AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE UMA CULTURA MISTA DE BACTÉRIAS
FERMENTATIVAS POTENCIALMENTE PRODUTORAS DE HIDROGÊNIO
1
Fábio Silva Oliveira, 2 Betânia Braz Romão, 3 Juliana de Souza Ferreira, 3 Vicelma Luiz Cardoso,
3
Fabiana Regina Xavier Batista
1
Bolsista de iniciação Científica PIBIC/FAPEMIG/UFU, discente do curso de Engenharia Química
2
Bolsista de Doutorado CAPES/UFU, doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
3
Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG)
1,2,3
Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP 38408-100)
e-mail: frxbatista@feq.ufu.br
RESUMO-. A escassez de reservas de combustíveis fósseis tem fomentado o desenvolvimento de processos alternativos para a obtenção de energia. Neste contexto, destacam-se os estudos direcionados ao aperfeiçoamento de processos dedicados a produção de biocombustíveis como o H2. Convencionalmente este biocombustível é produzido através da reforma de vapor,
bem como através de rota biológica. Nos últimos anos, os microrganismos como as bactérias fermentativas, capazes de produzir H2 quando em condições específicas de cultura, tem sido fortemente empregados em bioprocessos com esta finalidade. Salienta-se que tais microrganismos em sua rota metabólica, através de processo fermentativo anaeróbico realizado no escuro, convertem os substratos do meio em ácidos orgânicos, dióxido de carbono e H2.
Para que esta conversão seja eficiente é necessária que elevada viabilidade celular se verifique. Este estudo tem por objetivo avaliar a viabilidade de células oriundas de lodo biológico, obtido de reator de manta de lodo. Para tal, a contagem das células viáveis através da metodologia “pour plate” foi empregada. Neste procedimento o crescimento das células amostradas em diferentes tempos de fermentação foi observado através de plaqueamento. Inicialmente, uma pequena quantidade de inóculo celular foi diluída de forma seriada em tubos de ensaio, utilizando uma solução cloreto de sódio (8,5g/L). Após isso 1mL de cada tubo foi adicionado a uma placa de Petri que recebeu em seguida tioglicolato de sódio (30g/L), triptona (10g/L) e extrato de levedura (5g/L). Ágar foi adicionado na sequencia e após o resfriamento e a solidificação do material as placas foram invertidas em um dessecador contendo uma vela acesa para que a condição de anaerobicidade fosse alcançada. Os resultados mostraram que após um período de 168 horas, colônias de bactérias foram observadas nas placas de Petri, fato que demonstrou a capacidade reprodutiva do consórcio microbiológico utilizado, conferindo viabilidade às células.
Palavras-Chave: biohidrogênio, fermentação escura, viabilidade celular
INTRODUÇÃO
Os combustíveis derivados do petróleo se tornaram a fonte principal para o mercado de transporte desde o século XX e o crescente con-sumo destes combustíveis leva a um aumento na emissão de CO2 na atmosfera e,
consequente-mente, às alterações climáticas como o aqueci-mento global (Balat e Kirlay, 2010). Além disso, as reservas de combustível fóssil são limitadas, con-centradas em certas regiões e, em vista disso, o seu custo tende a se elevar (Bartels et al, 2010). Portanto, há uma necessidade urgente de se
ob-ter uma fonte de energia sustentável como alob-ter- alter-nativa para a redução do consumo desses com-bustíveis, e que deve seguir os seguintes critérios: emissão zero de CO2, ser de fonte renovável,
a-tender a elevada demanda de energia e apresen-tar um custo comparável ao do atual preço do petróleo (Rupprechet et al., 2009)
As fontes de energia renováveis incluem a energia solar, eólica, hidroeletricidade e a bio-massa. Os biocombustíveis obtidos da biomassa podem ser líquidos (bioetanol e biodiesel) ou ga-sosos (biogás e biohidrogênio) sendo que o bioe-tanol e o biodiesel são os principais atualmente produzidos apresentando desenvolvimento em
termos de qualidade e produção de escala indus-trial. O biohidrogênio também se mostra uma al-ternativa promissora devido à alta eficiência de conversão em potência útil, por ser renovável e não contribuir para o efeito estufa, sendo que ao sofrer a combustão fornece somente água como subproduto. O hidrogênio possui o mais alto teor de energia por unidade em peso do que qualquer outro combustível (142kJ/L) e é facilmente con-vertido em eletricidade por células combustíveis (Jegannathan et al, 2009).
