Biologia do Desenvolvimento do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP), bolsa de Mestrado, processo número 2007/06260-3.
“Observa o teu culto a família e cumpre teus deveres para com teu
pai, tua mãe e todos os teus parentes. Educa as crianças e não precisarás
castigar os homens."
Dedico o esforço deste trabalho àqueles a quem tenho como bem mais
precioso deste mundo: minha esposa e meus filhos.
Agradecimentos
Em primeiro lugar, obrigado aos meus pais, por serem meu ponto de apoio fora do meu círculo familiar primário quando as coisas não iam como eu esperava. Sempre me
incentivaram a continuar, mesmo que as pedras parecessem grandes demais. Vocês representam força, persistência e determinação. Vocês são, para mim, o maior exemplo que
tenho na vida e me deram com muito sacrifício, as bases para que eu pudesse chegar a este momento.
À minha esposa e aos meus filhos, meu mais terno agradecimento pelo auxílio, amor e compreensão. Apesar de todos os sacrifícios passados (sempre com carinho e bom humor) vocês me deram alegrias nos momentos mais tensos, me mostrando que havia algo
mais além de cada tropeço – o aprendizado - que sempre me ajudou a enfrentar os desafios. Vocês me deram uma lição de superação que jamais vou esquecer em minha vida.
Aprendi muito com vocês, obrigado por acreditarem em mim sempre, mais do que eu mesmo já tinha acreditado em qualquer momento de minha vida. Amo muito vocês.
À minha orientadora Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares, que por várias vezes soube intuir as dificuldades pelas quais eu passava, e soube como ninguém suportar as
consequências que advinham do meu momento, orientando e dirigindo meu esforço. Muito obrigado pelos inúmeros conselhos recebidos, por toda paciência, confiança e apoio.
Agradeço do fundo do coração por sua generosidade em compartilhar seu conhecimento sem restrições. Tenho muito respeito e admiração pela grande profissional e pela ótima pessoa que você é sem sombra de dúvidas.
Aos meus amigos, Mariana, Tuty, Paulinha e Claudia Kanashiro, pela paciência e compreensão com que sempre me ouviram e pela prontidão e sensatez com que sempre me
aconselharam. Obrigado por terem passado pela minha vida de uma maneira tão bacana, sempre me alegrando.
amizade sempre presentes.
Ao Prof. Dr. Paulo Pinto Joazeiro e todos os seus alunos, por contribuir com meu trabalho com conselhos valiosos e por toda hospitalidade com que me receberam.
À Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini e todos os seus alunos e funcionários do Laboratório de Diversidade Genética do IB/Unicamp pela ajuda indispensável à realização
deste trabalho.
Ao Sílvio, que foi um companheiro impar nos meus dias de laboratório. Aprendi
muito com você, muito obrigado por compartilhar sem reservas seu conhecimento comigo.
À Lucimara, que soube me ouvir e me puxar a orelha quando era necessário, você
terá sempre meu respeito pela sua honestidade, ponderação e paciência em ouvir e opinar.
Mais que isso, a ajuda na bancada que você me ofereceu não se iguala a nenhuma
que eu tenha recebido em todos os dias passados no laboratório. Muito obrigado, do fundo do coração. Desejo-lhe sorte na sua carreira, porque competência e determinação você tem
de sobra.
À Angélica, pelas hibridações com Sox9 e MyoD. Sua ajuda foi providencial para que
eu tivesse estes resultados.
Agradeço à Liliam Panagio, secretária de pós-graduação do programa de Biologia
Celular e Estrutural, pela atenção sempre a mim dispensada, e pela compreensão e disponibilidade constantes para comigo.
Aos funcionários Rita, Juvani e dona Raquel, pela ajuda constante e incansável.
Muito obrigado aos membros de minha banca, por aceitarem avaliar este trabalho.
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural por terem oferecido esta oportunidade de crescimento profissional e
realização deste trabalho.
Lista de abreviações
AER...Apical ectodermal ridge – Prega ectodérmica apical
Alk...Activin receptor-like
AP...eixo ântero posterior
BBR...Boerigher block reagent
BMP...Bone morphogenetic protein
BMPr...Bone morphogenetic protein receptor
c-AMP...ciclyc AMP
c-MET...gene que codifica o receptor MET para o fator HGF
Col...Gene codificador de colágeno
Co-Smad...cooperating SMAD
DEPC...Diethyl pyrocarbonate
Dhand...ou HAND2, heart and neural crest derivatives expressed 2
DMSO...Dimethyl Sulfoxide
Dpr...Gene Dapper
Dsh...Disheveled
DV...eixo dorso-ventral
ECM...extra-cellular matrix, matriz extra celular
En...gene Engrailled
FGF...Fibroblast growth factors
Fz...gene Frizzled
GDF...Growth differentiation factor
Gli3A...proteína ativadora Gli3
Gli3R...proteína repressora Gli3
HH...estádio de desenvolvimento segundo Hamburger & Hamilton
HMG...high mobility group
Hox...homeotic genes
Ihh...Indian hedgehog genes
LEF...lymphoid enhancer-binding factor
Lmx...LIM homeobox transcription factor
LRP...Leucine-responsive regulatory protein
L-Sox, Sox...SRY (sex determining region Y)-box containing gene
Mrf4...myogenic regulatory factor 4
Myf...myogenic factor
Myo D...myoglianin D
N-CAM...neural cell adhesion molecule
PBT...Phophate Buffered Saline - tween
PCP...Planar cell polarity
PD...eixo próximo-distal
PKA...cAMP-dependent protein kinase
PKC...protein kinase C
PTHrP...parathyroid hormone-related protein
r-Fng...radical-Fringe
R- Smad...recptor-regulated mothers against decapentaplegic homolog
Runx...runt related transcription factor
SF/Hgf...Scatter Factor or Hepatocyte Growth Factor
Shh...Sonic hedgehog
SRY...sex determining region of Chr Y
Tbx...T BoX family
Tcf...T cell factor
TGF-β...transforming growth factor beta
VEGF...vascular endothelial growth factor
Wnt...wingless-type gene
ZP...zona de progresso
ZPA...zone of polarizyng activity
Resumo
Os membros de vertebrados representam uma aquisição importante do grupo, os quais possibilitaram a expansão destes pela Biosfera. As bases moleculares do desenvolvimento dos membros estão sob intensa investigação, e o papel de diversos genes e moléculas de sinalização começam a ser bem compreendidos tanto no contexto do estabelecimento de seus eixos quanto da padronização dos tecidos e estruturas.
A família dos genes Dapper (Dpr) tem sido associada a diversos processos da embriogênese de vertebrados, desde a coordenação de movimentos morfogenéticos durante a gastrulação à morfogênese de estruturas tão distintas quanto encéfalo, olhos e coração. No entanto, pouco se sabe sobre o papel destes genes no desenvolvimento dos membros, um sítio marcante de sua expressão durante a embriogênese de vertebrados. Resultados preliminares obtidos com emprego de hibridação in situ em embrião de galinha no nosso laboratório já haviam mostrado a expressão destes genes nos membros, e isto sugeriu que eles pudessem desempenhar um papel importante na ontogênese destas estruturas. Assim, os padrões de expressão dos genes Dpr1 e Dpr2 entre os estádios HH24 e HH34 da ontogênese de aves foram caracterizados por meio de hibridação in situ neste trabalho. Também foram avaliadas a expressão dos marcadores moleculares MyoD para desenvolvimento de músculo esquelético, e Sox9 para desenvolvimento de cartilagem, bem como foi feita coloração dos membros com alcian blue, que evidência matriz extra-celular de tecido cartilaginoso.
Os resultados obtidos revelaram que, no estádio HH24, a expressão de Dpr1 etá presente no mesênquima proximal e medial dos membros anterior e posterior, e ausente da região distal (autópode). Neste estádio, a expressão de Dpr2 é claramente associada à agregação das células mesenquimais em condensações pré-condrogênicas.
formação.
