Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Agronomia da
Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências: Fruticultura de Clima Temperado.
Orientador: Valmor João Bianchi Co-Orientador: José Antonio Peters
Co-Orientador: Maria do Carmo Bassols Raseira
Dados de catalogação na fonte:
(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)
B214c Bandeira, Juliana de Magalhães
Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas/Juliana de Magalhães Bandeira; orientador Valmor João Bianchi; co-orientadores José Antonio Peters e Maria do Carmo Bassols Raseira. - Pelotas, 2010. -120f.; il..- Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Faculdade de Agro-nomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2010.
1. Prunus salicina 2. Cultivo in vitro 3.Polinização controla-da I Bianchi, Valmor João (orientador) II. Título.
Banca examinadora:
__________________________ __________________________ Dr. Elizete Beatriz Radmann Dr. Leonardo Ferreira Dutra Universidade Federal de Pelotas Embrapa Clima Temperado
__________________________ __________________________ Dr. Márcia Wulff Schuch Dr. Paulo Vitor Dutra de Souza Universidade Federal de Pelotas Universidade Federal do Rio Grande do Sul
__________________________ Valmor João Bianchi
Aos meus pais, Celso e Ieda,
Aos meus irmãos, Rafael, Carolina, Letícia e Felipe
Dedico.
Ao meu namorado, Sérgio Renato
Em primeiro lugar, agradeço a minha família pelo apoio, incentivo e compreensão em todos os momentos da minha vida;
A minha avó Ieda de Magalhães por ser o alicerce de uma família tão grande quanto a nossa, mantendo-nos unidos, sempre com o espírito alegre e batalhador, servindo de exemplo a todos nós;
A todos os meus familiares pelo apoio, educação, base familiar e valores morais, através dos quais pude formar meu caráter. Agradeço, em especial, aos meus pais Celso e Ieda, e irmãos (Rafael, Carolina, Letícia e Felipe) por sempre terem acreditado em mim, me incentivando e vibrando a cada conquista. Aos meus tios Ariano Martins de Magalhães Jr. e Airton José Rombaldi pelo apoio, incentivo e acima de tudo por serem pessoas maravilhosas, grandes pesquisadores e ótimos exemplos a serem seguidos;
Ao meu namorado Sérgio Renato pelo companheirismo, apoio, garra, incentivo, compreensão, se fazendo presente durante todas as etapas desta caminhada;
À Universidade Federal de Pelotas (UFPel) pela oportunidade de realizar o curso de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado, em especial ao Departamento de Botânica e à Embrapa Clima Temperado pela oportunidade e disponibilização de suas dependências físicas para o desenvolvimento deste trabalho;
Ao Prof Dr. Valmor João Bianchi pela imprescindível orientação, profissionalismo, colaboração, incentivo, auxílio e amizade, assim como aos professores co-orientadores Dr. José Antônio Peters e Drª. Maria do Carmo
À Profª. Drª. Eugênia Jacira Bolacel Braga e ao Prof. Dr. Marcos Antonio Bacarin pela colaboração, apoio, incentivo, disposição e amizade;
Aos demais professores e pesquisadores do curso de Pós-Graduação em Agronomia, concentração em Fruticultura de Clima Temperado que fizeram parte do meu crescimento profissional, Andrea de Rossi Rufato, Caroline Marques Castro, Flávio Herter, Márcia Wulff Schuch e José Carlos Fachinello devido ao profissionalismo e ensinamentos transmitidos, imprescindíveis à realização do curso de doutorado;
Aos colegas e amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas pelo apoio e incentivo. Em especial à Carina da Silva, Daiane Benneman, Elizete Radmann, Ilda da Silva, Isabel Rodrigues, Letícia Benitez, Letícia Barbosa, Luciane Arantes, Luciana Nogueira, Luis Willian Arge, Márcia Ribeiro, Monalize Mota, Rodrigo Danielowski e Simone Wendt, os quais tornaram este período muito mais prazeroso e agradeço em especial, à bolsista Liane Bahr Thurow pela dedicação, apoio, amizade e incansável ajuda;
Aos funcionários, pesquisadores, colegas e estagiários, mas, sobretudo amigos, do Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal, da Embrapa Clima Temperado, Gisely Correia, Daiana Finkenauer, Diego Borges Duarte, Everton Pederzol, José Martins Pereira, Luciane Leitzk, Maicon Bonemann, Maria de Fátima Tavares da Silveira, Marcelo Couto, Patrícia Einhardt, Rodrigo Franzon e Tiago da Silveira, por terem me recebido gentilmente na Embrapa, pelo apoio, dedicação e amizade;
Aos demais colegas e amigos do curso de Pós-Graduação em Agronomia pelo apoio, dedicação e cooperativismo André de Souza, Andressa Comiotto, Cari Timm; Cláudia Lima, Doralice Fischer, Evandro Schneider, Fernanda Azevedo, Fernando Hawerroth, Ivan Pereira, Juliano Shimitz, Mateus Pasa, Poliana Francescatto, Luciano Picolotto, Simone Galarca, Thaís Cappellaro, Tânia Pelizza e ZeniTomaz, por mais breve que tenha sido o nosso convívio, valeu a pena cada momento;
Aos meus amigos que muitas vezes sem entender as preocupações que me acercavam, sempre estiveram presentes me auxiliando, apoiando e vibrando a cada conquista, amenizando os percalços desta caminhada;
Saibam que eu carrego comigo um
pouquinho de cada um de vocês.
“... Porque se a estrada me cobra, pago seu preço
E desabrigo o caminho pra o meu sustento
Mesmo que o mundo desabe num tempo feio
Sei o que as asas do poncho trazem por dentro...”
Gujo Teixeira E Luiz Marenco
“... Carrego nas costas meu mundo
E junto umas coisas que me fazem bem
Fazendo da minha janela
Imenso horizonte, como me convém ...”
Luiz Marenco
“A vida é curta,
A arte é longa,
A oportunidade fugaz,
A experiência falaciosa,
O julgamento difícil.”
BANDEIRA, Juliana de Magalhães. Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas. 2010. 120f. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.
A ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) tem papel de destaque na fruticultura
mundial. Possui grande importância no mercado brasileiro e vem ganhando adeptos à sua produção, principalmente no Rio Grande do Sul e Santa Catarina onde as condições de inverno favorecem o seu cultivo. Porém, existem alguns problemas enfrentados pelos produtores e melhoristas que limitam o aumento da produção nacional de ameixeiras, entre esses, destacam-se a autoincompatibilidade gametofítica, devido à presença de um loco multialélico (contendo os denominados alelos-S) e a suscetibilidade à Xillela fastidiosa Wells, que afeta a qualidade do material
propagativo. Frente a esses problemas, o objetivo da realização deste trabalho foi identificar fisiologicamente os alelos-S de seis cultivares de ameixeira japonesa e desenvolver um protocolo de micropropagação para a cv. América. Desta forma, foram realizados experimentos de polinização controlada nos campos experimentais da Embrapa Clima Temperado (Pelotas/RS) e polinização in vivo, em laboratório, de seis cultivares copa de ameixeira japonesa (América, Rosa Mineira, Pluma 7, Amarelinha, Reubennel e Santa Rosa), onde foram avaliados a frutificação efetiva e o crescimento do tubo polínico (CTP), respectivamente. Também foram realizados experimentos no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas (UFPel/RS), visando identificar um protocolo adequado para a micropropagação da cv. América. Nos estudos de compatibilidade reprodutiva, a frutificação efetiva foi muito baixa para todos os cruzamentos, sendo observado maior valor na autopolinização da ‘Reubennel’ (8,41%). ‘América’ somente apresentou frutificação quando polinizada com as cvs. Rosa Mineira, Amarelinha, Santa Rosa e Reubennel, sendo que essa última apresentou compatibilidade mútua com a cv. América. ‘Amarelinha’ e ‘Rosa Mineira’ mostraram-se compatíveis com o pólen da ‘Rosa Mineira’ e ‘Reubennel’. Houve interação significativa para o grau de CTP e o pólen utilizado para polinizar cada um dos genitores femininos, sendo que os cruzamentos entre ‘América’ x ‘Pluma 7’ e ‘Rosa Mineira’ x ‘Santa Rosa’ foram incompatíveis enquanto que a cv. América apresentou-se autoincompatível. Alguns cruzamentos que não apresentaram polinização e frutificação no campo, atingiram o óvulo (grau 6) ou o ovário (grau 5) durante a polinização in vivo, tais como ‘Reubennel’ x ‘Rosa Mineira’;
‘Rosa Mineira’ e ‘Amarelinha’ x ‘América’ e ‘Amarelinha’ e ‘Pluma 7’, e ‘Santa Rosa’ x ‘América’. Estes resultados, juntamente com os dados moleculares dos alelos-S, permitem um melhor entendimento a respeito da biologia reprodutiva de P. salicina.
