Revista de Biologia e Ciências da Terra ISSN: 1519-5228
revbiocieter@yahoo.com.br Universidade Estadual da Paraíba Brasil
Machado Souza, Sérgio Alessandro; Stein, Vanessa C.; Vesz Cattelan, Letícia; Bobrowski, Vera Lúcia; Gomes Rocha, Beatriz Helena
Utilização de sementes de alface e de rúcula como ensaios biológicos para avaliação do efeito citotóxico e alelopático de extratos aquosos de plantas medicinais
Revista de Biologia e Ciências da Terra, vol. 5, núm. 1, 2005, p. 0 Universidade Estadual da Paraíba
Paraíba, Brasil
Disponível em: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=50050101
Como citar este artigo Número completo Mais artigos
Home da revista no Redalyc
Sistema de Informação Científica Rede de Revistas Científicas da América Latina, Caribe , Espanha e Portugal Projeto acadêmico sem fins lucrativos desenvolvido no âmbito da iniciativa Acesso Aberto
Utilização de sementes de alface e de rúcula como ensaios biológicos
para avaliação do efeito citotóxico e alelopático de extratos aquosos de
plantas medicinais
Sérgio Alessandro Machado Souza1, Vanessa C. Stein1, Letícia Vesz Cattelan1, Vera Lúcia Bobrowski2, Beatriz Helena Gomes Rocha2.
RESUMO
Ensaios biológicos têm sido utilizados, freqüentemente, no monitoramento de substâncias potencialmente tóxicas. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial alelopático e citotóxico dos extratos aquosos de capim cidreira (Cymbopogon citratus-DC-Stapf.) e de estévia (Stevia rebaudiana-Bert) sobre sementes de alface e de rúcula. Os bioensaios foram conduzidos em germinador (25ºC), com extrato aquoso obtido por decocção de folhas secas nas concentrações de: 10, 20 e 100 mg/mL (capim cidreira) e 1,25, 2,5 e 5,0 mg/mL (estévia), e água destilada (controle). Os testes de germinação, primeira contagem e índice de velocidade de germinação (IVG), que avaliam efeito alelopático, foram feitos com quatro repetições de 100 sementes/concentração/bioensaio. Para determinação da citotoxicidade, através do índice mitótico (IM), foram contadas, pela técnica de varredura, 2000 células/concentração/bioensaio. Houve redução significativa de todas as variáveis analisadas, pelo teste de Duncan (P<0,05), conforme o aumento da concentração do extrato de capim cidreira em ambos bioensaios. O extrato de estévia apresentou efeito somente em sementes de alface, sendo negativo sobre o IVG e a primeira contagem, e positivo no IM, na concentração de 5,0 mg/mL. As sementes de alface podem ser utilizadas para avaliar o efeito de substâncias glicosadas, enquanto que as de rúcula para monitorar a ação de substâncias derivadas de terpenos voláteis, composto esse presente em grande quantidade no capim cidreira.
Palavras-chaves: Alelopatia, Divisão Celular, Germinabilidade, Toxicidade, Biotestes, Cymbopogon citratus (DC) Stapf., Stevia rebaudiana (Bert.),
ABSTRACT
Biological assays have been frequently used in the potentially toxic substances monitoring. The present study aimed to evaluate the allelopathic and cytotoxic potential of lemon grass (Cymbopogon citratus-DC-Stapf.) and estevia aqueous extracts (Stevia rebaudiana-Bert) on lettuce and rucola seeds. Bioassays were carried out in a germinator at 25°C with aqueous extract obtained from boiled dried leaves in concentrations of 10, 20 and 100 mg/mL (lemon grass) and 1,25, 2,5 and 5,0 mg/mL (estevia), and distilled water (control). The germination tests, first score and germination speed rate (GSR) that evaluate allelopathic effect were done with four repetitions of 100 seeds/concentration/bioassays. For the cytotoxicity determination, through the mitotic index (MI), 2000 cells/concentration/bioassay were scored through the scan technique. There was a significantly decrease in all analyzed variables by the Duncan test (P<0,05) according to the increase of lemon grass extract concentration in both
bioassays. Estevia extract presented effect just on lettuce seeds, being negative on GSR and first score, and positive on MI in concentration of 5,0mg/mL. Lettuce seeds can be used to evaluate the glycoside substances effects, while the rucola ones to evaluate the action of derived substances from volatile terpenes, which is found in great quantity in lemon grass. Key words: Allelopathy; Cell Division; Germiability; Toxicity; Biotests, Cymbopogon citratus (DC) Stapf., Stevia rebaudiana (Bert.),
1- INTRODUÇÃO
A utilização de ensaios biológicos vegetais para o monitoramento da bioatividade de extratos, frações e compostos isolados de plantas têm sido freqüentemente incorporado à identificação e monitoramento de substâncias potencialmente tóxicas (NOLDIN et al., 2003). Inúmeros compostos químicos como ácidos fenólicos, cumarinas, terpenóides, flavonóides, alcalóides, glicídios, taninos e quinonas, são encontrados na composição química dos vegetais, esses podem desencadear efeitos benéficos ou maléficos sobre outros vegetais ou demais organismos.
