisiológicas normais, mas em algumas situações a atividade em excesso dessas enzimas resulta em enfermidades através de vários mecanismos. Esquema proposto por Elkington e
colaboradores (2005).
MT1-MMP não consegue degradar o colágeno do tipo IV na membrana basal, mas essa MMP liga-se e ativa a MMP-2, uma colagenase do tipo IV (Seiki, 2003).
A expressão de MMPs pode ser analisada por várias técnicas. Uma técnica muito usada é a zimografia, que identifica as MMPs através da degradação de seus substratos específicos e de seu peso molecular. Essa técnica permite identificar se a MMP está em sua forma ativa ou latente, como pró-MMP (Snoek-van Beurden & Von den Holf, 2005).
Hoekstra e colaboradores (2001) sugerem o uso da expressão de MMPs nos tecidos como uma ferramenta para o diagnóstico de tumores, devido à correlação entre a expressão de MMPs no tumor e o estágio do tumor. Um exemplo é o aumento nos níveis de MMP-2 em pacientes com câncer prostático, quando comparado aos níveis de homens saudáveis.
As MMPs 2 e 9 (gelatinases) são enzimas consideradas importantes por contribuírem no processo invasivo metastático e angiogênico de vários tumores, incluindo o câncer de próstata. Essa contribuição deve-se, principalmente, à degradação do colágeno do tipo IV, principal constituinte das membranas basais. Vijayababu e colaboradores (2006) demonstraram que o quercetin, um flavonóide comumente presente em muitos vegetais, é um potente inibidor das MMPs 2 e 9 em cultura de células de câncer de próstata (PC3). O estudo também demonstrou que as células tratadas com quercetin expressaram um aumento na atividade da pró-enzima MMP-9, quando comparado ao grupo controle, indicando que a conversão da pró-enzima MMP-9 a MMP-9 é inibida pelo flavonóide.
Essas evidências quanto à participação das MMPs no caráter metastático dos tumores demonstram que a inibição da atividade das MMPs, por inibidores naturais ou sintéticos, pode ser um importante caminho para o tratamento do câncer de próstata independente de hormônios (Woessner, 1999; Kugler, 1999; Lokeshwar, 1999; Hidalgo & Eckhardt, 2001).
Para prevenir a degradação tecidual causada por um desequilíbrio no balanço TIMP-MMP, é importante conhecer e estudar como as MMPs e os TIMPs estão envolvidos nos processos patológicos específicos. Portanto, a análise das MMPs em amostras biológicas pode contribuir para a caracterização de certas afecções que envolvem destruição tecidual e possivelmente levar ao desenvolvimento de novas terapias.
A regulação da expressão das MMPs por andrógenos na próstata ainda não está completamente esclarecida. Liao et al. (2003) demonstraram que células LNCaP aumentam a expressão do RNAm e da proteína da MMP-2 quando estimulada por andrógenos, enquanto os níveis da MMP-9 não sofreram alterações. Em contraste, estudos experimentais em animais revelaram que a privação androgênica levou a um aumento na expressão de MMPs (Wilson et al., 1991; Powell et al., 1996; Justulin et al., manuscrito em preparação). Powell et al. (1996) demonstraram que a expressão da MMP-7 aumenta significantemente durante a involução da próstata ventral de rato induzida pela castração. Wilson et al. (1991) descreveram também que durante a involução seguida à castração ocorre um aumentou na atividade gelatinolítica da MMP-2 e MMP-9. Ambos os grupos de autores sugerem que estas MMPs possam estar envolvidas com os processos de atrofia glandular e remodelação tecidual da próstata na ausência de andrógenos. A expressão das duas MMPs também está elevada durante o processo de recuperação glandular com reposição hormonal em ratos castrados (Justulin et al., manuscrito em preparação). Entretanto, estudos sobre os efeitos da finasterida, que aumenta os níveis de T e diminui os de DHT intraprostáticos, sobre a expressão de MMPs na próstata ainda não foram realizados.