Nos experimentos de micropropagação verificou-se que o estabelecimento in vitro de explantes basais da cv. América em meio MS, é superior ao de explantes apicais. Concentrações de BAP entre 0,25 e 0,50mg dm-3 são mais adequadas para sua multiplicação enquanto que o meio MS suplementado com 1,0mg dm-3 de AG
3 e 2,0g dm-3 de carvão vegetal é o mais adequado para o alongamento in vitro de suas brotações. A metade da concentração dos sais e vitaminas do meio MS com a adição de 1,0mg dm-3 de AIB é o mais eficiente para o enraizamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa, cv. América, por períodos inferiores a 20 dias, atingindo 88% de sobrevivência após 30 dias de aclimatização.
General Abstract
BANDEIRA, Juliana de Magalhães. Reproductive compatibility and micropropagation of Japanese plum. 2010. 120p. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.
The Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) has an important role in the horticulture
worldwide. It has great importance in Brazilian market and is gaining fans for its production, especially in Rio Grande do Sul and Santa Catarina where winter conditions are propicious to its cultivation. However, there are some problems faced by farmers and breeders, which limit the increase in domestic production of plum trees, among these, there are the gametophytic self-incompatibility, due to the presence of a codominant multi-site (containing the so-called S-alleles) and susceptibility to Xillela fastidiosa Wells, which affects quality of propagation material. In
face of these problems, the objective of this work was to identify physiologically S-alleles of six cultivars of Japanese plum and develop a micropropagation protocol for the cv. America. Thus, experiments of controlled pollination were carried out in experimental fields at Embrapa Clima Tempreado (Pelotas/RS) and the in vivo pollination were carried out in the laboratory of six cup cultivars of Japanese plum (America, Rosa Mineira, Pluma 7, Amarelinha, Reubennel and Santa Rosa), to evaluate the fruit set and pollen tube growth (CTP), respectively. Additionaly, were also performed experiments of micropropagation in the Laboratory of Plant Tissue Culture (UFPel/RS) to identify an appropriate protocol for micropropagation of cv. America. In studies of reproductive compatibility, the fruit set was very low for all crosses, with the larger value had occur in the autopollination of 'Reubennel' (8.41%). 'America' only formed fruit when pollinated with the cvs. Rosa Mineira, Amarelinha, Santa Rosa and Reubennel, these last one had mutual compatibility with cv. America. 'Amarelinha' and 'Rosa Mineira' proved to be compatible with the pollen of 'Rosa Mineira' and 'Reubennel'. There was significant interaction for CTP level and pollen used to pollinate each female parents, and the crosses between 'America' x 'Pluma 7' and 'Rosa Mineira' x 'Santa Rosa' were incompatible while cv. America is self-incompatible. Some crosses that showed no pollination and fruiting in the field, hit the egg (level 6) or ovary (level 5) during in vivo pollination, such as 'Reubennel' x 'Rosa Mineira', 'Rosa Mineira' and 'Amarelinha' x 'America' and 'Amarelinha' and 'Pluma 7', and 'Santa Rosa' x 'America'. These results, together with the molecular data of S-alleles, allow a better understanding of the reproductive biology of P. salicina.
explants of cv. America in MS medium is higher than the apical explants. BAP concentrations between 0.25 and 0.50mg dm-3 are more appropriate for the multiplication while MS medium supplemented with 1.0mg dm-3 GA3 and 2.0g dm-3 of vegetal charcoal is the most appropriate to in vitro elongation of their shoots. Half of concentration of salts and vitamins of MS medium with the addition of 1.0mg dm-3 of IBA is the most efficient for the in vitro rooting of Japanese plum, cv. America, during periods of less than 20 days, reaching 88% survival after 30 days of acclimatization. Keywords: Prunus salicina. In vitro cultivation. Controlled pollination.
Lista de Figuras
Capítulo 1 Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa
Figura 1 Percentagem de grãos de pólen germinados no estigma de cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), nas
genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Amarelinha’ (b), ‘Reubennel’ (c), ‘Rosa Mineira’ (d), ‘Pluma 7’ (e) e ‘Santa Rosa’ (f) após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. As barras representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 35 Figura 2 Desenvolvimento do tubo polínico no pistilo de flores das
cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após
120h das polinizações controladas realizada in vivo e mantidas em temperatura ambiente (a). Germinação dos grãos de pólen na superfície estigmática (b), no estilete demonstrando o depósitos de calose (c) e interrupção do crescimento do tubo polínico no estilete (d, e), tubo polínico atingindo o ovário (grau 5) (f) e tubo polínico atingindo o óvulo (grau 6) (g). Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 36 Figura 3 Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do
percurso estigma-óvulo de ameixeiras japonesas (Prunus salicina
Lindl.), em função das polinizações controladas, realizadas in vivo, após 120h, e mantidas em temperatura ambiente nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Santa Rosa’ (b), ‘Pluma 7’ (c), ‘Amarelinha’ (d), ‘Rosa Mineira’ (e) e ‘Reubennel’ (f). As barras representam o erro padrão da média. Emrapa/Pelotas/RS, 2010... 38
Capítulo 2 Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro da ameixeira japonesa, cv. América
Figura 1 Comprimento médio das brotações (cm), número médio de folhas e de gemas formadas nos explantes de gemas apicais e basais (a) e aspecto das brotações iniciais de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, a partir de
explantes apicais (b) e basais (c), após 30 dias do estabelecimento in vitro em meio MS. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 53 Figura 2 Comprimento médio das brotações de ameixeira japonesa
(Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in
vitro, em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 54 Figura 3 Número médio de brotos (a) e de gemas (b) por explante das
brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 55 Figura 4 Brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio MS acrescido de citocininas (BAP e 2iP) em diferentes concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010... 56 Figura 5 Média da massa seca (mg) das brotações de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de
cultivo in vitro em função da adição de citocininas (BAP e 2iP) (a) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3) (b). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 58 Figura 6 Comprimento médio das brotações (cm) (a); número médio de
gemas e de brotações por explante (b); média da massa seca das brotações (mg) (c); aspecto geral das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40
dias de cultivo in vitro em função dos diferentes meios de cultura. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 59
Figura 7 Comprimento médio das brotações (a) e aspecto das brotações (b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América,
aos 40 dias de cultivo in vitro em função da adição AG3 nas concentrações de 0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg dm-3, acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 61 Figura 8 Comprimento médio (a) e aspecto das brotação (b) de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40
dias de cultivo in vitro em meio MS suplementado com AG3 nas concentrações de 0; 1; 5 e 10mg dm-3 na presença ou ausência de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 62 Capítulo 3 Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira
japonesa cv. América
Figura 1 Percentagem de enraizamento, de formação de raízes secundárias, de primórdios radiculares e de calos (a), e número de raízes por brotação (b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 71 Figura 2 Percentagem de sobrevivência após 20 dias de aclimatização
