Biofísica. Membrana Celular. Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

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Biofísica

Membrana Celular

Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

(2)

Ao lado temos um desenho de uma célula animal, quando

falamos da membrana

celular (membrana

plasmática), estamos nos

referindo ao seu envoltório, a barreira física que separa a célula do meio ambiente. A

membrana apresenta uma

espessura aproximada de 60 Å ( 6.10-9 _{m), enquanto uma}

célula típica tem dimensões

entre 1 m e 100 m

(micrômetros, 1 μm = 10-6 _{m ),}

ou seja, no mínimo mil vezes maior que a espessura da membrana celular. Tenha em mente o conceito de célula no

estudo dos fenômenos

elétricos da célula. 2

Diagrama esquemático com os componentes de uma célula animal. Disponível em: < http://www.infoescola.com/wpcontent/uploads/2009/11/celula-animal.jpg>. Acesso em: 23 de agosto de 2015.

(3)

Resumindo, a célula é envolvida por um manto que

chamamos de membrana

plasmática ou membrana

celular. A espessura da

membrana é tipicamente

milhares de vezes menor que a célula, como podemos ver no desenho ao lado.

3 Disponível em : http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia/cito5.php. Acesso em: 23 de agosto de 2015.

(4)

A principal função da membrana celular é

manter moléculas tão diversas como

proteínas e pequenos solutos no interior da célula. A membrana funciona para

regular seletivamente sua

permeabilidade, ou seja, a facilidade

com a qual moléculas e íons atravessam

a membrana. O estudo da composição

da membrana faz uso de diversas

técnicas físicas, discutiremos a seguir o

Modelo de Mosaico Fluido da

membrana. No livro de Oparin, “A Origem

da Vida”, ele propôs que para qualquer

forma de vida, é necessária a presença de uma barreira, que separe a parte “viva” do meio que a cerca. Esse trabalho

destaca a necessidade de uma

membrana para isolar, até mesmo as formas de vida mais simples, do meio

exterior. 4

Modelo computacional da bicamada fosfolipídica da membrana celular.

Figura gerada com o programa Visual Molecular Dynamics (VMD) as coordenadas atômicas para a bicamada fosfolipídica foram obtidas do site:

http://people.ucalgary.ca/~tieleman/download.html.

Acesso em: 23 de agosto de 2015.

(5)

Proteína intrínseca, ou transmembrana

Proteína extrínseca

O Modelo de Mosaico Fluido indica dois tipos de proteínas inseridas na bicamada lipídica (elipsóides cinzas). A proteína da esquerda é uma proteína extrínseca e a da direita uma proteína intrínseca. Os fosfolipídios são indicados com a cabeça polar em preto e, a cauda hidrofóbica, pelas linhas que saem da esfera preta.

Referência : Singer SJ, Nicolson GL. Science. 1972 ;175(23):720-31.

Em 1972, Singer e Nicolson propuseram um modelo para a membrana celular,

chamado de “Modelo de Mosaico Fluido”.

Nesse modelo temos a bicamada

lipídica, onde encontram-se inseridas

proteínas. O modelo prevê duas formas de proteínas inseridas na membrana, uma

que atravessa toda a membrana,

chamada proteína intrínseca, ou

transmembranar. A segunda forma de

proteína, localiza-se parcialmente inserida na membrana, sendo encontrada tanto no exterior como voltada para o citoplasma.

Tal forma de proteína é chamada

extrínseca.

5

(6)

O Modelo de Mosaico Fluido prevê a

passagem seletiva de íons pelas

proteínas intrínsecas. Entre as proteínas intrínsecas temos os canais iônicos e as

bombas iônicas. Outra característica do

modelo, é liberdade de movimentação das proteínas na bicamada lipídica. De acordo com as características básicas do modelo, estrutura em mosaico e difusão, previu-se a liberdade lateral e rotatória, assim como a distribuição aleatória de componentes

moleculares na membrana celular.

Moléculas apolares podem atravessar a

bicamada, já íons ficam retidos na

bicamada precisando da ação das

proteínas transmembranares para sua passagem.

6 Proteína intrínseca, ou transmembrana

Modelo de Mosaico Fluido

O Modelo de Mosaico Fluido indica dois tipos de proteínas inseridas na bicamada lipídica (elipsóides cinzas). A proteína da esquerda é uma proteína extrínseca e a da direita uma proteína intrínseca. Os fosfolipídios são indicados com a cabeça polar em preto e, a cauda hidrofóbica, pelas linhas que saem da esfera preta.

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7

Modelo de Mosaico Fluido

Membrana celular. Imagem disponível em: <

http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_membrane#mediaview er/File:Cell_membrane_detailed_diagram_en.svg>. Acesso em: 23 de agosto de 2015.