A citotoxicidade de substâncias é avaliada pelo surgimento de alterações no processo de divisão celular sobre o organismo teste, tanto pela inibição do índice mitótico como pela incidência de mutações cromossômicas, como, quebras cromatídicas, perda de cromossomos inteiros ou a formação de micronúcleos.
Segundo Chou & Kuo (1986), a fitotoxicidade de extratos sobre várias plantas é atribuída à diversidade de aleloquímicos presentes em sua composição originados do metabolismo secundário dos vegetais.
Muitas substâncias químicas presentes nos vegetais podem levar ao surgimento de um efeito alelopático, o qual se refere à capacidade que as plantas tem de interferir na germinação de sementes e no desenvolvimento de outras, por meio de substâncias que estas liberam na atmosfera, ou quase sempre no solo. Os compostos alelopáticos constituem também uma forma de comunicação, pois permite às plantas distinção entre os organismos que lhe são prejudiciais ou benéficos (RODRIGUES & LOPES, 2001).
Os compostos químicos muitas vezes considerados como alelopáticos, são utilizados na medicina popular para a cura de doenças, onde sua preparação e seu uso apropriado trazem muitos benefícios, porém seus efeitos genotóxicos e mutagênicos necessitam de maiores investigações (NUNES & ARAUJO, 2003). No entanto, a maioria das pesquisas em alelopatia refere-se ao efeito aleloquímico sobre a germinação e o crescimento da planta-teste, não considerando os efeitos celulares relacionados às mudanças fisiológicas do sistema da planta-teste (PRATES et al., 2001).
O capim cidreira, Cymbopogon citratus (DC) Stapf. é uma espécie nativa da Europa e muito cultivada em quase todos os países tropicais inclusive no Brasil, tanto para fins industriais como na medicina tradicional. Seu uso é largamente difundido desde a região norte à região sul do país na forma de um chá, que pode ser preparado por decocção de folhas secas ou por infusão de folhas frescas. O citral é o composto químico presente em maior quantidade no capim cidreira, ao qual atribui-se a atividade calmante e espasmolítica, é empregado para
o alívio de cólicas intestinais e ao tratamento de estados de intranqüilidade, farmacologicamente comprovado (LORENZI, 2002).
Estévia, Stevia rebaudiana (Bert.), planta herbácea perene, nativa da região sul do Brasil, e também encontrada ao longo da fronteira com o Paraguai, teve suas folhas utilizadas como adoçante durante séculos pelos índios guaranis (LORENZI, 2002). Ainda segundo o mesmo autor, análises fitoquímicas de estévia mostram que o composto presente em grandes quantidades nas folhas é o esteviosídeo (5 a 10 %), e que esse tem um poder adoçante cerca de 300 vezes maior que o da sacarose, representando cerca de até 18% da folha; por não ser calórico, desperta um grande interesse para fins alimentícios, dietéticos e medicinais. Na medicina popular a planta é considerada hipoglicemiante, diurética, e hipo-tensora, sendo usado com sucesso como adoçante mais apropriado para pessoas diabéticas.
Visto que as sementes são excelentes organismos para bioensaios, pois, quando são reidratadas elas entram em processo de germinação, onde sofrem rápidas mudanças fisiológicas e tornam-se altamente sensíveis ao estresse ambiental, o presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico e alelopático dos extratos aquosos de Cymbopogon citratus (DC) Stapf. (Poaceae) e de Stevia rebaudiana (Bert) (Asteraceae) sobre sementes de alface (Lactuca sativa L.) e de rúcula (Eruca sativa Mill.)
2 – MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Genética do Departamento de Zoologia e Genética do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas – RS.
