UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Marly Unello Rosinha
DISTRIBUIÇÃO DE NEUROMARCADORES NA
FORMAÇÃO HIPOCAMPAL DE AVES
Orientador: Prof.Dr.Cláudio Antônio Barbosa de Toledo Co-orientadora: Profª. Drª Elenice A. de Moraes Ferrari
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular, na área de Fisiologia.
Data da Defesa:17/12/2003
BANCA EXAMINADORA
MEMBROS
Prof.Dr.Cláudio Antônio Barbosa de Toledo_______________________________
Prof. Dr. Francesco Langone _________________________________________________
Prof. Dr. Luiz Roberto Giorgetti Britto__________________________________________
Profª Drª Raquel Simoni Pires_________________________________________________
RESUMO
O hipocampo em mamíferos e aves exerce papel fundamental no processamento de vários tipos de memórias, existido muitas comparações quanto às características
anatômicas, embriológicas e fisiológicas entre ambos. Ainda assim, a descrição precisa das características celulares, bioquímicas e dos circuitos neurais do hipocampo de aves necessita de maiores investigações. A técnica de imunohistoquímica parece constituir uma ferramenta importante para o estudo anatômico e neuroquímico das regiões cerebrais pela relativa facilidade de aplicação e validade dos resultados. O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão da marcação imunohistoquímica de
formações hipocampais (FH) de pombos (C.livia) quanto à presença de subunidades de receptores de glutamato do tipo AMPA. Os anticorpos usados reconhecem as
subunidades GluR1 e GluR4 e uma seqüência comum existente em ambos GluR2 e GluR3. Paralelamente, o trabalho estudou a localização da enzima colina acetil
transferase (ChAT), do neurotransmissor serotonina (5-HT), do modulador substância P (SP) e do peptídeo intestinal vasoativo (VIP). Assim, cortes de cérebros de pombos, previamente perfundidos, foram tratados imunohistoquimicamente com anticorpos contra as substâncias citadas acima. Os resultados mostraram a expressão da marcação imunorreativa contra os anticorpos para as subunidades GluR1 , GluR2/3 e GluR4. Os dados permitiram identificar e delimitar cinco subpopulações neuronais descritas na literatura: a área das fibras mediais, a área em forma de “V”, a área medial, a área dorsomedial e a área lateral. Os dados obtidos confirmaram a demarcação de uma fronteira SP+ entre a área parahipocampal e o hipocampo, a SPf. As quatro subunidades de receptores do tipo AMPA apresentaram-se presentes em toda a região da formação hipocampal. As subunidades GluR1 e GluR2/3 apresentaram semelhanças quanto ao padrão de distribuição celular e de fibras, que estão presentes em maior quantidades nas regiões dorsomedial e na área em “V”. Proporcionalmente às outras subunidades, a subunidade GluR4 apresentou menor distribuição, ocorrendo marcação de fibras e corpos celulares dispersos por toda a região estudada. Embora os dados não tenham sido suficientes para determinar relações de qualquer natureza entre hipocampos de aves e mamíferos, a descrição da existência de receptores do tipo AMPA nessa área cerebral constitui uma contribuição original para a análise dos processos que envolvem a transmissão glutamatérgica no hipocampo das aves.
ABSTRACT
Hippocampus of mammalian and avian species have fundamental role in memory processes. There also are a lot of provisional anatomical and physiological comparisons between them, but no one were conclusive yet. Descriptions about cellular and biochemical characteristics as well neural circuits are ever-investigated target. Immunochemistry seems to be an important device to address anatomical and neurochemical studies because they provide easy application and valid results. We have studied the distribution of the AMPA-type glutamate subunits receptors, the enzyme choline acetyltransferase (ChAT), the neurotransmitter serotonin (5-HT), substance P (SP) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) using immunohistochemistry techniques. All these substances were present in the hippocampal formation and it was possible to identify five different internal areas: the medial fiber tract area, the “V” shaped area, the medial area, the dorsomedial and the lateral area. A boundary-like region between hipocampal formation and others palidals areas were delineated by neuropil SP+ (SPf). GluR1+ and GluR2/3+ fibers and cells distribution were very similar and more frequent in the dorsomedial area and the “V” shaped area. The GluR4 fibers and cells bodies are less frequent and lessdensely distributed. Although the results were not conclusive enough for us to establish relationships between avian and mammalian hippocampus, the AMPA-type glutamate subunits description were important to increase de knowledgement about avian brain glutamate transmitting.
SUMÁRIO
I-INTRODUÇÃO... 01
1.Considerações anatômicas sobre a estrutura hipocampal de aves... 02
2..Considerações funcionais sobre a estrutura hipocampal... 12
3.Distribuição de receptores do tipo AMPA no hipocampo de mamífero... 18
II- OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA... 20
III- MATERIAL E MÉTODOS 1- Animais... 21
1.1-Perfusão... 21
2-Preparação histológica... 21
2.1-Imunohistoquímica... 22
2.2-Anticorpos... 23
3-Análise das lâminas... 23
3.1-Análise morfocitométrica... 23
IV- RESULTADOS 1.Descrição da distribuição e tipologia celular na formação hipocampal de pombos com a utilização do método GIEMSA... 25
2.Determinação da distribuição de agentes neuroquímicos na formação hipocampal de pombos com a utilização da técnica de imunohistoquímica... 29
2.1-Colina acetil transferase – ChAT... 29
2.2-Serotonina - 5-HT... 32
2.3-Substância P – SP... 32
2.4-Peptídeo intestinal vasoativo – VIP... 35
3.Imunorreatividade às subunidades dos receptores para glutamato do tipo AMPA... 43
3.1-Fibras e neurópilo GluR1+... 43
3.2-Corpos celulares GluR1+... 52
3.3- Fibras e neurópilo GluR2/3+... 52
3.4- Corpos celulares GluR2/3+... 57
3.5- Fibras e neurópilo GluR4+... 60
3.6- Corpos celulares GluR4+... 60
V- DISCUSSÃO... 67
VI- CONSIDERAÇÕES FINAIS... 77
VII- CONCLUSÕES...81
XI- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...82
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1- Esquema e fotomicrografia da região do telencéfalo dorsal de pombos corado por
Giemsa(a)...5
Figura 2- Esquema e fotomicrografia da região do telencéfalo dorsal de pombos corado por Giemsa(b)...8
Figura 3- Esquema e fotomicrografia da região do telencéfalo dorsal de pombos corado por Giemsa(c)...27
Figura 4- Estruturas ChAt+...31
Figura 5- Estruturas 5-HT+...34
Figura 6- Estruturas SP+...37
Figura 7- Estruturas VIP+(a)...40
Figura 8- Estruturas VIP+(b)...42
Figura 9- Estruturas GluR1+(a)...45
Figura 10- Estruturas GluR1+(b)...47
Figura 11- Estruturas GluR1+(c)...49
Figura 12- Estruturas GluR2/3+(a)...51
Figura 13 Estruturas GluR2/3+(b)...54
Figura 14 Estruturas GluR2/3+(c)...56
Figura 15 Estruturas GluR2/3+(d)...59
Figura 16 Estruturas GluR4+(a)...62
Figura 17 Estruturas GluR4+(b)...64
Figura 18 Estruturas GluR4+(c)...66
DISTRIBUIÇÃO DE NEUROMARCADORES NA
FORMAÇÃO HIPOCAMPAL DE AVES
I – INTRODUÇÃO
Muito se tem estudado sobre a anatomia e fisiologia do hipocampo de mamíferos estabelecendo-se, com relativa segurança, os limites de suas áreas e suas respectivas funções (SUPÈR et al., 1998; LEVIN et al., 2002; LIU et al., 2003; ROSENZWEIG et al., 2003; HORI et al., 2003).
O hipocampo dos mamíferos tem sido material de estudo desde 1883 quando, retomando as anotações de Arantius, Cajal publicou uma descrição detalhada dessa parte do encéfalo (apud WALTER,2002). Essa área está localizada bilateralmente na região do lobo temporal, fazendo parte de um conjunto de estruturas implicadas no processamento da emoção, denominado sistema límbico. É formado por uma dobra interna da parte ínfero medial do próprio lobo temporal, que se curva em direção ao ventrículo lateral. O hipocampo propriamente dito interconecta-se às várias estruturas funcionalmente próximas, podendo admitir-se uma formação hipocampal. As regiões consideradas como integrantes da formação hipocampal de mamíferos são: o hipocampo propriamente dito (Corno de Amon), o giro denteado, o subículo e o córtex entorrinal (BUTLER & HODOS, 1996).