Resumindo, a membrana

celular funciona como uma barreira seletiva entre os

meios intracelular e

extracelular. Na estrutura da membrana, destaca-se a bicamada fosfolipídica, com proteínas inseridas (modelo de mosaico fluido). Além

das proteínas, há ainda

carboidratos ligados aos

fosfolipídios e às proteínas e moléculas de colesterol inseridas na bicamada. Glicolipídio Glicoproteína Proteína Extrínseca Canal Iônico Colesterol Glicolipídio Proteína Extrínseca

Proteína Intrínseca Citoesqueleto Proteína Extrínseca Hélice  Meio extracelular

Núcleo Citoplasma

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8

Modelo de Mosaico Fluido (Glossário)

Termo Função biológica

Carboidratos

(glicoproteínas e glicolipídios)

Na membrana, os carboidratos aparecem ligados covalentemente aos lipídios (glicolipídios) e às proteínas (glicoproteínas). Participam da interação célula-célula, reconhecimento molecular e crescimento celular. O processo de ligação do carboidrato à proteína o lipídio é chamado glicosilação. Canal iônico Proteína Extrínseca Carboidrato Cabeças Polares Biocamada Fosfolipídica Glicoproteína Fosfolipídio Colesterol Glicolipídio

Proteína Extrínseca Filamentos do Citoesqueleto

Meio Extracelular

Citoplasma

Trecho em Hélice Alfa Cauda Hidrofóbica Proteína Intrínseca _Proteína

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9

Proteína parcialmente inserida na bicamada fosfolipídica, podendo está voltada tanto para o meio extracelular como para o meio intracelular. Exemplos de proteínas extrínsecas são proteínas G e enzimas que ficam parcialmente inseridas na bicamada, como a fosfodiesterase.

Proteína intrínseca

Essas proteínas atravessam toda extensão da bicamada fosfolipídica, possibilitando comunicação entre os meios intracelular e extracelular. Os canais iônicos e bombas iônicas são exemplos de proteínas intrínsecas.

Canal iônico Proteína Extrínseca Carboidrato Cabeças Polares Biocamada Fosfolipídica Glicoproteína Fosfolipídio Colesterol Glicolipídio

Proteína Extrínseca Filamentos do

Citoesqueleto

Meio Extracelular

Trecho em Hélice Alfa Cauda Hidrofóbica

Proteína Intrínseca _Proteína Extrínseca

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Colesterol É responsável por manter a integridade da membrana e modula a sua fluidez. Sua parte polar interage com a cabeça polar dos fosfolipídios e, sua porção hidrofóbica, interage com as caudas hidrofóbicas dos fosfolipídios. Sua molécula apresenta um sistema de anéis, que reduz a fluidez da membrana. Canal iônico Proteína Extrínseca Carboidrato Cabeças Polares Biocamada Fosfolipídica Glicoproteína Fosfolipídio Colesterol Glicolipídio

Proteína Extrínseca Filamentos do Citoesqueleto

Meio Extracelular

Extrínseca

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11

Citoesqueleto Encontrado no citoplasma, fornece a base para o ancoragem de proteínas e a formação de organelas que se estendem da célula. Apresenta uma composição proteica. Em células eucarióticas são encontradas as proteínas actina e tubulina na sua formação.

Canal iônico Proteína Extrínseca Carboidrato Cabeças Polares Biocamada Fosfolipídica Glicoproteína Fosfolipídio Colesterol Glicolipídio

Proteína Extrínseca Filamentos do

Citoesqueleto

Meio Extracelular

Extrínseca

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CH₂ CH CH₂ O P O _X O O -O C R₁ O O C R₂ O

Biomembranas são baseadas

principalmente em lipídios, com

predominância de fosfolipídios. A

estrutura química geral de uma molécula de fosfolipídio é mostrada ao lado (figura

a). Tal molécula é basicamente um

glicerol (figura b), sobre o qual foram

ligadas as cadeias de ácidos graxos (R₁ e R₂). O grupo fosfato permite a ligação covalente de outra molécula, designada na figura por pelo grupo X. Um dos ácidos

graxos típicos encontrados nos

fosfolipídios é chamado ácido palmítico (figura c) . a) b) HO CH₂ C CH₂ OH OH H Fosfolipídio c) Glicerol Ácido palmítico 12 Fosfolipídios

(13)

A molécula de ácido palmítico (ou ácido hexadecanóico) apresenta 16 carbonos e 31 hidrogênios. Tal ácido graxo é dito

saturado, pois apresenta o maior número

possível de hidrogênios ligados. A

presença de ligações duplas na cadeia de ácido graxo indica que o mesmo é não saturado. As duas cadeias R₁ e R₂ não

precisam ser homogêneas, ou seja,

podem apresentar cadeias de tamanhos distintos. Nos fosfolipídios, uma parte da molécula é polar, a cabeça hidrofílica ou

polar, e a parte apolar é composta pelas

duas cadeias de ácidos graxos. O

diagrama esquemático ao lado ilustra uma molécula de fosfolipídio. Moléculas que

apresentam parte polar e parte

hidrofóbica são chamadas anfipáticas.

Na figura da abaixo temos a

representação CPK do fosfolipídio. Cabeça polar Caudas hidrofóbicas Caudas hidrofóbicas Cabeça polar 13 Fosfolipídios

(14)

Diversos modelos computacionais de

biomembranas foram construídos e

submetidos à simulação de dinâmica

molecular. Na dinâmica molecular,

podemos simular computacionalmente

aspectos sobre a mobilidade dos sistemas moleculares, de forma que a interação da bicamada fosfolipídica com moléculas de água pode ser analisada. Tais simulações usam diferentes componentes para a formação da bicamada, no exemplo ao

lado foram usadas moléculas de

1-

palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfatidilcolina, formando uma caixa

retangular, onde temos moléculas de água

interagindo com a parte polar da

bicamada. No modelo computacional,

vemos claramente que as caudas

hidrofóbicas não interagem com as

moléculas d’água. Hi drof íl ica Hi drof ób ica Hi drof íl ica

Modelo computacional da membrana

14

(15)

Fosfolipídio original

Abaixo temos a descrição da montagem do modelo computacional da bicamada fosfolipídica. 15 1) Montagem do fosfolipídio. Podemos usar as coordenadas atômicas de um fosfolipídio, obtidas experimentalmente e otimizar a estrutura tridimensional computacionalmente. As coordenadas atômicas do fosfolipídio podem ser determinadas por cristalografia. 2) Montagem da monocamada. As coordenadas atômicas do fosfolipídio original são movimentadas gerando cópias da molécula original, só que em outra posição. O processo de cópia é gerado aplicando-se operações matemáticas simples sobre as coordenadas atômicas do fosfoliídio. Fosfolipídio transladado 3) Montagem da bicamada. Após o descolamento de dezenas de fosfolipídios, temos um modelo da bicamada fosfolipídica. O modelo acima apresenta 128 moléculas, 64 em cada camada.

