Lorenna Carvalho da Rosa
Estudo da cinética do fármaco antimalárico primaquina em ratas grávidas e não grávi-das
Rio de Janeiro 2016
Lorenna Carvalho da Rosa
Estudo da cinética do fármaco antimalárico primaquina em ratas grávidas e não grávi-das
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Saúde Pública, da Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, na Fundação Oswaldo Cruz, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde Pública. Área de concentração: Abordagem Ecológica de Doenças Transmissíveis.
Orientador: Prof. Dr. Francisco José Roma Paumgartten. Coorientador: Prof. Dr. Davyson de Lima Moreira.
Rio de Janeiro 2016
Catalogação na fonte Fundação Oswaldo Cruz
Instituto de Comunicação e Informação Científica e Tecnológica Biblioteca de Saúde Pública
R788e Rosa, Lorenna Carvalho da
Estudo da cinética do fármaco antimalárico primaquina em ratas grávidas e não grávidas. / Lorenna Carvalho da Rosa. -- 2016.
56 f. : tab. ; graf.
Orientador: Francisco José Roma Paumgartten. Coorientador: Davyson de Lima Moreira.
Dissertação (Mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz, Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, Rio de Janeiro, 2016.
1. Gravidez. 2. Farmacocinética. 3. Primaquina – uso terapêutico. 4. Ratos Wistar. 5. Placenta - metabolismo. 6. Antimaláricos - farmacologia. I. Título.
CDD – 22.ed. – 616.9362 Número de classificação
do assunto principal. Solicitar na biblioteca
Lorenna Carvalho da Rosa
Estudo da cinética do fármaco antimalárico primaquina em ratas grávidas e não grávi-das
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Saúde Pública, da Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, na Fundação Oswaldo Cruz, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde Pública. Área de concentração:
Abordagem Ecológica de
Doenças|Transmissíveis.
Aprovada em: 14 de junho de 2016.
Banca Examinadora
Prof. a Dra Isabella Fernandes Delgado
Fundação Oswaldo Cruz – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Prof. a Dra. Ana Cecilia Amado Xavier de Oliveira
Fundação Oswaldo Cruz – Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca
Prof. Dr. Davyson de Lima Moreira (Coorientador) Fundação Oswaldo Cruz – Instituto de Tecnologia em Fármacos
Prof. Dr. Francisco José de Roma Paumgartten (Orientador)
Fundação Oswaldo Cruz – Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca
Rio de Janeiro 2016
Este trabalho é dedicado à minha família, minha mãe Luciene Rosa, meu irmão Marcelo Rosa, meu noivo Carlos Henrique Junior e minha vó Jonilda Lopes.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me concedido saúde por toda a vida, por ter per-mitido que eu realizasse esse trabalho, mas peço a Ele que me dê sabedoria para continuar a aprender e conquistar muito mais.
Agradeço a minha mãe, Luciene Carvalho da Rosa por todo apoio, incentivo e força nos momentos mais difíceis. Sem seus sacrifícios, dedicação e carinho eu não teria conseguido chegar até aqui. Minha mãe é a grande razão do meu incentivo. Agradeço ainda mais por ser minha melhor amiga.
Agradeço ao meu irmão, Marcelo Carvalho da Rosa, por ser tão especial e carinhoso. Vo-cê é meu grande e verdadeiro incentivo.
Agradeço a minha vó, Jonilda Lopes Fernandes, por todo cuidado e paciência.
Agradeço ao meu noivo, Carlos Henrique Pereira Junior por todo amor, apoio, dedicação e carinho. Agradeço também por fazer meus dias melhores e por ser, acima de tudo, meu amigo.
Agradeço ao meu professor e orientador, Francisco José Roma Paumgartten, por todo apoio e confiança. Agradeço também por todo aprendizado.
Agradeço a Dra. Ana Cecília Amado Xavier de Oliveira, por ter me aberto às portas do laboratório, por toda ajuda e paciência.
Agradeço a minha grande amiga e companheira, Monica Regina Siqueira. Obrigada por estar ao meu lado todo esse tempo, por dividir comigo as angústias, por ter sido minha incen-tivadora nos momentos mais difíceis. Obrigada por sua amizade. Esse foi um dos meus maio-res pmaio-resentes durante o meu mestrado.
Agradeço a Thais Rolim, e ao Dr. Davyson de Lima Moreira, por terem participado ati-vamente do desenvolvimento deste trabalho, agradeço a confiança, agradeço por todo o tempo que se dedicaram e ao grande esforço para que obtivéssemos o sucesso.
Agradeço a Natalia Rosestolato, minha estágiaria (sem bolsa), que usou a vontade de aprender para se dedicar a este trabalho. Agradeço por todo cuidado e paciência. Agradeço também pelos momentos de risos mesmo chegando às 6h da manhã.
Agradeço a Isabella Fernandes Delgado, Igor Barbosa da Silva e Marco Eduardo do Nas-cimento Rocha por terem aceitado participar da minha banca.
Agradeço a toda equipe do laboratório de Toxicologia Ambiental.
A Rosângela de Carvalho, por sempre estar disposta a me ajudar e por todos os artigos que me enviou durante esse período, eles me salvaram quando mais precisei.
Agradeço ao Sr. Ivan, por toda ajuda com animais, e também pelos momentos de descon-tração.
Ao Ótavio e ao Ónesimo, por toda ajuda, vocês sempre foram muito solícitos.
Agradeço a Hellen Leal, por ter me auxiliado nos meus experimentos, pela sua amizade, e pelos nossos momentos de descontração dentro e fora da Fiocruz.
Agradeço a Deise Coelho e a Carolina Mourse, por terem me ajudado a estudar quando decidi fazer a prova do mestrado.
Agradeço a Maria Regina Carneiro, que sempre esteve disposta a me ajudar.
Agradeço a Ana Paula do Carmo, que teve o cuidado de me repassar todo seu material de estudo. Que sempre se disponibilizou em tirar minhas dúvidas.
Agradeço a minha amiga Carla Melo, por me incentivar quando decidi tentar o mestrado, por estar comigo nos momentos mais difíceis da minha vida, por ser minha companheira e parceira de vida.
Agradeço ao meu amigo, Pedro Marques, por me apoiar e me ajudar sempre.
Agradeço às minhas amigas de faculdade Michelle Matos, Ana Carolina Farias e Tainã Vieira. Estaremos sempre perto umas das outras.
Agradeço às minhas tias Therezinha Rosa e Liliane Carvalho, vocês são minhas queridas, minhas incentivadoras.
Agradeço à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pe-la concessão da bolsa durante todo o período de realização do Mestrado.
Por fim, gostaria de agradecer a todos que contribuíram direta ou indiretamente para que esse trabalho fosse realizado.
Para ser feliz Confia em Deus. Aceita a vontade do senhor no dever de cada dia. Não fujas da simplicidade. Conserve a mente interessada no trabalho. Detenha-se apenas no “lado bom” das pessoas. Guarde seu coração sempre sem ressentimentos. Crie esperança e otimismo onde estiveres. Reflita sobre as necessidades alheias, buscando sempre suprimi-las e atenuá-las. Fazei todo o bem que puderes em favor dos outros, sem pedir nada em troca. Ajude muito, espere pouco e sirva sempre. Espalhe felicidade sempre que possível. Assim, adquiriremos a luminosa ciência de ser feliz.
RESUMO
O conhecimento da cinética do medicamento é essencial para o seu uso com seguro na te-rapêutica. Nas últimas quatro décadas, vários estudos demonstraram que infecções e proces-sos inflamatórios podem alterar o metabolismo modificando o seu intervalo eficaz e seguro. Isto é particularmente verdadeiro para medicamentos cujas doses tóxicas não estão distantes daquelas mínimas doses necessárias para o efeito terapêutico. A primaquina (PQ) é um medi-camento antimalárico com propriedades terapêuticas únicas atuando tanto nos parasitas da fase hepática quanto em gametócitos. Todavia, tem sido relatado que a PQ causa anemia he-molítica e hemólise intravascular em indivíduos predispostos com deficiência genética de glicose-6-fosfato desidrogenase, um grave efeito adverso. Em virtude esta preocupação de segurança e receios de uma possível hemólise na mãe e feto, a PQ e as 8-aminoquinolinas via de regra não são usadas na gravidez. A segurança da PQ em animais durante a gravidez , en-tretanto, não foi investigada. Um estudo prévio de Do-Carmo (2015) encontrou que níveis plasmáticos de PQ, após uma única dose oral administrada a camundongos grávidas eram inferiors aqueles medidos para a mesma dose dada a fêmeas não-grávidas. O objetivo deste estudo foi investigar a cinética da PQ em ratas grávidas e se ela é transferida via placenta do compartimento materno para o fetal. Ratas grávidas e não-grávidas foram tratadas com pri-maquina 40 mg / kg peso corporal pr entubação gástrica e amostras de sangue foram coletadas a diferentes intervalos após o tratamento. As concentrações plasmáticas de PQ foram determi-nadas por método de HPLC-DAD-UV validado por Do-Carmo (2015). Para investigar a pas-sagem transplacentária, cesareana foram efetuadas no dia 21 de gravidez e amostras de sangue materno e fetal foram coletadas. Os resultados mostraram que a concentração plasmática da PQ nas grávidas era inferior as medidas em fêmeas não grávidas tratadas com a mesma dose do fármaco. Os dados também indicaram que a concentração de PQ no sangue fetal eram aproximadamente ½ or 0.5 a concentração medida no plasma materno. Em conclusão, a ciné-tica da PQ é alterada na gravidez de ratos, uma moficação que pode ser devida a alterações da absorção, distribuição (volume distribuição), e/ou depuração do medicamento na gravidez à termo. Estes resultados sugerem que, se a PQ for eventualmente usada na gravidez, um ajuste de doses pode ser necessário.