(a); volume (cm3) e massa seca das raízes (g) (b), e aspecto geral das plantas (c) de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3) , após 120 de aclimatização. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 72 Figura 3 Número de raízes por brotação (a) e percentagem de
enraizamento de brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no
meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 74 Figura 4 Comprimento médio das raízes de plantas de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de
cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 75
Figura 5 Plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, após 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB (a-e) e AIA (f-j) (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010... 76 Figura 6 Percentagem de sobrevivência após 20 (a) e 30 (b) dias de
aclimatização de plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010... 78
Lista de Tabelas
Capítulo 1 Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa
Tabela 1 Genótipos de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) utilizados
para a polinização controlada e posterior caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva. Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 29 Tabela 2 Notas atribuídas ao grau de desenvolvimento do tubo polínico
através do pistilo das cultivares de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.) polinizadas in vivo. Embrapa/Pelotas/RS,
2010... 30 Tabela 3 Percentagem de frutificação efetiva dos cruzamentos
controlados, realizados a campo, nos pomares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) da Embrapa Clima Temperado,
no ano de 2008. Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 32 Capítulo 2 Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de
ameixeira japonesa, cv. América
Tabela 1 Percentagem de contaminação e de oxidação dos explantes com gemas apicais e basais de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.), cv. América, após 30 dias do estabelecimento in
Sumário
Resumo Geral ...8 General Abstract ...10 Lista de Figuras...12 Lista de Tabelas ...16 Sumário...17 Introdução Geral...19Capítulo 1 - Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa...24
1.1 Introdução ...25
1.2 Material e Métodos...28
1.3 Resultados e Discussão...31
1.4 Conclusão ...43
Capítulo 2 - Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de ameixeira japonesa, cv. América ...44
2.1 Introdução ...45
2.2 Material e métodos ...48
2.2.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv. América...48
2.2.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv. América...49
2.2.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa cv. América ...50
2.3.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv.
América...51
2.3.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv. América...53
2.3.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa cv. América ...60
2.4 Conclusão ...64
Capítulo 3 - Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira japonesa cv. América...65 3.1 Introdução ...66 3.2 Material e Métodos...69 3.3 Resultados e Discussão...70 3.4 Conclusão ...79 Considerações Finais ...80 Referências...81 Apêndices ...100 Apêndice A – Capítulo 1...101 Apêndice B – Capítulo 2...107 Apêndice C – Capítulo 3...112 Anexos ...115 Anexo A ...116 Anexo B ...117 Anexo C ...119 Anexo D ...120
Introdução Geral
Dentre as plantas lenhosas cultivadas, as espécies frutíferas apresentam um importante papel econômico no Brasil, pois contribuem significativamente para manter o país como terceiro maior produtor de frutas do mundo, depois da China e da Índia (PORTOCARRERO, 2005). Em 2007 os pomares brasileiros produziram 43.112.804 toneladas de frutas, em uma área plantada de 2.260.154ha (IBGE, 2009). Devido ao potencial de geração de emprego e renda, a fruticultura ocupa hoje posição estratégica na expansão do agronegócio brasileiro. A base agrícola da cadeia produtiva gera 5,6 milhões de empregos, ou seja, 27% do total da mão-de-obra agrícola ocupada no País (PORTOCARRERO, 2005).
Dentre as frutíferas exploradas no mundo, várias espécies do gênero Prunus
(P. persica L. Bastch, P. salicina Lindl. e P. domestica L.) são largamente cultivadas por
apresentarem grande aceitação pelos consumidores e por sua rentabilidade, fatos que têm contribuído para uma notável expansão da produção e também consumo de frutas no Brasil. Como essas espécies são originárias de locais de clima temperado, a adaptação ocorre de forma mais fácil nas regiões mais frias do país, principalmente nos estados do Sul e Sudeste, como Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo e Sul de Minas Gerais, que apresentam condições edafoclimáticas favoráveis ao cultivo e graças ao uso de cultivares próprias para microclimas dessas regiões (SEGANFREDO, 1995; BIASI, 2004).
A ameixeira pertence à família Rosaceae, subfamília Prunoidae, gênero Prunus,
que compreende mais de 20 espécies (WEINBERGER, 1975). As espécies mais importantes são P. salicina Lindl. (ameixeira japonesa), P. domestica L. (ameixeira
européia), P. insititia Linn. (ameixeira européia) e P. cerasifera Ehrn. (ameixeira
Muitos botânicos indicam a ameixeira como núcleo central de divergência do gênero Prunus que, por sucessivas variações, originou as diferentes frutíferas da
família Rosaceae. A maioria das cultivares de interesse comercial pertence ao grupo das ameixeiras japonesas, diplóides (2n=16), originárias do Extremo Oriente, e das ameixeiras européias, hexaplóides (2n=48), originárias da região do Cáucaso, da Turquia e da Pérsia (CASTRO et al., 2008a).
As cultivares de ameixeira japonesa são as mais exploradas no Brasil por possuírem variedades com menor exigência em frio, as quais foram introduzidas e/ou selecionadas de acordo com as condições climáticas das regiões com potencial para sua produção. Por outro lado, as ameixeiras européias são pouco cultivadas, devido à alta exigência em frio para a superação da dormência, no entanto, apresentam grande importância econômica em outros países (REVERS; MACHADO, 2005).
Em virtude das várias espécies existentes e do resultado de hibridações ocorridas ao longo do desenvolvimento da cultura, principalmente pelo plantio de variedades selecionadas, a ameixeira é considerada uma das frutíferas arbóreas que mais se difundiu pelo mundo (CASTRO et al., 2008a). Entretanto, a produção brasileira de ameixa japonesa é pequena e insuficiente para suprir a demanda do mercado interno e destina-se, na quase totalidade, ao consumo in natura. Os frutos prestam-se também ao aproveitamento industrial, em forma de passas, geléias, licores e destilados. Em 2008, o país importou cerca de 18.367.942Kg de ameixas in natura, ocupando terceiro lugar de fruta fresca mais importada, logo após a pêra e a maçã (IBRAF, 2009). O volume médio de ameixeira comercializado no país entre 2002 e 2007, de acordo com a CEAGESP/SP, foi de 1.904,33t ano-1 (INSTITUTO FNP, 2007).
Dentre os fatores associados à baixa produção e produtividade da maioria das cultivares de ameixeira japonesa no Brasil encontra-se a autoincompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítica (GSI - gametofitic self incompatibility) (SCHIFINO-WITTMANN; DALL’AGNOL, 2002; RASEIRA, 2003; SAPIR et al., 2004; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005) e a suscetibilidade à escaldadura das folhas, causada pela bactéria
Xillela fastidiosaWells, que afeta a qualidade do material propagativo (SILVEIRA et al.,
2003), sendo que uma das principais formas de disseminação desse patógeno é por meio da propagação de material contaminado.
A autoincompatibilidade reprodutiva (SI - self-incompatibility) é um dos maiores problemas no manejo das culturas que apresentam esta característica e em programas de melhoramento genético de várias espécies frutíferas, podendo comprometer significativamente a frutificação efetiva e a produtividade dos cultivos. No sistema de incompatibilidade gametofítica o determinante feminino é uma RNAse - a S-RNAse - que se expressa exclusivamente no pistilo e suas proteínas são localizadas principalmente na parte superior do estilete onde atuam inibindo ou degradando o RNA do tubo polínico que compartilha o mesmo alelo-S do pistilo (SCHIFINO-WITTMANN; DALL’AGNOL, 2002; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005; BRUCKNER et al., 2006).