No estádio HH28, o pdrão de expressão de Dpr1 ainda acompanha o contorno dos dígitos, além de serem observados altos níveis de expressão nos precursores dos tarsos e carpos. Por sua vez, Dpr2 é expresso fortemente nos dígitos 1 e 5 dos membros anterior e posterior, bem como nos blastemas dos dígitos posteriores.
Finalmente, no estádio HH34, transcritos Dpr1 e Dpr2 estão concentrados nas regiões das articulações dos membros em desenvolvimento, enquanto Dpr2 é expresso também em tendões e em anexos ectodérmicos em formação. Este estudo suporta fortemente a hipótese de que os genes Dpr1 e Dpr2 desempenham um papel no processo de condrogênese que antecede a formação dos ossos dos membros de aves, bem como no desenvolvimento de outras estruturas, como articulações, tendões e anexos cutâneos.
Abstract
The acquisition of vertebrates limbs represents an important novelty for this group and allowed the expansion of vertebrates through the Biosphere. The molecular basis of limbs development are under intense investigation, and the role of several genes and signaling molecules begin to be understood both within the context of axis determination as well as in the patterning of tissues and structures.
The Dapper (Dpr) gene family has been associated with different processes of vertebrates embryogenesis, from the coordination of morphogenetic movements during gastrulation to morphogenesis of structures as different as brain, eyes and heart. However, nothing is known about the role of these genes in limb development, am important domain of Dpr expression during the embryogenesis of vertebrates. Preliminary results of in situ hybridization in chicken embryo obtained in our laboratory had already shown the expression of these genes in limb, suggesting that they could play an important role in the ontogeny of these structures. Thus, in this study the Dpr1 and Dpr2 expression pattern was characterized by in situ hybridization between stages HH24 and HH34 of chicken development. We also determined the expression of the molecular markers
MyoD (skeletal muscle) and Sox9 (cartilage) and stained limbs at the different stages with
alcian blue, that labels the extracellular matrix of cartilage.
The results revealed that, at stage HH24, Dpr1 expression is observed in the proximal and medial mesenchyme in the fore and hindlimb buds but avoids the autopod. At this stage, the expression of Dpr2 is clearly associated with mesenchymal condensations of pre-chondrogenic cells.
At stage HH25, Dpr1 and Dpr2 transcripts were found for the first time in the autopod, delimiting a region with the shape of the cartilaginous templates of the developing digits.
are found at high levels in the tarsi and carpi precursors. In turn, Dpr2 is expressed strongly in the first and fifth digits of the forelimbs and hindlimbs, as well as in the digit blastemas.
Finally, at stage HH34, Dpr1 and Dpr2 transcripts are concentrated in the developing joints, while Dpr2 is also expressed in ectodermal tendons and developing skin appendages. This study strongly supports the hypothesis that Dpr1 and Dpr2 play a role in the process of chondrogenesis before the formation of the limb bones in birds as well as the development of other structures such as tendons and skin appendages.
Sumário
Agradecimentos...6
Lista de abreviações...9
Resumo...11
Abstract...13
Sumário...15
1. Introdução...17
2. Revisão Bibliográfica...22
2.1. O desenvolvimento dos membros dos vertebrados...
23
2.2. Indução dos botões dos membros...
24
2.2.1. O estabelecimento dos eixos dos membros...
26
2.2.1.1. O eixo próximo-distal...
26
2.2.1.2. O eixo ântero-posterior...
28
2.2.1.3. O eixo dorso-ventral...
29
2.2.2. A coordenação dos três eixos...32
2.3. Miogênese, condrogênese e formação dos dígitos...33
2.3.1. Miogênese...33
2.3.2. Condrogênese...34
2.3.2.1. Origem e caracterização das células condrogênicas...
35
2.3.2.2. Diferenciação e maturação dos condrócitos...
37
2.3.2.3. As famílias Sox e RunX...
39
2.3.2.4. A formação dos dígitos...
41
2.4. As vias de sinalização e a embriogênese...42
2.4.1. Sinalização Wnt...42
2.4.2. Sinalização TGF-β...46
2.4.3. Os genes Dapper modulam as via Wnt e TGF-β...49
3. Objetivos...51
4. Justificativa...53
5.Resultados e discussão...55
6. Conclusões...66
7
.1. Coleta e estadiamento dos embriões...697
.2. Preparação dos embriões para a hibridação in situ...707
.3. Preparação das Sondas...707.3.1. Clones empregados para síntese das sondas...70
7
.3.2. PCR para produção de templates...717.4. Hibridação in situ de embriões inteiros...72
7.5. Hibridação in situ de cortes histológicos...74
7.6. Corte de embriões em vibrátomo...76
7.7. Coloração em Alcian Blue...77
7.8. Produção e análise das imagens...78
Referências Bibliográficas...79
O desenvolvimento ontogenético dos vertebrados começa com uma única célula, o zigoto. Este inicia um processo de sucessivas divisões celulares, e as células resultantes destas divisões progressivamente se diferenciam para formar organismos compostos por bilhões de células e que apresentam uma grande complexidade estrutural. Durante este processo, sinais moleculares são finamente modulados para transmitir às células as informações necessárias para a construção de estruturas tão distintas quanto olhos e membros, conferindo a cada elemento constituinte destes órgãos as dimensões exatas para a sua plena funcionalidade (Mattick 2007).
O surgimento dos membros dos vertebrados foi um evento marcante em sua história evolutiva. Seu desenvolvimento é um processo ontogenético complexo, e que está submetido praticamente às mesmas vias de sinalização e moléculas adaptadoras que regem o desenvolvimento de outras partes do corpo do embrião. Os membros dos vertebrados são estruturas que derivaram evolutivamente das nadadeiras dos peixes e possibilitaram a ocupação da superfície dos continentes e de novos nichos através da adaptação dos membros a novas funções como, por exemplo, o vôo (Gilbert, 2003; Shubin et al., 2006).
A aquisição do autópode (mãos/pés) é considerada uma novidade evolutiva dos tetrápodes (Shubin et al., 2006). Em função de sua complexidade, os membros dos tetrápodes são muito estudados quanto às bases moleculares do desenvolvimento e da padronização corporal (Tickle, 2006; Hill, 2007), bem como no que concerne aos processos de diferenciação dos vários tipos de tecidos que os compõem (Rodriguez-Guzman et al., 2007). Moléculas de sinalização como Wnts, BMPs, FGFs e Shh, bem como fatores transcricionais pertencentes a diferentes famílias, como por exemplo o Sox9, já têm seu papel razoavelmente estabelecido nestes processos (Buckingham et al., 2003; Kawakami et al., 2006).
A elucidação dos mecanismos que atuam durante a ontogenia certamente é um dos maiores desafios da biologia contemporânea. Embora os detalhes moleculares estejam longe
de serem completamente elucidados, dois grandes grupos de proteínas coordenam a maioria dos processos do desenvolvimento. O primeiro grupo inclui moléculas sinalizadoras, cujo papel é transmitir informações sobre o contexto celular, isto é, sobre o ambiente onde a célula está inserida, para as redes de regulação da atividade gênica. Neste grupo estão proteínas secretadas e seus respectivos receptores de membrana, como aqueles representados pelos sistemas Wnt-Frizzled e Hedgehog-patched (Carroll et al., 2005). No segundo grupo estão as proteínas regulatórias capazes de modificar a expressão gênica em vários níveis, tais como as proteínas homeóticas e outras proteínas modificadoras da cromatina, bem como fatores transcricionais e fatores de splicing (Carroll et al., 2005). Este trabalho em conjunto possibilita a construção de estruturas tão complexas quanto os membros de organismos vertebrados.
A conexão entre estes dois grupos de proteínas com freqüência é feita por proteínas adaptadoras, que atuam como coadjuvantes nos processos do desenvolvimento. Proteínas adaptadoras são moléculas destituídas de atividade catalítica própria, mas que promovem um aumento na eficiência de processos biológicos específicos, ao interagir com outras proteínas através de seus diversos domínios estruturais. Desta forma, elas auxiliam no funcionamento das vias de transdução de sinal, facilitando interações moleculares com receptores de membrana, proteínas quinase, pequenas GTPases e outras moléculas sinalizadoras com atividade enzimática conhecida (Ranganathan & Ross 1997; Hall & Lefkowitz 2002).