4) Montagem da bicamada com moléculas de água.

Moléculas de água são distribuídas aleatoriamente na estrutura da bicamada. Após a simulação de dinâmica molecular, as moléculas de água localizam-se nas partes hidrofílicas, como mostrado acima,

Bicamada fosfolipídica

Bicamada fosfolipídica com água

(16)

Podemos pensar que o modelo computacional representa um fatia da membrana celular, sem a presença de proteínas. É como se tivéssemos cortado

uma fatia em formato de cubo da

biomembrana. Na simulação

computacional da membrana, as

moléculas de água posicionam-se nas regiões polares, como era de se esperar. A vantagem da simulação computacional, é que uma vez confirmada a capacidade de simulação de aspectos conhecidos, como a interação com água, podemos adicionar moléculas aos sistemas e prever seu comportamento. Por exemplo, podemos prever qual o comportamento de fármacos com a bicamada. Tal simulação é de

interesse no desenvolvimento de

fármacos, visto que, para que possam agir, a maioria dos fármacos têm que atravessar a membrana. H idrof íl ica H idrof ób ica H idrof íl ica

Modelo computacional da membrana

Diagrama esquemático da membrana

H idrof íl ica H idrof ób ica H idrof íl ica 16

(17)

Muitas das proteínas, que interagem com a membrana celular, apresentam regiões em hélice alfa. Para entendermos esta

interação proteína-membrana, vamos

olhar alguns detalhes da estrutura da

hélice alfa. Uma hélice alfa, como

mostrada na figura a, tem as cadeias laterais apontando para fora da hélice (indicadas com setas). Tal hélice alfa pode ser representada como um cilindro (figura b). Nas figuras c e d temos a visão de cima de cada uma das representações da

hélice alfa. As visões facilitam a

identificação das regiões hidrofóbicas e hidrofílicas das hélices alfa, como nas figuras c e d. a) b) c) d) Cadeias laterais Cadeias laterais 17 Interação Intermoleculares

(18)

Nas estruturas de feixes de hélices

transmembranares, verifica-se que a

parte da hélice que toca os lipídios é relativamente mais hidrofóbica que a parte que participa do contato

hélice-hélice. No diagrama esquemático à

direita, temos um feixe de 4 hélices (figura b), onde vemos que a região entre as hélices é mais hidrofílica que a região em contato com a bicamada lipídica. A região das hélices, em contato com as caudas hidrofóbicas da bicamada fosfolipídica, estão indicadas por setas.

a) Hélice transmembranar

b) 4 hélices transmembranares Superfície mais hidrofóbica

Superfície mais hidrofílica 18

(19)

Apresentaremos o complexo proteico centro de reação fotossintético da bactéria púrpura R. viridis, como exemplo de proteína transmembranar. O centro de reação fotossintético é o local da etapa inicial da captura de energia luminosa na fotossíntese. Tal complexo proteico é

composto de quatro cadeias

polipeptídicas, indicadas na figura ao lado, nas cores azul, vermelha, cinza e

dourado. A proteína apresenta uma

estrutura quaternária tetramérica. Há

também quatorze cofatores de baixo peso molecular, indicados em amarelo. Entres

os cofatores temos cromóforos, que

absorvem a energia luminosa, que é convertida em potencial eletroquímico, através da membrana.

Referência: Deisenhofer, J. & Michel, H. (1989) EMBO J.

8:2149-2170. 19

(20)

Na representação ao lado, os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos estão em cinza, os polares em verde, os ácidos em vermelho e os básicos em azul. Átomos pertencentes aos cofatores estão em

ciano. Vemos claramente uma

heterogeneidade na distribuição de

cargas na superfície das proteínas. No

centro temos uma região

preponderantemente hidrofóbica, e nas

partes superior e inferior uma

concentração de resíduos de aminoácidos carregados e polares, o que caracteriza uma região hidrofílica.

Referência: Deisenhofer, J. & Michel, H. (1989) EMBO J. 8:2149-2170. 132 Å 72 Å H idr of íli ca H idr of ób ic a H idr of íli ca 20 Interação Intermoleculares

(21)

A representação à direita indica os

elementos de estrutura secundária,

notadamente: hélices, fitas e regiões de alças, conectando as hélices e fitas. As cadeias L e M (estruturas do meio) apresentam preponderantemente hélices, enquanto o citocromo (estrutura de cima) e a cadeia H (estrutura da parte debaixo) apresentam outros elementos de estrutura secundária.

Observação: As coordenadas atômicas usadas para representar a estrutura do centro de reação fotossintético estão

depositadas no banco de dados de

estruturas PDB (Protein Data Bank), com código de acesso: 1PRC. O endereço do PDB é www.rcsb.org/pdb . Essa estrutura foi a primeira proteína transmembranar a

ter sua estrutura elucidada por

cristalografia por difração de raios X.