2.1 - Extrato aquoso
Para a obtenção dos extratos aquosos foram utilizadas folhas secas de capim-cidreira e de estévia, embaladas e lacradas comercialmente. Essas foram pesadas em balança de precisão, colocadas em erlenmeyer (500 mL) e após adicionada água destilada à temperatura de 100°C. Os recipientes foram hermeticamente fechados e deixados em repouso por 10 minutos. Após filtragem, o extrato aquoso obtido foi diluído de modo a obter-se três concentrações de cada espécie vegetal. As concentrações foram de 10, 20 e 100 mg/mL para capim-cidreira e de 1,25, 2,5 e 5,0 mg/mL para estévia.
2.2 - Bioensaios
Os organismos testes utilizados foram sementes de alface e de rúcula, sendo que as sementes de alface foram submetidas a resfriamento de 4°C por 72h para superação da dormência. Os bioensaios foram realizados em câmara de germinação com temperatura controlada de 25°C. As sementes de alface e de rúcula foram acondicionadas em caixas gerbox (11 x 11 cm) forradas com papel mataborrão umedecido com 9mL dos extratos e água destilada (controle negativo). Foram utilizadas 4 repetições estatísticas de 100 sementes de alface e de rúcula, para cada concentração dos extratos e do controle, em delineamento estatístico inteiramente casualizado.
Foram realizadas contagens diárias para o índice de velocidade de germinação (IVG), e aos quatro dias (teste de primeira contagem) e aos sete dias (teste de germinação ou germinabilidade), segundo as Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992).
2.3- Índice mitótico
Para a determinação do índice mitótico foi empregada a técnica de esmagamento (GUERRA & SOUZA, 2002). Foram coletadas as radículas dos organismos testes aos quatro dias e fixadas em Carnoy (3:1, etanol: ácido acético) por um período de 2 a 24h à temperatura ambiente e após acondicionadas em freezer. A preparação do material para posterior analise do Índice Mitótico (IM) foi realizada na seguinte ordem: água destilada por 5 minutos; HCl 5N por 20 minutos à temperatura ambiente; água destilada por 5 minutos. Após as radículas foram transferidas para lâmina onde em microscópio esteroscópico foi retirada a coifa para a obtenção do meristema apical, adicionada orceína acética 2%, colocada uma lamínula sobre o material esmagado, e posteriormente aquecida.
As lâminas das células de alface foram observadas em microscópio óptico a uma magnitude de 400x, e as de rúcula numa magnitude de 1000x.
Foram contadas, através da técnica de varredura, 2000 células por tratamento para cada bioensaio. O índice mitótico foi obtido dividindo-se o número de células em mitose pelo número total de células observado e multiplicando-se por 100.
2.4- Análise estatística
Os resultados foram submetidos a analise de variância (SANEST – ZONTA & MACHADO, 1984), sendo as médias comparadas pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.
3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Através do IVG e do teste de primeira contagem foi verificada uma diminuição na germinação de sementes de alface em contato com o extrato de capim cidreira, conforme o aumento da concentração, apesar da porcentagem de germinação somente ter sido afetada negativamente com a solução de 100 mg/mL (Tabela 1). Segundo Ferreira & Borghetti (2004), freqüentemente o efeito alelopático não se dá sobre a germinabilidade (percentual final de germinação), mas sobre a velocidade de germinação ou sobre outro parâmetro do processo. Com relação à concentração, Carvalho et al. (1996) também observaram potencial alelopático de folhas verdes de cana-de-açúcar (Sacharum officinalis), sobre sementes de sábia (Mimosa caesalpiniaefolia L.), que variava em função das concentrações testadas. Alguns autores afirmam que a ação das substâncias aleloquímicas não é muito especifica, podendo uma mesma substância desempenhar várias funções, dependendo de sua concentração e composição química (RICHARDSON & WILLIAMSON, 1988).
As diferentes concentrações de capim cidreira sobre as células meristemáticas de alface, acarretaram um efeito citotóxico, ou seja, uma diminuição da divisão celular, nas concentrações de 20 e 100 mg/mL (Tabela 1). Resultados semelhantes foram observados por Prates et al. (2000), em sementes de milho quando essas foram tratadas com leucena (Leucaena leucocephala (Lam.).