As proteínas codificadas pela família de genes Dapper (Dpr) são um importante grupo de proteínas adaptadoras, que colaboram em diversos processos do desenvolvimento embrionário, ao interagir com diferentes moléculas, dependendo do contexto celular (Brott & Sokol 2005).
A proteína Dpr1, por exemplo, foi descrito inicialmente como uma proteína moduladora da via de sinalização Wnt, através da interação com a proteína Dishevelled
(Dsh) (Cheyette et al., 2002; Gloy et al., 2002). Nesta via de sinalização, após a interação entre o receptor Frizzled e o ligante Wnt, ocorre a ativação de Dsh, que desestabiliza o complexo de degradação da β-catenina. Esta, por sua vez, acumula-se no citoplasma e é então translocada ao núcleo celular. No núcleo, β-catenina coordena a expressão de genes-alvo específicos (Logan & Nusse, 2004). Dentro deste contexto, Dpr1 age como inibidor desta via ao interagir com Dsh e induzir sua degradação via lisossomos (Zhang et al., 2006).
Dpr2, outra proteína pertencente à família Dpr, modula a sinalização mediada pela proteína Nodal, que pertence à superfamília de fatores parácrinos TGFβ (Zhang et al., 2004).
Sinais Nodais são transduzidos através da interação de homodímeros desta molécula com receptores TGFβ do tipo II, como no restante da família TGFβ (Gilbert, 2006). Ocorre então a interação deste receptor com o receptor TGFβ do tipo I, que é ativado pela atividade quinase serina/treonina do receptor TGFβ do tipo II, fosforilando o domínio intracelular do receptor TGFβ do tipo I. O receptor do tipo I ativado fosforila a molécula citoplasmática R-Smads que se complexa com Co-Smad, outra proteína citoplasmática. O complexo R-Smads/Co-Smad é translocado ao núcleo e ativa, junto com o cofator CoF e fatores de transcrição basais, a transcrição de genes-alvo (Gilbert, 2006). Dpr2 atua na via de sinalização Nodal acelerando a degradação dos receptores TGFβ do tipo II, Alk4 e Alk5, via lisossomos (Zhang et al., 2004).
A despeito do conhecimento disponível, novas pesquisas são necessárias para identificar outras moléculas que participem do desenvolvimento dos membros. Experimentos de hibridação in situ em embriões inteiros realizados anteriormente revelaram a presença de transcritos dos genes Dpr1 e Dpr2 nas fases iniciais de formação dos membros de aves (estádios HH20/HH21) (Alvares et al., 2009). Este trabalho mostrou que a expressão dos genes Dpr é mantida durante à ontogênese dos membros de aves pelo menos até o oitavo dia do desenvolvimento embrionário (estádio HH34).
marcadores moleculares envolvidos na diferenciação dos tecidos cartilaginoso (Sox9) e do músculo esquelético (MyoD), foi possível concluir que a atividade destes genes está associada principalmente a sítios onde ocorre o desenvolvimento do tecido cartilaginoso/ósseo e a sítios onde está havendo formação das articulações dos membros.
Como visto, os genes Dpr codificam proteínas que se caracterizam por modular a atividade das vias de sinalização Wnt e TGFβ, cujos sinais são essenciais para diferentes etapas do desenvolvimento dos membros de vertebrados, incluindo a especificação e diferenciação das cartilagens e do tecido ósseo. Assim, com base no padrão de expressão dos genes Dpr este estudo propõe que estas moléculas atuem no processo de formação dos moldes cartilaginosos que precedem o processo de ossificação endocondral, bem como no processo de formação das articulações, provavelmente mediando sinais Wnt e TGFβ.
2.1 - O desenvolvimento dos membros dos vertebrados
Os vertebrados possuem membros pélvicos e peitorais pareados que, em função do processo evolutivo, são bastante diversificados entre as espécies. Ao menos seis aspectos dos membros podem ser considerados pontos potenciais de diversificação (Carroll et al., 2005):
Posicionamento ao longo do eixo do corpo Aparecimento do botão do membro
Estabelecimento e sinalização dos organizadores Organização da expressão Hox no eixo próximo-distal
Especificação dos principais elementos ósseos e cartilaginosos Regulação da identidade no eixo ântero-posterior
A representação espacial de um membro de um animal tetrápode pode ser feita através de um sistema de coordenadas de três eixos ortogonais, cada eixo representando uma direção na qual ocorre o crescimento e desenvolvimento do membro (Figura 1).
Figura 1 - Representação dos eixos de coordenadas. Os eixos recebem as denominações de próximo-distal (PD) determinando as regiões proximal e distal do membro estendido em relação ao plano do corpo, ântero-posterior (AP) determinando a região anterior e posterior, e o dorso-ventral (DV) determinando as regiões dorsal e ventral (no membro superior, a palma da mão sendo ventral e o dorso da mão sendo dorsal). Figura adaptada de Tickle, 2006.
demonstraram e estabeleceram o conceito das regiões organizadoras nos embriões (Spemann & Mangold, 1924), foram descobertas outras regiões com o papel de organizadores, dentre elas aquelas que dirigem o desenvolvimento dos membros dos vertebrados. Nestas estruturas existem pelo menos dois importantes centros organizadores: a prega ectodérmica apical ou AER (apical ectodermal ridge) e a zona de atividade polarizadora ou ZPA (zone of polarizing activity), as quais estão envolvidas no controle do desenvolvimento dos eixos PD e AP dos membros, respectivamente. Essas regiões são fontes de morfógenos – moléculas sinalizadoras que formam gradientes de concentração coordenando o desenvolvimento do embrião (Carroll et al., 2005; Gilbert, 2003). As principais famílias de moléculas sinalizadoras que dirigem o desenvolvimento do membro em cada eixo compreendem componentes Wnt, TGF-beta, Shh e FGF, pricipalmente (Niswander, 1997; Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005; Tickle, 2006).
A seguir, será feito um sumário das bases moleculares do desenvolvimento dos membros, focalizando a formação de seus botões, o estabelecimento e a organização dos eixos corporais nestas estruturas e a diferenciação dos elementos musculares, cartilaginosos e ósseos.
2.2 Indução dos botões dos membros
Um homeobox é um segmento de DNA de 180 pares de bases de comprimento e que codifica 60 aminoácidos (McGinnis et al., 1984), encontrado em genes envolvidos na regulação do desenvolvimento de animais, fungos e plantas. Os genes que contêm estas sequências são chamados de genes homeobox, e dentre eles encontramos os genes Hox, que estão localizados em agrupamentos ou clusters no genoma dos animais. Trabalhos pioneiros com Drosófila mostraram que a sequência em que estão localizados neste agrupamento obedece à ordem dos segmentos do corpo os quais coordenam o desenvolvimento, sendo responsáveis em boa medida pela criação do padrão do eixo
corporal (Lewis, 1978; Lewis et al., 1980; Struhl, 1981).
A especificação dos locais onde os botões de membro surgirão depende da ação do ácido retinóico e do gradiente de concentração de alguns genes Hox, principalmente Hox-6c e Hox-9d. O ácido retinóico é um modulador da expressão Hox e supõe-se que seu gradiente de concentração ao longo do corpo do embrião ative estes genes determinando, conseqüentemente, os pontos de afloramento dos botões de membros. Isto é feito através da especificação das células do mesoderma lateral que irão compôr as estruturas precursoras do esqueleto, bem como dos somitos que irão fornecer as células precursoras musculares aos membros (Gilbert, 2003; Buckingham et al., 2003; Buckingham, 2006; Carroll et al., 2005). Embora a posição dos botões dos membros possa variar quanto ao nível somítico entre diferentes espécies, ela é constante quanto ao limite de expressão mais anterior de genes Hox (Carroll et al., 2005). Os membros anteriores, por exemplo, surgem sempre no limite anterior de expressão do gene Hox-6c (Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005). A indução do botão inicial do membro é coordenada pela molécula FGF-10 e pelas moléculas Wnt-2b e Wnt-8b. O mesoderma lateral, antes da formação dos botões dos membros, secreta FGF-10 em toda a sua extensão. Imediatamente antes da sua formação, ocorre a sinalização Wnt-2b para membros anteriores e Wnt-8B para os posteriores, que restringirá a produção de FGF-10 somente nos campos dos membros. Os botões começam então a se formar pelo acúmulo das células que migram do mesoderma lateral e dos somitos sob o ectoderma do botão do membro (Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005; Tickle, 2006).