2. Justificativa e Objetivos
2. Justificativa e Objetivos
2. Justificativa e Objetivos
2. Justificativa e Objetivos
Considerando que a finasterida tem sido amplamente utilizada no tratamento da hiperplasia prostática benigna e devido às questões de que ela possa ter um efeito preventivo adicional no aparecimento de tumores prostáticos, este trabalho teve por objetivos:
1. Investigar os efeitos da finasterida sobre a estrutura e a composição do epitélio e do estroma dos diferentes lobos da próstata de ratos (lobo ventral, dorsolateral e anterior);
2. Analisar e quantificar os índices de apoptose e de proliferação celular ocorridos após o tratamento;
3. Investigar o efeito da finasterida sobre a expressão e atividade das MMPs -2 e -9.
4. Avaliar a expressão do TIMP-2 nos diferentes lobos prostáticos do rato com especial atenção ao processo espontâneo de prostatite crônica não bacteriana do lobo lateral.
Artigo 1
Artigo 1
Artigo 1
Artigo 1
Efeito da finasterida sobre a próstata de rato: atrofia glandular
e atividade das MMPs-2 e-9
Flávia K. Delella1, Luis A. Justulin Jr.1, Sérgio L. Felisbino2
1Departamento de Biologia Celular, Instituto de Biologia – Universidade Estadual de
Campinas – (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brasil
2Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências – Universidade Estadual Paulista
(UNESP), Botucatu, São Paulo, Brasil
Título resumido: Finasterida e atividade de MMPs na próstata.
Palavras chave: próstata, apoptose, PCNA, zimografia, fibra colágena, diidrotestosterona.
Este trabalho teve auxílio financeiro das seguintes entidades: CAPES, FAPESP (Processo Nº. 04/13261-8) e FUNDUNESP (Processo Nº. 1080/05).
Resumo Introdução.
A finasterida, um inibidor da enzima 5α-redutase do tipo 2, amplamente utilizada no tratamento dos sintomas da hiperplasia prostática benigna, promove redução do peso prostático e pode reduzir o risco de câncer de próstata. Assim, neste estudo, nós investigamos se a finasterida promove um aumento na atividade de MMPs como é observado na castração.
Material e Métodos.
Ratos Wistar machos adultos receberam doses diárias de finasterida (25mg/Kg) e seus lobos prostáticos ventral (PV), dorsolateral (PDL) e anterior (PA) foram removidos e pesados. As próstatas foram processadas para análises citoquímicas, morfométricas, imunocitoquímicas e bioquímica de zimografia e dosagem hormonal.
Resultados.
A finasterida provocou diminuição significativa no peso dos três lobos prostáticos. Essa involução foi seguida de redução na altura das células epiteliais, aumento da área estromal, reorganização das fibras colágenas, aumento do índice apoptótico e queda no nível de proliferação celular. Apesar desta atrofia glandular, a finasterida não promoveu alterações significativas na atividade gelatinolítica da MMP-2 e -9 nos diferentes lobos.
Conclusão.
A finasterida promove uma lenta atrofia glandular, com importantes modificações estruturais e fisiológicas, sem provocar um aumento expressivo da atividade das MMPs -2 e -9. Futuros estudos com outras MMPs podem ajudar a entender melhor os efeitos da finasterida sobre a próstata e seu potencial uso na prevenção e tratamento de tumores.
Introdução
A glândula prostática depende da estimulação androgênica para o seu desenvolvimento e crescimento normais (Yamashita et al., 1996). O principal andrógeno responsável por essas funções é a diidrotestosterona (DHT), resultante da 5α-redução da testosterona, a partir da enzima 5α-redutase do tipo 2, expressa pelas células epiteliais e estromais da próstata (Galbraith et al., 1997; Steers, 2001). A DHT liga-se ao receptor de andrógenos no núcleo das células prostáticas com 5-10 vezes mais afinidade que a testosterona (Rittmaster, 1994).