A relação anatômica mais direta entre a região hipocampal de mamíferos e aves apóia-se no fato de que nos dois grupos de animais, a região considerada hipocampo margeia o ventrículo lateral. Porém a topografia apenas não garante relações de proximidade funcional e aumenta a necessidade de maiores estudos a respeito do assunto.
Os estudos originais de Ariëns-Kappers et al. (apud SZÈKELY, 1999), referem que a parte medial do telencéfalo dorsal de aves corresponde ao hipocampo dos mamíferos (ANEXO I). Assim, critérios embriológicos, topográficos e funcionais serviram para a análise comparativa entre os cérebros desses vertebrados e são baseadas nessas premissas as constantes revisões sobre essa estrutura. Utilizando-se as técnicas de imunohistoquímica, a hibridização in situ e a clonagem foi possível estabelecer a tipologia celular, as aferências e eferências da região do hipocampo, além da presença de neuromediadores (INOUE et al.,
1. Considerações anatômicas sobre a estrutura hipocampal de aves
Em uma das primeiras tentativas de identificação das regiões que formam o hipocampo de aves por Craig, Durward e Ariëns-Kapers em 1930 (apud CAMPBELL & HODOS, 1970), a porção dorsomedial do cérebro anterior foi inicialmente dividida em dois grandes segmentos: a área parahipocampal (APH), localizada dorsolateralmente e o hipocampo (HP) propriamente dito, localizado ventromedialmente, como se pode ver na Figura 1A.
O argumento utilizado para essa divisão foi de que essas regiões possuíam dois padrões distintos de camadas celulares que as diferenciava. Utilizando a técnica de coloração pelo método de Nissl, os autores descreveram o hipocampo como a continuação do manto cortical com alguma laminação, ou seja com a sutil presença de camadas celulares.
A coloração por cresil violeta também mostrou um padrão celular constituído por duas lâminas ou camadas celulares densas, porém, não favoreceu a delimitação de uma fronteira ou limite definitivo da região do hipocampo com a área parahipocampal (CAMPBELL & HODOS, 1970).
Embora, segundo SZÉKELY (1999), seja mais fácil determinar a divisão entre o HP e o APH em pássaros canoros por conta de uma estratificação em camadas celulares mais delineada do que aquela encontrada em pombos, ainda hoje não se tem bem definido o limite lateral do hipocampo de nenhum dos tipos de aves estudadas.
Devido à escassez de dados conclusivos a respeito da organização celular e da bioquímica do hipocampo de aves, um zoneamento imunohistoquímico da região hipocampal desses animais é uma ferramenta que contribui para elucidar pontos controversos que dificultam o estabelecimento de relações entre esse grupo e os mamíferos (STRIEDTER, 2002).
O conhecimento das características celulares (morfológicas e bioquímicas) dos neurônios presentes no hipocampo de aves foi ampliado por estudos que utilizaram
marcadores para determinar a imunorreatividade a algumas substâncias presentes em hipocampos de mamíferos, tais como KREBS et al.(1991b) e ERICHSEN et al.(1991).
FIGURA 1
Esquema e fotomicrografia da região do telencéfalo dorsal de pombos corado por Giemsa. Observa-se na figura superior (A) as 2 divisões propostas por Craig, Duward e Äriens- Kapers (1930) e utilizadas no Atlas Estereotáxico do cérebro de pombos por Karten e Hodos (1967). A figura inferior (B) ilustra aproximadamente as divisões anatômicas admitidas por Krebs et al.(1991) e Erichsen et al.(1991) para as propostas de regionalização da formação hipocampal de pombos. Abreviaturas: D=dorsal, DMs=dorsomedial superior, Dm=dorsomedial, Vm=ventromedial, HP=hipocampo e APH=área parahipocampal. Barra de escala: 250µm.
Para descrever com maior precisão a organização da formação hipocampal KREBS et
al.(1991b) dividiram a formação hipocampal em quatro regiões: dorsal (D), dorsomedial
superior (DMs), dorsomedial inferior (DMi) e ventromedial (VM) como foi esquematizado na Fig.1B.
A seguir, os pesquisadores realizaram marcações de imunorreatividade para os anticorpos contra a colina acetil transferase, a descarboxilase do ácido glutâmico, a tirosina hidroxilase e a serotonina.
A colina acetil transferase (ChAT) é a enzima responsável pela síntese do neuromediador acetil-colina a partir de acetil-CoA e o aminoácido colina, no terminal axônico. A descarboxilase do ácido glutâmico (GAD) é a enzima catalisadora da síntese de ácido gama- amino butírico (GABA) a partir do aminoácido glutamato e a enzima tirosina-hidroxilase (TH) é a primeira enzima no circuito bioquímico de síntese de norepinefrina e epinefrina. Essas substâncias mais a serotonina (5-HT) são encontradas abundantemente na formação hipocampal de mamíferos (AMARAL et al.,1985; ALONSO
et al.1995), podendo servir como ponto de partida para o estudo da região considerada nas
aves.
Com os resultados obtidos nesse estudo, KREBS et al.(1991b) identificaram as seguintes áreas que aparecem delimitadas na Figura2A:
1. área das fibras do trato medial – essa área é composta por fibras aferentes que atravessam a junção septohipocampal e se estendem dorsalmente em direção à região ventromedial da formação hipocampal. Essas fibras parecem pertencer ao trato septomesencefálico (BAGNOLI & BURKHALTER, 1983) e são intensamente ChAT+, 5-HT+ e TH+.
2. área dorsomedial : a área que ocupa toda a parte dorsomedial. É imunorreativa aos anticorpos utilizados contra ChAT, 5-HT, TH e GAD e parece ser rica em terminais e neurópilo marcado.
3. área em forma de “V”: Utilizando-se a técnica de Nissl, duas faixas de células são evidenciadas nas porções laterais da região ventromedial. Apresenta grandes células piramidais descritas em trabalhos anteriores (PISANA,1986).
FIGURA 2
Esquema e fotomicrografia do corte de encéfalos de pombo corado por Giemsa mostrando as áreas da formação hipocampal determinadas imunohistoquimicamente. A figura superior (A) indica aproximadamente as subdivisões preliminares propostas por Erichsen et
al.(1991). A figura inferior (B) mostra esquematicamente as subdivisões sugeridas pelos
mesmos autores (KREBS et al.,1991) após a utilização de novos marcadores imunohistoquímicos.O pontilhado claro indica a região limite da formação hipocampal denominada de fronteira (SPf). Abreviaturas: FTM =fibras do trato medial. Barra de escala: 250µm..
4. área entre o “V”: que inclui a parte inferior da região dorsomedial e a região ventromedial. Possui corpos celulares imunorreativos à GAD e poucos terminais imunorreativos às demais substâncias (TH, 5-HT e ChAT).
A tentativa de estabelecer uma fronteira entre essas diversas subdivisões, consideradas áreas hipocampais e a área parahipocampal, resultou no estabelecimento de uma quinta área, lateral à região dorsal, identificada por células em forma de cesto, TH+, denominada de área dorsolateral.
As considerações iniciais sobre a formação hipocampal puderam se ampliadas para seis subdivisões, por estudos subseqüentes de ERICHSSEN et al (1991), utilizando-se outros marcadores imunohistoquímicos como anticorpos contra a substância P (SP), a somatostatina (SS), a leucina-encefalina (LENK), o neuropeptídeo Y (NPY), o peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e a colecistoquinina (CCK). Muitos desses neuropeptídios coexistem com neurotransmissores no mesmo terminal axônico. Os resultados imunohistoquímicos obtidos permitiram o redimensionamento da área dorsomedial e da área entre o “V” resultando em seis áreas, cujos contornos aproximados podem ser observados na Fig.2B.
1. área das fibras do trato medial : região ocupada por fibras que originalmente mostraram-se ChAT+, 5-HT + e TH+ e posteriormente apresentaram marcações positivas para SP, CCK, LENK, VIP, NPY e SS.
2. área em forma de “V”: região descrita no primeiro trabalho como fortemente corada pela técnica de Nissl e que não havia apresentado imunorreatividade aos anticorpos utilizados. As grandes células piramidais presentes na área parecem ser circundadas por células em forma de cesto, imunorreativas ao CCK.
3. área medial: região que se estende pelo interior da área em forma de “V”. É uma área que contém corpos celulares e fibras imunorreativas aos anticorpos contra NPY e SS;
4. área das células VIP: região que apresenta células VIP+ localizadas ventralmente à região dorsomedial.