Palavras-chave: Gravidez. Farmacocinética. Primaquina (PQ). Ratas Wistar. Passagem trans-placentária. CLAE-DAD.
ABSTRACT
Knowledge on the drug kinetics is essential for its safe use in therapeutics. In the last four decades, several studies demonstrated that infections and inflammatory processes may even-tually alter drug metabolism thereby changing its effective and safe dose range. This holds particularly true for drugs the toxic doses of which are not far from the lowest doses required for a therapeutic effect. Primaquine (PQ) is an antimalarial drug with unique therapeutic properties acting both on the liver phase parasites and on gametocytes. PQ, however, has been reported to cause hemolytic anemia and intravascular hemolysis in predisposed individ-uals bearing a genetic deficiency of glucose-6-phosphate dehydrogenase, however, is a severe adverse effect. Owing to this safety concern, and fears of a possible drug-caused hemolysis in the mother and/or fetus, PQ and related 8-aminoquinolines are as a rule not used during preg-nancy. Safety of PQ in pregnant animals, however, has not investigated. A previous study by Do-Carmo (2015) found that PQ plasma levels, after administering a single oral dose to preg-nant mice were lower than those measured for the same dose in non-pregpreg-nant females The objective of this study was to extend these preliminary findings in mice and to investigate in PQ kinetics in pregnant rats and whether it is transferred via the placenta from the maternal to the embryo-fetal compartment. Pregnant and non-pregnant rats were treated with 40 mg / kg bw PQ by gavage and blood samples were collected at different time intervals after dosing. PQ plasma concentration was determined by a HPLC-DAD-UV method developed and vali-dated by Carmo (2015). To investigate the transplacental transfer of PQ, caesarean sections were performed on day 21 of gestation (GD 21) and maternal and fetal blood samples were obtained. Results showed that PQ plasma concentration in pregnant rats were lower than the PQ plasma levels measured in non-pregnant females treated with the same dose. Data also showed that PQ concentration in the fetal blood plasma was nearly ½ or 0.5 the plasma con-centration in the mother plasma. In conclusion, PQ kinetics is altered during rat pregnancy, a change that may be due to alterations of drug absorption, distribution (volume of distribution) and / or clearance at the term pregnancy. These results indicated that, if PQ is eventually used during pregnancy a dose-adjustment may be required.
Keywords: Pregnancy. Pharmacokinetics. Primaquine (PQ). Wistar rats. Passage Transplacen-tal. HPLC-DAD.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Fórmula estrutural da Primaquina... 16 Figura 2 - Diagrama ilustrando a passagem transplacentária e cinética no
compartimento embrio-fetal... 22 Esquema 1 - Etapas do tratamento de fêmeas de rato não grávidas... 29 Esquema 2 - Etapas cruzamento das ratas Wistar... 30 Esquema 3 - Gráfico 1 - Gráfico 2 - Gráfico 3 - Gráfico 4 - Gráfico 5 -
Etapas do tratamento de fêmeas de ratas grávidas... Curva da concentração plasmática (ng/mL ±EPM) da PQ versus tempo após o tratamento de ratas Wistar não grávidas com a dose oral de 40 mg/kg... Curva da concentração plasmática (ng/mL; Média±EPM) da PQ
versus tempo após o tratamento de ratas Wistar grávidas (GD 21)
com a dose oral de 40 mg/kg... Curva da concentração plasmática (ng/mL; média±EPM) da PQ versus tempo após o tratamento de ratas Wistar (grávidas / GD21 e não grávidas) com a dose oral de 40 mg/kg... AUC30-180 da concentração plasmática de PQ após administração de uma única dose do fármaco (40 mg/kg) por via oral (entubação gástrica) a ratas grávidas e não grávidas... Razão entre a concentração plasmática da PQ no sangue dos fetos e a concentração plasmática da PQ no sangue das mães (sangue retirado por ocasião da cesárea)...
31 36 38 40 42 44
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resumo de tratamento dos animais... 32 Tabela 2 - Parâmetros cromatográficos utilizados para a determinação de
primaquina em plasma... 33 Tabela 3 - Experimento preliminar... 35 Tabela 4 - Concentrações da PQ em diferentes intervalos de tempo após o
tratamento oral de ratas Wistar não grávidas... 37 Tabela 5 -
Tabela 6 -
Tabela 7 -
Tabela 8 -
Concentração plasmática PQ das ratas Wistar grávidas tratadas PQ por via oral... Concentrações plasmáticas PQ em diferentes intervalos de tempo após a administração oral de ratas grávidas e não grávidas... AUC30-180s individuais calculada para ratas grávidas (GD 21) e não grávidas... Concentrações plasmáticas de PQ (ng/mL, média ± EPM) no sangue materno e no pool de fetos no momento da cesárea de fêmeas de rato grávidas...
39
41
43
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
8-AQ 8-aminoquinolina
ADME Processos farmacocinéticos: Absorção, Distribuição, Metabolização e Eliminação
CECAL Centro de Criação de Animais de Laboratório CEUA Comitê de Ética em no Uso de Animais CL
CLAE
Cromatografia em Fase líquida
Cromatografia em Fase Líquida de Alta Eficiência CMáx Cl CV % CYP CPQ DAD ENSP EP FIOCRUZ GD 21 G6PD HPLC IV PBS PQ RCF SNC t(1/2) Tmáx UV Vd V.O. Concentração máxima Clearance
Coeficiente de variação percentual Citocromo
Carboxiprimaquina
Detector por arranjo de diodos, do inglês Diodo Array Detector Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca
Erro padrão
Fundação Oswaldo Cruz
Ratas no vigésimo primeiro dia de gestação glicose-6-fosfato desidrogenase
Cromatografia Líquida de Alta Performance, do inglês High
Performance Liquid Chromatograpy
Intravenosa Salina tamponada Primaquina
Força centrífuga relativa Sistema Nervoso Central
Tempo de meia vida de eliminação
Tempo para atingir a concentração máxima Ultravioleta
Volume de distribuição Via Oral
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 14 2 JUSTIFICATIVA... 23 3 OBJETIVOS... 25 4 MATERIAL E MÉTODOS... 26 4.1 ANIMAIS... 27 4.2 PRIMAQUINA... 27
4.3 TRATAMENTO DOS ANIMAIS... 27
4.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E TRATAMENTO... 28
4.4.1 Experimentos preliminares para seleção da dose e da via de administração da primaquina... 28
4.4.1.1 Tratamento por via oral (entubação gástrica)... 28
4.4.1.2 Tratamento por via intravenosa (veia da cauda)... 28
4.4.2 Experimento... 29
4.4.2.1 Ratas não grávidas... 29
4.4.2.1.1 Tratamento... 29
4.4.2.2 Ratas grávidas... 30
4.4.2.2.1 Acasalamento... 30
4.4.2.2.2 Acompanhamento da gestação... 30
4.4.2.2.3 Tratamento... 31
4.5 ANÁLISE DA PRIMAQUINA NO PLASMA DE RATAS WISTAR... 32
4.6 TRATAMENTO ESTATÍSTICO... 33
5 RESULTADOS... 34
5.1 RESULTADOS DOS ESTUDOS PRELIMINARES PARA SELEÇÃO DE DOSE E VIA DE ADMINISTRAÇÃO... 34
5.1.1 Administração por via oral (entubaçao gástrica)... 34
5.1.2 Administração por via intravenosa... 34
5.2 RESULTADOS DOS ESTUDOS PRINCIPAIS... 35
5.2.1 Cinética da primaquina em ratas não grávidas... 35
5.2.2 Cinética da primaquina em ratas grávidas... 37
5.2.3 Farmacocinética da primaquina: diferenças entre ratas grávidas e não grávidas... 39
5.2.3.1 AUC de ratas grávidas e não grávidas... 40
5.2.4 Passagem transplacentária da primaquina... 43
6 DISCUSSÃO... 46
7 CONCLUSÃO ... 51
14
1 INTRODUÇÂO
Farmacocinética
Farmacocinética é a ciência médica que estuda os aspectos que ocorrem com o fármaco durante a sua trajetória no organismo, desde o momento em que administrado até a sua eliminação. É a ciência que estuda as relações entre o movimento do fármaco no organismo e os processos que o afetam. Descreve o movimento temporal do fármaco desde a sua entrada no organismo até o momento que é eliminado. Esta passagem envolve a absorção (entrada no organismo ou passagem para a circulação sistêmica), a distribuição entre órgãos e tecidos, a metabolização ou biotransformação e a eliminação, etapas que conjuntamente são indicadas pelo acrônimo ADME. Conhecer a farmacocinética é essencial para o desenvolvimento de medicamentos eficazes e seguros. Tanto os efeitos adversos quanto à ação terapêutica (efetividade) dependem da concentração que o fármaco atinge nos locais de ação nível este que por sua vez, tem relação com a concentração plasmática (i.e., a concentração no compartimento central). A metabolização e, portanto, a eliminação de fármacos pode ser alterada de forma significativa durante processos inflamatórios e infecciosos. Adaptações fisiológicas e metabólicas do organismo durante a gravidez (e.g., ganho de peso, alterações de volemia e débito cardíaco, modificações hormonais entre outras) também podem influenciar de forma marcante na absorção, na distribuição, na metabolização e na eliminação de fármacos. Todas essas alterações farmacocinéticas podem ter impacto sobre os níveis da substância nos tecidos alvo e modificar as doses nominais que são eficazes e seguras do ponto vista terapêutico. Conhecer os efeitos dos processos inflamatórios e infecciosos e da gravidez sobre a farmacocinética é particularmente importante para o caso dos fármacos que apresentam intervalo terapêutico estreito, ou seja, aqueles para as quais os efeitos adversos aparecem em doses próximas às doses em que ocorrem os efeitos terapêuticos (RANG HP, 2007).
