Atividade antimicrobiana de extratos vegetais sobre bactérias patogênicas humanas
ALVARENGA, A.L.1; SCHWAN, R.F.2*; DIAS, D.R.3; SCHWAN-ESTRADA, K.R.F.4*; BRAVO-MARTINS, C.E.C.1
1
Departamento de Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Lavras (UFLA); 2Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras, Campus Universitário 37200-000, Lavras, MG; 3Unilavras – Centro Universitário de Lavras; 4*Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Maringá (UEM)-PR. Autor para correspondência: schwan@wnet.com.br
RESUMO: Extratos aquosos e alcoólicos de alecrim (Rosmarinus officinalis), capim-limão (Cymbopogon citratus), gengibre (Zingiber officinale), hortelã (Mentha piperita), orégano (Origanum vulgare) e sálvia (Salvia officinalis), a 10 e 20% (m:m), foram testados quanto à atividade antibacteriana sobre Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Listeria monocytogenes (ATCC 33090), Salmonella choleraesuis (ATCC 14028), Shigella flexneri (ATCC 25931), Streptococcus mitis (ATCC 9811) e Streptococcus mutans (ATCC 25175), utilizando-se o método de difusão em ágar Müller Hinton. Não houve ação antimicrobiana dos extratos aquosos, independente da concentração, sobre nenhum dos microrganismos pesquisados. Os extratos etanólicos das plantas testadas, na concentração de 20%, inibiram parcialmente o crescimento de Shigella flexneri. Palavras-chave: Extratos, plantas medicinais, atividade antimicrobiana
ABSTRACT: Antimicrobial activity of plant extracts against human bacterial pathogens. Aqueous and alcoholic plant extracts, from rosemary (Rosmarinus officinalis), lemongrass (Cymbopogon citratus), gingerroot (Zingiber officinale), peppermint (Mentha piperita), oregano (Origanum vulgare) and sage (Salvia officinalis), at 10 and 20%, were tested against Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Listeria monocytogenes (ATCC 33090), Salmonella choleraesuis (ATCC 14028), Shigella flexneri (ATCC 25931), Streptococcus mitis (ATCC 9811) and Streptococcus mutans (ATCC 25175) using the agar diffusion method. No antimicrobial activity was found in aqueous plant extracts in both concentrations prepared (10 and 20%) upon all microorganisms tested. All alcoholic extracts showed intermediary inhibition properties at 20% against Shigella flexneri.
Key words: Plant extracts, antimicrobial activity, bacterial inhibition
Recebido para publicação em 23/11/2006 Aceito para publicação em 20/03/2007
INTRODUÇÃO
Várias patologias que afetam a Saúde Pública são de origem microbiana e especialmente bacteriana. Estudos com patógenos veiculados pela ingestão de alimentos contaminados, como espécies de Staphylococcus, Listeria, Shigella, Salmonella, entre outros, têm sido realizados (Murray, 2000; Tauxe, 2002). O controle das espécies de Streptococcus, reconhecido como uma das principais bactérias responsáveis pela cárie dentária, tem sido realizado com o uso de produtos antimicrobianos, como forma preventiva de inibir o crescimento destas espécies de bactérias(Yamashita et al., 1993; Koo et al., 2003). A forma de aquisição desta bactéria é por contato direto entre os hospedeiros com objetos
inanimados (chupetas e brinquedos) ou através da saliva (principal via de transmissão) ou ainda pela mãe (a mais importante fonte de infecção) (Yamashita et al., 1993; Cai et al., 1994). Embora estas bactérias apresentem vias de transmissão, sintomatologia e mecanismos de infecção diferentes, as doenças bucais causadas por microrganismos são consideradas grandes problemas de saúde pública (Silver, 2003; Chinivasagam et al., 2004). Para o controle destas patologias bucais são utilizados fármacos que, na maioria são sintetizados em laboratório, e para os quais muito tempo e recursos econômicos são gastos em pesquisas até que possam ser utilizados (Barraca & Minami, 1999).