No bioensaio realizado com sementes de rúcula, tratadas com capim cidreira, houve um comportamento muito similar ao da espécie anteriormente citada, sobre todas as variáveis analisadas (Tabela 1). Carvalho et al. (1996) ressaltam a importância de estudos e identificação das plantas com propriedades alelopáticas, tanto na utilização de cultivares agrícolas capazes de inibir plantas daninhas, quanto na determinação de práticas culturais e de manejos mais adequados. Conforme Pires et al. (2001), o aumento da concentração do extrato leva a uma drástica redução do índice mitótico, ocasionando paralisação do crescimento radicular em sementes de milho tratadas com extrato de leucena (Leucaena leucocephala–Lam.). Esse evento acaba corroborando com os resultados verificados nas sementes de rúcula quando tratadas com extratos de capim cidreira.
As sementes de rúcula sofreram um maior efeito alelopático e citotóxico do extrato de capim cidreira do que as sementes de alface, sobre as variáveis testes de germinação, de primeira contagem e índice mitótico, demonstrado pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade, conforme o aumento do extrato aquoso (Tabela 1).
Segundo Simões (2003), o capim cidreira produz metabólitos secundários como geraniol, citral e diterpenos com funções ecológicas conhecidas como inibidores de germinação e, freqüentemente, apresentam toxidade elevada sendo geralmente dose dependente. A literatura apresenta também trabalhos que relatam o efeito inibitório de terpenos voláteis sobre a germinação de Eucaliptus globus, Artemísia absithium entre outras. (ALMEIDA, 1993).
Tabela 1. Germinação, Índice de Velocidade de Germinação (IVG), primeira contagem e Índice Mitótico (IM) observados nos bioensaios submetidos a diferentes concentrações de extratos aquosos de Cymbopogon
citratus (DC) Stapf (Capim cidreira) e de Stevia rebaudiana (Bert) (Estévia).
Variáveis Aleatórias
Bioensaio Extrato
Aquoso Concentração (mg/mL) Germinação (%)
IVG 1º Contagem (%) IM (%) 0 100 a 81,20 a 98 a 16,15 a 10 100 a 47,14 b 97 a 9,78 a 20 99 a 42,22 c 89 b 4,09 b Capim cidreira 100 40 b 10,38 d 25 c 3,81 b 0 100 a 89,97 a 100 a 26,67 b 1,25 100 a 75,42 b 99 ab 32,11 b 2,50 100 a 59,76 c 99 ab 23,8 b Alface Estévia 5,00 100 a 60,15 c 98 b 44,13 a 0 100 a 89,97 a 100 a 26,67 a 10 99 a 38,20 b 80 b 29,15 a 20 62 b 17,98 c 44 c 12,57 b Capim cidreira 100 25 c 6,65 d 16 d 4,65 c 0 100 a 81,20 a 98 a 16,15 a 1,25 100 a 80,75 a 97 a 13,68 a 2,50 100 a 74,88 a 98 a 9,87 a Rúcula Estévia 5,00 100 a 82,17 a 98 a 9,32 a
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade.
O extrato aquoso de estévia não apresentou efeito significativo sobre a germinação de sementes de alface, entretanto, reduziu o IVG e o teste de primeira contagem, mas aumentou a freqüência de divisão mitótica (IM) com a concentração mais elevada (5,0 mg/mL) (Tabela 1). Contudo, Nunes et al (2001), ao analisarem células da medula óssea de ratos Wistar, observaram que os animais tratados com diferentes concentrações de esteviosídeo não apresentaram lesões no DNA através do ensaio cometa.
No bioensaio com rúcula nenhuma das variáveis foi afetada pelas diferentes concentrações do extrato aquoso de estévia (Tabela 1), ou seja, não ocorreu um efeito danoso sobre o desenvolvimento de plântulas de Eruca sativa Mill.
Com relação à sensibilidade, para o extrato aquoso de estévia, as sementes de alface sofreram maior influência alelopática e citotóxica, ao contrário do bioensaio com rúcula, que não apresentou nenhuma variação nas análises realizadas (Tabela 1).
5 – CONCLUSÕES
• A ação do extrato aquoso de capim cidreira provoca efeito alelopático e citotóxico sobre sementes de alface e de rúcula, conforme o aumento das concentrações;
• Sementes de alface são mais sensíveis ao extrato aquoso de estévia, evidenciando-se assim, que essa espécie pode ser utilizada como ensaio biológico para avaliar efeitos de compostos glicosados;
• Sementes de rúcula podem ser utilizadas para monitorar a ação de substancias derivadas de terpenos voláteis, composto esse presente em grande quantidade no capim cidreira.