Cadeia H Cadeia M Cadeia L Citocromo 21 Interação Intermoleculares

(22)

A estrutura do centro de reação

fotossintético não foi determinada em

contato com a membrana celular, mas a

partir da análise de sua estrutura

cristalográfica isolada, podemos elaborar uma hipótese de como a proteína interage com a membrana. Vamos destacar os

principais aspectos da estrutura da

proteína.

1) Apresenta 4 cadeias polipeptídicas, sendo que duas delas se destacam pela participação majoritária de hélices na sua estrutura, as cadeias L e M mostradas na figura ao lado. 22 Cadeia H Cadeia M Cadeia L Citocromo Interação Intermoleculares

(23)

2) As cadeias L e M apresentam

preponderância de resíduos de

aminoácidos hidrofóbicos na superfície da proteína, como indicado na figura ao lado. 3) A análise da estrutura indica um padrão de hidrofobicidade na forma de sanduíche. O citocromo hidrofílico, as cadeias L e M hidrofóbicas e a cadeia H hidrofílica.

4) A dimensão maior da proteína chega a 132 Å de comprimento.

5) A bicamada fosfolipídica apresenta uma espessura de aproximadamente 60 Å, como mostrado abaixo.

23 132 Å 72 Å H idr of íli ca H idr of ób ic a H idr of íli ca 60 Å Interação Intermoleculares

(24)

6) A bicamada fosfolipídica apresenta um padrão de hidrofobicidade da forma de sanduíche, onde a parte hidrofóbica fica no meio de duas partes opostas hidrofílicas, como mostrada na figura ao lado.

7) Do ponto de vista físico-químico,

esperamos que as partes hidrofóbicas da proteína apresentem interação com as

partes hidrofóbicas da membrana.

Esperamos, também, interações entre as partes hidrofílicas da proteína com as cabeças polares da bicamada fosfolipídica.

Considerando as observações

experimentais destacadas anteriormente, podemos levantar uma hipótese científica sobre a interação do centro de reação fotossintético com a membrana celular.

24 Hid rof íli ca Hi d rof ó b ica Hi d rof íli ca Interação Intermoleculares

(25)

Citoplasma Meio extracelular 25 Centro de reação fotossintético da bactéria púrpura R. viridis. Bicamada fosfolipídica.

?

Interação Intermoleculares

(26)

Citoplasma

Interação das cadeias L e M (vermelho e cinza) do centro de reação fotossintético com a bicamada lipídica.

Hélice alfa é a estrutura secundária comumente encontrada em segmentos

transmembranares de proteínas de

membranas. Normalmente temos a

combinação de vários segmentos de

hélice, formando feixes de hélices

transmembranares, como nas estruturas das cadeias L e M da estrutura do centro de reação fotossintético mostrada ao lado. A partir da análise da estrutura

do centro de reação fotossintético,

podemos propor um modelo para

interação da proteína com a membrana.

No modelo temos que a parte

hidrofóbica, formada por hélices,

interage com a membrana celular,

conforme indicado no diagrama

esquemático ao lado.

Meio extracelular

26

(27)

Outra estrutura possível para proteínas transmembranares é a folha beta. Um arranjo onde a folha beta fecha-se sobre si forma um arranjo similar a um barril, sendo denominado barril beta. A estrutura em barril proporciona as características

físico-químicas desejáveis para uma

proteína transmembranar, tal como

blindagem dos átomos da cadeia principal que participam de ligações de hidrogênio. A figura ao lado mostra a estrutura de uma porina. As porinas criam canais na membrana permitindo a passagem de moléculas de baixa massa molecular (inferior a 700 Da), tais como moléculas

de água, íons, glucose e outros

nutrientes.

Barril beta da porina de Rhodopseudomonas blastica. Código de acesso PDB: 8PRN

27

(28)

Venenos de serpentes podem ser pensados como coquetéis de proteínas e peptídeos, que apresentam um vasto espectro de atividades biológicas, entre elas muitas de interesse farmacológico. Há dois objetivos principais nos estudos

dos componentes dos venenos de

serpentes. Um focado nos soros e

possíveis inibidores para os acidentes ofídicos, que ainda ocorrem no Brasil e no resto do mundo. Outro foco está centrado

nas propriedades farmacêuticas dos

componentes dos venenos.

Cobras brasileiras. Bothrops jararacussu (Jararaca). Disponível em: <

http://www.cobrasbrasileiras.com.br/bothrops_jararacussu.h tml>.

28

(29)

Entre as proteínas identificadas nos

venenos, destacam-se as

metaloproteases e as fosfolipases A2 (discutidas aqui). As fosfolipases A2 são enzimas que catalisam a clivagem de fosfolipídios, componentes da membrana. Tal enzima foi intensivamente estudada e está presente no veneno de diversas

serpentes. Entres suas atividades,

destacam-se a atividade miotóxica,

apresentada pelo veneno das serpentes do gênero Bothrops. A ação miotóxica é responsável por danos extensos no tecido muscular, se não tratada. A fosfolipase A2 apresenta 122 resíduos de aminoácidos

em sua estrutura primária, e sua

estrutura 3D foi elucidada por técnicas de difração de raios X. A estrutura apresenta

6 hélices principais, indicadas por

cilindros azuis e duas fitas em amarelo.

C

N

Estrutura da fosfolipase A2 de Bothrops jararacussu.