Dentre as espécies pertencentes à família Rosaceae, a qual inclui mais de
110 gêneros e 2.000 espécies, a maioria das cultivares de P. salicina apresentam o
sistema de GSI (SAPIR et al., 2004). Desta forma, a identificação dos alelos-S é importante para o estabelecimento de pomares com cultivares compatíveis reprodutivamente e, assim, reduzir perdas no campo, devido a baixa frutificação efetiva.
Considerando a importância econômica desta cultura para o país, deve-se procurar compreender melhor o mecanismo reprodutivo que envolve a combinação entre cultivares polinizadoras, para obtenção de uma produção satisfatória de frutas (RASEIRA, 2003), utilizando plantas livres de patógenos. Deste modo, metodologias que permitam avaliar antecipadamente a compatibilidade genética entre cultivares são de grande interesse, na medida que permitem selecionar previamente cultivares totalmente compatíveis (MOTA; OLIVEIRA, 2005).
Por meio de ensaios de polinização controlada a campo e in vivo, e avaliação molecular dos alelos-S das cultivares, é possível tornar o processo de seleção de uma polinizadora muito mais eficiente (BROOTHAERTS et al., 1995; ISHIMIZU et al., 1999; YAEGAKI et al., 2001).
Instituições governamentais vêm investindo em pesquisas com a finalidade de melhorar os sistemas de produção atualmente empregados. A introdução de novas espécies, o melhoramento genético e a produção de mudas sadias contribuem para o aumento da eficiência do sistema produtivo. A muda de qualidade potencializa a resposta à tecnologia aplicada no pomar, auxiliando na redução de custos e na produção de frutas com alta qualidade e produtividade (OLIVEIRA et al., 2004).
A micropropagação tem sido desenvolvida para inúmeras espécies frutíferas, como um método alternativo e rápido de propagação vegetativa a partir de uma célula ou de segmentos de tecidos de plantas (ERIG et al., 2004; ERIG; SCHUCH, 2005a), com a finalidade de multiplicar plantas com as mesmas características genéticas da planta-matriz, livres de patógenos, independente da época do ano (SCHUCH; ERIG, 2005), permitindo a produção de matrizes com qualidade genética e sanitária comprovadas, quando comparado aos métodos convencionais de enxertia e estaquia (ERIG; SCHUCH, 2005b; GRIMALDI et al.,2008).
A propagação in vitro permite o controle de variáveis responsáveis pelo desenvolvimento da planta, produzindo material vegetal clonal homogêneo e com elevada qualidade sanitária (ASSIS; TEIXEIRA, 1998; OLIVEIRA et al., 2006; SOUZA et al., 2006; SOUZA et al., 2008).
Além disso, esse método de propagação pode ser utilizado para vários estudos biotecnológicos, a exemplo da transformação genética para características de interesse. Porém, o uso prático da propagação in vitro de plantas lenhosas, principalmente prunoídeas, requer domínio da tecnologia de propagação in vitro, o qual é o resultado de estudos realizados com os fatores que afetam o crescimento e o desenvolvimento para cada espécie e/ou cultivar, entre eles, a constituição do meio de cultura, tipo e concentração de reguladores de crescimento (ERIG et al., 2002; DONINI et al., 2008b).
Dentre as cultivares adaptadas a região sul do país, a ameixeira japonesa (P.
salicina) cv. América é considerada uma das preferidas do mercado sul-brasileiro,
devido às suas características organolépticas, porém, é uma cultivar autoincompatível, que apresenta grande flutuação na produtividade e exige polinização cruzada para que ocorra a frutificação (RASEIRA, 2003). É uma das cultivares recomendadas para o plantio no Rio Grande do Sul, considerada região de clima ameno, já que exige cerca de 500 a 600 horas de acúmulo de frio (temperaturas inferiores a 7,2ºC) e suas principais polinizadoras são as cultivares Reubennel e Rosa Mineira (CASTRO et al., 2008a).
Diante do exposto, a caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva entre cultivares de ameixeira japonesa é de grande valia para a confirmação da caracterização molecular dos alelos-S, a qual foi realizada previamente no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da UFPel (MOTA, 2008), além de possibilitar seu uso como subsídios para programas de
melhoramento genético, já que estudos relacionados a caracterização fisiológicas da compatibilidade reprodutiva das cultivares de ameixeira japonesa adaptadas a região sul do país são bastante escassos e desatualizados em virtude das mudanças climáticas.
Por outro lado, a técnica de micropropagação permite a multiplicação clonal de plantas em larga escala, com alta qualidade genético-sanitária para a formação de pomares, além de fornecer material para experimentos de regeneração, que é uma etapa crucial para o melhoramento via transformação genética, almejando selecionar novos genótipos com características de interesse.
Dentre as características desejadas para a ameixeira está a obtenção de plantas autoférteis, que pode ser obtida por meio do silenciamento gênico via RNAi (RNA de interferência), responsável pela degradação dos RNAs homólogos no citosol, impedindo, desta forma, que ocorra a tradução do RNA alvo (VAUCHERET etal., 2001), podendo promover, neste caso, o bloqueio da tradução dos alelos-S envolvidos na incompatibilidade reprodutiva. Para este estudo foi eleita a cv. América por ser bem adaptada a região sul do país, com boa produção e aceitação do mercado consumidor, além de ser categoricamente autoincompativel reprodutivamente.
Capítulo 1
Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs.
copa de ameixeira japonesa
Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa
1.1 Introdução
Dentre as espécies de ameixeira, Prunus salicina Lindl. (2n=18), também
conhecida como ameixeira japonesa, é a mais cultivada no Brasil por possuir genótipos com menor exigência em frio, os quais foram introduzidos e/ou selecionados de acordo com as condições climáticas das regiões aptas para o cultivo (REVERS; MACHADO, 2005). Entretanto, as cultivares de ameixeira japonesa apresentam diferentes graus de compatibilidade reprodutiva, determinada por um loco multialélico, contendo os denominados alelos-S (TAKAYAMA; ISOGAI, 2005), necessitando de plantio de cultivares polinizadoras durante a instalação do pomar, a fim de garantir a fecundação e níveis de produção aceitáveis economicamente.
É indicada a implantação de pelo menos uma planta polinizadora para cada quatro produtoras (CASTRO et al., 2008a), com compatibilidade e período de floração total ou parcialmente sincronizadas (CARVALHO; RASEIRA, 1989; SAPIR et al., 2004). O uso de mais de uma cultivar polinizadora também é recomendável para se ter maior garantia de cobertura de todo o período de floração da cultivar principal (DALBÓ; FELDBERG, 2009).
O sucesso da polinização cruzada é influenciado por fatores genéticos de incompatibilidade, pela ação de insetos polinizadores (SPIERS, 1983; HARDER; THOMSON, 1989; GOLDWAY et al., 1999), fatores ambientais (chuva,vento, baixas temperaturas após a floração, carência de acúmulo de frio durante o período de dormência, alternância de temperatura após a polinização), além de possíveis deficiências de caráter fisiológico, conforme verificado em outras culturas, como por
exemplo em macieira (WHILLIAM; MAIER, 1977; PETRI; PASCOAL, 1981; SCHRAMM, 1985; SOLTÉSZ et al., 1997). De acordo com os mesmos autores, esses fatores afetam o crescimento e a penetração do tubo polínico até o óvulo.