5. área dorsomedial: região que ocupa as áreas mais dorsomediais da formação hipocampal. Apresenta neurópilo que mostra além de imunorreatividade aos anticorpos contra ChAT, 5-HT e TH (descritos no primeiro trabalho), imunorreatividade aos anticorpos contra SP e VIP.
6. área lateral: região lateral à área medial com neurópilo imunorreativo para anticorpos contra CCK, 5-HT, VIP e NPY.
Além disso, foi observada pelos mesmos autores, uma sétima área delimitada pela fronteira de imunorreatividade contra o anticorpo para substância P, a fronteira-SP (SPf) lateral ao hipocampo, que poderia significar o limite entre este e a área parahipocampal. Essa região apresenta neurônios de corpo celular alongado, imunopositivos ao anticorpo contra substância P e também apresenta estruturas TH+ parecendo terminais ao redor de células em forma de cesto. Aparentemente, essas células em forma de cesto podem ser neurônios contendo substância P e encefalinas (KREBS et al., 1991).
A partir desses dados, foi sugerido por ERICHSSEN et al. (1991), que os limites do hipocampo em pombos [que não foram definidos no Atlas Estereotáxico de Karten & Hodos (1967)] poderiam ser obtidos por técnicas imunohistoquímicas. O limite lateral do hipocampo poderia ser definido pela forte imunorreatividade para o anticorpo contra substância P. Isto porque rostralmente à área em forma de V da região hipocampal aparece densa marcação do neurópilo SP+ que penetra em direção ao pálido lateral, destacando-o do restante. Essa configuração de fronteira parece limitar a região fora do hipocampo, embora exista ainda muita controvérsia a respeito (TOMBOL et al., 2000).
Em resumo, agora se define a região hipocampal em pombos como aquela área entre o ventrículo e a parede medial, lateralmente separado da área parahipocampal por uma região imunorreativa aos anticorpos contra SP, LENK e TH. Esta conclusão coincide com aquela estabelecida por trabalhos de marcação por Nissl (KREBS et al.,1989) em estudos com outras espécies de aves, principalmente Zebra finch, que também discutiram os limites entre o hipocampo e demais regiões vizinhas (MONTAGNESE et al., 1996 e SZÈKELI, 1999).
As imunomarcações obtidas corroboram as propostas comparativas entre hipocampos de aves e mamíferos (KREBS et al.,1991). Assim, segundo PISANA (1986) a área em
forma de “V” no pombo poderia relacionar-se ao corno de Amon no mamífero porque em ambas as regiões aparecem grandes células piramidais circundadas por outras em forma de cesto que são imunorreativas ao CCK. Essas células, nas aves, estendem campos dendríticos perpendiculares aos braços do “V”.
De acordo com ANDERSON & REINER (1990), a área medial do hipocampo da ave poderia relacionar-se à região hilar no mamífero, porque em ambos os grupos de animais aparece imunorreatividade aos anticorpos contra SS e NPY, além das células serem morfologicamente semelhantes. KÖLER (1983) sugeriu que a área das células VIP no pombo poderia ser relacionada às camadas granulares do giro denteado no mamífero porque neste local também ocorre esse tipo de marcação imunopositiva ao anticorpo contra VIP. Seus resultados também permitiram associar a área das fibras do trato medial ao
alveus (camada alvear) e fímbria- fórnix do mamífero, pois em ambas as regiões aparecem
aferentes colinérgicos, serotonérgicos e catecolaminérgicos que formam os tratos ali existentes. Esses aferentes tomam parte dos circuitos neuroquímicos que modulam as respostas hipocampais em roedores. METZGER (2002) descreveu a presença marcante de fibras serotonérgicas na porção imediatamente inferior à região dorsomedial, o que repete o padrão encontrado em mamíferos onde as camadas granulares relacionam-se intimamente ao giro denteado.
2. Considerações funcionais sobre a estrutura hipocampal
A área hipocampal está envolvida no processamento da memória tanto em aves quanto em mamíferos, permitindo a associação funcional entre vários sistemas neurais. Segundo alguns pesquisadores (VENERO et al.,1997 e COLOMBO et al, 2000a) é possível correlacionar a estrutura hipocampal nesses dois grupos de animais com aprendizagem e o processamento dos vários tipos de memória tais como a contextual e a espacial.
A aprendizagem espacial e o comportamento de estocagem de comida, atividades também relacionadas ao hipocampo, têm sido muito bem estudadas em pombos e outros pássaros (CLAYTON, 1998 e COLOMBO et al., 2000b).
As descrições das conexões telencefálicas que relacionam o hipocampo ao lobo paraolfatório, ao pálido lateral e à parte límbica do estriado permitiram supor a participação dessas regiões na formação da memória utilizando-se técnicas de esquiva inibitória, principalmente em pintainhos (CSILLAG, 1999).
Além da esquiva-inibitória, o condicionamento Pavloviano clássico tem sido freqüentemente usado como modelo para testes de memória e aprendizagem pela simplicidade de análise que oferece e pelas possibilidades de associações a contextos específicos (LANDEIRA-FERNANDEZ, 1996; SCHAFE, 2001; CHAN et al., 2001). Além disso, trabalhos com aprendizagem e memória de associações som-choque demonstraram que manipulações através de lesões no hipocampo podem modificar a resposta condicionada dos pombos, como demonstrado através de vários trabalhos de colaboradores de nosso laboratório (REIS et al.,1999; BRITO, 2002; AMARAL- TOMA & FERRARI, 2003).
Segundo IZQUIERDO & MEDINA (1995), o aprendizado pode decorrer de mudanças na força e duração das sinapses. Desta forma é possível que aquelas sinapses que envolvam o fenômeno da potenciação a longo prazo (LTP- long term potentiation) estejam relacionadas ao armazenamento de informações no hipocampo. Assim, a importância dessa área cerebral nas últimas duas décadas foi relacionada diretamente aos estudos da LTP (KANDELL et al., 2000). Essa sinapse de longa duração parece existir somente em áreas onde os aminoácidos glutamato e glicina estão presentes (KANDEL et al.,2000).
Os estudos a respeito do papel do glutamato em sinapses no sistema nervoso central iniciaram-se há 50 anos com os trabalhos investigando a ação convulsivante do L-glutamato e refutando a corrente acadêmica que atribuía exclusivamente aos circuitos adrenérgicos esta ação (DANUSZ, 1995).
Os primeiros indícios de que o L-glutamato poderia ser classificado como neurotransmissor surgiram com os trabalhos de CURTIS et al., (apud WATKINS, 2000) em 1959. Nesta época foram evidenciadas a ação despolarizadora e a ação geradora de potenciais excitatórios pós-sinápticos em neurônios glutamatérgicos da medula espinhal de gatos (WATKINS, 1981). Porém, somente em 1980 passou-se a aceitar, com certas reservas, que o glutamato pudesse ser um neurotransmissor importante como a acetilcolina ou a noradrenalina (WALKINS, 1994).
Em NICHOLLS (1994) o glutamato é classificado como um neurotransmissor Tipo I, porque é um aminoácido simples, como glicina e GABA (acido gama-amino butírico), perfazendo, em conjunto, cerca de 90% das sinapses existentes em todo o SNC de mamíferos. As sinapses glutamatérgicas ocorrem em várias áreas encefálicas de vertebrados e são excitatórias em alguns casos e moduladoras em outros, dependendo da natureza do receptor celular (DINGLEDINE, 1999). As sinapses glutamatérgicas freqüentemente são encontradas em protuberâncias especializadas dos dendritos chamadas espinas, cuja exata função não está bem esclarecida (MENNERICK & ZORUMSKI,2001).
A biossíntese do L- glutamato se faz a partir de um produto secundário do metabolismo intermediário do ciclo do ácido carboxílico, o alfa-cetoglutarato. Ocorre por meio de transaminação e redução do 2-oxoglutarato pela enzima glutamato desidrogenase e desaminação da glutamina formada pela enzima glutaminase (TOHYAMA et al.,1998).
As células gliais (astrócitos) também colaboram com o fornecimento de glutamato recaptando-o da fenda sináptica por meio de transportadores acoplados ao sódio e convertendo-o em glutamina através da ação da enzima glutamina sintetase. Essa glutamina formada se difunde novamente para o interior do neurônio e é hidrolisada por uma glutaminase específica, gerando glutamato (NICHOLLS, 1994).