A identidade anterior ou posterior do membro depende da expressão dos genes Tbx4 (anterior) e Tbx5 (posterior). Embora o nocaute destes genes não provoque transformações homeóticas, ensaios de ganho de função determinaram a importância dos mesmos na especificação do tipo de membro (Gilbert, 2003).
2.2.1 – O estabelecimentos dos eixos dos membros
2.2.1.1 - O eixo próximo-distal
A formação da AER é o evento chave no estabelecimento do eixo próximo-distal. A AER é formada por um prega de células ectodérmicas posicionadas na junção dorso-ventral do botão do membro. A indução da AER ocorre logo após a formação do botão do membro, provavelmente pela ação do FGF-10. BMPs parecem estar envolvidos na indução da AER, principalmente BMP4 e BMP7, os quais estabelecem os compartimentos dorsal e ventral no botão através da indução da sinalização Wnt7a no compartimento dorsal e En1 no ventral na ectoderme do botão. Essa sinalização também estabelecerá o eixo DV (Robert, 2007). Quando formada, a AER passa a produzir FGF-8, induzindo a formação da zona de progresso (ZP), que corresponde ao mesênquima abaixo do ectoderma do botão do membro. A ZP promove o crescimento linear do membro, através da sua interação com a AER. Estas duas estruturas sinalizadoras apresentam um processo de feedback positivo, pelo qual a ZP produz Wnt-3a para a manutenção da AER, enquanto a AER produz FGF-8, mantendo a ZP em proliferação (Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005). A remoção da AER faz cessar a formação de elementos esqueléticos e, portanto, o crescimento do membro. Por outro lado, o seu transplante produz estruturas distais supernumerárias (Gilbert, 2003; Robert, 2007).
Ao longo do crescimento próximo-distal, ocorre a especificação dos três segmentos próximo-distais denominados estilópode, zeugópode e autópode, conforme mostra a Figura 2 (Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005). Além de interagir com a ZP, a AER interage com moléculas que especificam os eixos AP e DV, para que cada célula obtenha instruções que dirijam a sua diferenciação (Gilbert, 2003; Tickle, 2006). Experimentos com transplantes da ectoderme da AER em separado do mesênquima da ZP mostraram que a polaridade e identidade dos segmentos do membro no eixo PD reside na ZP e não na AER (Gilbert, 2003).
Figura 2 – Membro superior de ave com os três segmentos próximo-distais representados. Para membros superiores/inferiores, estilópode compreende o úmero/fêmur, o zeugópode compreende o rádio e a ulna/tíbia e fíbula, e o autópode corresponde ao segmento contendo os carpos/tarsos, metacarpos/metatarsos e dígitos, respectivamente. Figura adaptada de Gilbert, 2003.
A identidade de cada segmento parece ser especificada através da expressão de genes Hox situados na porção 5' dos complexos A e D, em campos sobrepostos formando camadas de expressão no botão, havendo colinearidade de expressão espaço-temporal que é quebrada apenas na fase de formação do autópode, como mostra a Figura 3 (Gilbert, 2003). A inversão de expressão dos genes Hox no desenvolvimento do autópode é mediada em camundongos por um único enhancer que não é encontrado no teleósteo zebrafish, no qual não ocorre inversão (Gilbert, 2003; Tickkle, 2006). No actinopterígio basal Polyodon spathula, entretanto, o mesmo padrão invertido de expressão ocorre. Isto sugere que tal inversão de expressão, embora primariamente tenha sido proposta como uma condição derivada que permitiu estabelecer o autópode como novidade evolutiva do grupo dos tetrápoda, parece mais ser uma condição ancestral importante para o desenvolvimento do autópode e que os teleósteos perderam ao longo do tempo (Davis et al., 2007).
Figura 3 – Expressão Hox no desenvolvimento dos membros. Expressão dos genes Hox em colinearidade espaço-temporal, em camadas sobrepostas. No autópode, é mostrada a inversão característica da expressão dos genes Hox com genes mais à 5' sendo expressos mais anteriormente. Fonte: Gilbert, 2003.
2.2.1.2 - O eixo ântero-posterior
O estabelecimento da polaridade no eixo AP inicia-se antes mesmo que o botão do membro esteja visível. Este evento depende da formação da ZPA 0 em uma pequena região do mesoderma na junção posterior entre o botão do membro e a parede do corpo. A ZPA expressará o fator Sonic Hedgehog (Shh), que atuará no estabelecimento da padronização ântero-posterior do botão do membro e regulará a expressão de fatores FGF que mantêm o crescimento linear do membro e mantêm a ZPA, bem como de BMPs, que atuarão na formação e padronização dos dígitos (Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005; Tickle, 2006). A indução da expressão de Shh no botão inicial de membro de galinha depende de fatores FGF (em especial FGF-8), e a especificação e restrição do local de expressão desta molécula depende do gene Hoxb-8 e do gene Dhand, que são expressos imediatamente antes de Shh, e possivelmente da interação de fatores transcricionais Gli com Shh (Niswander, 1997; Carroll et al., 2005; Tickle, 2006). Em camundongos em que a expressão de Dhand é bloqueada, Shh não é expresso no botão do membro e os membros tornam-se severamente malformados e truncados, em função da falta de feedback entre AER e ZPA (Gilbert, 2003,
Carroll et al., 2005).
As proteínas Gli são efetoras da via de sinalização Shh (Carroll et al., 2005; Tickle, 2006), podendo atuar como ativadoras ou repressoras de genes-alvo específicos. A presença do ligante Shh mantém estas moléculas na sua forma não clivada, e nessa forma estas proteínas atuam como ativadores transcricionais. Se não há o ligante Shh, então as proteínas Gli são clivadas, passando para a forma curta que, quando translocada para o núcleo, atua como repressora dos genes-alvo da via Shh. A expressão de Gli3R (repressor) no botão do membro é espacialmente complementar à expressão de Shh, e parece influenciar a padronização dos dígitos (Tickle, 2006). Camundongos nocauteados para Shh têm a expressão de Gli3 em todo o botão do membro, tornam-se polidáctilos com oito dígitos não diferenciados, todos semelhantes ao dígito 1. O papel de Shh então parece ser de diminuir a expressão de Gli3 na região posterior, e a resposta à Shh pode residir na concentração absoluta de Gli3R ou no balanço entre Gli3R e Gli3A para estabelecer a padronização do eixo AP (Tickle, 2006).
O gene Gremlin, que codifica um antagonista para BMP, é reprimido por GLI3R. FGF4, que mantém a expressão de Shh na ZPA, é reprimido por BMPs, e dessa forma a expressão de FGF4 na região posterior da AER é mantida pela limitação da expressão de GLI3R na região anterior do botão do membro, e assim o papel de Shh na manutenção da expressão de FGF4 e, portanto, na manutenção do feedback positivo entre AER e ZPA passa pela expressão do gene Gremlin (Tickle, 2006).
2.2.1.3 - O eixo dorso-ventral
Estudos de mapas do destino utilizando quimeras de galinha – codornas mostraram que antes do crescimento dos membros, um largo domínio (150 μm) de ectoderme, situada abaixo da placa lateral mesodérmica, está programado para formar a AER. Nesta fase, a futura ectoderme dorsal do botão do membro cobre os somitos e a futura ectoderme ventral do botão do membro deriva de células acima da mesoderme lateral somatopleural. A futura
ectoderme do membro é inicialmente dividida em dois grandes domínios, um domínio dorsal cobrindo os somitos e se estendendo até o meio da placa lateral e um domínio ventral se estendendo lateralmente. A AER então alonga suas bordas, recrutando células de um dos dois domínios durante sua morfogênese (Hinchliffe, 1977; Laufer et. al., 1997; Hill, 2007) .