29

(30)

Estudos estruturais das fosfolipases A2 lançaram as bases moleculares para o entendimento da atividade miotóxica. A hipótese mais aceita, estabelece que a clivagem dos fosfolipídios da membrana celular levam à ação miotóxica. Modelos

computacionais da interação da

fosfolipases A2 com a membrana

identificaram detalhes da interação, como mostrado ao lado. A fosfolipase A2 , uma proteína rica em hélices (indicadas como

cilindros azuis), apresenta interações

eletrostática e hidrofóbica com a

membrana, o que possibilita a

desestruturação desta e a consequente

atividade tóxica. A simulação

computacional indicou que a ligação da

fosfolipase A2 à membrana, desloca

moléculas de água, o que pode facilitar a interação da enzima com os fosfolipídios.

Disponível em:<

http://www.ks.uiuc.edu/Research/smd_imd/pla2/>. Acesso em: 23 de agosto de 2015.

Modelo computacional da interação da fosfolipase A2 com a monocamada da membrana. Os fosfolipídios são indicados com caudas hidrofóbicas em verde.

30

(31)

Canais de K+ _são _proteínas

transmembranes que permitem a saída de íons de potássio da célular. A habilidade mostrada pelos canais de K+ _dependentes

de voltagem, de permitirem

majoritariamente a saída de íons de K+_{, é}

conseguida por meio de um filtro de

seletividade, presente numa das

extremidades do poro. A figura ao lado ilustra a passagem de íons de K+ _(esferas

verdes) pelo canal de K+_. _{A região}

mostrada é a parte do filtro. Em solução, os íons de K+ _{apresentam-se envolvidos}

por 8 moléculas de água (esferas

vermelhas), formando uma camada de

hidratação. A esferas de hidratação dos

íons de K+_{, acomodam-se no canal de K}+ _e

começam a perder as moléculas de água, a interação com a água é substituída pela interação com os oxigênios das carbonilas do canal de K+ _{dependente de voltagem.}

Interação intermolecular do canal de K+ _{dependente de}

voltagem com íons de K+_{(esferas verdes).}

Disponível em:

<http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=38>. Acesso em: 23 de agosto de 2015.

Meio extracelular Citoplasma 31 Canais Iônicos Esfera de hidratação

(32)

A região do canal de K+_{, que captura a}

esfera envoltória de K+_{, apresenta um}

tamanho preciso para uma interação

favorável com a camada de hidratação envoltória de K+_{. No caso do íon de Na}+_{, a}

esfera envoltória é menor que a do K+_,

levando a uma interação fraca com o canal de K+_{. Assim, o sistema da esfera de Na}+_,

não tem uma interação favorável com o canal de K+_{, permanecendo no interior da}

célula. Podemos pensar que a esfera de hidratação do Na+_{, por ser menor que a do}

K+_{, está frouxamente ligada ao canal de K}+

dependente de voltagem, o que não é favorável para a perda das moléculas de água e posterior passagem pelo canal.

32

Canais Iônicos

Animação mostra a difusão de íons pelo canal iônico. Disponível em: <

http://leavingbio.net/OSMOSIS%20AND%20DIFFUSION.htm

>.

Meio extracelular

(33)

A estrutura do canal de K+ _dependente

de voltagem de Streptomyces lividans

apresenta estrutura quaternária

tetramérica (4 cadeias polipeptídicas), representadas na figura ao lado. Cada

cadeia é formada por três hélices

transmembranares e um loop (laço), o íon de potássio está representado no centro do tetrâmero em verde. Também vemos o loop P e a hélice P, que são responsáveis pela seletividade iônica (indicados em azul). O loop P é formado pelo resíduos Gly-Tyr-Gly, que estão alinhados de forma a estreitar o funil

formado pela estrutura do canal.

Estamos olhando do meio extracelular

para o meio intracelular. Canal de K+ _dependente _de _voltagem _visto _do _meio

extracelular para o meio intracelular. Código de acesso PDB: 1BL8.

Fonte: Sansom, MS. Current Biology 1998, 8:R450–R452 http://biomednet.com/elecref/09609822008R0450 33

(34)

O canal de K+ _{dependente de voltagem}

forma uma passagem na membrana

celular. Tal passagem é altamente

seletiva por K+ _{e sensível à mudança de}

potencial elétrico. A parte intracelular do

tubo do canal de K+ _{apresenta uma}

cavidade de 10 Å de diâmetro. A

cavidade está alinhada com resíduos hidrofóbicos e preenchida por moléculas de água. As dimensões dests cavidade, permitem um ajuste ideal para interação com os íons de K+_.

Canal de K+ _dependente _de _voltagem _visto _do _meio

extracelular para o meio intracelular. Código de acesso PDB: 1BL8.

Fonte: Sansom, MS. Current Biology 1998, 8:R450–R452 http://biomednet.com/elecref/09609822008R0450 34

(35)

A figura a lado mostra um zoom da região que interage com o íon de K+_{. A}

carga positiva do íon de K+ _interage

eletrostaticamente com os oxigênios das carbonilas dos resíduos de Tyr58, com as distâncias interatômicas variando de

3,07 a 3,21 Å. Os oxigênios das

carbonilas não apresentam uma carga

elétrica completa, mas uma carga

elétrica parcial negativa, que sofre

atração eletrostática pela carga positiva do íon de K+_{. O íon de K}+ _{é mostrado}

pela esfera verde no centro da figura.

A figura acima mostra a interação do íon de potássio (esfera verde) com 4 carbonilas. Cada carbonila pertence à tirosina 58, que está presente em cada monômero da estrutura do canal de K+_{dependente de voltagem . Código de acesso PDB:}

1BL8.