Atualmente, 90% da produção de hidrogê-nio são provenientes de processos como a refor-ma a vapor de hidrocarbonetos e a gaseificação do carvão, que dependem de combustível fóssil e requerem condições de altas temperaturas e pressões. No entanto, os métodos biológicos a-presentam grande potencial para a obtenção de hidrogênio sem causar danos ambientais (Kim e Kim, 2011). A produção biológica do hidrogênio pode seguir três rotas: (i) biofotólise da água por microalgas ou cianobactérias, que possui como vantagens a utilização de água e energia solar que são fontes abundantes e a formação de pro-dutos simples (H2 e CO2), (ii) decomposição de
compostos orgânicos por bactérias fotossintéti-cas, denominada fotofermentação, que pode ter conversão completa de resíduos de ácidos orgâ-nicos a H2 e CO2, e (iii) a produção por
fermenta-ção de resíduos orgânicos por microrganismos anaeróbios ou facultativos, também denominada como fermentação escura, que pode degradar uma ampla variedade de substratos com o em-prego de reatores de simples tecnologia e sem a necessidade do fornecimento de luz (Allakhverdi-ev et al., 2009, Hallenbeck e Ghosh, 2009).
A fermentação escura se mostra como um processo que emprega uma ampla variedade de efluentes, subprodutos e resíduos de indústrias de alimentos ou agrícolas, ricos em carboidratos, celulose e óleos, sem exigir configurações espe-ciais de reatores como os processos fotossintéti-cos e podendo usar culturas puras ou mistas para a fermentação. Apesar das vantagens deste pro-cesso, estudos recentes indicaram baixos índices para a conversão de substrato, eficiência e taxa de produção de hidrogênio, causados principal-mente pela queda de pH devido ao acúmulo de ácidos orgânicos, produzidos na etapa de acido-gênese e pelo consumo de H2 por bactérias do
tipo metanogênicas. Portanto, é evidente a ne-cessidade de obter avanços para a síntese biohi-drogênio, e tornar o processo técnica e economi-camente viável (Valdez-Vazquez e Poggi-Varaldo, 2009, Venkata Mohan, 2009).
Estudo de cinética e viabilidade celular
O estudo de cinética é fundamental para se avaliar os efeitos dos parâmetros em um proces-so de fermentação, como pH, tipo de substratos e microrganismos, temperatura (Wang e Wan, 2009). No caso particular da fermentação escura, empregando-se cultura mista de bactérias, faz-se necessário definir uma metodologia adequada para realizar a contagem de células viáveis duran-te o processo e o isolamento. Com isso, pode-se determinar o gênero predominante no consórcio, que pode variar dependendo de sua origem, uni-dades de tratamento, esterco, solos (Valdez-Vazquez e Poggi-Varaldo, 2009).
Há métodos usados para a contagem de células viáveis que dispensam o preparo e o a-companhamento de culturas em período de incu-bação, que se mostram ser mais rápidos, como é o caso da técnica de SPC (solid phase cytometry) (Vermis et al., 2002). Os métodos baseados em preparo de cultura em meio de crescimento anae-róbico se baseiam em:
Meio contendo tioglicolato de sódio: que é um agente que reduz o O2 em água, criando a
condição de anaerobiose. Este meio ainda pode conter corantes como resazurina e azul de metile-no que auxiliam na indicação visual da presença de oxigênio, sendo usados, portanto, para distin-ção de bactérias aeróbicas ou anaeróbicas (Kara-kashev et al., 2003).
Jarra anaeróbica: que consiste em uma câmara onde há remoção de O2 pela reação com
H2 formando água. A adição de H2 à câmara
ocor-re devido à pocor-resença de uma catalisador (alumi-na-paladium) posicionado na tampa da jarra ou em sacolas geradoras de gás (Gas-Pak) (Vinde-rola e Reinheimer, 1999).
Recipientes com vela: dispensam o uso das jarras anaeróbicas. As placas com meio e inóculo são colocadas em um recipiente junto com uma vela acesa. À medida que ocorre a queima da vela, a concentração de O2 é reduzida e
aumenta-se a concentração de CO2. Esta condição pode
favorecer o crescimento de microrganismos mi-croaerófilos (Vinderola e Reinheimer, 1999, Malik, 1992).
A proposta deste trabalho foi avaliar a ciné-tica de fermentação escura, usando cultura mista proveniente de um reator UASB. Foram verifica-das as evoluções de consumo de substrato e de crescimento celular. Para o estudo de viabilidade celular, foram feitas adaptações na composição do meio de cultura para a contagem de células viáveis.