Muitos genes importantes são expressos nessa fronteira antes da diferenciação da AER, incluindo aqueles que expressam o fator de transcrição Engrailed-1 (En-1) e o fator secretado radical fringe (r-Fng), um membro da família de fatores secretados relacionados à
Drosophila fringe (Fng), envolvido na modulação da via Notch (Panin et al., 1997). En-1 é
expresso apenas na ectoderme ventral, enquanto r-Fng é expresso no ectoderme dorsal (Davis & Joyner, 1988; Davis et al., 1991; Gardner & Barald, 1992; Rodriguez-Esteban et al.,1997). Estudos recentes indicam que tanto En-1 quanto r-Fng possuem papel importante no posicionamento da AER (Laufer et al., 1997). A interface entre as células que expressam e as que não expressam r-Fng é exatamente o local de formação da AER. En-1 restringe a expressão de r-Fng à ectoderme dorsal e auxilia na formação da interface dorso ventral. É importante notar que o estímulo inicial para a formação da AER é derivado do mesoderma basal e sua interação com a ectoderme leva à exata posição da sua formação.
Existem pelo menos quatro genes que são diferentemente expressos ao longo do eixo DV (Figura 4). En-1 que é expresso na ectoderme ventral, r-Fng e Wnt-7a expressos na ectoderme dorsal e Lmx-1 expresso na mesoderme dorsal (Dealy et al., 1993; Parr et al., 1993; Riddle et al., 1995; Vogel et al., 1995). O fator Wnt-7a parece ser chave neste processo, ao menos nos elementos distais dos membros, pois o nocaute deste gene provoca a ventralização dos mesmos. Wnt-7a parece induzir a expressão do gene Lmx-1, cujo produto é um fator transcricional essencial para especificar células de destinos dorsais no membro. Se Lmx-1 for expresso no mesênquima ventral do botão, este se desenvolverá como dorsal (Gilbert, 2003). A expressão de Wnt-7a é restrita à ectoderme dorsal porque é reprimida na ectoderme ventral pelo fator de transcrição En1 (Figura 4). A expressão de En1 é induzida na ectoderme ventral pela sinalização dos BMP’s através do receptor do tipo
1, BMPr1a. A ausência de En1 ou BMPr1a leva a um padrão de bi-dorsalização (Niswander, 2003).
Figura 4: Mecanismos da padronização dorso ventral e o posicionamento da AER. (A)
Expressão gênica através do eixo dorso ventral do botão do membro. Wnt-7a e o radical Fringe (r-Fng), são expressos na ectoderme dorsal. Os domínios contendo os fatores Lmx-1 e Engrailed-1 (En-1) determinam a mesoderme dorsal e a ectoderme ventral, respectivamente. (B) Interações genéticas envolvidas na formação da AER e especificação do padrão dorsal. A expressão de En-1 na ectoderme ventral restringe a expressão de r-Fng e Wnt-7a a ectoderme dorsal. Interações entre as células que expressam e as que não expressam r-Fng levam à especificação da AER. Wnt-7a direciona a mesoderme dorsal a adotar características dorsais, assim como Lmx-1. En-1 tem dupla função, no posicionamento da AER e na especificação dorsal. (Figura retirada de Johnson & Tabin, 1997).
O balanço entre BMPs e Noggin no mesoderma lateral somítico ao nível do botão do membro parece induzir o estabelecimento dos compartimentos dorsal e ventral no ectoderma do botão, e capacitam o ectoderma dorsal a se tornar a região organizadora responsável pelo estabelecimento do eixo DV. Esta passa a secretar a molécula Wnt-7a (Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005; Robert, 2007).
2.2.2 – A coordenação dos três eixos
A coordenação dos três eixos envolve interações e processos de feedback entre os mesmos. A base para a manutenção do crescimento do botão do membro está na interação entre a AER e a ZPA. A AER secreta o fator FGF8, o qual induz a expressão de Shh na ZPA. Shh induz a expressão de FGF4 no mesênquima posterior na ZP através da repressão a antagonistas BMP pelo efetor GLI3R, e FGF4 difunde-se e sinaliza para a manutenção da AER, fechando um ciclo de feedback positivo. O fator Wnt-7a parece regular positivamente Shh, mantendo a expressão deste na ZPA (Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005).
2.3 – Miogênese, condrogênese, e formação dos dígitos
2.3.1 – Miogênese
A miogênese no membro inicia-se com a delaminação de células progenitoras musculares do lábio hipaxial do dermomiótomo no somito ao nível do botão do membro. Estas células precursoras musculares migram sob controle do gene Lbx1 (Buckingham et al., 2003; Guzman et al., 2007) e do receptor CXCR4 de quimiocinas (Cxc motif receptor 4) e seu ligante SDF1, para o compartimento do botão do membro nos locais onde se formarão as massas musculares dorsais e ventrais (Guzman et al., 2007). Os progenitores musculares no dermomiótomo expressam Pax-3, o qual regula a transcrição do receptor c-met nestas células (Buckingham et al., 2003; Guzman et al., 2007), e a interação com seu ligante SF/HGF parece ativar a delaminação e a migração (Guzman et al., 2007). A proliferação e diferenciação dos progenitores musculares só acontece quando estes alcançam o botão do membro. Nos botões dos membros, os fatores MyoD e Myf5 estão envolvidos na diferenciação dos progenitores em mioblastos, da mesma forma como ocorre nos somitos (Buckingham et al., 2003). A sinalização mediada por Wnt6 expresso no ectoderma do botão do membro regula a expressão de MyoD e Myf5 (Buckingham et al., 2003; Guzman et al., 2007), e Shh parece também estar envolvido na ativação destes genes. Os mioblastos então proliferam sob influência de FGFR4, tendo como ligante FGF8.
A diferenciação dos mioblastos em fibras musculares no membro acontece sob a ação de MyoD, Mrf4 e miogenina (Buckingham et al., 2003), e o desenvolvimento do músculo completo parece depender de sinalização proveniente dos tendões em formação (Guzman et al., 2007).
2.3.2 – Condrogênese
Grande parte do esqueleto dos vertebrados ocorre por ossificação endocondral, onde um molde de cartilagem é formado e posteriormente mineralizado e substituído por ossos (Olsen et al., 2000) (Figura 5). A condrogênese, o primeiro passo da ossificação endocondral, origina os tecidos esqueléticos, que fornecem estrutura, mobilidade e proteção para os vertebrados em desenvolvimento. O desenvolvimento de cartilagem envolve uma série de eventos como o comprometimento de células mesenquimais para a linhagem condrocítica, a condensação do mesênquima pré-cartilaginoso e a diferenciação dos condroblastos em condrócitos, que levam à formação da cartilagem e da ossificação endocondral.