Entretanto, nas duas principais afecções que acometem a próstata, a hiperplasia prostática benigna (HPB) e o câncer de próstata (CP), ocorre a participação da DHT para a sua evolução (Hsing et al., 2002; Carson & Rittmaster, 2003). A HPB é uma doença progressiva, acomete principalmente os homens com mais de 50 anos de idade e caracteriza-se por um crescimento glandular e estromal prostático contínuo, que provoca a constrição da uretra e diminuição do fluxo urinário (Marks et al., 1997). Estudos em humanos e animais sugerem que o desenvolvimento da HPB vincula-se a um desequilíbrio da homeostase da glândula, mantida pela DHT, entre proliferação e morte celular, com os processos proliferativos predominando em relação aos apoptóticos (Griffiths et al., 1997; Carson & Rittmaster, 2003).
Já para o CP, a etiologia permanece amplamente desconhecida. Idade avançada, raça e histórico familiar são os únicos fatores de risco estabelecidos. Supostos fatores de risco, os quais incluem andrógenos, dieta, atividade física, fatores sexuais, inflamação e obesidade têm sido associados, mas seus papéis na etiologia do CP permanecem não conclusivos. Estima-se que mais de 42% do risco de CP são por influência genética, incluindo genes isolados ou em combinação. Numerosas variantes genéticas de proteínas relacionadas com a biossíntese/metabolismo de andrógenos, metabolismo carcinogênico, reparo de DNA e nas vias da inflamação crônica têm sido exploradas, mas os resultados não são conclusivos. A patogênese do CP provavelmente envolve um intercâmbio entre fatores genéticos e ambientais (para revisão: Hsing & Chokkalingam, 2006).
privação do principal andrógeno prostático, a DHT, revertendo a progressão natural do processo da HPB e aliviando os sintomas em muitos homens afetados (Prahalada et al., 1994; Marks et al., 1997). Os níveis séricos de T são ligeiramente elevados em homens e animais após a administração de finasterida, enquanto que os níveis de DHT diminuem para 80%-90% em relação aos níveis normais (Rittmaster, 1994).
Na próstata, os efeitos da diminuição dos níveis de DHT pela finasterida incluem a redução do peso prostático, redução na altura das células epiteliais e redução na atividade de síntese de secreção (Prahalada et al., 1994; Huynh, 2002). Além disso, a finasterida promove diminuição dos índices de proliferação celular (Lobaccaro et al., 1996) e aumento nos índices de apoptose de células epiteliais prostáticas (Rittmaster et al., 1995; Prahalada et al., 1998; Huynh, 2002). Corradi et al. (2004) demonstraram, no gerbilo, que além da atrofia do compartimento epitelial, a finasterida promove importante remodelação do compartimento estromal, com alteração da morfologia das células musculares lisas e na concentração e disposição das fibrilas colágenas.
Atualmente, além do tratamento da HPB pela finasterida, alguns autores sugerem que a finasterida tenha efeitos no tratamento e prevenção do câncer de próstata (para revisão Reddy 2004). A associação entre tempo de vida de exposição à DHT e o risco de desenvolver câncer sugere que a prevenção química do câncer seja possível com a inibição da enzima 5-alfa redutase (Canby-Hagino et al., 2006). A recente conclusão do ‘Prostate Cancer Prevention Trial’ indica que a prevenção química é possível com a finasterida. Nesta triagem com 18.882 homens com mais de 55 anos, foi demonstrado que, entre 4368 homens que receberam finasterida (5mg por dia), durante 7 anos, 803 (18,4%) desenvolveram câncer, contra 1147 (24,4 %) entre 4692 pacientes que receberam placebo. Entretanto, uma maior incidência de tumores com graus de Gleason 7, 8, 9 e 10 foi encontrada nos pacientes que receberam finasterida (37 %) contra 22,2% nos pacientes que receberam placebo (Thompson et al., 2003). Estes autores concluíram que embora a finasterida previna ou atrase o aparecimento do câncer, ela aumenta o risco de câncer de próstata de alto-grau. Por outro lado, outros autores sugeriram bastante cautela na interpretação dos resultados para afirmar esta maior incidência de tumores de alto-grau nos
histoarquitetura glandular que interferem nos parâmetros da escala de Gleason e também promovem um aumento da área glandular amostrada em biopsias de agulha, aumentando o seu índice de detecção (Andriole et al., 2005; Molinie et al. 2005; Lippman & Lee, 2006).