Como comentamos, os processos de absorção, distribuição, metabolização ou biotransformação e eliminação (Clearance) determinam a concentração plasmática da droga. A depuração ou “Clearance” (CL) de um fármaco, por outro lado, é definida como o volume que é inteiramente depurado da substância na unidade de tempo, ou o volume (virtual) do qual todo o fármaco seria removido em determinada unidade de tempo.
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constante da taxa de eliminação (kel), que representa a fração do fármaco eliminada na unidade de tempo, por exemplo, depende do Clearance (CL) e do Volume distribuição (Vd), e esta relação é expressa pela equação que se segue:
kel = Cl / Vd Ou seja, Cl = kel x Vd
Outro parâmetro farmacocinético importante é a meia-vida (t1/2) de eliminação, ou o tempo necessário para a concentração do fármaco no plasma cair pela metade. A t1/2 é inversamente relacionada à kel, ou seja, t1/2 = 0.693 / kel, ou ainda t1/2 = 0.693 (Vd/Cl).
Durante a gravidez ocorrem alterações fisiológicas que podem influenciar a cinética de fármacos (DAWES; CHOWIENCZYK, 2001), inclusive dos antimaláricos (WILBY; ENSOM, 2011). Há registros na literatura que durante a gravidez alguns fármacos sofrem alterações no volume de distribuição e alterações no clearance, podendo resultar em modificação na concentração plasmática do fármaco. Alterações na atividade de algumas enzimas hepáticas importantes para o processo de biotransformação têm sido descritas durante a gravidez, podendo exigir ajustes na dose administrada. As enzimas do citocromo P450 (CYP3A4, CYP2D6, CYP2A6, CYP2C9 e CYP2D6) e também enzimas de conjugação, como as uridina 5’-difosfato-glicuronosiltransferase (UGTs) são conhecidamente alterados durante a gravidez (PAVEK; CECKOVA; STAUD, 2009).
Primaquina
A primaquina (PQ) é uma 8-aminoquinolina (8-AQ) desenvolvida em 1925. Antimaláricos do tipo 8-aminoquinolina apresentam propriedades terapêuticas ímpares, diferentemente de vários outros medicamentos utilizados para combater a malária, pois age de forma eficaz e possui ação gametocida. Estudos experimentais demonstraram que a PQ atua nos gametócitos maduros reduzindo a infectividade pelo P. falciparum (RIECKMANN et al., 1968; RIECKMANN et al., 1969). A PQ atua, também, sobre os gametócitos maduros de todas as espécies de plasmódios, até mesmo sobre as cepas multirresistentes de P. falciparum(VALE; MOREIRA; GOMES, 2009), atua sobre as formas dos hipnozoítas quiescentes de P. vivax e de P. ovale (ASHLEY; RECHT; WHITE, 2014). Qualquer estratégia para a erradicação da malária provavelmente precisará incorporar a utilização de uma 8-AQ, a PQ é a única 8-AQ aprovada clinicamente, e é atualmente usada para o tratamento de reincidentes (NANAYAKKARA et al., 2014).
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Dessa forma, a PQ é um fármaco que possibilita a cura radical de infecções por P.
ovale e P. vivax, além de ser profilática quanto ao aparecimento da fase eritrocítica destas
infecções.
Em resumo, a PQ é muito importante para as seguintes conjunturas: Prevenção inicial contra todas as espécies de malária;
Prevenção para recidivas de pessoas extensivamente expostas ao P. vivax ou ao P. ovale; Cura radical em indivíduos infectados com P. vivax ou P. ovale.
Todavia, a PQ tem fraca atividade contra as formas assexuadas do estágio eritrocítico da infecção por P. falciparum. Ainda assim, a PQ foi testada com sucesso na segunda guerra mundial e Elderfield e colaboradores em 1946 consideraram esse fármaco um grande avanço (ELDERFIELD et al., 1946). A estrutura química da primaquina está representada na Figura 1.
Figura 1 - Fórmula estrutural da Primaquina
Fonte: Do Carmo, 2015
A PQ pode acarretar o desencadeamento de hemólise intravascular em indivíduos predispostos com deficiência genética de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), ou seja, a PQ é capaz de causar anemia hemolítica e metahemoglobinemia (síndrome causada pelo acúmulo de metahemoglobina no sangue, que ocorre quando o Fe+2 da hemoglobina é oxidado a Fe+3, estado de oxidação em que o Fe é incapaz de carrear o oxigênio), especialmente nestes indivíduos com deficiência genética G6PD (ASHLEY et al., 2014).
Em atenção ao receio de desencadear hemólise intravascular na mãe e no feto, a PQ e as 8-aminoquinolinas são antimaláricos na maioria das vezes evitados na gravidez (CLYDE, 1981; NOSTEN et al., 2006). São escassas as informações sobre a cinética e os efeitos adversos da PQ na gravidez, o que limita avaliações de segurança desses fármacos em termos da profilaxia ou tratamento de mulheres em idade reprodutiva residentes em áreas endêmicas.
Como mencionado anteriormente, a PQ atua na fase gametocítica das infecções por malária, o que reduz a infectividade resultando em diminuição da transmissão da doença,
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com menor incidência de novas infecções na comunidade. Por esse motivo, sabe-se o quão é importante conhecer a cinética da PQ, fármaco de atuação eficiente nesta fase da infecção (WHITE et al., 2012).
Mihaly e colaboradores (1985) estudaram a farmacocinética da PQ em homens caucasianos saudáveis. Conforme os autores, o principal metabólito da PQ é a carboxiprimaquina. Os autores viram também que a PQ é rapidamente absorvida nas doses de 15 a 45 mg e que as baixas concentrações plasmáticas da PQ se dão por conta da ampla e rápida distribuição do fármaco nos tecidos (MIHALY et al., 1985; MIHALY et al., 1984).
Além das notáveis propriedades antimaláricas, a PQ e outras 8-aminoquinolinas são eficazes para o tratamento de outras doenças infecciosas negligenciadas como a pneumonia causada pelo Pneumocystis carinii e também a doença de Chagas. Outros antimaláricos do tipo 8-aminoquinolinas estão em desenvolvimento na busca de medicamentos que compartilhem os efeitos curativos ímpares da PQ sem apresentar os seus inconvenientes em termos de toxicidade (VALE et al., 2009).