Figura 5: Representação esquemática do processo de condrogênese durante o desenvolvimento do botão do membro. Células indiferenciadas derivadas da placa do
mesoderma lateral se agregam para formar condensações, as quais são moldes para o futuro padrão do esqueleto. Estas células se diferenciam em condrócitos e passam por uma série de processos de diferenciação incluindo proliferação, hipertrofia e morte celular. Os condrócitos em proliferação eventualmente se arranjam em colunas paralelas e em seguida finalizam o ciclo celular para se converterem em condrócitos hipertróficos. Seguindo o princípio da hipertrofia, os condrócitos direcionam a mineralização e invasão de vascular. Na vascularização os osteoblastos são transportados pelas veias para a cartilagem, produzindo matriz óssea usando a cartilagem restante como molde. Ao mesmo tempo, os condrócitos hipertróficos passam por apoptose e são repostas por matriz óssea. O número de genes envolvidos em cada processo de condrôgenese é mostrado no diagrama. Muitos estudos sugerem que condrócitos hipertróficos passam por trans diferenciação em osteoblastos. Runx (P) indica a Runx2 expressa no pericôndrio. (figura retirada de Shimizu et al., 2007).
os genes Sox e genes Runx que atuam em diversas fases da condrogênese. Os genes Sox são os grandes reguladores da condrogênese, atuando nos processos de condensação, proli-feração e maturação das células precursoras cartilaginosas localizadas no mesênquima dos membros em desenvolvimento. Por sua vez, os genes Runx são particularmente importantes no processo que envolve a maturação dos condrócitos, bem como para a ossificação. Além disso, os condrócitos expressam um grande número de fatores de crescimento dependendo do estágio de desenvolvimento, incluindo FGF’s, BMPs e Ihh/PTHrP. Por exemplo, condro-blastos expressam concentrações mais altas de Sox9, enquanto osteocondro-blastos expressam concentrações maiores de outro fator transcricional conhecido como Runx2. Dessa forma, o balanço entre as concentrações destes dois fatores transcricionais parece determinar se a célula cartilaginosa se tornará uma célula óssea ou não. Este balanço é regulado pela via Wnt canônica, em função do antagonismo entre Sox9 e beta-catenina. A sinalização TGF-β
regula a expressão de Sox9, e a proteína Sox9 interage com vários co-ativadores transcri-cionais (Kawakami et al., 2006). A sinalização proveniente dessas moléculas garante uma alta organização da regulação da condrogênese. FGF’s e BMPs geralmente funcionam anta-gonicamente durante o processo de diferenciação dos condrócitos (Minina et al., 2002, Yoon et al., 2006).
Ihh e PTHrP formam um ciclo de ““feedback”” negativo para controlar a taxa de
pro-gressão dos condrócitos do estado proliferativo para o hipertrófico (Vortkamp et al., 1996; St-Jacques et al., 1999). O estudo da coordenação dos eventos celulares e moleculares en-volvidos na condrogênese é essencial para entender o contexto de formação dos membros.
2.3.2.1 - Origem e caracterização das células e condensação pré-cartilaginosa
O padrão esquelético do membro é relativamente pré-determinado na fase inicial do desenvolvimento pela condensação pré-cartilaginosa (Janners et al., 1970; Summerbell et al., 1972), tendo a forma, tamanho, posição e número de elementos esqueléticos já
estabelecidos. As condensações celulares formam-se como resultado de atividade mitótica alterada, falha das células em mover-se de um local, ou como nos membros, pela agregação em um ponto. Estes fatores causam um aumento na densidade do aglomerado de células mesenquimais, aumento da área celular ou volume, sem um aumento na proliferação celular (Janners et al., 1970), possivelmente mediado pela locomoção que a matriz extracelular (ECM) promove.
A condensação celular está associada a um aumento do contato célula-célula, através da adesão celular e de junções “gap”, interações célula-matriz e fatores secretados que interagem com seus respectivos receptores. Antes da condensação, as células mesenquimais presentes no membro secretam uma ECM rica em hialurona e colágeno tipo I, que limita a interação célula-célula. Quando as condensações começam, um aumento da hialuronidase promove a diminuição da hialurona facilitando a interação célula-célula. Esta interação é o gatilho de uma ou mais vias de transdução que iniciam a diferenciação condrogênica. Duas moléculas importantes envolvidas na adesão celular são a caderina neural (N-caderina) e a molécula de adesão celular neural (N-CAM), responsáveis respectivamente pela iniciação e manutenção da condensação. Estas moléculas são expressas no mesênquima em condensação dos membros, desaparecem na diferenciação cartilaginosa e posteriormente são detectadas apenas no pericôndrio (Dessau et al., 1980).
Além das interações célula-célula e interações célula-matriz, também parece ter um importante papel na condensação das células mesenquimais a fibronectina, componente da ECM. Esta molécula tem sua expressão aumentada em áreas de condensação celular (fonte) e diminuída conforme a diferenciação continua, podendo facilitar o processo em que as células mesenquimais formam condensações celulares. Este processo pode estar relacionado com o domínio amino terminal de ligação da heparina (Frenz et al., 1989).
2.3.2.2 - Diferenciação e maturação dos condrócitos
Durante a ossificação endocondral dos ossos do membro, as células condensadas (condrócitos) passam por um processo de diferenciação que inclui a proliferação, maturação e morte celular. O resultado do processo de diferenciação é o alargamento da cartilagem primordial. Isto é feito inicialmente pela proliferação dos condrócitos junto com a secreção da ECM como os colágenos tipos II (Col2a1), -IX e –XI. Durante este processo os condrócitos proliferativos arredondados tornam-se achatados e formam uma camada colunar paralela ao eixo longitudinal (Figura 5).
Duas moléculas sinalizadoras, Ihh e peptídeo relacionado ao hormônio da paratireóide (PTHrP) foram identificadas como reguladoras do processo de maturação e hipertrofia.
Ihh é um membro da família Hedgehog das proteínas estruturalmente conservadas,
que é conhecida por ser o sinal chave para padronização embrionária em muitos organismos. A super expressão de Ihh na cartilagem das asas de embriões de galinha em desenvolvimento acarreta a formação de elementos cartilaginosos mais largos e menores que perderam os condrócitos hipertróficos (Vortkamp et al., 1996).
O receptor PTHrP é membro da família de proteínas heteroméricas G e agem através das vias cAMP/ proteína quinase A (PKA) e a fosfolipase C/ proteína quinase C (PKC) quando ativadas pelos seus ligantes. Em camundongos mutantes duplo homozigotos para o receptor PTHrP, através de coloração por Alizarina Red S, observou-se mineralização acelerada nos ossos formados por ossificação endocondral, causando entre outros defeitos cabeça convexa, nariz e mandíbulas pequenas, língua protuberante e membros desproporcionalmente pequenos (Abou-Samra et al., 1989).
hipertrofia. Ihh e PTHrP são expressos nos pré-condrócitos e condrócitos hipertróficos e no pericôndrio periarticular, respectivamente. Eles formam um ““feedback”” negativo que tem um importante papel na maturação dos condrócitos (Vortkamp et al., 1996; St-jacques et al., 1999). A sinalização Ihh que alcança o pericôndrio articular promove a expressão de PTHrP, que regula positivamente a proliferação dos condrócitos pela via do receptor PTHrP, resultando num atraso da hipertrofia. Portanto, impedindo a proliferação dos condrócitos, PTHrP exerce efeito negativo em Ihh (Lai & Mitchell, 2005). Além do mais, foi demonstrado que Ihh pode induzir a proliferação dos condrócitos independente de PTHrP (Long et al., 2001).
A hipertrofia dos condrócitos é outro fator que contribui para o alongamento do molde de cartilagem, apenas através do aumento de tamanho sem alterar o número de células. Este processo e caracterizado pela síntese de novo de CoIX, que também contribui para o alongamento da cartilagem inicial. Os condrócitos hipertróficos passam por uma diferenciação terminal em que eles induzem a mineralização de matriz e a atração de vasos sanguíneos através da via VEGF (fator de crescimento vascular endotelial), em seguida passam por morte celular programada (Figura 5). Juntamente com a morte celular programada, osteoblastos são transportados pelos vasos sanguíneos e gradualmente substituem a cartilagem por matriz óssea calcificada (Gerber et al., 1999).
Evidências obtidas de culturas de membros e camundongos transgênicos mostram que FGFs e BMPs atuam antagonicamente no processo de diferenciação dos condrócitos (Minina et al., 2001; Yoon et al., 2006). Geralmente, a via BMP acelera a proliferação, maturação e diferenciação final dos condrócitos, enquanto a via FGF funciona de uma maneira oposta, tanto diretamente como indiretamente. No entanto, a natureza da atividade dessas vias precisa ser melhor entendida (De Lise et al., 2000).
2.3.2.3 – As famílias Sox e Runx
Dentre muitos fatores intracelulares, o fator transcricional Sox9 é a molécula chave na condrogênese inicial. Sox9 pertence à família SRY (região do cromossomo Y que determina o sexo) e contém o domínio HMG (high mobility group) de ligação com o DNA.