Outro aspecto importante que deve ser considerado em situações de privação androgênica, é que durante o processo de atrofia glandular induzido por este procedimento, é observada uma significativa remodelação tecidual que inclui também a degradação ou remodelação de componentes da matriz extracelular (MEC) (Powell et al., 1996; Ilio et al. 2000). A remodelação da MEC envolve uma classe especial de enzimas, as metaloproteinases de matriz (MMPs), endopeptidades dependentes de metais, principalmente zinco e cálcio, capazes de degradar os colágenos, elastina, laminina, fibronectina e proteoglicanos (Matrisian, 1990; Heikinheimo & Salo, 1995; Quaranta, 2000). Dentre os 25 tipos de MMPs descritas até o momento, as MMPs -2 e -9 (gelatinases) são consideradas de grande importância por contribuírem no processo invasivo metastático e angiogênico de vários tumores, incluindo o câncer de próstata. Essa contribuição deve-se, principalmente, à degradação do colágeno do tipo IV, principal constituinte das membranas basais (Vijayababu et al., 2006).
No processo de involução seguido à castração cirúrgica, foi demonstrado aumento na expressão e atividade de MMPs durante os primeiros 8 dias (Wilson et al., 1991; Powell et al., 1996). Wilson e colaboradores (1991) observaram aumento na atividade gelatinolítica das MMPs -2 e -9 na próstata ventral de ratos. Powell e colaboradores (1996) demonstraram aumento do RNAm e da proteína da MMP-7 nos primeiros 8 dias após a castração. Ambos os grupos de pesquisadores atribuíram estes aumentos de atividade de MMPs à atrofia glandular e à remodelação tecidual após a castração. Powell e colaboradores (1996) também sugeriram que a privação androgênica pode não ser tão benéfica ao processo de controle da progressão tumoral por selecionar células independentes de andrógeno e por fornecer um ambiente mais rico em MMPs e conseqüentemente mais favorável à invasão tumoral e metástase.
Neste sentido, parece ser extremamente relevante um estudo sobre os efeitos da finasterida sobre a atividades de MMPs na próstata. Neste trabalho, avaliou-se os efeitos da
finasterida sobre os três lobos prostáticos de rato, principalmente sobre o processo de atrofia glandular e sua relação com a expressão e atividade das MMPs -2 e -9.
Material e Métodos 1. Animais
Para a realização do trabalho foram usados 48 ratos Wistar sexualmente adultos (com idade de 3 meses), pesando cerca de 350g, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de Campinas. Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina/Botucatu, em caixas de polietileno, com substrato de maravalha autoclavadas, em condições controladas de luminosidade e temperatura média de 25°C, sendo fornecidas água filtrada e ração “ad libitum”.
Os animais foram pesados e randomizados em 2 grupos experimentais: grupo controle (CT) e grupo tratado com finasterida (FIN).
Os animais tratados receberam doses diárias de finasterida (Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories), na concentração de 25mg/Kg/dia, dissolvida em óleo de milho e administrada em injeções subcutâneas. Os animais CT receberam doses diárias do veículo farmacológico (óleo de milho), também por injeções subcutâneas. Todos os animais (grupo FIN e grupo CT) foram pesados em intervalos regulares durante os tratamentos para adequar as doses diárias ao ganho de peso de cada animal. Para cada situação experimental foram utilizados 6 animais.
Após 3, 7, 30 e 90 dias de tratamento, os animais foram sacrificados por alta dose de pentobarbital, injetado intraperitonealmente.