MATERIAIS E MÉTODOS
Matéria-prima e cultura mista de bactérias anaeróbicas
O soro permeado usado como substrato neste trabalho foi gentilmente concedido pela So-oro Concentrado Indústria de Produtos Lácteos Ltda (Marechal Cândido Rondon, PR). O soro de leite permeado foi avaliado como sugestão para se evitar oscilações de concentração durante os futuros ensaios, em virtude de diferentes lotes de amostras soro de leite in natura. De acordo com a informação do fabricante o soro de leite permeado possui 92,97% de lactose, 0% de gordura e 1,42 %de proteína.
Em trabalho preliminares desenvolvidos pa-ralelamente, também realizado pelos pesquisado-res do Núcleo de Processos Biotecnológicos da FEQ/UFU, em que foi usado o soro permeado não enriquecido com compostos minerais, houve uma maior conversão de H2 por açúcar
consumi-do, visto pelo rendimento de 25,37 mmolH2/g
substrato consumido. A produtividade de 4,56 mmol H2/L·dia foi menor do que para o soro de
leite in natura, registrada como 7,75 mmol H2/L·dia.
Com base no alto rendimento, neste traba-lho foi utilizado o soro permeado com comple-mentação no meio, com a seguinte composição de nutrientes em g/L: 3 KH2PO4, 7 K2HPO4, 1
MgSO4, 4 extrato de levedura, 1 (NH4)2SO4, e 0,5
de extrato de carne
O consórcio microbiano foi proveniente de um reator UASB, fornecido pela Cooperativa A-gropecuária LTDA de Uberlândia – CALU (Uber-lândia, MG).
Ensaios de Fermentação escura
O processo fermentativo foi conduzido em batelada, em frasco de penicilina de 100 mL, sen-do o volume reacional de 75 mL e headspace de 25 mL, sendo que o volume de inóculo utilizado foi de 1,2 mL e a concentração de lactose de 30 g/L, a temperatura ambiente. O pH inicial foi ajus-tado para 6 com NaOH (1M) e nitrogênio foi insu-flado ao frasco para garantir a condição de anae-robiose do meio. Uma seringa foi adaptada ao frasco para que o biogás produzido fosse libera-do, conforme mostrado na Figura 1
Figura 1 – Fermentação batelada anaeróbica escura. Substrato: soro de leite permeado.
A partir do terceiro dia, amostras do meio foram coletadas para a determinação de açúcares redutores totais (ART) e para a contagem de célu-las viáveis, de modo a se obter as curvas de con-sumo do substrato e de crescimento celular. A evolução do processo de fermentação escura foi acompanhada até a depleção do substrato. Os ensaios foram realizados em replicatas.
A medida de açúcares redutores totais (ART) foi determinada pelo método colorimétrico de DNS (Miller, 1959).
Viabilidade Celular
Para a contagem de células viáveis foi ado-tado a técnica de pour plate. Nessa técnica, o crescimento celular é realizado em plaqueamento, sendo que a inoculação do ágar é feita antes da sua solidificação. O meio anaeróbico foi garantido preparando-se o meio com tioglicolato de sódio em um dessecador contendo uma vela acesa (Karakashev et al., 2003, Vinderola e Reinheimer, 1999, Malik, 1992).
Procedimento: Inicialmente, para a prepa-ração do meio de cultura utilizou-se: ágar bacte-riológico (15g/L); tioglicolato de sódio (30g/L), sendo que a solução usada na diluição seriada do inóculo foi constituída de cloreto de sódio 8,5g/L.
O meio de cultura, as placas de Petri e os tubos de ensaio contendo 9 mL de solução salina, foram autoclavados a 121°C por 20 min. O meio de cultura autoclavado foi colocado em um banho termostatizado a 45°C.
Para as diluições, 1 mL de inóculo foi trans-ferido para um tubo de ensaio contendo 9 mL da solução salina, obtendo uma diluição 1:10. Após homogeneização retirou-se 1 mL desse tudo e colocou em outro tubo contendo a solução salina obtendo assim uma diluição 1:100, esse procedi-mento foi realizado até se obter uma diluição 1:1012.
O volume correspondente a 1 mL de cada tudo de ensaio, das seguintes diluições 102, 104,
106, 108, 1010, 1012, foi transferido para as placas de Petri. Em seguida, adicionou-se o meio de cul-tura realizando um movimento em oito para ho-mogeneização da amostra. Após o resfriamento as placas foram colocadas invertidas em um des-secador contendo uma vela acesa para dar con-dição anaeróbica ao ambiente. O dessecador foi colocado em uma estufa a 37°C. Inicialmente, a contagem foi realizada após o período de incuba-ção de cerca de 48 horas.