Mecanismo de ação da PQ
Acredita-se que a atividade da PQ seja atribuída à interferência na estrutura do DNA do parasita, impedindo a replicação do material genético, permeando a droga aos pares de bases (FERREIRA; GOMES MDO; VIEIRA, 2011; VALE et al., 2009). Outra rota de ação possível seria a ação na produção de metabólitos altamente reativos, gerando espécies oxidativas intracelulares (espécies reativas de oxigênio), ou mesmo, na interferência da ubiquinona no transporte de elétrons da cadeia respiratória mitocondrial. Apesar disso, não há nenhuma informação contundente mostrando se a atividade antimalárica da PQ é mediada por seus metabólitos ou apenas devido a ação direta do fármaco (FERREIRA et al., 2011; VALE et al., 2009).
Estudos dos efeitos da PQ sobre a estrutura de modelos de membranas de lipídeos sugerem que, a interação não especifica da PQ com membranas biológicas podem exercer papel admirável e simular uma rota adicional no modo de ação, ou estar envolvida com seus efeitos adversos. Mesmo sabendo dos diversos efeitos biológicos causados pela PQ a compreensão do mecanismo de ação ainda é desconhecida (BASSO et al., 2011).
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Farmacocinética da Primaquina
A Primaquina é metabolizada pela CYP1A2, CYP3A4 (CONSTANTINO et al., 1999; LI et al., 2003) e CYP2D6. A farmacocinética da PQ não é bem compreendida, mas sabe-se que é rapidamente metabolizada, com uma meia-vida (½) de seis horas em humanos (WHITE, N. J., 1992).
A PQ é administrada apenas por via oral, pois, causa hipotensão. É rapidamente absorvida no trato gastrointestinal e concentra-se no cérebro, coração, fígado, pulmões e músculo esquelético. A concentração no plasma atinge os maiores índices entre 1-3h, com meia-vida de 4-9h. A PQ é rapidamente eliminada pela urina, sendo que uma menor fração é eliminada em sua forma original. É extensamente transformada em seu metabólito ativo, a carboxiprimaquina (CPQ), que é eliminada muito mais lentamente (meia-vida de 22-30h) e que pode se acumular em caso de dosagem crônica. Seu metabolismo é complexo e pouco compreendido (BAIRD; HOFFMAN, 2004; LAURENCE L. BRUNTON, 2012; OLSON, 2013).
Em estudos desenvolvidos por Chau Vuonga e colaboradores (2015) em humanos e camundongos, ficou demonstrado que atividade antimalárica do estagio hepático da doença requer a ativação metabólica pela CYP da subfamília 2D. os metabólitos hidroxilados gerados pela ação da CYP2D6 são os prováveis responsáveis pela toxicidade sobre o parasito, uma vez que a ciclagem desses metabólitos irá produzir espécies reativas de oxigênio.
Tekwanie e colaboradores (2015) realizaram um estudo para determinar o perfil farmacocinético de PQ e CPQ, o principal metabólito da PQ no plasma. Foi administrado PQ difosfato por via oral 30 min após o almoço, em seis humanos adultos (voluntários), equivalente a 45mg de PQ base. Foram coletadas amostras de sangue em diferentes intervalos de tempo. As concentrações plasmáticas de PQ eram baixas e variáveis e atingiram o pico em torno de 2-4h, variando entre 121ng/mL a 221ng/mL. A CPQ obteve concentrações mais elevadas que variaram de 168ng/mL a 299ng/mL. As concentrações de pico para a CPQ foram observadas com 8h e essas concentrações altas eram sustentadas por até 24h.
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Gravidez
Durante a gravidez ocorrem alterações fisiológicas e imunológicas que interferem na patogênese de doenças e resistência a infecções. A infecção por malária pode representar uma ameaça perigosa para o curso da gravidez (MARTINEZ-ESPINOSA; DANIEL-RIBEIRO; ALECRIM, 2004).
A malária é quase sempre sintomática e afeta pessoas de todas as idades. Na maior parte dos casos, mulheres grávidas acometidas por malária apresentam os sintomas e consequências mais graves da doença, podendo levar ao aborto, morte fetal e nascimento prematuro (MARTINEZ-ESPINOSA et al., 2004).
Em gestantes, a malária pode ocasionar anemia grave, hipoglicemia, edema pulmonar, hemorragia, sepse puerperal, malária cerebral e até mesmo a morte. Em áreas de alta transmissão da malária, os adultos podem adquirir imunidade parcial que é significantemente reduzida em grávidas, sobretudo em primigestas (primíparas) que apresentam anemia mais grave e malária placentária. O sequestro esplênico dos eritrócitos infectados causa deficiência de ácido fólico e anemia microcítica. Em gestantes, o sequestro adicional de eritrócitos pela placenta agrava significativamente o quadro de anemia associado à infecção (ROGERSON et al., 2007).
Estudos sobre gravidez relatam que há uma redução da motilidade (capacidade de realizar movimentos autônomos) do estômago e do intestino, de modo que o esvaziamento gástrico e tempo de passagem intestinal podem ser aumentados de 30-50%. Apesar destas alterações, a absorção do fármaco não parece ser significativamente alterada durante a gravidez, com algumas exceções. O débito cardíaco aumenta na gravidez aproximadamente 30%. Há também aumento do volume de plasma em cerca de 50%. Essas mudanças atingem um máximo de 30-34 semanas. O Total de água aumentada corpo é de aproximadamente 8L, sendo que a maior parte desta água é extracelular (MORGAN, 1997).
Wilby e colaboradores (2011), revendo os estudos sobre a farmacocinética de antimaláricos na gravidez, evidenciaram que os parâmetros farmacocinéticos da maioria dos antimaláricos propostos em diretrizes clínicas estão frequentemente alterados na gravidez. Deste modo, tratamentos considerados de primeira linha, com medicamentos à base de artemisinina, e outros como a cloroquina, lumefantrina e pirimetamina / sulfadoxina, podem, em virtude das alterações cinéticas, apresentar eficácia terapêutica comprometida e/ou segurança alterada (WILBY; ENSOM, 2011). A prevalência da malária
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causada pelo P. falciparum em áreas endêmicas é maior entre as mulheres grávidas do que em outros grupos (BRABIN, 1983; MCGREGOR, 1984; MENENDEZ, 1995).
Passagem transplacentária de fármacos
Grande parte dos fármacos atravessa a barreira placentária. Alguns fatores influenciam nesta transferência e também no efeito dos fármacos sobre o feto, com destaque para: propriedades físico-químicas do fármaco, características de permeabilidade da placenta e tempo da disponibilidade do fármaco na circulação materna (BERTRAM G. KATZUNG, 2014; REYNOLDS; KNOTT, 1989; RURAK; WRIGHT; AXELSON, 1991)
A passagem dos fármacos através das barreiras celulares
Na placenta existem junções entre as células e o endotélio, que está envolto por uma camada impermeável de células periendoteliais (LAURENCE L. BRUNTON, 2012). Essas características têm consequências importantes para a distribuição de fármacos. As moléculas pequenas atravessam as membranas celulares de quatro maneiras principais: Lipossolubilidade: é um dos determinantes mais importantes das características farmacocinéticas de um fármaco. A passagem de fármacos depende da lipossolubidade e do grau de ionização, assim como ocorrem com outras membranas biológicas. Substâncias lipofílicas tendem a se difundir rapidamente na placenta, alcançando rapidamente a circulação fetal (LAURENCE L. BRUNTON, 2012).
Peso molecular e pH: O peso molecular do fármaco também influencia a velocidade de transferência e a quantidade do mesmo transferido pela placenta. Considerando que o sangue tem pH 7.4 e que o pH do sangue fetal é 7,3, substâncias que forem bases fracas, com pKa, acima de 7,4, estarão mais ionizadas no compartimento fetal, levando ao aprisionamento iônico e, consequentemente, a maiores concentrações no feto (BERTRAM G. KATZUNG, 2014; LAURENCE L. BRUNTON, 2012).
Transportadores placentários: Uma proteína transmembrana que liga uma ou mais moléculas ou íons, modifica sua conformação e os libera do outro lado da membrana. Esses sistemas podem atuar de forma puramente passiva, sem necessidade de uma fonte de energia; À vista disso, eles apenas facilitam os processos de equilíbrio transmembrana das espécies transportadas na direção do seu gradiente eletroquímico e o mecanismo é então chamado de difusão facilitada. Diante disso o transporte pode ocorrer contra um gradiente eletroquímico sendo chamado de transporte ativo. Estudos já identificaram alguns
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transportadores na placenta, bem como seus efeitos sobre transporte de substância para os fetos (MÁRCIO LEAL HORTA, 2002).