Apesar da grande diversidade de antimicrobianos que agem sobre diversos microrganismos patogênicos, estudos buscam por um antimicrobiano ideal, ou seja, aquele que apresenta maior espectro de ação, menor toxicidade, menor custo e menor indício de resistência bacteriana, haja vista que já existe resistência bacteriana a alguns produtos antimicrobianos (Nascimento et al., 2000; Pazhani, 2004). A atividade antimicrobiana desejada pode ser encontrada em espécies de plantas medicinais. A flora brasileira apresenta-se altamente diversificada em espécies que na sua maioria ainda não foi pesquisada cientificamente quanto à sua ação antimicrobiana (Simões et al., 2000; Auricchio & Bacchi, 2003).
Tem-se verificado cientificamente o uso popular de plantas com a finalidade de obtenção dos mais variados efeitos medicamentosos, incluindo sua aplicação como antimicrobianos (Pozetti et al.,1972; Kumar & Berwal, 1998; Castro et al., 2000; Koo et al., 2003; Burt, 2004). O uso de plantas medicinais, muitas delas cultivadas no fundo do quintal, é prática secular baseada no conhecimento popular e transmitida oralmente, na maior parte das situações (Nascimento et al., 2000; Castro et al., 2000). Numa população com baixo acesso a medicamentos, como a brasileira, agregar garantias científicas a essa prática terapêutica traz variadas vantagens, como baixo custo e fácil acesso, diminuição de efeitos adversos e evitar ou diminuir os riscos de intoxicação por uso inadequado (Furlan, 1998). Neste sentido, a investigação de materiais naturais como fontes de novos agentes antibacterianos têm aumentado potencialmente nos últimos vinte anos, onde diferentes extratos de plantas medicinais, condimentares e aromáticas têm sido testados (Nascimento et al., 2000; Castro et al., 2000).
Assim, o objetivo deste trabalho foi o de avaliar o efeito de extratos aquoso e etanólico de diferentes plantas aromáticas ou medicinais (orégano (Origanum vulgare), hortelã (Mentha piperita), alecrim (Rosmarinus officinalis L), sálvia (Salvia officinalis), capim limão (Cymbopogon citratus) e gengibre (Zingiber officinale)) sobre bactérias patogênicas de importância em saúde pública (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella choleraesuis, Shigella flexneri, Streptococcus mitis e Streptococcus mutans).
MATERIAL E MÉTODO
Microrganismos testados
O experimento foi realizado no Laboratório de Fisiologia de Microrganismos do Departamento de Biologia e no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência dos Alimentos
da UFLA. Foram utilizadas cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Listeria monocytogenes (ATCC 33090), Salmonella choleraesuis (ATCC 14028), Shigella flexneri (ATCC 25931), Streptococcus mitis (ATCC 9811), Streptococcus mutans (ATCC 25175), adquiridos na Fundação André Tosello.
Preparo dos inóculos
Para a padronização da técnica e dimensionamento do inóculo, uma alçada de cada cepa bacteriana foi semeada em 10 mL do meio de cultura líquido BHI (Brain Heart Infusion) e incubadas a 37ºC por 24 horas. As suspensões de microrganismos foram ajustadas de acordo com o tubo 2 da escala de MacFarland, expressa em número de bactérias mL-1
de meio de cultura (aproximadamente de 6,0 x 108
células mL-1). Foram removidos 100 µL de cada uma
das suspensões bacterianas para posterior inoculação nos meios de origem.
Preparo dos extratos
Para o teste de inibição dos microrganismos foram utilizados extratos aquosos e etanólicos nas concentrações de 10 e 20% (m/m), fornecidos pelo Horto Medicinal do Centro Universitário de Lavras (Unilavras). Estes extratos foram preparados a partir de plantas frescas selecionadas, coletadas no período de 12:00 às 14:00h: folhas e caules novos de orégano (Origanum vulgare L. família Lamiaceae), hortelã (Mentha piperita L; família Lamiaceae) e alecrim (Rosmarinus officinalis L; família Lamiaceae); folhas de sálvia (Salvia officinalis L; família Lamiaceae) e capim limão (Cymbopogon citratus (DC) Stapf, família Poaceae) e rizomas de gengibre (Zingiber officinale [Willd] Roscoe, família Zingiberiaceae). As plantas utilizadas foram botanicamente identificadas e o material herborizado está depositado no Herbário Luna - Unilavras. Para o preparo dos extratos aquosos foram adicionados 100 g de planta em 400 g de água destilada e triturada em Hand Blender (JD-1001) Modelo 14A4257. O homogeneizado obtido foi coado em gaze e filtrado em papel de germinação com auxílio de bomba a vácuo e posteriormente em papel de filtro quantitativo (poros de 8 µm, Quanty). A solução foi ainda submetida à filtragem, utilizando-se filtro Millipore (0,45 µm) originando a solução aquosa a 20% (m/m), que foi acondicionada em frascos e congelada. Em seguida foram adicionados 250 g de água destilada estéril a 250 g da solução a 20%, obtendo-se a solução aquosa a 10%.