Para que ocorra a polinização e a fecundação, o grão de pólen deve ser transportado adequadamente até o estigma, onde emitirá o tubo polínico através do pistilo, fertilizando o óvulo. Alterações em qualquer um destes processos poderão impedir a formação do fruto (SANZOL; HERRERO, 2001), reduzindo significativamente a frutificação efetiva ou fruit set.
A velocidade de crescimento do tubo polínico (CTP) até o ovário é variável em angiospermas, podendo ser de poucas horas a dias. Em Acacia retinodes Schltr. o
crescimento do tubo até o ovário leva em torno de 11 horas, enquanto que em
Banksia coccinea R.Br. pode levar até seis dias. Pound et al. (2003) verificaram que em
Eucalyptus nitens (Deane & Maiden) o pólen alcançou o óvulo duas semanas após a
polinização.
Em ameixeiras o CTP é relativamente lento, cerca de 120h (CARVALHO, 1989). A velocidade de crescimento é de extrema importância para o sucesso reprodutivo da planta, pois quanto mais rápido minimiza-se os danos por fatores desfavoráveis (TANGMITCHAROEN; OWENS, 1997), os quais podem provocar a abscisão do estilete, antes da fecundação (CARVALHO, 1989).
A identificação da região do pistilo onde o CTP é interrompido pode evidenciar o sistema de autoincompatibilidade atuante. Este mecanismo é considerado um dos sistemas mais importantes, estando presente na maioria das angiospermas para evitar a autofecundação, produzindo e mantendo a diversidade dentro das espécies (DE NETTANCOURT, 1977; RICHARDS, 1986; BARRETT, 1988).
De acordo com Bittencourt Júnior. et al. (2003), no sistema de incompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítico os tubos polínicos incompatíveis têm o seu desenvolvimento cessado no estilete. Por possuir como determinante feminino uma RNAse - a S-RNAse - a qual segrega junto com os alelos-S e se expressa exclusivamente no pistilo. Estas proteínas estão presentes desde a superfície das papilas estigmáticas até o ovário, mas localizam-se principalmente na parte superior do estilete (HARING et al., 1990; DE NETTANCOURT, 2000; SHIFINOWITTMANN; DALL’AGNOL, 2002), onde atuam inibindo ou degradando o RNA do tubo polínico que compartilha o mesmo alelo-S do pistilo (ZISOVICH et al.,
2004; ZUCCHERELLI et al., 2002; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005; BRUCKNER et al., 2006).
Este sistema de incompatibilidade é considerado o mais distribuído nas angiospermas, a exemplo das famílias Rosaceae, Solanaceae, Papaveraceae, Liliaceae, dentre outras (GIBBS, 1986), constituindo uma das principais barreiras para programas de melhoramento genético que buscam a obtenção de novas cultivares, bem como para o manejo reprodutivo dos pomares.
O reconhecimento do pólen incompatível opera no nível de interação proteína-proteína dos dois determinantes (masculino e feminino), sendo que a resposta de autoincompatibilidade ocorre quando ambos determinantes estão carregados com o mesmo alelo-S (BATLLE et al., 1995; BROOTHAERTS et al., 1995; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005). Os grãos de pólen mostram expressão independente, segregando 1:1, e assim os cruzamentos podem ser compatíveis - quando os alelos do grão de pólen e do pistilo são diferentes; semicompatíveis - quando pelo menos um alelo-S do grão de pólen é idêntico ao do pistilo e, desta forma, metade dos grãos de pólen germinam e desenvolvem o tubo polínico normal; ou totalmente incompatíveis - quando os dois alelos-S do grão de pólen são idênticos aos do pistilo (RICHARDS, 1986).
A análise da fertilidade do grão de pólen é indispensável para o melhoramento genético clássico. Portanto, dados sobre a viabilidade e o desenvolvimento de grãos de pólen são fundamentais para os estudos da biologia reprodutiva e para o desenvolvimento de programas de melhoramento genético (FLANKLIN et al., 1995).
A viabilidade do pólen pode ser determinada por diferentes métodos: através da utilização de corantes, germinação in vitro, germinação in vivo e percentagem de frutificação efetiva (DAFNI, 1992; KEARNS; INOUYE; 1993; LEITE; SOUZA, 2003).
A avaliação das plantas polinizadoras envolve polinizações controladas a campo, combinadas com análises laboratoriais, para determinar a viabilidade dos grãos de pólen (SOUZA; RASEIRA, 1998). Além disso, técnicas de microscopia permitem analisar características associadas à germinação dos tubos polínicos e suas taxas de crescimento, servindo também para analisar hibridações efetivas em programas de melhoramento genético e, assim, elucidar características referentes a incompatibilidade reprodutiva (KEARS; INOUYE, 1993), sendo considerado um teste de grande valia, já que elimina resultados falsos de incompatibilidade por não ser
influenciados pelos fatores ambientais, os quais, a polinização realizada a campo está sujeita.
Com base no que foi exposto, a realização deste trabalho teve por objetivo a caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa, por meio da avaliação da frutificação efetiva e do crescimento do tubo polínico (CTP), após a polinização in vivo, a fim de confirmar alguns dados da caracterização molecular dos alelos-S destas cultivares, realizada previamente em nosso laboratório, além de possibilitar seu uso como subsídio para programas de melhoramento genético.
1.2 Material e Métodos
Para as análises de caracterização fisiológica dos alelos-S foram utilizadas cultivares de P. salicina (Tab. 1, Anexo A e B) do Campo Experimental da Embrapa
Clima Temperado (CPACT) (Pelotas/RS), tanto para os experimentos realizados a campo quanto para aqueles realizados em laboratório. As polinizações foram executadas no momento em que os genótipos a serem polinizados possuíam número suficiente de flores em estádio de balão para compor os tratamentos.
Durante a hibridação controlada, realizada a campo, para garantir que o pólen fosse inoculado no período de receptividade máxima do pistilo, as polinizações foram realizadas repetidamente durante o período de floração. Desta forma, botões florais foram emasculados e a polinização foi realizada manualmente, passando-se levemente o dedo indicador contendo o pólen de interesse sobre o estigma. Os ramos foram ensacados com tecido não tecido (TNT) branco e devidamente identificadas com fitas plásticas. Após cada cruzamento, as mãos foram lavadas com álcool 70% para evitar a contaminação de um pólen com o outro. Como controle, foi realizada a autopolinização das cultivares produtoras, onde os botões florais foram emasculados e polinizados com o pólen da própria cultivar.
Para verificar a percentagem de fecundação foram polinizadas 150 flores, em estádio de balão para cada cruzamento, conforme metodologia descrita para gramíneas, por Wilson e Brown (1957), adaptada para frutíferas como ameixeira, pereira, pessegueiro e damasqueiro (CARVALHO, 1989; GONÇALVES, 2008). Após uma semana da polinização retirou-se o TNT para permitir o crescimento normal dos ramos e desenvolvimento dos frutos, os quais foram contados após 40 dias da
polinização, determinando-se a percentagem de frutificação efetiva em relação ao número de flores polinizadas e ensacadas (fruit set).
Tabela 1 – Genótipos de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) utilizados para a
polinização controlada e posterior caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva. Embrapa/Pelotas/RS, 2010
Genitores femininos Genitores masculinos América Rosa Mineira Pluma 7 Amarelinha Reubennel Santa Rosa América The First Reubennel América Reubennel Rosa Mineira Reubennel América Amarelinha Amarelinha Rosa Mineira América Reubennel Rosa Mineira Amarelinha Rosa Mineira Santa Rosa* América Pluma 7 Pluma 7 América Santa Rosa Santa Rosa** * Cruzamento realizado apenas in vivo, no laboratório.