Percebeu-se que a ação do glutamato era receptor-mediada pelo fato de existirem agonistas que reproduziam suas ações em determinados circuitos neurais. Um dos primeiros agonistas sintetizados em 1960 foi o NMDA (N-metil-D-aspartato), seguido das
descobertas dos ácidos naturais kaínico e quisquálico. Mais tarde, um análogo do ácido ibotênico, o AMPA (alfa-amino-hidroxi-5-metilixazole-4-acido propiônico) foi sintetizado e funcionou simulando a ação do L-glutamato em sinapses (WATKINS, 2000).
Um segundo passo foi a confirmação da existência de dois tipos diferentes de receptores para glutamato através da utilização de antagonistas seletivos. Os trabalhos de DAVIES et al. (apud WATKINS, 1981), no final de 1970 foram realizados com antagonistas radiomarcados e confirmaram a existência de duas grandes categorias de receptores diferentes para glutamato. Uma das categorias, os receptores NMDA, era bloqueada por APV (ácido 2-amino-5-fosfonovalerico) e a outra categoria, não- NMDA, era bloqueada por CNQX (6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona). Logo a seguir MAYER
et al. (1984) utilizando métodos eletrofisiológicos, confirmaram os dados dos trabalhos
farmacológicos, reforçando o conceito de que existem receptores para o glutamato do tipo não NMDA e NMDA.
Um outro tipo de receptor para glutamato, o do tipo kainato, foi descrito mais tardiamente, no final de 1980, por dificuldades de isolamento e da diferenciação dessa categoria de receptores daqueles do tipo AMPA. Como alguns agonistas de receptores do tipo AMPA ligam-se aos receptores de kainato também, alguns resultados diferenciais foram mascarados retardando a descrição de receptores para glutamato do tipo kainato (O’BRIEN et al., 2000). Isso perdurou até que estudos de eletrofisiologia foram utilizados para diminuir as dúvidas a respeito da diferenciação entre as duas categorias de receptores, que produzem diferentes freqüências de pulsos de potenciais de ação (FRERKING et al. 2002).
Mas a ferramenta decisiva para a diferenciação das categorias de receptores para glutamato descrita em HOLLMANN et al.(1989), foi a clonagem das subunidades formadoras do receptor do tipo AMPA, que permitiu a descoberta de quatro subunidades diferentes GluR1, GluR2, GluR3 e GluR4. A clonagem subseqüente de receptores do tipo NMDA e kainato levou ao avanço da compreensão de como funcionam as vias glutamatérgicas no sistema nervoso central de mamíferos.
De acordo com as propriedades intrínsecas os receptores para glutamato podem ser ionotrópicos (iGlu) ou metabotrópicos (mGlu). Os ionotrópicos como os do tipo AMPA , kainato e NMDA funcionam como canais iônicos permeáveis aos íons sódio, potássio e por
vezes ao cálcio (HUME et al. 1991). Os do tipo metabotrópicos determinam cascatas de segundos mensageiros, dividindo-se em oito subtipos (MADDEN, 2002).
O receptor para glutamato do tipo AMPA é tetramérico, ou seja, formado por quatro subunidades. A formação do complexo tetramérico pode incluir qualquer combinação das quatro subunidades GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, randomicamente presentes, cujo arranjo determina a funcionalidade do receptor (ROSENMUND, 1998). Cada subunidade possui um resíduo N-terminal extracelular e um resíduo C-terminal intracelular, sendo que o sítio de ligação ao glutamato é formado pelas regiões S1 e S2 do N-terminal. A porção C-terminal possui sítios de ligação para diversas proteínas como NSF (fator de estimulação neural) e PICK1(proteína interagente a kinase C) (ANEXO II).
As subunidades são formadas por quatro alfa-hélices protéicas sendo que o poro do canal é estruturado por uma volta simples que conecta o primeiro e segundo segmento transmembrânico. O sítio de ligação com o glutamato parece consistir de dois lobos formados pela porção extracelular do N-terminal e a porção inicial da última hélice. Esses dados estruturais foram obtidos através de estudos de mutagênese em receptores e de estudos com receptores para aminoácidos em bactérias. Essa imagem foi recentemente confirmada por análise radiográfica dos cristais formados pelas regiões extracelulares da subunidade GluR2 (O’BRIEN, 2001).
Cada subunidade dessa família de receptores existe em duas formas: flip e flop, sendo que a variação decorre da sutil diferença na seqüência de aminoácidos da porção da terceira volta citoplasmática. As formas são geradas por processamento (“splicing”) alternativo no momento da transcrição primária. As variantes flip aparecem primeiro no desenvolvimento do neurônio e são mais ativas que as formas flop, o que talvez possa explicar a menor atividade do receptor em neurônios mais maduros (NICHOLLS, 1994).
A subunidade GluR2 sofre uma edição pós-transcripcional de seu mRNA que remove um grupo amina de uma determinada base de adenina alterando o codon de glutamina (Q) para arginina (R) no segundo domínio transmembrana. A presença da arginina induz a formação de uma carga positiva no interior do poro, tornando a estrutura repelente ao cálcio. Dessa forma, receptores do tipo AMPA contendo essa subunidade constituem receptores impermeáveis ao cálcio. Isso permite regulações particulares no fluxo iônico ao
longo do canal (SOMMER et al. 1991; VISSAVAJJHALA et al.1996; HALBACH & DERMIETZEL , 2001).
Trabalhos de FABIAN- FINE et al.(2000) registram a presença de receptores do tipo AMPA em terminais pré-sinápticos em mamíferos, porém, tanto os receptores do tipo AMPA quanto os receptores do tipo NMDA são encontrados na membrana pós-sináptica de neurônios hipocampais em mamíferos. Essas diferenças podem ser devidas ao fato de que a LTP não ocorre da mesma maneira em todos os circuitos hipocampais de mamíferos (SCHAFFE et al., 2001).
O hipocampo dos mamíferos possui três circuitos neurais reconhecidamente envolvidos no processamento do aprendizado e memória: o circuito perfurante, o circuito das fibras musgosas e o circuito colateral de Schaffer. Todos esses circuitos são sensíveis à facilitação sináptica, isto é, após breve seqüência de estímulos de alta freqüência os neurônios aumentam a amplitude de seus potenciais excitatórios pós –sinápticos. Este fenômeno de potenciação a longo prazo (LTP) não ocorre da mesma maneira nos três circuitos (SODERLING et al.,2000).
No circuito das fibras musgosas a LTP é considerada não associativa porque dependente da entrada de cálcio somente nos terminais pré-sinápticos antes da seqüência de estímulos. O íon cálcio ativa o sistema cálcio-calmodulina que aumenta os níveis do AMP cíclico e ativa proteínas kinase A no neurônio pré-sináptico. Quanto ao papel do glutamato, nesse circuito, liga-se aos receptores do tipo NMDA e AMPA, sendo os primeiros menos ativos nesse processo (WALKINS et al.,1994).
No “circuito colateral de Schaffer” e no “circuito perfurante” há necessidade de alterações nos neurônios pré e pós sinápticos para que a LTP ocorra e assim é considerada LTP associativa SODERLING et al., (2000). No circuito colateral de Schaffer é necessária primeiramente a ativação de receptores para glutamato do tipo NMDA. Os receptores do tipo AMPA são caracterizados por serem rápidos em contraponto à velocidade de excitação dos receptores do tipo NMDA. Isto ocorre porque os receptores do tipo NMDA são primariamente não-responsivos durante a estimulação neuronal por causa do bloqueio realizado por um cátion Mg++ que impede a entrada do íon Ca++ através do poro do canal. Então, receptores do tipo AMPA medeiam a despolarização pós-sináptica pelo influxo de Na+, alterando o bloqueio voltagem dependente, permitindo o influxo de Ca++ pelos
receptores NMDA (DINGLEDINE et al, 1999). Esse tipo de receptor só se torna permeável ao íon cálcio se houver ligação com o glutamato e alteração do potencial elétrico da membrana celular com intensidade suficiente para expulsar o íon magnésio que bloqueia a entrada do canal. O influxo de cálcio produz a ativação de proteínas-kinase dependentes do sistema cálcio-calmodulina, proteína kinase C, proteína kinase A e tirosina-kinase fin (MENNERICK & ZORUNSKI, 2001).
Uma substância sinalizadora, possivelmente o óxido nítrico, é liberada em resposta às quantidades aumentadas de cálcio que penetram na célula pós-sináptica e regula a quantidade de glutamato a ser liberado na sinapse (SCHAFFE et al. 2001).