35

(36)

Na figura ao lado, vemos a superfície molecular do canal de K+ _{dependente de}

voltagem. A coloração azul indica carga

relativa positiva, a vermelha carga

relativa negativa e a azul ciano carga neutra. O íon de K+ _{(indicado pela esfera}

verde no centro da estrutura) sofre

interação eletrostática com as

concentrações de cargas negativas do canal de K+ _{. A estrutura quaternária do}

canal iônico fica clara na figura, com 4 cadeias polipeptídicas. A estrutura do

canal de K+ _{dependente de voltagem é}

chamada homotetrâmero, ou seja, um tetrâmero com 4 monômeros idênticos.

Superfície molecular do canal de K+ _{dependente de}

voltagem. A figura mostra a visão do meio extracelular, como se observássemos do meio extracelular para o meio intracelular. Código de acesso PDB: 1BL8.

36

(37)

Podemos fazer uma analogia do canal

de K+ _{dependente de voltagem com uma}

maçã, onde a visão da molécula ao lado é análoga à visão da deliciosa maçã mostrada na foto abaixo.

Superfície molecular do canal de K+ _{dependente de}

voltagem. A figura mostra a visão do meio extracelular, como se observássemos do meio extracelular para o meio intracelular. Código de acesso PDB: 1BL8.

37

(38)

Usando a maçã, podemos imaginar o que temos que fazer para visualizarmos o interior da maçã, como se quiséssemos observar o interior do canal de K+ _dependente

de voltagem. Na primeira foto à esquerda, temos a maçã inteira, vista de cima. Na foto seguinte, temos a maçã com a quarta parte removida. Na terceira foto, temos a maçã com a quarta parte removida vista de perfil.

38

(39)

Agora temos o análogo do canal de K+ _{dependente de voltagem, mostrado abaixo de}

cada foto da maçã, deixando clara a visualização do interior do canal na última figura da direita. A primeira figura da molécula vemos o canal por cima, na segunda com um dos monômeros retirados e, por último, de perfil, vemos o interior do canal de K+

dependente de voltagem.

39

(40)

Na figura ao lado removemos o

monômero B, o que possibilita

visualizarmos o interior do canal de K+_{. A}

figura foi girada 90º _{em relação à figura}

vista de cima. O tubo formado permite a

passagem do íon de K+ _do _meio

intracelular (parte de baixo) para o meio extracelular (parte de cima). Na parte de baixo, vemos uma região essencialmente hidrofóbica, no centro do canal (indicada por uma circunferência branca), esta região apresenta uma cavidade, que

permite a passagem dos íons de K+_.

Podemos pensar que esta cavidade é

uma antecâmara, onde o íon de K+

despe-se de sua camada de solventes (as 8 moléculas de água que cercam o íon).

Cavidade hidrofóbica

Superfície molecular do canal de K+_{. A figura mostra a}

visão de perfil do canal. Código de acesso PDB: 1BL8. 40

(41)

O íon de K+ _{intracelular é capturado e}

desloca-se para a cavidade hidrofóbica,

indicada pela circunferência branca.

Acima desta cavidade temos o loop P,

com a sequência de resíduos de

aminoácido Gly-Tyr-Gly, que estreitam o tubo que liga ao meio extracelular, selecionando os íons de K+_{. A presença}

de resíduos glicina (Gly) no loop P confere grande flexibilidade estrutural a esta região da proteína.

Cavidade hidrofóbica

Loop P

Superfície molecular do canal de K+_{. A figura mostra a}

visão de perfil do canal. Código de acesso PDB: 1BL8. 41

(42)

Como já destacamos anteriormente, um

aspecto estrutural comum a muitas

proteínas intrínsecas é a presença de hélices na região transmembranar. Na estrutura do canal de K+ _{vemos um feixe}

de hélices interagindo com as caudas hidrofóbicas da bicamada fosfolipídica,

como mostrado ao lado. O canal de K+

tem um aspecto de cone, como se fosse uma casquinha de sorvete.

K+

Citoplasma Meio extracelular

Estrutura do canal de K+ _{dependente de voltagem}

interagindo com a bicamada fosfolipídica. Código de acesso PDB: 1BL8.

42

(43)

Os canais iônicos permitem a difusão de íons, esse fenômeno pode ser estudado a partir de uma analogia com uma cuba de vidro, onde temos cloreto de sódio ( 5 % de NaCl) dissolvido de um lado da cuba e do outro água pura. Os dois sistemas estão separados por uma membrana permeável ao NaCl e à água. Como a membrana é permeável, ocorre a difusão, que leva as moléculas de água do lado direito a movimentar-se para o setor do lado esquerdo e, os íons de NaCl, a difundirem-se para o lado direito. 43 Difusão 5 % de NaCl dissolvido em água 0 % de NaCl dissolvido em água

(44)

Com a difusão o sistema atinge o equilíbrio, onde a concentração salina é idêntica em ambos os lados. Considerando-se que o volume é o mesmo em ambos os lados, e que a concentração inicial de NaCl do lado esquerdo era 5 % e 0% do lado direito, temos, no equilíbrio, 2,5 % de NaCl em ambos os lados. O fenômeno da difusão é dependente da temperatura do sistema, pois, conforme aumentamos a temperatura, aumentamos a energia cinética dos componentes do sistema (água e NaCl).