Ligação proteica: a quantidade de ligação de um fármaco depende de alguns fatores, são eles: a concentração do fármaco livre, sua afinidade pelos sítios de ligação e a concentração das proteínas. A forma com que um fármaco se liga às proteínas plasmáticas, afeta a taxa de transferência e a quantidade transferida. No entanto, se uma substância for muito lipossolúvel, sua transferência não será muito afetada pelo grau de ligação às proteínas (CUNHAIII, 2006).
O crescimento do feto depende principalmente de nutrientes fornecidos pela placenta. Sabe-se que a placenta não é um órgão passivo para a transferência materno/fetal de nutrientes. Estudos demonstram que a placenta pode adaptar-se morfologicamente e funcionalmente, otimizando o fornecimento de substratos, determinando a quantidade e proporções relativas dos substratos e também dos metabólicos fornecidos para o feto (SFERRUZZI-PERRI; CAMM, 2016). A placenta auxilia na proteção fetal de substâncias da circulação materna. Ela exerce um papel de barreira semipermeável e tem função de metabolização de algumas substâncias que passam por ela.
A placenta é o órgão que forma a interface materno/fetal e em virtude desta localização desempenha papel importante permitindo ou não a passagem de fármacos da circulação materna para circulação fetal (GANAPATHY, 2011). A figura 2 mostra que os fármacos cruzam a placenta e alcançam o feto pela veia umbilical. Cerca de 40 a 60% do fluxo de sangue venoso umbilical entram no fígado fetal, podendo ser parcialmente metabolizado antes de ganhar a circulação sistêmica fetal (MORGAN, 1997); o restante é desviado do fígado e entra direto na circulação fetal geral. O fármaco que passa pelo fígado se divide entre o rim e o coração. No rim o fármaco pode ser eliminado através da urina para o líquido amniótico, e em parte, segue até o intestino e retorna para o fígado através da veia porta. O fármaco que passa pelo coração pode retornar em parte ao intestino, através da artéria hepática, e em parte retornar para o compartimento materno através da artéria umbilical. O ciclo tem fim quando o fármaco deixa de ser administrado, reduzindo a concentração plasmática a níveis não detectáveis.
Em resumo, no processo de excreção – O feto filtra os fármacos devido ao amadurecimento renal e ao aporte sanguíneo, eliminando-os para o líquido amniótico.
Clearence do líquido amniótico – parte é devolvido ao organismo materno e parte é
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interviloso – Até a supressão do aporte medicamentoso na mãe (MORGAN, 1997).
Figura 2 - Diagrama ilustrando a passagem transplacentária e cinética no compartimento embrio-fetal
Legenda: Processo de eliminação de um fármaco na unidade mãe/ placenta/ feto, adaptado de Drug
disposition in mother and foetus 1997. Mãe (M); placenta (P); artéria umbilical (AU); veia umbilical (VU),
coração fetal (C); rim de fetal (R), intestino fetal ( I ) e fígado fetal (F). O fígado fetal possui três entradas: a veia umbilical, cujo fluxo é parcialmente desviado para o fígado através do ducto venoso (- - - -), a veia porta (VP) e a artéria hepática (AH). A urina excretada pelos rins passa pelo fluido amniótico (FA), que é em seguida ingerido pelo feto.
Fonte: Adaptado de MORGAN, 1997. M F AU VU C R F FA F I F AH F VP F P
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2 JUSTIFICATIVA
Estudo anterior conduzido no Laboratório de Toxicologia Ambiental da ENSP/ FIOCRUZ e que faz parte da Dissertação de Mestrado de Ana Paula Barbosa do Carmo (2015), constatou que, após uma única dose administrada por via oral, os níveis plasmáticos da PQ no sangue de camundongos DBA/2 fêmeas grávidas, eram consistentemente menores do que os níveis encontrados no sangue das fêmeas não-grávidas em todos os intervalos de tempo, pós-tratamento em que amostras de sangue foram coletadas (15, 30, 60 e 90 min). Esses resultados iniciais obtidos por Do Carmo (2015) indicam que a farmacocinética da PQ está alterada de forma expressiva ao final da gravidez e que a fêmea grávida necessitaria de doses mais elevadas para alcançar concentrações plasmáticas equivalentes às determinadas em não grávidas, ou seja, os níveis terapêuticos do fármaco requereriam a administração de doses orais mais altas. Entretanto, a autora não esclareceu o modo pelo qual a gravidez modifica a cinética da PQ, nem investigou a passagem transplacentária deste antimalárico. Entre as hipóteses levantadas por Do Carmo (2015) para os menores níveis de PQ no sangue de camundongos fêmeas grávidas estão as seguintes: 1) possível interferência da gravidez com o tempo de esvaziamento gástrico e absorção da PQ, 2) as marcantes modificações de massa corporal que ocorrem na gravidez aumentariam o volume de distribuição (Vd), diminuindo a concentração da PQ no compartimento intravascular, 3) a indução de enzimas do metabolismo hepático aceleraria o Clearance (CL) da PQ durante a gestação.
Uma das limitações enfrentadas por Do Carmo (2015) para investigar a fundo a influência da gravidez na farmacocinética da PQ foi o fato da pesquisadora ter trabalhado com camundongos. O menor tamanho deste roedor, quando comparado ao de ratos, dificulta a retirada repetida de amostras de sangue de maior volume. Portanto, para avaliar as variações das concentrações plasmáticas da PQ ao longo do tempo, em um mesmo indivíduo (camundongo) seria preciso dispor de métodos analíticos muito mais sensíveis do que o que a autora dispunha. Como frequentemente feito na literatura, Do Carmo (2015) contornou a dificuldade de forma parcial utilizando vários camundongos que foram eutanasiados a cada intervalo de tempo pós-tratamento. Além de requerer o emprego de um número muito maior de animais, esta abordagem tem outros inconvenientes como, por exemplo, o fato de impedir, ou tornar muito imprecisa (ofuscando a variação interindividual já que os cálculos envolvem valores médios de um grupo de camundongos) a determinação de parâmetros farmacocinéticos tais como AUC, Vd e CL. Assim sendo,
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não foi possível coletar amostras repetidas de volume adequado de sangue, com a presteza e constância necessária para construir curvas da variação da concentração plasmática (Cp) da PQ ao longo do tempo para cada camundongo individualmente (amostras repetidas do mesmo animal). Essa impossibilidade se deve ao fato de que o volume de plasma necessário para cada análise é 50 µL, e as análises devem ser feitas em triplicata, o que requer a retirada de 150 µL de plasma (ou aproximadamente 300 µL de sangue total) a cada intervalo de tempo pós-tratamento.
Para prosseguir o trabalho de pesquisa iniciado por Do Carmo (2015), investigou-se a cinética da PQ em ratas grávidas e não grávidas. A eventual confirmação de que em ratos, tal como descrito em camundongos, a gravidez altera a farmacocinética da PQ, permitirá utilizar este roedor como modelo para investigar o impacto da gestação na absorção, distribuição, metabolismo e eliminação da PQ.
O estudo em ratos resolve o problema de obter quantidade suficiente de sangue por amostra repetida e permite construir curvas individuais (para cada animal) da variação da concentração plasmática de PQ ao longo do tempo. Além disso, torna-se viável também avaliar a diferenças de concentração plasmática de PQ entre a mãe e o feto.
Em síntese, o estudo em ratos permitirá reunir novas informações sobre esse importante antimalárico, no que diz respeito à farmacocinética durante a gravidez e passagem transplacentária. Embora o uso da PQ seja em geral contraindicado na gravidez, por receio de complicações relacionadas a fenômenos hemolíticos em indivíduos (mãe e/ou feto) com deficiência de G6PD, a PQ é um antimalárico com características terapêuticas únicas, ou seja, pertence ao grupo de 8-aminoquinolinas com atividade contra formas hepáticas latentes do plasmódio (hipnozoítas) produzindo cura radical de infecções por
Plasmodium vivax e P.ovale. Esta singularidade da PQ entre os antimaláricos disponíveis –
prevenindo recidivas – justifica o aprofundamento do estudo da sua farmacocinética na gravidez.
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3 OBJETIVOS
Objetivo geral
O objetivo deste trabalho foi investigar em ratos as alterações da farmacocinética da PQ na gravidez, assim como determinar em que medida este fármaco antimalá-rico é transferido, via placenta, do organismo materno para o compartimento em-brio-fetal.
Objetivos específicos
Comparar a eliminação da PQ em ratas não grávidas e grávidas a termo (21 dia de gestação), após a administração de uma única dose do fármaco por via oral.
Determinar se a cinética da PQ pode ser descrita por modelo de um compartimento, e os parâmetros farmacocinéticos Co (concentração extrapolada para o tempo (0), Vd (volume distribuição), t1/2 (meia-vida de eliminação) e AUC (área sob a curva) em grávidas e não grávidas.