3. Distribuição de receptores do tipo AMPA no hipocampo de mamífero
Quase todas as áreas da região hipocampal de mamíferos revelam a presença de receptores para glutamato. Porém, evidencia-se um maior registro de receptores do tipo AMPA na região CA1 e proporcionalmente menor em outras áreas hipocampais como: CA2, CA3 , CA4, giro denteado, camada granular do giro denteado, subículo e córtex entorrinal (TOYAMA et al.,1998).
Os dados obtidos por PETRALIA et al.(1992) indicaram que as subunidades GluR1 e GluR2 são mais abundantes nas regiões CA1, CA2, CA3 , CA4 (camada piramidal) e giro denteado (camada granular) e que a subunidade registrada com menor freqüência na formação hipocampal é a GluR4.
Algum tempo depois, WENTHOLD et al. (1996) mostraram que as maiores populações de receptores do tipo AMPA nas regiões CA1 e CA2 do hipocampo de ratos agrupavam se de duas maneiras: uma delas possuía associações de subunidades GluR1 e GluR2 e outra de GluR2 e GluR3, sendo que pouquíssimas eram as associações GluR1 e GluR3.Porém, a exata definição da localização das subunidades na estrutura celular ainda é obscura.
Experimentos específicos de MARTIN et al. (1993) para localização das subunidades, já evidenciavam a presença de GluR2 em dendritos, sendo que os dados foram confirmados por HE et al. (1998). Porém, PINHEIRO et al. (2003) discutiram a prevalência de subunidades GluR1 e GluR2/3 pré-sinapticamente sem excluir a possibilidade de ocorrerem em neurônios pós-sinápticos também.
Da mesma forma, os trabalhos de FABIAN- FINE et al.(2000) com secções da área CA3 de ratos mostraram que os receptores do tipo AMPA distribuem-se indiferente em neurônios pré-sinápticos e pós- sinápticos tanto em culturas in vitro quanto em experimentos com cérebros intactos.
MOGA et al.(2002) utilizando um anticorpo monoclonal contra GluR3,revelou que a maioria dos interneurônios e todas as células piramidais da região hipocampal eram GluR3 positivas.
Por outro lado, BOCHET et al.(1994) encontraram grande quantidade de neurônios não piramidais (tipo II) da área CA1 apresentando subunidades GluR1 e GluR4 em comparação a uns poucos deles com GluR2. Porém, em neurônios piramidais e não piramidais do tipo I, os receptores do tipo AMPA preferencialmente são compostos por subunidades GluR2 , como apontam os dados de TSUZUKI et al. (2000). Mais tarde a equipe de BOLSHAKOV (2001) descreveu a predominância de isoformas flip nas células contendo GluR2 dessa região.
Em trabalhos com camundongos FUJISE et al. (1999) descreveram neurônios grandes, multipolares, com soma e dendritos GluR2/3+, identificados como células musgosas localizadas no hilo do giro denteado. Além disso, a região do fimbria- fórnix também se mostrou GluR2/3 + nesses animais.
II - OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA
Dentre os vários neuromediadores já descritos como presentes no hipocampo de mamíferos, o aminoácido glutamato é dos mais importantes. A distribuição (e o papel funcional) de seus receptores no encéfalo de mamíferos também estão bem documentados na literatura; parecendo exercer papel fundamental nos processos relacionados à memória e aprendizagem. Os receptores para glutamato do tipo AMPA estão implicados nos fenômenos de LTP, cabendo a eles a despolarização prévia da membrana neuronal que antecede ativação dos do tipo NMDA. Em aves, classe muito utilizada como modelo de estudo em processos de aprendizado e memória, há grande escassez de informações sobre esse mediador. Estudos envolvendo a distribuição de receptores de glutamato no hipocampo são necessários em qualquer abordagem funcional mais específica, em especial àquelas que não se limitam apenas ao registro de respostas comportamentais.
Desta forma, o presente estudo revisa algumas imunomarcações no hipocampo de pombo que foram sugeridas por KREBS et al. (1991) e propõe a ampliação dos resultados com a inclusão da marcação de imunorreatividade para anticorpos contra as subunidades que formam os receptores AMPA no hipocampo dessa ave. Esse tipo de dado certamente poderá ampliar nosso conhecimento sobre essa importante região e, quem sabe, verificar as possibilidades de correlação dessa área entre diferentes vertebrados.
III. MATERIAIS E MÉTODOS
1- AnimaisForam utilizados quinze pombos (Columba livia) adultos, obtidos de um criadouro local, de ambos os sexos, mantidos em biotério, em gaiolas com água e comida ad libitum, num ciclo claro/escuro de 12:12 horas. Todos os procedimentos seguiram o protocolo experimental de respeito aos princípios éticos em experimentação animal aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, sob o protocolo nº 516-01.
1.1-Perfusão
Os animais foram induzidos à anestesia profunda com ketamina (Francotar, VIRBAC, 0,06ml/100g de peso corporal, i.m.) e xilazina (Rompum, MILES- LAB, 0,04ml/100g de peso corporal,i.m.). Cirurgicamente foi exposta a caixa torácica e injetada heparina (heparina sódica 0,2ml/100g de peso) no ventrículo esquerdo, seguida de perfusão por via intracardíaca com solução salina tamponada 9%, 100ml/100gr de peso (pH 7.4) e, a seguir, com solução de paraformaldeído (PFA), na mesma quantidade, a 4% em tampão fosfato 0,1M, a 4ºC (pH7.4). Os cérebros foram removidos e mantidos no mesmo fixador (PFA 4%) por cerca de 12 horas e depois transferidos para uma solução crioprotetora de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7.4, onde permaneceram pelo menos 24 horas até a sessão de cortes feitos em micrótomo de congelamento (Leica, mod.1400).
2- Preparação histológica
Os cortes foram feitos no plano coronal, com espessura de 40 µm, colocados em compartimentos isolados preenchidos com solução tampão fosfato (0,1 M, pH 7.4 a 4ºC), e submetidos a 3 lavagens de 10 minutos em solução tampão 0,1M em temperatura ambiente.
A seleção seguiu as coordenadas de A 3,25 a A 10,00 do Atlas Estereotáxico de Cérebro de Pombo (KARTEN & HODOS,1967). Algumas lâminas foram coradas pelo método Giemsa para a obtenção de um guia histológico do espaço estudado. O protocolo seguido para a coloração pelo contracorante Giemsa obedeceu aos seguintes passos: 1 hora em álcool 95ºe clorofórmio (1:1); 1 minuto em álcool 90%, 1 minuto em álcool 70%; lavagem em água destilada; 45 minutos em mistura morna (70ºC) de contracorante Giemsa; lavagem em PB (0,1M); fixação do corante em molibdato de amônia por 5 minutos; lavagem em água destilada; passagem em bateria de álcoois por 90 segundos seguindo a ordem: 70%, 90%, 100% e novamente em 100%; clarificação em CitriSolv (Fisher Scientific) em duas passagens de 5 minutos cada uma e por fim montagem da lâmina com lamínula e Permount (Fisher Scientific).
Os demais cortes foram processados imunohistoquimicamente e revelados pelo método da peroxidase (BOENISH,1992), descrito abaixo.
2.1- Imunohistoquímica
Primeiramente os cortes foram lavados e incubados, por 12 horas em temperatura ambiente com um anticorpo primário feito contra a substância a ser estudada, em várias diluições de 1:500 a 1:5000. Todas as diluições foram feitas em tampão fosfato (0,1M, pH 7,4) com Triton-X-100 a 0,3% mais 5% de soro normal da mesma espécie onde foi feito o anticorpo secundário. Após este período os cortes foram submetidos a outra série de três lavagens em tampão fosfato (temperatura ambiente) e incubados por uma hora com anticorpo secundário biotinilado contra as imunoglobulinas do animal no qual foi produzido o anticorpo primário em diluição de 1:250. Após todas a série de lavagens (temperatura ambiente), os cortes permaneceram imersos por uma hora em solução de Triton – X- 100 (0,3%; tampão fosfato 0,1M) com 0,4M de NaCl, onde foi adicionado o complexo avidina- biotina- peroxidase (ABC ELITE kit, Vector Lab). Após três lavagens, os cortes foram colocados num recipiente contendo diaminobenzidina (DAB) à 0,05% em tampão fosfato 0,1M por cerca de 15 minutos. Foi adicionada à mistura 300µl de solução de peróxido de hidrogênio a 30% (solução final: 0,01%) para evidenciação da reação.