44 Difusão 2,5 % de NaCl dissolvido em água 2,5 % de NaCl dissolvido em água

(45)

45 Osmose 5 % de NaCl dissolvido em água 0 % de NaCl dissolvido em água

Quando trocamos a membrana permeável, por uma semipermeável, observamos o fenômeno da osmose. Na osmose temos a transferência de moléculas de água da região com baixa concentração de soluto (lado direito da cuba), para uma região com alta concentração de soluto (NaCl), lado esquerdo da cuba. Assim, temos uma pressão atuando do lado direito para o lado esquerdo, a pressão osmótica (). O fluxo de água do lado direito para o esquerdo é chamado de fluxo osmótico.

(46)

46 Osmose 2,5 % de NaCl dissolvido em água 0 % de NaCl dissolvido em água

Abaixo temos a situação que ocorre quando o equilíbrio é atingido. A pressão da coluna de líquido do lado esquerdo compensa a pressão osmótica. A pressão

osmótica () depende da concentração do soluto (C_M), da temperatura em Kelvin (T) e

da constante dos gases (R = 0,0821 L atm mol–1 K–1), conforme a equação abaixo:

RT

C

_M





(47)

47

Osmose

Steve Lower's Web site. Osmosis and osmotic pressure. Disponível em: <http://www.chem1.com/acad/webtext/solut/solut-4.html >. Acesso em: 23 de agosto de 2015.

Hipertônica Isotônica Hipotônica

A hemácias apresentam alta permeabilidade na membrana, com uma concentração intracelular aproximada de 0,85 % de NaCl, em condições fisiológicas. Assim, numa situação onde a concentração salina no meio extracelular, é maior que no meio intracelular (solução hipertônica), temos o encolhimento das células. Numa situação onde a concentração salina extracelular, é bem menor que no meio intracelular (solução hipotônica), temos a lise (quebra) das células, chamada de hemólise. Quando a solução extracelular, apresenta uma concentração salina próxima à intracelular, temos uma solução isotônica.

(48)

48

Osmose

O gráfico abaixo ilustra a hemólise em função da concentração salina extracelular. Vemos que conforme diminuímos a concentração salina extracelular (solução hipotônica), aumentamos a hemólise.

Gráfico da hemólise em função da concentração salina. Disponível em: <http://cellbiologyolm.stevegallik.org/node/64>. Acesso em: 23 de agosto de 2015.

(49)

No nosso estudo de fenômenos elétricos da célula, focaremos na membrana celular, boa parte desses fenômenos serão discutidos para entendermos o funcionamento elétrico dos neurônios. Os neurônios são células

nucleadas, que apresentam um corpo

central, chamado soma. Essas células

apresentam grandes variações de forma,

assim para os propósitos dos nossos

estudos, vamos considerar que o neurônio apresenta a estrutura básica, mostrada no diagrama esquemático ao lado. No diagrama temos, além do corpo celular, dendritos e um terminal único, chamado axônio. O axônio é responsável pela transmissão do

impulso nervoso. Podendo ser bem

extenso, comparado com o resto do

neurônio. Uma descrição detalhada da

estrutura do neurônio e de outras células

será apresentada na disciplina “Biologia

Celular e Tecidual”. 49 Axônio Terminais axonais Corpo celular Núcleo

Diagrama esquemático de um neurônio.

(50)

Vimos que a célula apresenta proteína intrínsecas, responsáveis pelo transporte

passivo de íons pela membrana. Especificamente, vimos, em detalhes, o

funcionamento do canal de potássio. Além dos canais iônicos, relacionados ao

transporte passivo de íons, ou seja, sem gasto de energia e descritos pelos

fenômenos de difusão e osmose, temos, também, o transporte ativo de íons na membrana. Nesse tipo de transporte, a proteína envolvida é a bomba iônica. Na aula de hoje veremos a bomba de sódio e potássio, representada no diagrama abaixo.

50 ATP

Na+ _{Meio intracelular}

Meio extracelular Bomba de Sódio e Potássio

K+

(51)

A bomba de sódio e potássio é uma proteína intrínseca com atividade enzimática. Ela catalisa a clivagem da molécula adenosina trifosfato (ATP), atividade de

ATPase. ATP (mostrado nas figuras abaixo) é um nucleotídeo contendo 3 grupos

fosfatos. ATP é uma reserva de energia química para o metabolismo celular.

a) ATP (Estrutura 2D) b) ATP (estrutura 3D)

51

(52)

A ação da bomba de Na+_/K+ _{segue as seguintes etapas:}

1) A bomba de Na+_/K+ _{, com ATP ligado, liga-se a 3 íons de Na}+ _{intracelulares.}

2) ATP é hidrolisado, causando a fosforilação de um resíduo de aspartato, da bomba de Na+_/K+ _{com a liberação de uma molécula de adenosina difosfato (ADP).}

3) A mudança estrutural da bomba de Na+_/K+_{, leva a uma exposição os íons de Na}+

que, por apresentarem baixa afinidade pela bomba de Na+_/K+_{, são liberados para o}

meio extracelular.

4) A bomba de Na+_/K+ _{liga-se a 2 íons de K}+ _{extracelulares, isto causa a}

desfosforilação da bomba, trazendo-a de volta à sua conformação anterior,

transportando K+ _{para dentro da célula.}

5) A forma desfosforilada da bomba de Na+_/K+ _{apresenta afinidade mais alta por íons}

de Na+_{, os íons de K}+ _{são liberados, a molécula de ATP liga-se à bomba.}

6) O sistema está pronto para um novo ciclo.