6 – REFERÊNCIAS
ALMEIDA, F.S.; A alelopatia em Plantas. IAPAR, Curitiba, v.55, n.2, p.62-64, 1993.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Divisão de Laboratório Vegetal. Regras para Análise de Sementes. Brasilia. 1992. 365p.
CARVALHO, G.J.; ANDRADE, L.A.B.; GOMIDE, M.; FIGUEIREDO, P.A.M. Potencialidades Alelopáticas de Folhas Verdes de cana-de-açúcar em Diferentes Concentrações de Matéria Seca na Germinação de Sementes de Alface. Ciências. Marilia-SP, v.5, n.2, p.19-24, 1996. CHOU, C.H.; KUO, Y.L.. Allelopathic exclusion of understory by Leucena leucocephala (Lam.). Journal of Chemical Ecology, v.12, n.1, p.1434-1448, 1986.
FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F.; Germinação: do básico ao aplicado. Porto Alegre, Artmed, 2004. 520p.
GUERRA, M.; SOUZA, M.J. Como Observar Cromossomos: um guia de técnica em citogenética vegetal, animal e humana. São Paulo, Funpec, 2002. 131p.
LORENZI, H. Plantas Medicinais no Brasil, São Paulo, Plantarum, 2002. 512p.
NOLDIN, V.F.; MONACHE, F.D.; YUNES, R.A.; Composição química e atividade biológica de Cynara scolymus L. cultivada no Brasil. Química Nova, São Paulo. v.26, n.3, p.331-334, 2003.
NUNES, A.P.M.; MACHADO, S.C.F.; PINHEIRO, M.; Estudo do Potencial Genotóxico de Produtos Naturais Através do Ensaio Cometa. Revista Medicina Nuclear. Chile. v.14 n.4, p3-6, 2002.
NUNES, A.P.M.; ARAUJO, A.C.; Ausência de Genotoxicidade do Esteviosídeo em E. coli. In. X Semana de Iniciação Cientifica da UERJ, Rio de Janeiro, 2003. Anais. p.15.
PIRES, N.M.; PRATES, H.T.; PEREIRA, I.A.; OLIVEIRA, R.S.; FARIA, T.C.L., Atividade Alelopática da Leucena sobre Espécies de Plantas Daninhas.Scientia Agrícola. São Paulo. V.58, n.1, p. 61-65, 2001.
PIRES, N.M; PRATES, H.T.; SOUZA, R.I.R.P.;FARIA, T.C.L.; PEREIRA, I.A.; MAGALHÃES, P.C.; Efeito do Extrato Aquoso de Leucena sobre o Desenvolvimento, Índice Mitótico e a Atividade da Perodoxidase em Plantas de Milho. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, São Paulo. v.13, n.1, p.55-65, 2000.
PRATES, H.T.; PAES, J.M.V.; PIRES, N.M.; PEREIRA, I.A.; MAGALHÃES, P.C.; Efeito do Extrato Aquoso de Leucena na Germinação e no Desenvolvimento do Milho. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.35, n.1, p.909-914, 2001.
RICHARDSON, D. R., WILLIAMSON, G. B. Allelopathic effects of shrubs of the sand pine scrub on pines and grasses of the sandhills. Forest Science, v.34. n.1 p.592-596, 1988.
RODRIGUES, F.C.M.P.; LOPES, B.M.; Potencial Alelopático de Mimosa caesalpinaefolia Benth sobre sementes de Tabebuia Alba (Cham.) Sandw. Floresta e Ambiente, Rio de Janeiro. v.8, n.1, p.130-136, 2001.
SIMÔES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R.; Farmacognosia: da planta ao medicamento. 4.ed. Porto Alegre: UFRGS, 2002. 821p.
ZONTA, E.P. & MACHADO, A.A.; (SANEST) Sistema de Analise Estatística, IFM, 1984. 1 CD-ROM.
[1] Graduando em Ciências Biológicas – Universidade Federal de Pelotas – UFPel – Instituto de Biologia – Departamento de Zoologia e Genética – Laboratório de Genética.
e-mail: sergiobioufpel@yahoo.com.br
[2] Dra Profa Adjunto Universidade Federal de Pelotas – UFPel – Instituto de Biologia – Departamento de Zoologia e Genética – Laboratório de Genética.