Assim que foi obtido o nível adequado de coloração para contraste das marcações, a reação foi interrompida pela imersão em tampão fosfato e os cortes submetidos a três séries de lavagens de dez minutos cada. Assim, os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas e mantidos em placa quente (35ºC) por quatro dias. Os controles foram feitos pela omissão do anticorpo primário ou pré-incubação com soro normal do animal onde foi produzido o anticorpo secundário e não foi observada marcação alguma nesses casos.
Após este tempo, os cortes foram hidratados em água destilada e tratados com uma solução intensificadora de tetróxido de ósmio 1% por 15-30 segundos, desidratados por uma bateria de álcool etílico em concentrações crescentes, clarificados com CitriSolv (Fisher Scientific) e cobertos com lamínulas seladas com Permount (Fisher Scientific). A observação das lâminas foi realizada em microscopia óptica (NIKON Eclipse E800).
2.2- Anticorpos
Foram utilizados anticorpos dirigidos contra as seguintes substâncias: a enzima de
síntese de acetil-colina, a colina acetil transferase (ChAT) da empresa Chemicon International Inc. (Temecula, CA); serotonina (5–HT) adquirido de DiaSorin (Stillwater, MN); substância P (SP) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP), ambos da Sigma BioSciences (St. Louis, MO); subunidades dos receptores de glutamato do tipo AMPA, GluR1, GluR4 e um anticorpo que reconhece uma porção comum para as subunidades GluR2 e GluR3 (GluR2/3), todos da Chemicon International Inc. (Temecula, CA). As diluições variaram entre 1:500 e 1:10.000, de acordo com o protocolo utilizado para cada anticorpo. Esses anticorpos têm sido bastante utilizados na literatura com especificidade comprovada em trabalhos prévios (CHEN et al. 1996).
3- Análise das lâminas
A área estudada envolveu a região do telencéfalo dorsal do pombo que margeia o ventrículo lateral. Essa região compreende o hipocampo (HP) e a área parahipocampal (APH) conforme descrito no Atlas Estereotáxico do cérebro de pombos (KARTEN &
HODOS, 1967). Escolheu-se como nível de referência àquele que compreendeu a área de maior extensão da formação hipocampal, A 8.00. Existem também, no texto, referências a outros níveis mais rostrais (9.50 e 9.00) ou caudais (6.50) utilizados para melhorar a localização da distribuição das áreas imunopositivas aos anticorpos contra as substâncias estudadas no telencéfalo do pombo.
O material foi fotografado, utilizando–se uma câmara fotográfica NIKON FDX-35 acoplada ao microscópio e filme fotográfico FUJI, 35mm, 100ASA.
Alternativamente as imagens do tecido foram digitalizadas por meio de uma câmera (Magnafire-Optronics) e exportadas para um computador Macintosh (G4A). As mídias foram processadas por meio dos softwares Photoshop 9 (Adobe Photoshop) e os esquemas foram desenhados com o auxílio do software Canvas 5 (Deneba Softwares).
3.1. Análise morfocitométrica
As células da região foram classificadas em grupos de acordo com seu tamanho e forma. Para a medida aproximada das dimensões celulares primeiro determinamos seu maior eixo e a medição desse comprimento realizada com o auxílio de uma barra de escala como referência.
IV. RESULTADOS
1. Descrição da distribuição e tipologia celular na formação hipocampal de pombos com a utilização do método GIEMSA
A utilização da coloração pelo método de Giemsa permitiu evidenciar os corpos celulares presentes na região do telencéfalo dorsal de pombos. A determinação da tipologia celular da área permitiu a verificação da densidade na distribuição das populações celulares na formação hipocampal, bem como a natureza laminar de algumas porções.
A região da formação hipocampal do pombo é rica em células distribuídas por toda sua extensão, exceto em seus limites medial e lateral. Esse último dado coincide com o trajeto das fibras do trato septomesencefálico que chega através da região septal e atravessa a região ventromedial dando origem a um ramo medial (fibras do trato medial) (Figura3B).
Numa visão geral, percebe-se que a distribuição das células não é homogênea pois existem duas áreas de maior acúmulo. Uma delas localiza-se na área ventromedial e parece similar a uma letra “V”, descrita anteriormente por Craig e utilizada como referência no Atlas Estereotáxico do cérebro de pombos de KARTEN & HODOS (1967). Esse efeito é obtido por acúmulo em camadas, de células fortemente coradas distribuídas numa porção lateral e outra medial que se encontram formando a letra “V”. O efeito também decorre do fato de que o interior do “V” possui células em menor quantidade e menos coradas também. Existem poucas diferenças entre as duas porções do “V”, mas a porção que margeia o ventrículo, a lateral, contém células mais aglomeradas e numerosas que a oposta, a medial.
Uma segunda área de maior densidade celular localiza-se na região dorsomedial, sendo menos diferenciada que a descrita acima. (Figura 3B).
Por toda a região foi possível observar três tipos diferentes de células: triangulares, irregulares ou losangonais, e arredondadas . As células tendendo a esféricas, sem cantos vivos e sem nucleação aparente foram chamadas de arredondadas.; outro grupo de células com três cantos vivos, sem nucleação aparente foram denominadas triangulares e células com quatro ou mais cantos vivos, com núcleo visível, foram chamadas de irregulares
As células triangulares possuem de 20 a 25µm de dimensão, são menos numerosas que as demais e mais encontradas na região medial e nas duas porções do “V”. Possuem corpos celulares com três cantos agudos de onde se pode observar, em algumas delas, projeções incipientes, já que o tipo de coloração (Giemsa) não permite visualização de toda a arborização celular.
As células irregulares possuem de 15 a 20 µm de dimensão, são muito numerosas e distribuem-se homogeneamente por toda a extensão da formação hipocampal. Seus corpos celulares possuem quatro ou cinco cantos agudos. Na maioria deles nota-se que uma das bordas é arredondada.
As células arredondadas são menores, com cerca de 10 a 15µm, muito numerosas e espalham-se por todas as áreas observadas. Não apresentam cantos aparentes, podendo-se observar muitas projeções laterais.
FIGURA 3
Esquema e fotomicrografia da formação hipocampal do cérebro de pombo corado pelo método de Giemsa. Na imagem superior (A) observa-se, em detalhe, a concentração de corpos celulares na região dorsomedial. Em (B) as setas indicam o trajeto de fibras na porção medial da região hipocampal. A figura em preto e branco (C) mostra a tipologia celular encontrada na formação hipocampal. Barra de escala: 100µm nas figuras A e C e 25µm na figura C.
2. Determinação da distribuição de agentes neuroquímicos na formação hipocampal de pombos com a utilização da técnica de imunohistoquímica
A técnica de imunohistoquímica foi utilizada com o objetivo de mapear neuroquímicamente a formação hipocampal do pombo. Foram utilizados alguns neuromarcadores sugeridos nos trabalhos de KREBS et al.1991 e ERICHSEN et al.1991 na tentativa de subdividir-se a região em áreas que pudessem oferecer algumas sugestões de correspondência com a formação hipocampal do mamífero. Para tanto, empregamos anticorpos diretamente contra ChAT (colina acetil transferase, enzima responsável pela síntese do neuromediador acetil-colina), 5-HT (serotonina), SP (substância P), VIP (peptídeo intestinal vasoativo) e subunidades dos receptores para glutamato do tipo AMPA (GluR1 GluR2/3 e GluR4). Esses resultados são discutidos a seguir.
2.1. COLINA ACETIL TRANSFERASE (ChAT)
Observou-se a ausência de corpos celulares ChAT+, mas notou-se marcada imunorreatividade ao anticorpo contra ChAT em fibras da região do trajeto medial do trato septomesencefálico que trafega pela área. Em cortes na altura A 8.00 a marcação é descontínua, indicando que o trajeto das fibras segue quase perpendicular ao plano de corte. Em outros níveis mais caudais (6.50) ou rostrais (9.50) a continuidade das fibras desse trato mostrou-se mais evidente, o que sugere ligeira modificação no ângulo de seu trajeto.
Na área ventromedial, nos limites medial e lateral das porções do “V”, observaram-se muitas projeções colaterais ChAT+ que parecem originar-observaram-se do feixe de fibras que trafega pela região e que se dirigem perpendicularmente para as duas porções do “V”, assumindo um padrão semelhante à fímbrias (Fig.4).