52

(53)

ATP ADP P_I P_I P_I P_I ATP ATP Na+ Na+ K+ 1 2 3 4 5 6 Meio intracelular

Meio extracelular _{Meio extracelular} Meio extracelular

Meio extracelular Meio extracelular Meio extracelular Meio intracelular Meio intracelular

Meio intracelular Meio intracelular

Meio intracelular

53

(54)

P_I

Na+

Meio extracelular

Meio intracelular

K+

O meio intracelular de um neurônio, na ausência de estímulos, apresenta um

potencial elétrico negativo com relação ao meio extracelular, chamado potencial de

repouso. Proteínas intrínsecas, chamadas canais de K+_{, apresentam-se abertos,}

permitindo a saída de íons de K+ _{. Assim, a saída de íons K+, deixa um excesso de}

carga negativa no interior da célula e, como resultado, um potencial negativo. A ação conjunta da bomba de Na+_/K+ _{e do canal de K}+ _{leva a um acúmulo de carga positiva}

no meio extracelular. Tal situação, tem como consequência, uma diferença de potencial negativa do meio intracelular com relação ao meio extracelular. Se colocarmos um eletrodo no interior de um neurônio em repouso, teremos um potencial elétrico de algumas dezenas de milivolts negativos.

Bomba de Na+_/K+ _{canal de K}+

54

(55)

Aproximadamente um terço de todo ATP da célula é usado para o funcionamento

da bomba de Na+_/K+_{, o que indica a}

importância para o metabolismo celular da bomba de Na+_/K+_{. Em 2007 foi elucidada}

a estrutura tridimensional da bombam de Na+_/K+_{, mostrada na figura ao lado (Morth}

et al., 2007). A análise da estrutura indicou uma divisão clara de regiões hidrofóbicas e hidrofílicas, que sugerem a

inserção na bomba de Na+_/K+ _na

membrana, conforme o modelo mostrado no próximo slide.

Referência: Morth JP, Pedersen BP, Toustrup-Jensen MS, Sørensen TL, Petersen J, Andersen JP, Vilsen B, Nissen P. Nature. 2007;450(7172):1043-9.

55

(56)

Meio extracelular

Citoplasma

Referência: Morth JP, Pedersen BP, Toustrup-Jensen MS, Sørensen TL, Petersen J, Andersen JP, Vilsen B, Nissen P. Nature. 2007;450(7172):1043-9.

A bomba de Na+_/K+ _{apresenta um domínio rico em hélices, que estão em contato com}

a parte hidrofóbica na bicamada, como indicado abaixo.

56

(57)

Como vimos anteriormente, o potencial de repouso é resultado da ação conjunta da bomba de Na+_/K+ _{e do canal de K}+_{. A bomba de Na}+_/K+ _{envia 3 íons de Na}+ _{para o}

meio extracelular e 2 íons de K+ _{para o meio intracelular, com gasto de uma molécula}

de ATP (adenosina trifosfato). Aproximadamente um terço do ATP gasto pela célula é usado pela bomba Na+_/K+ _{para manter este fluxo iônico. O canal de K}+ _{permite que o}

excesso de K+ _{seja expelido da célula, sem gasto de ATP. A ação conjunta das duas}

proteínas intrínsecas, leva a uma perda de carga positiva pela célula, causando o aparecimento de um potencial negativo no meio intracelular, este potencial é chamado de potencial de repouso, pois não precisamos de estímulo externo para gerá-lo.

Bomba de Na+_/K+ Na+ K+ K+ Citoplasma Meio extracelular Canal de K+ 57 Potencial de Membrana

(58)

Na aula de hoje, vimos a estrutura da membrana celular, um tópico de interesse da Biologia Celular e Tecidual. O estudo das forças que regem a formação da bicamada, está relacionada à Física. A estrutura molecular dos componentes da

membrana, é objeto de estudo da

Química, Bioquímica Estrutural e Biologia Molecular. O estudo da penicilina está

relacionada à Farmacologia. Aula de

hoje Química Física Bioquímica Estrutural Biologia Celular e Tecidual 58

Relação com Outras Disciplinas

Biologia Molecular

(59)

Segue uma breve descrição de dois sites relacionados à aula de hoje. Se você tiver alguma sugestão envie-me (walter.junior@pucrs.br ).

1) http://www.susanahalpine.com/anim/Life/memb.htm . Este site mostra animações

flash do modelo de mosaico fluido.

2) http://www.brookscole.com/chemistry_d/templates/student_resources/shared_reso

urces/animations/ion_pump/ionpump.html . Este site mostra uma animação com o

funcionamento da bomba de sódio e potássio.

3) http://www.blackwellpublishing.com/matthews/default.html . Este site traz

animações figuras e testes sobre neurobiologia. É um site de apoio ao livro de Matthews GG. Neurobiology.

4) http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=38 . Nesse site temos uma

descrição da estrutura do canal de K+ _{dependente de voltagem.}

59

(60)

1)Explique o modelo de mosaico fluido.

2)Explique o potencial de repouso da célula.

60

(61)

OLIVEIRA, Jarbas Rodrigues de; WACHTER, Paulo Harald; AZAMBUJA, Alan Arrieira. Biofísica para ciências biomédicas. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2002. 313 p.

OKUNO, Emiko; CALDAS, Iberê Luiz; CHOW, Cecil. Física para ciências biológicas e biomédicas. São Paulo: Harper & Row do Brasil, 1982. 490 p.

PURVES, W. K., SADAVA, D., ORIANS, G. H., HELLER, H. G. Vida. A Ciência da Biologia. 6a ed. Artmed editora. 2002.

61