Figura 6: representação esquemática da condrogênese no membro de vertebrados em desenvolvimento. A. A condrogênese envolve o comprometimento de células mesênquimais para a
linhagem condrocítica, condensação do mesênquima pré-cartilaginoso e diferenciação dos condroblastos em condrócitos, os quais levarão à formação de cartilagem e osso endocondral. Após a formação de condensações pré-cartilaginosas, as células se diferenciam em condroblastos que começam a elaborar uma matriz cartilaginosa rica em colágeno II (Col2). Col2 contém uma porção que se liga ao fator de transcrição Sox9. Sox9 é expresso em células mesênquimais, pré- condrócitos e condrócitos diferenciados. Para avaliar com eficiência a função do gene no programa condrogênico, um gene repórter de Sox9 é usado contendo quatro sítios de ligação para Sox9 acima do pomotor de colágeno ligado ao gene luciferase. B: Hibridação in situ de Col2a1 nas culturas primárias do mesênquima do membro revela um aumento da expressão de Col2a1 durante o programa condrogênico (12 h – 72 h). Adaptada de Gilbert et al. 2003 e Zhao et al. 1997
Sox9 é expresso nos condroprogenitores mesenquimais, condrócitos diferenciados,
mas não nos condrócitos hipertróficos (Ng et al., 1997; Wright et al., 1995). Hibridações in
situ mostraram que o padrão de expressão de Sox9 precede, porém lembra bastante, o
padrão de expressão de Col2a1 (Figura 6) (Zhao et al., 1997).
requerimento de Sox9 tanto na condensação pré-cartilaginosa como na diferenciação dos condrócitos (Akiyama et al., 2002). Além disso, experimentos de ganho de função de Sox9 em células não condrogênicas levou à expressão de genes condrocíticos (Bell et al., 1997; Healy et al., 1999). O gene Sox9 é, portanto, considerado pré-requisito em ambos os casos e suficiente para a formação de cartilagem. No entanto, o efeito positivo de Sox9 na proliferação dos condrócitos parece ser mediada por outros membros da família Sox. Dentre eles, L-Sox5 (uma forma mais longa de Sox5) e Sox6, são ao menos parcialmente regulados por Sox9 (Lefebvre et al., 1998; Akiyama et al., 2002).
Por sua vez, a família Runx dos fatores de transcrição regula a determinação do destino celular em vários tecidos e tem demonstrado um importante papel na diferenciação dos osteoblastos. Especificamente, o gene Runx2 é necessário para a diferenciação dos osteoblastos, pois estudos mostraram que a deleção deste em camundongos resulta na completa perda de osso (Otto et al., 1997). Runx2 também é expresso nos progenitores mesenquimais pré-condrogênicos (Inada et al., 1999; Otto et al., 1997) e em condrócitos hipertróficos (Inada et al., 1999). Especificamente, a expressão embrionária está presente nas células osteocondroprogenitoras durante as condensações mesenquimais, antes da visível diferenciação dos condrócitos ou diferenciação dos osteoblastos (Ducy et al., 1997; Smith et al., 2005).
Portanto, a inibição da expressão de Runx2 ocorre e assim permanece nos progenitores mesenquimais comprometidos com a linhagem condrocítica (por exemplo, em cartilagens periarticulares), e a expressão deste volta a ocorrer posteriormente nos condrócitos em proliferação comprometidos com a linhagem óssea, sendo responsável pelo fenótipo hipertrófico destes (Goldring et al., 2006). A deleção de Runx2 também exibe redução na proliferação dos condroblastos e um distúrbio na maturação dos condrócitos em alguns elementos esqueléticos (Inada et al., 1999). Assim como outros membros Runx, os genes Runx1 e Runx3 também influenciam na regulação positiva dos condrócitos hipertróficos (Yoshida et al., 2004).
2.3.2.4 – A formação dos dígitos
A formação dos dígitos acontece com a expansão ântero-posterior do mesênquima distal da região posterior do botão do membro onde há expressão de Shh, e há então condensação de elementos precursores de cartilagem que formarão o punho e dígitos, formando uma estrutura chamada placa digital (Shubin et al., 2006). A padronização dos dígitos sofre grande influência de fatores BMPs, principalmente BMP2 e BMP7, e parece ser regulada pela expressão de Shh (Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005; Tickle, 2006).
BMPs parecem influenciar tanto a morte celular no tecido interdigital e interarticular quanto a condensação das células ósseas para formação dos elementos esqueléticos dos dígitos, e têm ação contexto-dependente (Gilbert, 2003; Robert, 2007). Os fatores BMP2, 4 e 7 são expressos durante as fases de definição da forma do membro no mesênquima interdigital e no mesênquima periférico, que não fará parte do membro em sua forma final, enquanto BMP7 é expresso nos dígitos no momento de sua formação propriamente dita (Gilbert, 2003). BMP2 e GDF5 parecem ter papel pivotal na formação das articulações, criando espaços para elementos esqueléticos marcando as células nas futuras regiões interarticulares que sofrerão apoptose (Gilbert, 2003; Robert, 2007), enquanto BMP7 recruta células para formação dos elementos esqueléticos (Gilbert, 2003). Aqui, novamente Gremlin parece ser um dos antagonistas que regulam a expressão dos BMPs (Tickle, 2006). Os genes
Tbx2 e Tbx3 são expressos em faixas nas extremidades anterior e posterior dos botões dos
membros, respectivamente. Sabe-se que a superexpressão de ambos provoca posteriorização dos dígitos dos membros posteriores de galinha, evidenciando sua participação na padronagem do eixo ântero-posterior do membro (Tickle, 2006).
2.4 - As vias de sinalização e a Embriogênese
Os processos de ontogênese no embrião dependem em sua maioria da ação de algumas poucas famílias de fatores parácrinos que dirigem a formação de todos os órgãos e tecidos dos embriões. Estes fatores, ao mesmo tempo que orientam a construção de tecidos e órgãos, também podem ser os causadores de doenças e malformações ao serem expressos em momentos ou locais inadequados (Carrol et al., 2005).
Assim, justifica-se a busca da compreensão do funcionamento e interação entre essas moléculas e seus parceiros, principalmente com relação à ativação e/ou inibição de vias de sinalização molecular. A identificação dessas possíveis interações passa por compreender a função de determinadas moléculas como agentes moduladores da atividade das vias de sinalização, e tem uma grande importância para a pesquisa básica e aplicada. As glicoproteínas da família Wnt e TGF-β são importantes fatores parácrinos que participam de maneira fundamental nos processos de desenvolvimento embrionário, tendo também um papel importante na origem de várias doenças humanas, como o câncer. Estas moléculas exercem muitas funções durante o processo de ontogênese, como determinação da polaridade celular, controle da proliferação e estabelecimento de destinos celulares, coordenação da migração de grupos de células e da apoptose (Niswander, 1997; Wodarz & Nusse, 1998; Tickle, 2006 ).
2.4.1 - Sinalização WNT
Vários experimentos de nocaute gênico em camundongos levaram à inativação da maioria dos genes Wnt. Os fenótipos resultantes revelaram que estes genes atuam na morfogênese de inúmeros tecidos e órgãos. Por exemplo, a inativação do gene Wnt-4 causa ausência de rins (Stark et al., 1994). O nocaute de Wnt-7A leva à ventralização dos membros, infertilidade feminina devido à falha na regressão do canal de Müller e atraso na
maturação morfológica das rosetas glomerulares do cerebelo (Parr & McMahon, 1998; Hall et al., 2000; Tickle, 2006).