FIGURA 4
Esquema e fotomicrografia da formação hipocampal de pombo indicando a área das fibras do trato medial e as projeções ChAT+, em forma de fímbrias, localizadas na região. Barra de escala: 50µm.
2.2. SEROTONINA (5-HT)
Foi notada a ausência de corpos celulares 5-HT+ na área da formação hipocampal. Porém, muitas fibras foram evidenciadas espalhando-se desde a região dorsal até a ventromedial. Em dois locais a distribuição de fibras serotonérgicas parece mais densa: na região dorsomedial e na porção medial do “V” (Figuras 5A e 5B). As fibras 5-HT+ são finas e varicosas. Nas regiões de maior distribuição, as fibras 5-HT+ parecem ocupar o trajeto das fibras do trato septomesencefálico e nos demais locais ocorrem fibras distribuídas como uma fina rede (Figura 5C).
Na região ventromedial, em cortes mais caudais (A 6,50), aparece intensa imunorreatividade ao anticorpo para 5-HT em fibras com inúmeras varicosidades, localizadas na porção do “V” oposta ao ventrículo, a parede medial. Essa diferença na intensidade de imunorreatividade desaparece nos cortes mais rostrais (Figura 5B).
2.3. SUBSTÂNCIA P (SP)
Na região estudada foi possível observar muitas fibras e abundante extensão de neurópilo SP+, porém nenhum corpo celular foi evidenciado.
Aparecem fibras imunorreativas ao anticorpo contra SP na região das fibras do trato medial (componente medial das fibras do trato septomesencefálico) que se estendem até a região dorsomedial (Figura 6A). Em destaque nota-se uma área densamente imunorreativa ao anticorpo contra SP na região dorsomedial, parecendo ser formada por fibras finas com varicosidades abundantes sugerindo campos terminais. Em cortes mais caudais essa porção parece reduzir-se ocupando somente uma pequena porção da área dorsomedial, porém, apesar da redução em número
FIGURA 5
Esquema e fotomicrografias da formação hipocampal de pombo indicando a localização de fibras 5-HT+. A imagem em campo escuro (A) mostra a distribuição abundante de fibras pela área dorsomedial estendendo-se para a área lateral. A imagem em B, também em campo escuro, pode-se notar a distribuição de fibras na região ventromedial. Observar que as setas indicam um feixe maior de fibras que parecem ocupar a região do componente medial do trato septomesencefálico. A fotomicrografia em maior aumento em contraste de fase (C) mostra fibras varicosas encontradas em toda a formação hipocampal. A seta em branco mostra em detalhe esse tipo de fibra. Barra de escala: 100µm em A e B e 25µm em C.
As fibras parecem mudar de trajeto conforme se deslocam no sentido dorsolateral, tornando-se oblíquas e estabelecendo uma região limite entre a região do hipocampo (HP) e a área parahipocampal (APH) (Figura 6B).
Uma extensa faixa de neurópilo SP+ aparece na região dorsomedial acompanhando as fibras descritas acima. A marcação do neurópilo não ocorre homogeneamente pela área, sugerindo uma distribuição em camadas. A primeira faixa de tecido no limite medial da região é intensamente SP+, a segunda é levemente SP+ e a última volta a apresentar forte marcação, o que pode configurar um padrão de distribuição trilaminar (Figura 6D).
2.4. PEPTÍDEO INTESTINAL VASOATIVO (VIP)
Ocorreu imunopositividade ao anticorpo contra VIP em fibras e corpos celulares por toda a região da formação hipocampal, desde a área lateral até a área ventromedial (Figura 7).
2.4.1- Fibras VIP+
Muitas fibras VIP+ compõem o trato que atravessa a junção septohipocampal, seguindo o mesmo trajeto do trato septomesencefálico. Além dessas fibras, outras mais finas com muitas varicosidades espalham-se por todo o espaço correspondente às áreas dorsomedial, área em forma de “V” e área entre o “V”, denominada área medial.
A área dorsomedial acumula um grande emaranhado de fibras fortemente VIP+ (Figura 8C).
FIGURA 6
Esquema e fotomicrografia da formação hipocampal de pombo indicando a localização de fibras SP+. A figura (A) indica fibras fortemente SP+ na área das fibras do trato medial que parecem ocupar região de passagem do trato septomesencefálico. Na imagem em B a linha tracejada aponta a região SPf sugerida por Erichsen et al. (1991) e Krebs et al. (1991) como limite entre o hipocampo e a área dorsolateral do telencéfalo. Nota-se em C fibras finas e varicosas na área dorsomedial cuja disposição parece indicar campos terminais. A foto (D) apresenta, tracejada, a aparente laminação existente na região. O efeito decorre dos diferentes graus de densidade das fibras localizadas na área dorsomedial. Barra de escala: 100µm em B e D; 50µm em A e C.
2.4.2-Corpos celulares VIP+
Muitos corpos celulares VIP+ aparecem por toda a região da formação hipocampal e são de três tipos: triangulares, irregulares e arredondadas (Figura 8A). As triangulares e as irregulares têm cerca de 20 a 25µm de tamanho e são intensamente imunorreativas.
As células arredondadas são menores, com cerca de 10µm, menos abundantes e apresentam menor intensidade de marcação.
Existem mais células triangulares na região ventromedial que na dorsomedial e pode-se obpode-servar a emergência de projeções de pode-seus cantos agudos, o que colabora para a extensa arborização da área (Figura 8C).
A região dorsomedial possui muitas células VIP+ com pericário de forma irregular, de onde se projetam longos processos que se dirigem aos limites mediais da região (Figura 8B).
FIGURA 7
Montagem de fotomicrografias em baixo aumento revelando uma visão geral da formação hipocampal de pombo, indicando a distribuição de corpos celulares VIP+. Barra de escala: 250µm.
FIGURA 8
Esquema e fotomicrografia da formação hipocampal de pombo indicando a distribuição de corpos celulares VIP+. A fotomicrografia em A mostra a distribuição de corpos celulares na região dorsomedial e a imagem em B evidencia em detalhe alguns corpos celulares VIP+. Notar as projeções e o pericário bem marcados. Notar em C a distribuição uniforme de corpos celulares VIP+ pelas áreas medial e em “V”. Barra de escala: 50µm em A; 25µm em B e 100µm em C.
3. Imunorreatividade aos anticorpos contra as subunidades dos receptores para glutamato do tipo AMPA
Observou-se imunorreatividade para os anticorpos contra as subunidades GluR1, GluR2/3 e GluR4 dos receptores AMPA em toda a formação hipocampal. Foram encontrados processos semelhantes a fímbrias, na maioria GluR4 +. Houve intensa imunorreatividade do neurópilo GluR1+ e GluR2/3+, sem a ocorrência de fibras isoladas marcadas. Os corpos celulares GluR1+, GluR2/3 + foram notados em maior número que os GluR4+.
Em cortes no plano A 8.00, a região dorsomedial do hipocampo apresentou marcação imunohistoquímica para todos os anticorpos contra as subunidades estudadas. Em cortes mais rostrais (A9.00-A10.0) observou-se um deslocamento da marcação imunorreativa do neurópilo GluR1 + e GluR2/3 + sendo mais densa no limite medial da formação hipocampal, acompanhando a porção medial do “V”. Notou-se que quanto mais rostral o corte, mais ventromedialmente o deslocamento ocorre, até desaparecer em A10.0.
4.1- Fibras e neurópilo GluR1+
Ocorre forte imunorreatividade ao anticorpo contra GluR1 do neurópilo na região dorsomedial (Figuras 9A ,10A e 11A).
Nos cortes mais rostrais (A 9,00) a distribuição desse neuróplio GluR1+ da região dorsomedial muda, medialmente ocupando a porção do “V” oposta ao ventrículo, o que sugere a continuada presença de estruturas reativas ao anticorpo contra GluR1 em áreas diferentes da região considerada no presente estudo (Figura 9 B).
A marcação do neurópilo vai se tornando cada vez menos extensa até restringir-se a uma estreita faixa no limite entre a região da formação hipocampal e área parahipocampal. A região ventromedial apresenta alguns processos colaterais perpendiculares às bordas da
FIGURA 9
Fotomicrografia da formação hipocampal do cérebro de pombos mostrando estruturas GluR1+. A primeira figura (A) da secção coronal (AP8.00) ilustra a área de maior marcação de neurópilo GluR1+ que se concentra na região dorsomedial, indicada por setas. A figura B da secção coronal (AP9.00) mostra, evidenciado por setas, o deslocamento da área de maior marcação de neurópilo GluR1+ para a região do braço medial do “V”. Em detalhe (C) as setas pontilhadas indicam a área das fibras do trato medial e, paralelas a ela, nota-se a localização das fímbrias GluR1+. Barra de escala: 250µm.