** Cruzamento realizado apenas a campo.
A determinação do ponto onde ocorreu a interrupção do CTP foi avaliada por meio da polinização in vivo e testes de CTP, utilizando o método empregado por Wilson e Brown (1957), com algumas adaptações. Quatro ramos de cada planta-mãe foram coletados a campo, de acordo com a disponibilidade de ramos contendo dez flores em estádio de balão. Os mesmos foram levados para o laboratório, à temperatura ambiente (18-20ºC), e mantidos com a base submersa em água para evitar a desidratação. As flores foram emasculadas e polinizadas manualmente com o pólen de interesse, conforme as combinações descritas na tab. 1.
Os pistilos foram coletados 120 horas após a polinização, colocados em frascos contendo solução fixativa composta por formol, ácido acético e álcool etílico (1:1:8) e armazenados em geladeira (4ºC) para, posteriormente, avaliar o CTP por meio de coloração histoquímica.
Para o preparo das lâminas e visualização do CTP, os pistilos, previamente fixados, foram lavados três vezes em água destilada e submersos em uma solução de NaOH (8N) por 24h, à temperatura ambiente, para o amolecimento dos tecidos, sendo novamente lavados três vezes com água destilada e transferidos para uma solução de hipoclorito de sódio a 0,5%, durante 10 minutos, para descoloração dos tecidos. A seguir, foram novamente lavados em água destilada e imersos em solução aquosa do corante diferencial Lacmóide (Resorcina azul) 1%, por 10 minutos, lavados uma vez com água destilada para retirar o excesso de corante dos tecidos, para finalmente proceder a montagem da lâmina. O pistilo foi posicionado em lâmina de vidro, em seguida, acrescentou-se uma ou duas gotas de solução Lacmóide diluída em água (1:2). Posteriormente, foi coberto com uma lamínula, a qual foi levemente pressionada, para que rompesse os tecidos do pistilo, permitindo a visualização do CTP no interior do mesmo.
Após o preparo das lâminas, as mesmas foram visualizadas em microscópio óptico (Carl Zeiss Ind Brasileira) com ocular de 10x e objetiva de 40x. Foram observadas 20 lâminas para cada combinação de cruzamento, avaliando-se a percentagem de grãos de pólen germinados e o grau de desenvolvimento do tubo polínico. Para esta última variável foram atribuídas notas de 1 a 6, baseado na classificação de Fraken et al. (1988), com algumas alterações, conforme ilustrado na tab. 2.
Tabela 2 – Notas atribuídas ao grau de desenvolvimento do tubo polínico através do pistilo das cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.)
polinizadas in vivo. Embrapa/Pelotas/RS, 2010
* Adaptado de Fraken et al., 1988.
Notas* Grau de desenvolvimento do tubo polínico 1 Tubo polínico no estigma, sem penetrar no estilete 2 Tubo polínico no 1º terço do estilete
3 Tubo polínico no 2º terço do estilete 4 Tubo polínico no 3º terço do estilete 5 Tubo polínico no interior do ovário 6 Tubo polínico próximo ao óvulo 7 Tubo polínico no óvulo
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições de cinco flores. As médias foram submetidas à análise de variância e comparação de médias pelo teste de Duncan com 5% de probabilidade de erro, por meio do software WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO, 2003). Os dados da variável percentagem de grãos de pólen germinados foram transformados para (x/100)1/2 enquanto que os graus de desenvolvimento do tubo polínico foram transformados para log (x), onde x, em ambos os casos, representa o valor observado.
1.3 Resultados e Discussão
Os resultados das polinizações controladas encontram-se na tab. 3, onde é possível verificar que a maior percentagem de frutificação efetiva foi obitdo na autopolinização da cv. Reubennel (8,41%), enquanto que todos os demais cruzametos apresentaram valores inferiores a 3,5%. De acordo com Van e Bester (1979), na polinização livre, apenas 5% de frutificação efetiva em cultivares de ameixeira seria suficiente para assegurar uma boa produção comercial. Embora estes autores tenham realizado o trabalho em regiões tipicamente de clima temperado, onde a floração é mais abundante e uniforme do que no Brasil, verifica-se que ’Reubennel’ é mais adaptada às condições de inverno ameno, do que as demais cultivares e não é totalmente autoincompatível. Mesmo assim, quando a floração não é abundante, a pesquisa recomenda o uso de uma cultivar polinizadora. Em todas as combinações, a autopolinização foi realizada manualmente, utilizando o pólen da própria cultivar, ao invés de apenas o ensacamento dos botões florais, o que permitiu depositar grande quantidade de grãos de pólen no estigma, pois segundo Stephenson e Bertin (1983), Bawa e Webb (1984) e Waser e Price (1991) em polinizações naturais, o número de grãos de pólen alocados no estigma nem sempre é suficiente para que haja penetração do tubo polínico no óvulo.
No presente trabalho, durante a autofecundação, obteve-se frutificação somente nas cvs. Reubennel e Rosa Mineira (Tab. 3), sendo um indicativo de que são autocompatíveis reprodutivamente. Tal resultado está de acordo com Raseira (2003), a qual afirma que ambas cultivares são moderadamente compatíveis, podendo produzir uma boa colheita comercial, mesmo sem a utilização de
polinizadora, desde que haja um florescimento abundante e condições climáticas favoráveis.
Tabela 3 – Percentagem de frutificação efetiva dos cruzamentos controlados, realizados a campo, nos pomares de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.) da Embrapa Clima Temperado, na safra de 2007/2008. Embrapa/Pelotas/RS, 2010
Genitores femininos Genitores masculinos Frutificação efetiva (%)
América 0 Rosa Mineira 0,66 Pluma 7 0 Amarelinha 0,63 Reubennel 2,44 Santa Rosa 1,33 América The First 0 Reubennel 8,41 América 0,68 Reubennel Rosa Mineira 0 Reubennel 3,47 América 0 Amarelinha 0 Amarelinha Rosa Mineira 1,28 América 0 Reubennel 3,47 Rosa Mineira 1,28 Rosa Mineira Amarelinha 0 América 0 Pluma 7 Pluma 7 0 América 0 Santa Rosa Santa Rosa 0
Nos cruzamentos realizados a campo, ‘América’ apresentou frutificação quando polinizada com as cvs. Rosa Mineira (0,66%), Amarelinha (0,63%), Santa Rosa (1,33%) e Reubennel (2,44%), sendo que esta última apresentou compatibilidade mútua com ‘América’ (0,68%). As cvs. Amarelinha e Rosa Mineira se mostraram compatíveis com ‘Rosa Mineira’ e ’Reubennel’, apresentando 1,28% e 3,47% de frutificação efetiva em ambos cruzamentos, para cada genitora feminina, respectivamente (Tab. 3). Nos demais cruzamentos não houve frutificação. Mesmo assim não é possível afirmar que a falta de frutificação tenha ocorrido devido à autoincompatibilidade reprodutiva, já que existem inúmeros fatores ambientais que podem influenciar no sucesso da frutificação.
Além da incompatibilidade reprodutiva existente entre as cultivares, as condições climáticas no momento da polinização (WEINBERGER, 1975) e após o florescimento, tais como chuva, vento, geadas, seca, entre outros, também podem ocasionar variação na polinização efetiva (THOMPSON; LIV, 1973; BARBOSA, 2006). A pseudocompatibilidade também pode ocorrer, influenciada por fatores ambientais e fisiológicos que permitem ou não a ocorrência de fertilização entre cultivares, neste caso, não existe influência de fatores genéticos para a fecundação (LARSEN, 1983; WHILLIAM; MAIER, 1977; EGEA; BURGOS, 1996).