Os lobos ventrais, dorsolaterais e anteriores foram removidos e imediatamente processados pelas técnicas descritas a seguir. O peso dos animais nos diferentes grupos, assim como a proporção entre o peso dos diferentes lobos e o peso corpóreo total foram determinados em cada situação.
No momento da remoção, a próstata dorsolateral foi avaliada e a presença de prostatite no lobo lateral foi detectada pela aparência esbranquiçada ou amarelada da
secreção. Estes lobos foram separados para as análises morfológicas, enquanto que os lobos sem sinais de prostatite foram separados para as análises bioquímicas.
2. Microscopia de Luz
2.1. Obtenção de cortes em Paraplast e resina
Lobos prostáticos ventrais, dorsolaterais e anteriores foram fixados em formaldeído a 4% dissolvido em tampão fosfato 0,2 M pH 7,2, por 24 horas. Após a fixação, o material foi desidratado em série crescente de etanol, diafanizado em xilol e incluído em Paraplast Plus (Kendall – Tyco Healthcare U.K. LTD). Cortes de 5 µm, produzidos em micrótomo rotativo, foram coletados em lâminas silanizadas e armazenados até o momento de uso. Alguns fragmentos foram desidratados até álcool 95% e embebidos em resina metacrilato (Historesin - Leica). Após a embebição o material foi incluído em moldes plásticos. Cortes de 3µm foram produzidos com navalha de vidro em micrótomo rotativo automático, coletados e armazenados em estufa a 40oC até o momento de uso.
2.2. Análise citoquímica
Cortes em Paraplast foram corados pela Hematoxilina/Eosina, para análise geral da estrutura glandular; pelo Picrossírius, para análise das fibras de colágeno (Junqueira et al., 1979) e pela Reticulina de Gömori (Gömori, 1937, modificado, em Taboga e Vidal, 2003) para análise das fibras reticulares presentes na membrana basal. Os cortes foram observados em luz normal e polarizada e fotomicrografados em microscópio Leica DMLB.
A presença de prostatite na glândula lateral apresentou grandes interferências nas análises morfométricas. Desta forma, neste estudo, decidimos realizar as análises quantitativas apenas na porção dorsal deste lobo. Uma análise qualitativa do lobo lateral foi realizada em separado. Já as análises de peso glandular e zimografia foram realizadas no conjunto dorsolateral.
2.3. Análise Imunocitoquímica para MMP-2 e MMP-9
citrato (0,01M), pH 6.0, durante 5 minutos no microondas. Após o resfriamento das lâminas, foi feito o bloqueio de peroxidases endógenas, obtido com H2O2 (3% em etanol –
5 minutos). Os cortes foram lavados em PBS, incubados com leite em pó desnatado (3% em PBS) durante uma hora em temperatura ambiente. Posteriormente, os cortes foram incubados durante 18 horas a 4ºC com o anticorpo primário (diluição 1:50) em BSA a 1% (Monoclonal MMP-2 Oncogene IM-83; Policlonal MMP-9 Santa Cruz sc 6840). O anticorpo primário foi detectado utilizando-se um anticorpo secundário (diluição 1:100) marcado com peroxidade. A reação foi revelada com diaminobenzidina (DAB) e os cortes foram contra-corados com hematoxilina. Controles negativos foram obtidos omitindo-se a incubação com o anticorpo primário. As imagens foram digitalizadas em analisador de imagens no software Leica Q-win versão 3.1 para Windons TM.
2.4. Análises Morfométricas
Os cortes em resina corados em HE foram utilizados para as análises morfométricas referentes à altura média do epitélio secretor e área do parênquima e do estroma glandulares.
Para o cálculo dos efeitos da finasterida sobre a altura média do epitélio secretor foram efetuadas 10 medidas interativas, utilizando-se a objetiva de 40X, em 10 ductos de cada lobo prostático de 4 animais de cada grupo, totalizando aproximadamente 400 medidas por lobo prostático por grupo experimental.