Após serem liberadas através de secreção, as moléculas Wnt ligam-se, nas células alvo, aos receptores Frizzled e aos co-receptores LRP5/6 (Miller et al.,1999), ambos na membrana da célula (Figura 7). Esta interação leva, mediante uma cascata de reações secundárias, ao acúmulo da proteína β-catenina no citoplasma da célula alvo. A fosforilação da proteína citoplasmática Dishevelled (Dsh) é o primeiro passo que se segue à interação dos receptores e age neutralizando o complexo de degradação da proteína β-catenina. Assim, a β-catenina acumulada no citoplasma entra no núcleo das célula alvo, onde interage com fatores de transcrição para estimular a expressão de genes específicos (Gordon & Nusse, 2006).
Figura 7 – Esquema simplificado das vias WNT canônica e não-canonica. Moléculas WNT
interagem com receptores de membrana Frizzled (FZ) e, na via canônica, esta interação leva à activação de Disheveled (DSH), a qual inibe o complexo APC/GSK3/Axina de degradação da proteína β-catenin (β-CAT). Na presença do ligante WNT, β-CAT torna-se estável e é translocada ao núcleo da célula, onde se associa aos fatores de transcrição (TCF/LEF). A sinalização WNT não-canônica envolve
A via não canônica parece envolver estimulação da liberação intracelular de cálcio (Ca+2) e ativação da proteína quinase C (PKC) e da proteína quinase II calmodulina-dependente (CAMKII) (Sheldahl et al., 1999). Foi demonstrado que a via não canônica antagoniza a atividade WNT canônica tanto em Xenopus quanto em células de mamíferos (Figura 7) (Ishitani et al., 2003; Mikels & Nusse, 2006; Torres et al., 1996).
Foi constatado que o ligante Wnt-5A, um dos Wnts que ativa a via não canônica de polaridade celular planar (PCP) se expressa no mesênquima do membro de camundongo logo após o início seu desenvolvimento (E9.5) (Parr et al., 1993), no ectoderma ventral e bem próximo da AER (Gavin et al., 1990; Parr et al., 1993; Yamaguchi et al., 1999). O botão do membro cresce distalmente e Wnt5a continua a ser expressa. Contudo, a expressão desta molécula no mesênquima torna-se gradualmente menor, com maior nível de expressão observado no ectoderma distal da AER em desenvolvimento e mesênquima subjacente (Parr et al., 1993; Yamaguchi et al., 1999). Os níveis mais altos de expressão de Wnt5a estão localizadas na zona de progresso, que contém os precursores mitóticos que formam as estruturas dos membros (Parr et al., 1993). Em E11.5, a expressão de Wnt5a de origem ectodérmica diminui e a expressão gradual dos transcritos de Wnt-5a se limita ao mesênquima distal (Gavin et al., 1990; Yamaguchi et al., 1999).
O gradiente próximo-distal de expressão de Wnt-5a no mesênquima do membro e ectoderme sugere que os genes Wnt possam contribuir para a padronização ao longo deste eixo (Gavin et al., 1990). Acredita-se que Wnt5a atua como um regulador positivo de condrogênese, uma vez que os mutantes nulos Wnt-5a exibem membros truncados, com maior gravidade da direção proximal para a distal (Parr et al., 1993; Yamaguchi et al,, 1999).
O tamanho reduzido do esqueleto do membro ao longo do eixo próximo-distal, juntamente com a perda de estruturas distais, sugere que as deficiências de função da AER ou da zona de progresso podem ser responsáveis pelo fenótipo observado (Yamaguchi et al.,
1999).
Expressão ectópica de moléculas Wnt da via canônica, como Wnt1, no desenvolvimento de membros de galinha também resultam em malformações esqueléticas. Estes resultados são consistentes com a possibilidade de que a via Wnt canônica iniba ou atrase a condrogênese (Day et al., 2005; Hill et al., 2005; Rudnicki & Brown, 1997; Tufan et al., 2002).
Outros estudos têm demonstrado que a super-expressão de Wnt1 em culturas de células do mesênquima de membro suprime a diferenciação condrogênica (Rudnicki & Brown, 1997). Wnt7a, que se expressa no ectoderma dorsal do membro (Akita et al., 1996; Parr et al., 1993), tem o mesmo efeito inibitório (Rudnicki & Brown, 1997; Stott et al., 1999).
A interrupção da via canônica por inibição da expressão de β-catenina em cultura de células de mesênquima de membro estimula a formação de cartilagem (Guo et al., 2004). Além disso, a inibição dirigida da sinalização por β-catenina em embriões promove condrogênese, reforçando a idéia de que a via Wnt canônica pode inibir diferenciação condrogênica (Akiyama et al., 2004; Guo et al., 2004).
2.4.2 – Sinalização TGF-β
Os membros da superfamília dos Fatores de Crescimento e Transformação-β (TGF-β), que inclui TGF-βs, Activinas, Nodal e BMPs, são fatores parácrinos que regulam uma série de processos celulares, incluindo proliferação celular, migração, diferenciação e morte celular (Itoh & ten Dijke, 2007). Desregulação de sua sinalização tem implicações em diversos transtornos de desenvolvimento e em várias doenças humanas, incluindo fibrose, câncer e doenças auto-imunes (Massague et al., 2000).
Dentre os fatores TGF-β, as proteínas BMPs exibem importante papel no desenvolvimento dos membros. Vários BMPs são expressos tanto na ectoderme quanto na mesoderme do membro em desenvolvimento. Em particular, BMP4 e BMP7 são expressos no mesoderma lateral durante a formação do botão do membro. O mesoderma lateral é um dos principais contribuintes para o mesênquima dos membros em desenvolvimento, e as células provenientes do mesênquima irão originar os elementos cartilaginosos que comporão o molde do esqueleto do membro (Ahn et al., 2001; Francis et al., 1994). As BMP2, BMP4 e BMP7 também são dinamicamente expressas no ectoderma que envolve o membro, com maiores níveis de expressão na AER em desenvolvimento (Ahn et al., 2001; Francis et al., 1994). Além disto, BMPs atuam na regressão da AER (Pizette & Niswander, 1999), diferenciação óssea e cartilaginosa (Karsenty & Wagner, 2002; Tsumaki & Yoshikawa, 2005) e regressão das membranas interdigitais (Zuzarte-Luis & Hurle, 2005).
A expressão ectópica do antagonista BMP, a proteína Noggin (Zimmerman et al., 1996) leva a uma inibição de condrogênese no mesênquima dos membros em desenvolvimento (Pizette & Niswander, 1999; Weston et al., 2000). Esta inibição da formação de cartilagem pela expressão ectópica de Noggin, parece ser devido à redução da formação de condensações pré-condrogênicas, sugerindo novamente que as BMPs desempenham um papel crítico no início da condensação de células mesenquimais e diferenciação subseqüente da cartilagem (Pizette & Niswander. 1999; Weston et al., 2000).
Assim, as BMPs desempenham papéis diferentes em fases diferentes de desenvolvimento dos membros.
A sinalização TGF-β é iniciada através da reunião de complexos de receptores que ativam os fatores de transcrição Smad (Massague, 1998). Sete receptores do tipo I (activin receptor-like, ou ALKs) e cinco receptores do tipo II foram identificados em vertebrados. Cada membro da superfamília TGF-β pode se ligar a várias combinações de receptores do tipo I e do tipo II (Figura 8).
Quando o ligante acopla-se aos receptores serina/treonina quinase tipos I e II, formam um tetrâmero composto de dois pares de receptores tipo I e II. Os receptores do tipo II então fosforilam os receptores tipo I (Wrana et al., 1992). Esta fosforilação é essencial e suficiente para iniciar a sinalização TGFβ (Shi & Massague, 2003). O receptor quinase tipo I ativado propaga o sinal dentro da célula através do fosforilação da proteína R-Smads (Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 e Smad8) (ten Dijke & Hill, 2004). Smad1, Smad5 e Smad8 são Smads que fazem a transdução dos sinais BMP, e Smad2 e Smad3 são R-Smads que fazem a transdução de sinais TGF-β e activina. As R-R-Smads fosforiladas formam heterodímeros com o parceiro comum Smad (Co-Smad), a Smad4. Estes complexos se acumulam no núcleo, onde regulam a expressão gênica de forma dose-dependente do ligante através de interações com fatores de transcrição, co-ativadores e co-repressores.