Ademais, a emasculação, realizada durante os cruzamentos dirigidos, pode causar injúria no pistilo devido à delicada constituição das flores de ameixeira (THIELE; STRYDROM, 1964), sendo um importante fator associado à baixa frutificação observada nos cruzamentos dirigidos.
Diferenças de frutificação efetiva e pegamento do fruto são bastante comuns de um ano para o outro, sendo influenciado pelas condições ambientais no momento da polinização e após o florescimento (WEINBERGER, 1975).
Segundo Nava et al. (2009), recentemente tem sido verificada baixa taxa de frutificação efetiva e/ou irregularidades de produção nos pomares brasileiros de ameixeiras, pessegueiros, e nectarineiras, principalmente em algumas áreas da região sul do Brasil. Ressaltam que dentre os possíveis motivos para este acontecimento está a antecipação do florescimento devido a elevada temperatura durante o período que antecede a floração, acarretando no retardamento do desenvolvimento do gametófito feminino e na formação de anomalias dos gametófitos masculinos. Estes fatores promovem redução da viabilidade do grão de pólen e baixa produção de sacos embrionários viáveis, resultando na falta de sincronia no processo de fecundação, reduzindo, desta forma, a frutificação efetiva. Portanto, esta pode ter sido outra razão para a baixa frutificação efetiva nos cruzamentos realizados no presente estudo, uma vez que na safra 2007/2008 nos pomares de ameixeira da Embrapa Clima Temperado (Pelotas/RS) foram muito prejudicados devido ao rápido aquecimento, no final do inverno, após o acúmulo de frio hibernal, além da incidência de chuvas no período de florescimento, entre os meses de agosto a início de novembro.
De acordo com o Laboratório de Agrometeorologia da Embrapa Clima Temperdo (CPACT) (Pelotas/RS) houve acúmulo de 700h de frio, entre os meses de maio a setembro de 2007, apresentando em média 4h de frio por dia no mês de
maio, 8h nos meses de junho e julho, e 3h no mês de agosto, a partir deste mês as temperaturas começaram a subir, iniciando, desta forma, a floração de diversas cultivares, enquanto que no mês de setembro o acúmulo de horas de frio foi de 13h em apenas três dias do final do mês, causando a queima de diversos botões florais que já haviam florecido. Quanto ao índice pluviométrico foi verificado que durante a época de floração houve um acúmulo de precipitação de 206mm no mês de agosto, no início do florescimento, 148,1mm em setembro, 149,3mm em outubro e 76,9mm em novembro, as chuvas foram bem distribuídas ao longo de cada mês, prejudicando a polinização controlada, realizada a campo (Anexo C).
Em relação aos cruzamentos in vivo, realizados no laboratório, foi observada uma elevada percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática do pistilo, entre 60-100%, exceto para o pólen da cv. Santa Rosa (21,67%) e para a cv. Rosa Mineira (40,23%) quando utilizada para polinizar as cvs. Rosa Mineira e Reubennel, respectivamente. Entretanto, ‘Santa Rosa’ apresentou 70,56% de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. América (Fig. 1), demonstrando que os grãos de pólen utilizados, quando polinizados nos pistilos das respectivas genitoras femininas, estavam viáveis e foram capazes de germinar.
De acordo com a análise de variância houve diferença significativa pelo teste de Duncan para a percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática da planta-mãe apenas entre os cruzamentos realizados com as genitoras femininas ‘América’, ‘Reubennel’ e ‘Rosa Mineira’ (Fig. 1, ilustração na Fig. 2b).
Na genitora feminina ‘América’ o pólen da cv. Amarelinha teve 100% de germinação, diferindo das cultivares Rosa Mineira (71,61%), Santa Rosa (70,56%), América (67,86%) e Reubennel (60%) (Fig. 1a, Apêndice A1). Dentre os cruzamentos realizados com a cv. Amarelinha, a ‘Rosa Mineira’ apresentou 100% de germinação dos grãos de pólen na região estigmática, diferindo apenas do cruzamento com ‘América’ (88,89%) (Fig. 1b, Apêndice A2). Já, em relação à cv. Reubennel houve diferença na percentagem de germinação do grão de pólen no estigma entre os três cruzamentos realizados, com maior percentagem de germinação do pólen da cv. América (94,66%) e menor da cv. Rosa Mineira (40,23%) (Fig. 1c, Apêndice A3). Nos cruzamentos realizados na ‘Rosa Mineira’ os grãos de pólen da própria cultivar e das cvs. Amarelinha e Reubennel apresentaram 100% de germinação no estigma diferindo apenas do pólen da ‘Santa Rosa’ (21,67%) (Fig. 1d, Apêndice A4).
Figura 1 – Percentagem de grãos de pólen germinados no estigma de cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Amarelinha’ (b), ‘Reubennel’ (c), ‘Rosa Mineira’ (d), ‘Pluma 7’ (e) e ‘Santa Rosa’ (f) após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. As barras representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.
Nos cruzamentos realizados nas cultivares ‘Pluma 7’ e ‘Santa Rosa’ não houve diferença significativa, apresentando média de 78,20% e 75,35% dos grãos de pólen germinados na região estigmática, respectivamente (Fig. 1e, 1f e Apêndices A5 e A6, respectivamente).
Genitor feminino cv. América
90,65 60 70,56 67,86 71,61 84,23 100 0 20 40 60 80 100 120 Amare linha The F irst Rosa
Mineira Pluma 7 Améric a Santa Rosa Reube nnel
cultivares doadoras de pólen
G rã os d e pó le n ge rm in ad os n o es tig m a (% )
Genitor feminino cv. Amarelinha
97,27 97,69 100 88,9 0 20 40 60 80 100 120
Reubennel Amarelinha Rosa Mineira América cultivares doadoras de pólen
G rã os d e pó le n ge rm in ad os n o es tig m a (% )
Genitor feminino cv. Reubennel
80,46 94,66 40,23 0 20 40 60 80 100 120
Rosa Mineira América Reubennel cultivares doadoras de pólen
G rã os d e pó le n ge rm in ad os n o es tig m a (% )
Genitor feminino cv. Rosa Mineira
100 89,29 21,67 100 100 0 20 40 60 80 100 120
Reubennel Amarelinha Rosa Mineira América Santa Rosa cultivares doadoras de pólen
G rã os d e pó le n ge rm in ad os n o es tig m a (% ) 71,42 85 0 20 40 60 80 100 120
Pluma 7 x América Pluma 7 x Pluma 7
G rã os d e pó le n ge rm in ad os no e st ig m a (% ) 80,14 70,56 0 20 40 60 80 100 120
Santa Rosa x América América x Santa Rosa
G rã os d e pó le n ge rm in ad os n o es tig m a (% ) d c a b f e
De acordo com estes resultados pode-se verificar que os grãos de pólen de qualquer uma das cultivares utilizadas no presente estudo, foram capazes de germinar no estigma (Fig. 2b), demonstrando sua viabilidade, porém o crescimento do tubo polínico durante o percurso entre o estigma até os óvulos (Fig. 2a), etapa essencial para que ocorra a fecundação e consequente frutificação, pode ser bloqueado por barreiras pré-zigóticas, a exemplo da autoincompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítica que é considerada de maior incidência nas angiospermas (GIBBS, 1986).