Para o cálculo dos efeitos da finasterida sobre a área relativa do parênquima e estroma glandulares foram efetuadas 10 medidas interativas de área, utilizando-se a objetiva de 20X, em, pelo menos, 10 campos microscópicos de cada lobo prostático de 4 animais de cada grupo, totalizando aproximadamente 40 medidas por lobo prostático por grupo experimental. Neste caso as áreas foram contornadas manualmente com o auxílio do mouse. A média da área foi determinada pelo software Leica Q-win versão 3.1 para Windons TM.
E, finalmente, para o cálculo dos efeitos da finasterida sobre a área ocupada por fibras colágenas foram efetuadas 10 medidas automáticas (detecção automática da cor
foram feitas com a objetiva de 20X, em, pelo menos, 10 campos microscópicos de cada lobo prostático de 4 animais de cada grupo, totalizando aproximadamente 40 medidas por lobo prostático por grupo experimental.
2.5. Detecção de proliferação celular e determinação do índice de proliferação celular Cortes em Paraplast foram submetidos à reação imunocitoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) (PC10 sc-56 da Santa Cruz Biotechnology). Os cortes foram desparafinizados e o bloqueio de peroxidases endógenas foi obtido com H2O2
(3% em etanol – 5 minutos). Após serem lavados em PBS, incubados com leite em pó desnatado (3% em PBS) durante uma hora em temperatura ambiente, os cortes foram incubados 18 horas a 4ºC com o anticorpo primário com diluição 1:100 em BSA a 1%. O anticorpo primário foi detectado utilizando-se anticorpo secundário marcado com peroxidade. A reação foi revelada com diaminobenzidina (DAB) e os cortes foram contra-corados com hematoxilina. Controles negativos foram obtidos omitindo-se a incubação com o anticorpo primário. O índice de proliferação foi determinado contando-se todos os núcleos marcados pelo anticorpo anti-PCNA de, pelo menos, 10 secções de ductos de cada lobo prostático de 4 animais de cada grupo experimental (aproximadamente 2.000 núcleos). A proporção de células marcadas foi expressa em relação ao número total de células contadas. As células foram contadas manualmente com o auxílio do mouse, no software Leica Q-win versão 3.1 para Windons TM.
2.6. Detecção de fragmentação de DNA associada à apoptose e determinação do índice de apoptose
Cortes em Paraplast foram submetidos à digestão por Proteinase K. Os cortes foram processados segundo as instruções do Kit apoptose (TdT-FragEl – Oncogene), o qual é baseado na reação de TUNEL. A marcação foi revelada pela diaminobenzidina e os cortes foram contra-corados com hematoxilina. Controles negativos foram obtidos omitindo-se a incubação com a enzima TdT. O índice de apoptose foi determinado contando-se todos os núcleos de, pelo menos, 10 ductos de cada lobo prostático de 4 animais de cada grupo e o
células contadas. A proporção de células marcadas foi expressa em relação ao número total de células contadas. As células foram contadas manualmente com o auxílio do mouse, no software Leica Q-win versão 3.1 para Windons TM.
3. Bioquímica 3.1. Zimografia
Lobos ventrais, dorsolaterais e anteriores inteiros (um par de lobos) de 3 ratos diferentes de cada grupo experimental foram utilizados em cada extração. O lobos foram homogeneizados em tampão de extração (30mg de próstata/100µl de solução), contendo Tris-HCl 50mM pH 7,4, NaCl 0,2M, Triton X-100 0,1% e 0,1% de coquetel inibidor de protease (P-8849 - Sigma-CO, Saint Louis, MO, USA) utilizando um homogeneizador do tipo Turrax em três ciclos de 5 segundos cada. O homogeneizado ficou incubando por 2 horas a 4ºC para aumentar a eficiência da extração. Após a incubação, o homogeneizado foi centrifugado a 4.000 RPM por 20 minutos a 4oC. O sobrenadante coletado foi mantido à -80ºC até a hora do uso. A concentração de proteínas em cada amostra foi determinada utilizando-se o método de Bradford (1976).