Investigar se, e em que medida, a PQ é transferida do organismo materno (sangue) para o feto (sangue) na gravidez a termo de ratos (21 dia de gestação).
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4 MATERIAL E MÉTODOS MATERIAIS
Agulha de gavagem para rato em aço inox curvo e com esfera; Agulha hipodérmica 0,45 x 13 mm;
Agulha hipodérmica 0,70 x 25 mm; Seringa de insulina 100 U, 1 mL; Seringa de tuberculina 1 mL; Tubo tipo eppendorf 1,5 mL
REAGENTES
Acetato de amônio extra puro (Merck);
Acetonitrila (gradient grade) para cromatografia líquida (Lichrosolv); Acetonitrila grau HPLC/SPECTRO (Tedia);
Ácido acético glacial (Vetec);
Heparina sódica 5.0000 U.I / mL, Hipolabor; Sulfato de zinco heptahidratado (Merck);
EQUIPAMENTOS
Agitador de tubos do tipo vortex, modelo AP56 (Phoenix); Balança analítica modelo AA-200 (Denver);
Balança série extend modelo ED822 (Sartorius); Bomba de vácuo (Millipore);
Coluna cromatográfica Supelcosil LC – CN (25 cm x 4,6 mm i.d., 5 m) (Supel-co);
Centrífuga modelo 5418 (Eppendorf);
Cromatógrafo de fase líquida acoplado ao detector de Ultravioleta com Rede de Diodos - CLAE-DAD SCL – 10A VP (Shimadzu®);
Lavadora ultrasônica modelo USC 1400 (Unique); Potenciômetro modelo Basic (Denver);
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4.1 ANIMAIS
Foram utilizadas ratas Wistar, com idades entre oito e dez semanas de vida, originárias da colônia mantida no Instituto de Ciência e Tecnologia e Modelos da Fundação Oswaldo Cruz.
No período de aclimatação (em torno de duas semanas) e durante todo o experimento, água de torneira filtrada e ração comercial para ratos (Nuvital® - Nuvital CR1, Curitiba, PR, Brasil) foram fornecidas ad libitum. Na sala em que os animais foram mantidos durante o experimento a temperatura (23 ± 2°C), a umidade relativa do ar (aproximadamente 70%) e o ciclo claro ( 6 às 18h) e escuro (18 às 6h) foram controlados. As trocas das camas de maravalha e gaiolas foram realizadas três vezes por semana.
Os animais foram alojados em grupos de cinco por gaiola de plástico de tamanho padrão para ratos com tampa de aço inoxidável e cama de maravalha de pinho branco.
4.2 PRIMAQUINA
Difosfato de Primaquina (GENIX IND. FARMACÊUTICA LTDA) foi fornecido por Farmanguinhos/ FIOCRUZ.
4.3 TRATAMENTO DOS ANIMAIS
As soluções usadas para tratar os ratos foram preparadas a partir do difosfato de PQ em equivalente de base, de acordo com:
- Peso molecular da PQ base 259.34674g/mol - Peso molecular de PQ Difosfato 455.337104g/mol
A dose da PQ base utilizada para o tratamento dos animais foi de 40mg/kg em volume de 5 mL/kg de Salina Tamponada (PBS).
As soluções foram preparadas sempre no mesmo dia do tratamento e mantidas sob refrigeração (+4 C) e ao abrigo da luz até serem administradas.
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4.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E TRATAMENTO
4.4.1 Experimentos preliminares para seleção da dose e da via de administração da
primaquina
Experimentos preliminares foram realizados para a seleção da dose e a via de administração a serem utilizados no desenvolvimento neste trabalho. Foram administradas doses de 20 à 40mg/kg de PQ por via oral e de 5 à 20mg/kg de PQ por via intravenosa.
4.4.1.1 Tratamento por via oral (entubação gástrica)
Dois grupos de ratas (n = 2/ grupo) receberam por entubação gástrica doses de 30 e 40 mg/kg de PQ base (volume administrado: 5 mL/kg de PBS), respectivamente. Após o tratamento, as ratas foram observadas quanto ao aparecimento de sinais clínicos de toxicidade. De acordo com as alterações clínicas registradas as ratas foram classificadas em três categorias: (1) Assintomáticas: animais que não exibiram sintomas aparentando estar bem após o tratamento com PQ; (2) Com sintomas não-letais de toxicidade: ratas que apresentaram tremores, espasmos musculares e hipoatividade; (3) Óbito: ratas que evoluíram para óbito após a ingestão da PQ.
As ratas foram acompanhadas quanto ao aparecimento de sinais de toxicidade e mortes por 24 horas. Todos os sobreviventes foram eutanasiados por decapitação
Estes ensaios preliminares indicaram ser a dose de 40mg/kg de PQ base, maior dose tolerada, que não causou a morte do animal.
4.4.1.2 Tratamento por via intravenosa (veia da cauda)
Grupos de ratas foram tratados por via intravenosa i.v. (veia da cauda) com 40mg/kg (n=2), 30mg/kg (n=1), 20mg/kg (n=1), 10mg/kg (n=2) e 5 mg/kg (n=3) de PQ base (diluída em PBS; volume administrado: 5 mL/kg), respectivamente. Após o tratamento i.v. as ratas foram observadas e as alterações clínicas registradas e classificadas como anteriormente descrito.
Em virtude da acentuada toxicidade e mortalidade constatada nos experimentos preliminares, a i.v. não foi utilizada nos experimentos principais com PQ.
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4.4.2 Experimento
4.4.2.1 Ratas não grávidas
Foram utilizadas 16 ratas Wistar, com idades entre oito e dez semanas de vida, originárias da colônia mantida no Instituto de Ciência e Tecnologia e Modelos da Fundação Oswaldo Cruz.
4.4.2.1.1 Tratamento
Foram tratados 16 animais com dose única de 40 mg/kg de PQ base (volume administrado = 5mL/kg de PBS) por via oral (entubação gástrica). Após a administração de PQ, um volume de aproximadamente 0.5µL de sangue foi coletado com auxílio de seringa heparinizada da veia lateral da cauda, obedecendo aos seguintes intervalos de tempo: 30, 60, 90, 120, 180, 360, 540, 720 e 1440 min (24h) após o tratamento. O sangue foi centrifugado a 12.000 rcf por 15 min e o plasma obtido foi congelado a -20C até a análise da concentração de PQ por CLAE-DAD-UV (máximo de 7 dias de estocagem) (Esquema 1, Tabela 1).
Esquema 1 - Esquema ilustrando as etapas do tratamento de fêmeas de rato não grávidas
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4.4.2.2 Ratas grávidas
4.4.2.2.1 Acasalamento
Para possibilitar o cruzamento, duas fêmeas foram transferidas para caixa de um macho experiente durante as duas últimas horas do ciclo escuro (6-8 horas). A confirmação da cópula foi feita pela presença de plug vaginal e/ou lavado vaginal com a presença de espermatozóides. Quando positivo para o lavado ou visualização de plug, o dia do cruzamento foi designado como dia zero (GD0) de gestação. O ganho de peso durante a gravidez, e as alterações clínicas observadas após o tratamento foram registrados (Esquema 2).
Esquema 2 - Esquema ilustrando as etapas cruzamento das ratas Wistar.
Fonte: A autora, 2016.
4.4.2.2.2 Acompanhamento da gestação
A gestação de 20 ratas foi acompanhada do dia zero (GD0) até o 21º dia, quando o grupo de fêmeas grávidas foi tratado com PQ base. Durante este período foi observado o estado clínico e comportamento geral do animal e o ganho de peso.
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4.4.2.2.3 Tratamento
As fêmeas grávidas foram tratadas (duas fêmeas por dia, intercaladas em intervalos de 7 min entre uma e outra), com dose única de 40mL/kg de PQ diluída em PBS (volume administrado =5 mL/kg) por via oral (entubação gástrica). Uma amostra de aproximadamente 0.5 µl de sangue foi coletada em seringa heparinizada da veia lateral da cauda 15, 30, 60, 90 e 120, 180 e 360 min após o tratamento. O sangue foi centrifugado a 12.000 rcf e o plasma congelado a -20C até a análise da concentração de PQ. Após o término das coletas de sangue, as grávidas foram pesadas e eutanasiadas antes de se proceder à laparatomia (abertura cirúrgica da cavidade abdominal). O útero foi removido e pesado com todo o conteúdo e também sem conteúdo. Os fetos foram rapidamente removidos, pesados e eutanasiados por decapitação. O sangue dos fetos foi recolhido do pescoço no momento da decapitação e armazenado em tubos do tipo “eppendorf” heparinizados. Como a quantidade de sangue passível de ser obtida por feto é limitada, optou-se por fazer coleta de sangue de 3 a 4 fetos/ grávida num mesmo tubo (pool). O sangue foi centrifugado a 12.000 rcf por 15 min e o plasma obtido foi congelado a -20C até a análise da concentração de PQ por CLAE-DAD-UV (Esquema 3, Tabela 1).