FIGURA 10
Fotomicrografias em campo escuro de cérebro de pombo mostrando o neurópilo GluR1+. A primeira imagem (A) indica a extensa distribuição de neurópilo GluR1+ na região dorsomedial . Na imagem seguinte (B) observa-se neurópilo GluR1+ na área das fibras do trato medial. Barra de escala: 50µm em A e 100µm em B.
FIGURA 11
Esquema e fotomicrografia da formação hipocampal de pombo indicando a distribuição de corpos celulares GluR1+. Nota-se na imagem (A), neurópilo fortemente GluR1+ na região dorsomedial. Em (B) pode-se observar abundante distribuição de corpos celulares GluR1+ na região ventromedial. Barra de escala: 250µm em A e 50µm em B.
FIGURA 12
Esquema e fotomicrografia da formação hipocampal de encéfalo de pombo indicando a distribuição de corpos celulares GluR1+ na área medial e braços do “V”. Notar a presença de células triangulares e irregulares distribuídas pela região. Barra de escala: 100µm.
formação hipocampal. Não se pode determinar se esses processos colaterais GluR1+ relacionam-se com os corpos celulares abundantes na região ou com as fibras do trato medial que trafegam pela região (Figuras 9C e 10B).
3.2-Corpos celulares GluR1+
As células GluR1+ são de dois tipos: triangulares e irregulares, com pericário bem definido, ambas possuindo de 15 a 20µm de tamanho.
Parecem originar-se do pericário algumas projeções bem visíveis em algumas situações, dependendo do plano dos cortes das células (Fig.11B).
Na região ventromedial parece ocorrer um arranjo na distribuição dos corpos celulares na parte interna do “V”, longe dos limites medial e lateral da região.
Muitos corpos celulares irregulares e triangulares, fortemente GluR1+, acumulam-se nas áreas medial e em forma de “V” (Figura12).
3.3- Fibras e neurópilo GluR2/3+
Parece repetir-se para o neurópilo GluR2/3+ o que foi observado para neuróplio GluR1+ quanto ao acúmulo na região dorsomedial em relação às demais áreas da formação hipocampal (Figura 13 A). Existe uma faixa estreita de neurópilo que se evidencia no sentido dorsolateral, da mesma forma como ocorre para GluR1, parecendo ser inclusive de mesma extensão (Figura 13B). Em cortes A 8.00, a área mais intensamente GluR2/3+ concentra-se na região dorsomedial e conforme os cortes vão se tornando mais rostrais, ocorre um deslocamento da região mas fortemente GluR2/3+ para o sentido ventromedial, na porção medial do “V”, assim como foi observado para fibras GluR1+(Figuras 14A,B e C).
FIGURA 13
Esquema e fotomicrografias da formação hipocampal de pombo indicando a distribuição de neurópilo GluR2/3+. Em A observa-se a distribuição de neurópilo GluR2/3+ na área dorsomedial e também ao longo do trajeto das fibras do trato medial. A imagem da secção coronal AP 9.50 em B ilustra a área de maior marcação de neurópilo GluR2/3+. Notar a expansão dorsolateral e o deslocamento da marcação para a porção medial do “V”. Barra de escala: 100µm.
FIGURA 14
Esquema e fotomicrografias da formação hipocampal de pombo indicando a distribuição de neurópilo GluR2/3+. A figura A mostra a área de neurópilo GluR2/3+ em AP 9.0 localizada no braço medial do “V”. Na foto B observa-se o deslocamento da maior concentração de neurópilo GluR2/3+ em AP 8.00 para a região dorsomedial. A imagem C, obtida com a associação da técnica de imunohistoquímica e contracorante Giemsa torna mais evidente o posicionamento do neurópilo marcado na área dorsomedial em AP 8.00. Barra de escala: 250µm.
Observam-se também muitas projeções colaterais formadas por pequenas fibras em forma de fímbrias, GluR2/3+, perpendiculares às bordas laterais e mediais da formação hipocampal.
3.4 - Corpos celulares GluR2/3+
São evidenciados corpos celulares GluR2/3+ de dois tipos: as de pericário irregular e as de formato triangular. O tamanho das células varia de 15 a 20µm de dimensão. O corpo celular parece bem delineado, parecendo muito semelhante aos corpos celulares GluR1+ que aparecem nesta mesma região (Figura15).
FIGURA 15
Esquema e fotomicrografias da formação hipocampal de pombo indicando a distribuição de corpos celulares GluR2/3+. A imagem A mostra a distribuição de corpos celulares na área dorsomedial. Na figura B observam-se os corpos celulares GluR2/3+ espalhados pela área medial. Barra de escala: 25µm.
3.5-Fibras e neurópilo GluR4+
A imunorreatividade ao anticorpo contra GluR4+ evidencia-se em finas fibras e processos perpendiculares às bordas do tecido (Figura16B).
Na região dorsomedial os processos colaterais parecem dirigir-se para o interior da formação hipocampal. (Figura 16A).
3.6-Corpos celulares GluR4+
Os corpos celulares GluR4+ estão espalhados por toda a extensão da formação hipocampal, distribuídos homogeneamente, não sendo visíveis projeções como dendritos ou axônios. São corpos celulares arredondados, como se pode observar na figura 18B, com pericário evidenciado, medindo cerca de 15µm de dimensão. Uma faixa estreita desses corpos celulares GluR4+ acompanha o neurópilo imunorreativo , na região dorsomedial (Figuras 17 e 18A).
FIGURA 16
Esquema e fotomicrografia da formação hipocampal de pombos mostrando fímbrias GluR4+. A imagem A ressalta um detalhe das fímbrias na região dorsomedial. A figura B mostra, indicada por setas, a distribuição das fímbrias na área das fibras do trato medial. Barra de escala: 50µm em A e 100µm em B.
FIGURA 17
Esquema e fotomicrografia da formação hipocampal indicando estruturas GluR4+. Embora não sejam evidentes populações celulares isoladas, a ligeira concentração de corpos celulares e pouco neurópilo evidenciado ocorrem na área dorsomedial. Barra de escala: 100µm.
FIGURA 18
Esquema e fotomicrografia de células GluR4+. A imagem (A) mostra a distribuição de corpos celulares localizados na região dorsomedial e em (B) pode-se notar, evidenciadas por setas, células arredondadas GluR4+ presentes em toda a formação hipocampal, embora em número reduzido. Barra de escala: 50µm em A e 25µm em B.
V – DISCUSSÃO
O presente estudou demonstrou a presença de subunidades dos receptores para glutamato do tipo AMPA no hipocampo de pombos. O trabalho também confirmou alguns dos resultados relatados em estudos anteriores de KREBS et al. (1991) e ERICHSEN et al. (1991) quanto às demarcações de áreas imunorreativas aos anticorpos contra ChAT, 5-HT, SP e VIP.
Nossos dados apresentam uma distribuição regular e uniforme de corpos celulares VIP+ por toda a formação hipocampal e não permitiram a observação de uma área circunscrita de células VIP+, considerada por ERICHSEN et al. (1991), como uma subdivisão específica. Com essa única exceção, portanto, as regiões identificadas no presente trabalho coincidem com as descritas por esses pesquisadores. Então, foram confirmadas cinco das seis subpopulações hipocampais separadas de acordo com suas características imunorreativas: a área das fibras mediais, a área em forma de “V”, a área medial, a área dorsomedial e a área lateral, além de uma região de fronteira (SPf).
Essas imunomarcações possibilitaram aos pesquisadores sugerir uma regionalização na formação hipocampal e levantar propostas de aproximações entre hipocampos de aves e mamíferos, que serão discutidas a seguir.
5.1. Área das fibras mediais
A área das fibras do trato medial apresentou-se imunorreativa aos anticorpos contra ChAT, 5-HT, SP, VIP, GluR1 GluR2/3 e GluR4. A marcação para ChAT, 5-HT, SP e VIP foi evidente em fibras acompanhando a borda da região estudada. As pequenas fimbrias GluR1+, GluR2/3+ e GluR4+ são perpendiculares ao trajeto de fibras que ocupa o eixo longitudinal do hipocampo, parecendo constituir-se projeções celulares e não fibras pertencentes a um trato específico. Estudos de TOMBOL et al.(2000a e 2000b) descrevem