Alíquotas (25 µg de proteína por linha) do extrato foram submetidas à eletroforese sob condições não redutoras (100V a 4oC) em gel de poliacrilamida a 8% contendo 0,1% de gelatina (colágeno denaturado). Após a eletroforese, os géis foram lavados em Triton X-100 2,5% duas vezes de 15 minutos e, em seguida, em tampão Tris-HCl 50Mm pH 8,4 por duas vezes de 5 minutos. Posteriormente, os géis foram incubados por 12 horas a 37oC no mesmo tampão contendo 5 mM de CaCl2 e 1 µM de ZnCl2. Após a incubação, os géis
foram corados com Comassie Brilliant Blue 0,25%. Áreas de proteólise aparecem como bandas claras contra um fundo azul escuro.
As bandas obtidas na zimografia foram digitalizadas, convertidas em bandas escuras sobre um fundo claro e analisadas por densitometria. A atividade gelatinolítica das bandas da MMP -2 e -9 foi analisada obtendo-se a densidade óptica integrada (IOD) das bandas utilizando-se Image Master VDS versão 3.0 acoplado ao aparelho Image Master VDS
(Pharmacia Biotech). Os valores foram plotados em histograma mostrando a razão entre o IOD dos grupos tratados sobre o valor do IOD do grupo controle.
3.2. Dosagem hormonal
Amostras de sangue dos animais foram coletadas no momento do sacrifício por punção cardíaca. O plasma foi separado por centrifugação e estocado a –80°C. A concentração plasmática de testosterona (T) foi determinada por método eletroquimioluminométrico e a concentração de diidrotestosterona (DHT) foi determinada por método de rádio-imuno-ensaio. Ambas as dosagens foram feitas no Laboratório de Análises Clínicas Tajara de São José do Rio Preto/SP.
4. Análises estatísticas
Os valores de pesos, medidas, índices e dosagens foram expressos pelas médias e desvios padrão. Foi utilizada análise de variância (Anova), com Tukey-Kramer como pós-teste para determinar as diferenças existentes entre os grupos. Foram consideradas significantes diferenças com P ≤ 0.05. As análises estatísticas foram feitas utilizando-se o programa Instat (version 3.0;GraphPad, Inc., San Diego, CA).
Resultados
Dosagem hormonal
Os resultados da dosagem hormonal de T e DHT plasmática estão descritos na Tabela 1. A finasterida provocou redução significativa dos níveis de DHT e aumento significativo de T (P<0,05), principalmente nos dois períodos iniciais de tratamentos analisados.
Morfologia e Morfometria Próstata Ventral
A próstata ventral (PV), em condições fisiológicas normais, é constituída por ductos pouco pregueados, por células colunares altas, com citoplasma basófilo e núcleo basal ovóide. O estroma que envolve os ductos é delgado, constituído por poucas células musculares lisas e fibroblastos interpostos por fibras colágenas finas (Figura 1A, 2A).
A administração de finasterida (FIN) provocou significativa involução na PV. Em todos os tempos de tratamento, a PV sofreu redução estatisticamente significativa, atingindo aos 7 e 90 dias de tratamento ~75 e 50%, respectivamente, do seu peso relativo quando comparado ao grupo controle (p ≤ 0,05) (Tabela 1). A involução da PV nos grupos tratados com FIN foi acompanhada pela visível diminuição tanto do compartimento luminal quanto da altura das células epiteliais e uma evidente compactação da cromatina das células basais (Figuras 1B e 2B).
Além disso, o tratamento com finasterida promoveu redução significativa dos valores da área do parênquima glandular, sendo esta redução mais acentuada significativamente aos 30 e 90 dias de tratamento, e um aumento significativo na área ocupada pelo estroma glandular, em todos os períodos analisados (Tabela 1).
Em todos os períodos analisados observou-se aumento na coloração pelo Picrossirius para as fibras do sistema colágeno da PV, em comparação ao grupo controle. Nos grupos tratados, houve diferença significativa entre os períodos de 3/30, 3/90 e 7/90