Figura 2 – Desenvolvimento do tubo polínico no pistilo de flores das cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após 120h das polinizações
controladas realizada in vivo e mantidas em temperatura ambiente (a). Germinação dos grãos de pólen na superfície estigmática (b), no estilete demonstrando o depósitos de calose (c) e interrupção do crescimento do tubo polínico no estilete (d, e), tubo polínico atingindo o ovário (grau 5) (f) e tubo polínico atingindo o óvulo (grau 6) (g). Embrapa/Pelotas/RS, 2010.
A autoincompatibilidade gametofítica é um mecanismo controlado geneticamente que impede a autopolinização, tornando-se necessária a polinização
a b c d
cruzada, garantindo, desta forma, a variabilidade genética. Quando os alelos-S do gametófito feminino (pistilo) e masculino (grão de pólen) forem diferentes, ocorre a síntese de um polissacarídeo (calose) na parte basal do tubo polínico protegendo-o, permitindo, desta forma, o desenvolvimento do mesmo para que ocorra a fecundação. Já, quando os alelos são iguais, promoverá a inibição ou paralisação do desenvolvimento dos tubos polínicos no estilete, devido a um engrossamento na extremidade dos tubos polínicos, os quais podem romper-se devido a excessiva deposição da própria calose (RAMALHO et al., 1996; WESTWOOD, 1982) (Fig. 2c, 2d e 2e).
O mecanismo de ação que confere a autoincompatibilidade ainda não está bem elucidado. Pode ser que o mecanismo de rejeição envolva a destruição da parede interna do estilete, devido ao acúmulo de calose, ou ainda, o aumento da calose pode ocorrer devido à degeneração prematura do citoplasma em resposta a inibição do CTP (VITI et al., 1997).
Foi verificado o desenvolvimento do tubo polínico alcançando cada um dos pontos, para os quais foram atribuídas notas para o grau de desenvolvimento ao longo do pistilo, após 120h da polinização em temperatura ambiente de 25ºC (Tab. 2 e Fig. 2). De acordo com a análise de variância houve interação significativa para o grau de desenvolvimento do tubo polínico e o pólen utilizado, em cada genitor feminino (Fig. 3).
Nos cruzamentos realizados não foi observada penetração no óvulo e sim, o tubo polínico bem próximo ao óvulo, conforme pode ser observado na fig. 2g. Este fato pode ser justificado pelo tempo decorrido após a polinização, uma vez que em estudos realizados por Carvalho (1989), em relação ao desenvolvimento dos tubos polínicos, em cruzamentos entre cultivares de ameixeira, constatou que nem sempre o tempo de 120 horas é suficiente, sendo necessárias 144 horas, para que os mesmos fecundem os óvulos.
Dentre outros fatores que também podem influenciar a não penetração no óvulo está a imaturidade do órgão reprodutor feminino. Entretanto, este fato não influenciou negativamente os resultados do presente estudo, o qual foi realizado com intuito de verificar se as cultivares apresentavam ou não a incompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítica através do CTP. Para tanto, observou-se apenas se o tubo polínico ultrapassou a barreira da incompatibilidade, que conforme mencionado anteriormente, se localiza no terço médio do estilete.
Figura 3 – Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeiras japonesas
(Prunus salicina Lindl.), em função das polinizações controladas, realizadas in vivo, após 120h, e mantidas em
temperatura ambiente nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Santa Rosa’ (b), ‘Pluma 7’ (c), ‘Amarelinha’ (d), ‘Rosa Mineira’ (e) e ‘Reubennel’ (f). As barras representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.
a b c
Genitor feminino ameixeira japonesa cv. América
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 35 55 30 15 20 15 20 35 40 25 40 25 10 15 10 10 15 35 35 5 25 30 40 5 35 30 15 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
In ci dê nc ia d o tu bo p o lín ic o em . c ad a e ta pa ( % )
América Amarelinha Pluma 7 Reubennel Rosa Mineira Santa Rosa The First
0 5 0 0 60 15 10 10 5 40 30 25 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
% d e in ci dê nc ia d o tu bo po lín ic o em c ad a et ap a
Santa Rosa x América América x Santa Rosa Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Pluma 7
0 0 0 0 0 20 10 25 45 20 30 50 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
In ci dê nc ia d o tu bo po lín ic o. e m c ad a et ap a (% ) América Pluma 7
Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Amarelinha
0000 0 00 00 0 0 0 10 60 20 30 5 5 35 55 100 5 10 85 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
In ci dê nc ia d o tu bo po lín ic o em c ad a et ap a (% )
América Amarelinha Reubennel Rosa Mineira
Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Rosa Mineira
0 00 0 00 00 00 0 0 0 60 10 10 15 5 35 60 5 100 25 60 10 5 70 20 5 5 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
In ci dê nc ia d o tu bo po lín ic o em c ad a et ap a (% )
América Amarelinha Reubennel Rosa Mineira Santa Rosa Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Reubennel
0 0 0 0 0 35 30 20 15 5 10 10 10 55 10 5 70 30 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
In ci dê nc ia d o tu bo po lín ic o. e m c ad a et ap a (% )
América Reubennel Rosa Mineira
d e f
Nos cruzamentos realizados com a cv. América como genitor feminino (Fig. 3a, Apêndice A7), o pólen da própria cultivar apresentou CTP apenas até o estádio 3, que representa o terço médio do estilete, com 55% de incidência, não diferindo estatisticamente do estádio 2, e não apresentando crescimento nos estádios 4, 5 e 6, o que caracteriza a autoincompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítica desta cultivar (RASEIRA, 2003; MOTA, 2008). O tubo polínico da cv. Pluma 7 atingiu 40% de incidência no grau 3, não diferindo dos graus 2 e 4, portanto não apresentou crescimento nos graus 5 e 6. Já com a cv. Santa Rosa houve 40% de incidência também no estádio 3, o qual não diferiu significativamente dos estádios 1 e 2, apresentando CTP até o estágio 5, não havendo nenhuma incidência no estádio 6, evidenciando que o CTP destas duas últimas cultivares, quando polinizadas na cv. América, é mais lento e, provavelmente, seria necessário mais tempo para que chegasse ao óvulo (Fig. 2f e ilustração na Fig. 3a).
Thiele e Stridom (1964) observaram que em casos de incompatibilidade entre ameixeiras, mesmo ocorrendo germinação dos grãos de pólen em 24 horas após a polinização, depois de 48 horas o tubo polínico ainda não atingiu a metade do pistilo, e após 72, 96 e 120 horas os tubos polínicos ainda continuam se desenvolvendo lentamente, podendo, desta forma, indicar certo grau de compatibilidade, concordando com resultados obtidos por Modlibowska (1945), Teskey e Shoemaker (1978), Stott (1972) e Silveira (2008), os quais sugerem que o desenvolvimento dos tubos polínicos nos cruzamentos incompatíveis apresenta crescimento mais lento do que os compatíveis.
De acordo com Frankel e Galum (1977), quando os alelos-S são idênticos, a velocidade de CTP torna-se mais lenta, ou mesmo nula, retardando a sua penetração até o ovário, e quando atinge o mesmo, dificilmente ocorrerá a fecundação, porque geralmente a fase de receptividade do óvulo já passou.
As demais polinizadoras da cv. América apresentaram desenvolvimento do tubo polínico até o estádio 6, ou seja, até o óvulo, porém a cv. Reubennel apresentou 40% de incidência do CTP no estádio 1, não diferindo do 3. A cv. The First também apresentou 35% no estádio 3, diferindo apenas dos estádios 1 e 2, nos quais não apresentaram nenhuma incidência, demonstrando que não houve interrupção do CTP nestes estádios. Quando utilizado a cv. Rosa Mineira como polinizadora, houve 35% de incidência de CTP nos estádios 6 (próximo ao óvulo) e 4 (no último terço do estilete), não diferindo do 3 (no terço médio do estilete),