Esquema 3 - Esquema ilustrando as etapas do tratamento de fêmeas de ratas grávidas.
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Grupos de ratos Número (n) Tratamento
(dose única)
Intervalo de tempo (min) pós-tratamento em que ocorreu a
coleta sangue
Fêmeas Grávidas 5 40mg/kg PQ 15, 120
Fêmeas Grávidas 10 40mg/kg PQ 30, 60, 90, 120, 180
Fêmeas Grávidas 5 40mg/kg PQ 30, 60, 120, 180, 360
Fêmeas Não Grávidas 2 40mg/kg PQ 15, 30, 60, 90, 120, 1440
Fêmeas Não Grávidas 3 40mg/kg PQ 30, 60, 90, 120,180
Fêmeas Não Grávidas 6 40mg/kg PQ 30, 60, 90, 120, 180, 1440 Fêmeas Não Grávidas 5 40mg/kg PQ 90, 180, 360, 540, 720, 1440 Nota: Número (n) de fêmeas grávidas e não grávidas tratadas (entubação gástrica) e intervalos de tempo após a administração de PQ em que foram coletadas amostras de sangue. As ratas grávidas foram tratadas no 21º dia de gestação; Número de animais tratados (n); Dose: 40mg/kg de Primaquina = PQ; Tempo em min.
Fonte:A autora, 2016.
4.5 ANÁLISE DA PRIMAQUINA NO PLASMA DE RATAS WISTAR
A determinação quantitativa da PQ em plasma foi realizada de acordo com metodologia desenvolvida e validada por Carmo (2015), em cromatógrafo de fase líquida de alta eficiência (CLAE), equipado com controlador SCL – 10A VP, desgaseificador DGU – 14A, bomba binária LC – 10AD VP, forno CTO – 10 AS VP, sistema de detecção por DAD SPD – M10A VP (Schimadzu®). A área do sinal foi integrada automaticamente pelo programa Schimadzu Class VP, versão 6.1. Todas as análises foram feitas no Laboratório de Toxicologia Ambiental, DCB/ ENSP/ FIOCRUZ, com auxílio da aluna de Iniciação Científica Thais Rolim e sob a supervisão do Dr. Davyson de Lima Moreira (Farmanguinhos/ FIOCRUZ). Os parâmetros para análise da PQ estão listados na tabela 2:
Em linhas gerais, a PQ foi extraída do plasma após precipitação das proteínas com solução de sulfato de zinco a 25% e acetonitrila. Volumes de 20 L do extrato do plasma foram injetados para cada análise que foi feita em triplicata. A quantificação de PQ foi realizada a partir da área do sinal e com base curva analítica que retornou a concentração em g/mL (Do Carmo, 2015).
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Tabela 2 - Parâmetros cromatográficos utilizados para a determinação de primaquina em plasma (Carmo, 2015).
Parâmetro Condição
Detecção UV (máx. = 264 nm)
Coluna Supelcosil LC – CN (25 cm x 4,6 mm i.d., 5 m) Fase Móvel ACN/Tampão Acetato de Amônio 10 mM pH = 3,80 (45:55)
Fluxo 1,0 mL.min-1
Temperatura 50C
Volume de injeção 20 L
Tempo de análise 7 minutos
ACN = acetonitrila grau HPLC/SPECTRO
4.6 TRATAMENTO ESTATÍSTICO
Os dados foram obtidos através do teste de Bonferroni com multiplas comparações. Ele foi utilizado para verificar se os valores das medias em função do tempo eram significativos entre si. Os dados foram analisados por testes paramétricos ANOVA e t test. As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando p˂0,05. A
comparação das médias foi feita com o teste estatístico de kruskal-wallis. O programa
usado para construir os gráficos e fazer as análises estatísticas foi o GRAPHPAD PRISM6®..
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5 RESULTADOS
5.1 RESULTADOS DOS ESTUDOS PRELIMINARES PARA SELEÇÃO DE DOSE E VIA DE ADMINISTRAÇÃO
5.1.1 Administração por via oral (entubação gástrica)
Todas as ratas que receberam as dose de 30 e 40mg/kg de PQ por v.o. (entubação gástrica) foram assintomáticas. Aparentaram estar bem, não apresentaram nenhum sintoma após a entubação. A dose selecionada foi a maior dose administrada não letal. Por este motivo foi preconizado para esse estudo a dose de 40mg/kg de PQ para os tratamentos por via oral.
5.1.2 Administração por via intravenosa
As ratas (R3a, R3b e R4a) tratadas com 20 e 30mg/kg de PQ morreram quase que instantaneamente após a administração do fármaco. Em analise visual, pode-se observar que as ratas tiveram seus corações aumentados e com manchas escuras, pulmão hiperimado e fígado normal. Nas doses de 10mg/kg a rata R5a após 5 min da administração, apresentou sintomas como tremores e hipoatividade. Não foram a óbito.
A rata R5b também tratada com 10mg/kg de PQ apresentou espasmos, confusão mental e deu saltos involuntários, sugerindo que o Sistema Nervoso Central (SNC) foi atingido. O animal foi a óbito 2 min após injeção.
As ratas (R6a, R6b e R6c) tratadas com 5mg/kg de PQ não apresentaram nenhum sintoma pós-injeção e foram consideradas com bom estado de saúde.
A tabela 3 apresenta de forma individual a Classificação dos sintomas de cada animal, após os tratamentos por via oral e via intravenoso (veia da cauda).
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Tabela 3 - Experimento preliminar
Tratamento Animal Dose PQ (mL/kg)
Classificação das ratas quanto à sintomatologia apresentada I
Sem sintomas aparentes
II
Sinais não letais de Toxicidade III Morte Via Oral R1a 30mg/kg X - - R1b 30mg/kg X - - R2a 40mg/kg X - - R2b 40mg/kg X - - Via intravenosa R3a 30mg/kg - - X R3b 30mg/kg - - X R4a 20mg/kg - - X R5a 10mg/kg - X - R5b 10mg/kg - X X R6a 5mg/kg X - - R6b 5mg/kg X - - R6c 5mg/kg X - -
Tabela 3 - Período total de observação pós-tratamento; 24 horas. Classificação dos sinais clínicos apresentados: (I) Sem sintomas aparentes; (II) Sinais de toxicidade neurológica, tais como tremores, espasmos e hipoatividade; (III) Morte após a aplicação da PQ. Fonte: A autora, 2016.
5.2 RESULTADOS DOS ESTUDOS PRINCIPAIS
5.2.1 Cinética da primaquina em ratas não grávidas
Todas as ratas não grávidas tratadas com PQ (40 mg/kg, v.o.) exibiram alterações de comportamento, tais como, apatia (hipoatividade), ataxia e bruxismo. Duas ocorrências de morte foram registradas nos tempos de 30 min após o tratamento. Essas fêmeas foram excluídas das análises.
As alterações da concentração plasmática de PQ ao longo do tempo após a administração de uma única dose oral de 40 mg/kg a fêmeas não grávidas são apresentadas
36
na Figura 3 e Tabela 4.
Como pode ser observado (no gráfico 1) há uma rápida elevação da concentração plasmática de PQ nos 30 minutos que se seguem ao tratamento oral sendo a Cmax (252,17 ± 5,88 ng/mL, média±EPM) alcançada 60 minutos após administração. Entre 60, 90 e 120 minutos há um aparente plateau permanecendo a concentração de PQ nos mesmos níveis que haviam sido atingidos já aos 60 minutos após o tratamento. A eliminação do fármaco foi lenta, havendo pequena queda da concentração plasmática de PQ entre 120 e 180 minutos pós-tratamento. O decréscimo da concentração plasmática de PQ continuou a ocorrer de forma lenta sendo a concentração registrada 24h após a administração foi comparável à concentração medida 15 minutos após o tratamento (Gráfico 1, Tabela 4).
0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 3 6 0 7 2 0 1 0 8 0 1 4 4 0 T e m p o ( m i n ) C o n c e n tr a ç ã o P Q ( n g /m L ) a a a b c d e f g
Gráfico 1 - Curva da concentração plasmática (ng/mL ±EPM) da PQ versus tempo após o tratamento de ratas
Wistar não grávidas com a dose oral de 40 mg/kg. O sangue foi retirado nos seguintes intervalos de tempo
pós-tratamento: 15, 30, 60, 90, 120, 360, 540,720 e1440 min. Os valores foram comparados por ANOVA de um critério para medidas repetidas seguida do teste post hoc de Bonferroni. As letras indicam as diferenças (p<0,05) entre médias: -. p 0,05: a≠15’; b≠30’; c≠60; d≠90; e≠120; f≠180; g≠360.