No entanto, adotando a metodologia descri-ta acima, com o período de incubação por apenas 2 dias, não se observou crescimento de colônias. Portanto, o meio para contagem de células viáveis usado para avaliação da cinética de crescimento celular durante o processo de fermentação em batelada, foi enriquecido com triptona (10g/L) e extrato de levedura (5g/L) e o período de incuba-ção foi ampliado para 5 dias (120 h).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A literatura nos mostra que além do monito-ramento do teor de substrato, pH e temperatura, a manutenção de elevada viabilidade dos microrga-nismos utilizados deve ser garantida para que condições ótimas de processo sejam verificadas na síntese do produto-alvo, o hidrogênio (Antoni-ne 2004). É (Antoni-neste contexto que a técnica de pourplate se destaca para a avaliação da viabilidade
celular.
É importante se salientar que esta metodo-logia pode ser empregada com os mais diversifi-cados objetivos, como a identificação de contami-nação microbiana em fermentações alcoólicas (Antonine, 2004) e na determinação de viabilidade de celular de probióticos (Hungria e Longo, 2009). Considerando o potencial desta técnica, pode-se avaliar a viabilidade do lodo oriundo de um reator UASB para a produção de hidrogênio através do monitoramento de colônias viáveis como descrito a seguir.
Na Figura 1 observam-se as colônias de bactérias do consórcio microbiano utilizado como inóculo.
Figura 1: Imagem da colônia de bactérias do consórcio microbiano proveniente do reator UASB. Microscopia ótica: 1000X.
O primeiro ensaio de fermentação indicou que o meio de cultura para contagem de células viáveis não foi adequado para o crescimento das bactérias durante a incubação de 2 dias.
Após o enriquecimento do meio com tripto-na (10g/L) e extrato de levedura (5g/L) e aumento do período de incubação para 5 dias, foi possível a contagem de células. O composto antifúngico (Nystatina) foi adicionado ao meio para se evitar o crescimento de fungos.
A necessidade para a alteração do tempo de incubação e da composição do meio de cultura pode ser justificada pelo uso de uma cultura mista de microrganismos como agentes da fermenta-ção, pois o consórcio microbiano pode exigir um período maior de adaptação ao meio e há a com-petição dos microrganismos pelo substrato.
Após a adaptação da metodologia para a análise microbiológica, foi possível a contagem das células.
Os resultados de consumo de substrato, apresentado como concentração de açúcares redutores totais (ART) (g/L) e de crescimento ce-lular (UFC/mL) são apresentados na Figura 2 e na Tabela 1, respectivamente.
Figura 2: Dados da cinética de crescimento celular e consumo de substrato durante a fer-mentação escura. Concentração inicial de lac-tose: 30 g/L).
Tempo(h) Célula (UFC*/mL) ART**(g/L)
0 3,00·1011 30,84 72 4,70·1015 26,82 120 9,00·1015 16,47 168 5,00·1012 13,76 240 3,00·1012 7,47 288 1,09·1012 6,46 336 3,00·1012 5,40
*UFC: unidade formadora de colônia **ART: açúcares redutores totais
Tabela 1: Dados da cinética de crescimento celular e consumo de substrato durante a fer-mentação escura. Concentração inicial de lac-tose: 30 g/L)
Pela análise da Figura 2, verifica-se que após o 8º dia de experimento, o crescimento celu-lar se encontra na fase estacionária, sendo que o número de células permanece constante em, a-proximadamente, 3,00·1018 UFC/mL.
Pode-se observar pela Tabela 1 que o con-centração de ART sofreu um decréscimo de 31 g/L para 5,40 g/L, enquanto o número de células sofreu um aumento de 107 vezes, em 168h de fermentação. Tal comportamento revela que as células oriundas do lodo do reator UASB encon-tram-se viáveis metabolicamente, uma vez que apresentam plena capacidade de proliferação, e, portanto estão aptas a ser empregada em biopro-cessos dedicados a produção de H2.
CONCLUSÃO
Através deste trabalho foi possível se verifi-car a necessidade de adaptação do meio de cul-tura para realizar a análise microbiológica, a
fer-mentação escura em batelada por um consórcio microbiano. O aumento do tempo de incubação e o enriquecimento com triptona e extrato de leve-dura foram primordiais para a contagem de célu-las viáveis.
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AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Universidade Federal de Uberlândia e a Faculdade de Engenharia Química pela oportunidade em realizar este trabalho, a Sooro Concentrado Indústria de Produtos Lácteos Ltda e também a Cooperativa Agropecuária LTDA de Uberlândia – CALU (MG). Por fim, agradecem ao apoio financeiro da FAPEMIG, da Vale S.A., do CNPq e da CAPES.