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Tabela 4 - Concentrações da PQ em diferentes intervalos de tempo após o tratamento oral de ratas Wistar não grávidas.
Tempo
(minutos) Concentração de Primaquina; Média(ng/mL) EPM n
15 51,0 5,9 2 30 93,0 24,8 12 60 252, 2 28,8 12 90 255,8 24,5 17 120 256,2 21,2 12 180 201,1 19,5 15 360 228,2 10,5 5 540 178,5 14,6 5 720 155,6 14,6 5 1440 52,3 7,0 13
Tabela 4 - Concentrações plasmáticas (ng/mL; média±EPM) de primaquina (PQ) em diferentes intervalos de tempo após o tratamento oral (40 mg/kg PQ) de ratas Wistar. As amostras de sangue foram coletadas 15, 30, 60, 90, 120, 360, 540,720 e1440 min após o tratamento. Número de fêmeas tratadas (n). Os valores foram comparados por ANOVA de um critério para medidas repetidas seguida do teste post hoc de Bonferroni. Fonte: A autora, 2016.
5.2.2 Cinética da primaquina em ratas grávidas
As fêmeas que acasalaram foram inspecionadas e pesadas regularmente durante toda a gestação. Todas as fêmeas grávidas receberam no 21º dia de gestação a dose de 40mg/kg de PQ administrada por entubação gástrica. A maioria dessas fêmeas grávidas apresentou alterações clínicas e de comportamento após o tratamento, tais como apatia ou hipoatividade, ataxia e bruxismo. Após serem pesadas e ter sido retirada a amostra de sangue, as fêmeas foram eutanasiadas. Logo após a eutanásia, foi realizada a laparatomia para retirada do útero gravídico com todo o seu conteúdo. O útero foi posteriormente aberto sendo removidos os fetos.
O gráfico 2 mostra os resultados doas concentrações de PQ (ng/mL) x tempo (min). A partir dos resultados observa-se que as concentrações nos tempos 90 e 120 diferem significativamente de 15 e 360 min (p< 0,05). Dessa forma, pode-se admitir que a Cmáx para a PQ no grupo de ratas grávidas é atingida em 90 minutos após a administração oral e é igual a 188,7 ± 13,7ng/mL. Após 360 min da administração oral da PQ a
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concentração plasmática é estatisticamente igual a concentração no tempo de 15 minutos, cerca de 61,1 ng/mL
Os dados representados na tabela 5 mostram a concentração plasmática (ng/mL) de PQ dos ratos fêmeas Wistar (15, 30, 60, 90, 120 e 360 min) após administração de 40 mg.kg por via v.o. Mostram também (n) de ratas usadas para cada tempo e (EP). Pode-se observar que neste grupo que o (Cmax) ocorreu no tempo de 90 min, com concentração média de 188.75 ng/mL de PQ no plasma.
Gráfico 2 - Curva da concentração plasmática (ng/mL; Média±EPM) da PQ versus tempo após o tratamento de ratas Wistar grávidas (GD 21) com a dose oral de 40 mg/kg. O sangue foi retirado nos seguintes intervalos de tempo pós-tratamento: 15, 30, 60, 90, 120, 360 min. Os valores foram comparados por ANOVA de um critério para medidas repetidas seguida do teste post hoc de Bonferroni. As letras indicam as diferenças (p<0,05) entre médias: -.p<0,05:a≠15’; b≠90’; c≠120.
Fonte: A autora, 2016. 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 a a b c T e m p o ( m in ) P Q ( n g /m L )
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Tabela 5 - Concentração plasmática PQ das ratas Wistar grávidas tratadas PQ por via oral.
Tempo
(minutos) Concentração de primaquina; Média ± EPM (ng.mL-1) N
15 70,3 19,4 5 30 125,0 15,0 15 60 142,5 13,9 15 90 188,7 13,7 10 120 161,8 14,3 20 180 130,5 14,5 15 360 61,1 7,6 5
Concentração plasmática (ng/mL; média±EPM) de primaquina (PQ) x tempo, das ratas Wistar grávidas tratadas com 40 mg/kg PQ v.o. O sangue foi coletado nos intervalos de tempo pós-tratamento de 15, 30, 60, 90, 120, 180 e 360 min. Número de fêmeas tratadas (N). Análise de variância para medidas repetidas seguida do teste post hoc de Bonferroni.
Fonte: A autora, 2016.
5.2.3 Farmacocinética da primaquina: diferenças entre ratas grávidas e não grávidas Como já visto, os dois grupos foram tratados com 40 mg/kg de PQ via oral. Em todos os intervalos de tempo após o tratamento oral, a concentração plasmática da PQ determinada nas ratas grávidas foi menor do que a concentração medida nas fêmeas não grávidas. A concentração máxima (Cmax) alcançada nas ratas não grávidas foi 256,15 ng/mL 120 min após o tratamento enquanto nas fêmeas grávidas a Cmax atingida após 90 min foi 188.75 ng/mL atingida após 90 min. O teste estatístico detectou diferenças (p<0,05) entre os dois grupos de ratas nos intervalos de tempo pós-tratamento de 30, 60, 120, 180 e 360 min (Gráfico 3, Tabela 6).
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Gráfico 3 - Curva da concentração plasmática (ng/mL; média±EPM) da PQ versus tempo após o tratamento de ratas Wistar (grávidas / GD21 e não grávidas) com a dose oral de 40 mg/kg. O sangue foi retirado nos seguintes intervalos de tempo pós-tratamento: grávidas, 30, 60, 90, 120, 180, e 360; não grávidas, 30, 60, 90, 120, 180, 360, 540, 720 e 1440 min. As comparações entre grávidas e não grávidas a cada intervalo de tempo após o tratamento foram feitas pelo teste t de Student. As diferenças (p <0,05) encontradas são indicadas com um asterisco (*). Fonte: A autora, 2016. 0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 3 6 0 7 2 0 1 0 8 0 1 4 4 0 g r á v id a s n ã o g r á v id a s * T e m p o ( m i n ) P Q ( n g /m L ) * * * *
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Tabela 6 - Concentrações plasmáticas PQ em diferentes intervalos de tempo após a administração oral de ratas grávidas e não grávidas.
Ratas Grávidas Não grávidas
Tempo
(min) Média EPM
n Média EPM N 15 70,4 19,4 5 51,0 5,9 2 30 125,1 15,0 15 193,0 24,8 12 60 142,6 13,9 15 252,2 28,8 12 90 188,8 13,7 10 255,8 24,5 17 120 161,9 14,3 20 256,2 21,2 12 180 130,5 14,5 15 201,1 19,5 15 360 61,1 7,6 5 228,2 10,5 5 540 - - 178,5 14,6 5 720 - - 155,6 14,6 5 1440 - - 52,3 7,0 13
Concentrações plasmáticas (ng/mL; média±EPM) de primaquina (PQ) em diferentes intervalos de tempo após a administração oral da dose de 40 mg/kg a ratas grávidas e não grávidas.
Fonte: A autora, 2016.
5.2.3.1 AUC de ratas grávidas e não grávidas
A AUC foi calculada para a curva de eliminação da PQ entre 30 e 180 minutos. Como visto na Figura 5, este é o segmento principal das curvas, e para este intervalo tínhamos todos os pontos nos dois grupos comparados. Contornamos desta forma a necessidade de extrapolar graficamente para a concentração plasmática zero, caso tivéssemos optado por calcular a AUC0-. Como ilustrado no gráfico 4, a AUC30-180 determinada para ratas grávidas foi inferior a AUC30-180 calculada para ratas não-grávidas. As concentrações plasmáticas mais baixas nos diferentes intervalos de tempo, a maior latência (Tmax) para a concentração pico
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(Cmax), a menor Cmax e a menor área AUC30-180 indicaram consistentemente que a gravidez altera de forma marcante a cinética da PQ, reduzindo a sua biodisponibilidade.
Gráfico 4 - AUC30-180 da concentração plasmática de PQ após administração de uma única dose do fármaco (40 mg/kg) por via oral (entubação gástrica) a ratas grávidas e não grávidas. A altura das barras corresponde a média ±EPM das AUCs calculadas para cada animal. A análise estatística (teste t de Student, para amostras independentes) indicou que as médias de AUC30-180 de grávidas e não grávidas foram diferentes (p<0.05, teste bi-caudal) Fonte: A autora, 2016. Grá vid as Nã o G ráv ida s 0 2 0 0 0 0 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 A U C 3 0 -1 8 0 m in ( n g /m L )