Os extratos alcoólicos foram obtidos em etanol/água (70% v/v) nas concentrações de 10 e 20% (m/m), por maceração durante 20 dias à temperatura ambiente. Após este período, a solução foi filtrada em gaze e conservada em frasco âmbar. O extrato etanólico a 10% foi obtido diluindo-se o extrato a 20% em etanol 70% (1:1).
Semeadura dos microrganismos
Streptococcus mutans e S. mitis foram transferidos para meio líquido BHI e incubados para reativação e posterior cultivo em ágar mitis salivarius. Foram removidas 04 alçadas de cada uma delas para 10 mL do meio de cultura líquido BHI, em tubos de ensaio. Após homogeneização, os tubos foram incubados a 37oC por 24 horas e utilizados para os
testes de inibição de crescimento. As demais bactérias foram transferidas para o meio TSB (Tripticase Soy Broth) para reativação e posterior cultivo em TSA (Tripticase Soy Agar) e incubadas conforme mencionado anteriormente. Antes de iniciar os ensaios de inibição, a concentração de células bacterianas foi ajustada ao tubo 2 da escala de MacFarland, apresentando aproximadamente 6 x108
bactérias mL-1, segundo padrões estabelecidos pelo
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2000). O crescimento foi evidenciado pela constatação macroscópica da turvação deste meio de cultura e foi realizada a coloração de Gram para todos os isolados bacterianos utilizados no experimento.
Avaliação da atividade antibacteriana dos extratos
A atividade antibacteriana dos extratos vegetais foi realizada de acordo com Nakamura et al. (1999). Um volume de 100 µL das suspensões bacterianas foi inoculado, em triplicata, em placas contendo Ágar Müeller-Hinton previamente solidificado, utilizando-se alça de Drigaslky. Após a distribuição da suspensão bacteriana, foram inseridos, assepticamente, oito anéis (microcilindros de aço) no meio de cultura em cada placa (à exceção da placa controle). Em seis destes anéis foram colocados os extratos (aquoso ou alcoólico), em um anel o solvente (água ou etanol, a depender do extrato a ser testado) e, no último anel, o antibiótico, específico para cada cepa de bactéria testada. Os antibióticos testados sobre os respectivos microrganismos foram selecionados por serem considerados como padrão para os testes de inibição do crescimento (NCCLS, 2000). Foram utilizados vancomicina (500 mg mL-1) como controle de
Staphylococcus aureus; ciprofloxacina (250 mg mL-1)
nas placas com Shigella flexneri e Salmonella choleraesuis; ampicilina (500 mg mL-1) sobre Listeria
monocytogenes e clorexedina (0,12% m/v) para inibir Streptococcus mutans e S. mitis. Os antibióticos utilizados possuem ação bactericida de largo espectro sobre microrganismos positivos e Gram-negativos, apresentando-se bastante efetivos contra infecções causadas por estas bactérias (Murray et al., 2000).
Depois de montadas, as placas foram
incubadas a 37ºC por 24 horas e avaliado os halos de inibição formados (Ejechi et al., 1999). Para a interpretação dos resultados foram seguidas as recomendações do NCCLS (2000), onde os halos de inibição formados foram comparados com a tabela de referência, sendo os microrganismos classificados como resistente (zona de inibição inferior a 15 mm), intermediário (de 15 a 29 mm) e sensível (de 30 a 35 mm) a determinado agente (NCCLS, 2000).
RESULTADO E DISCUSSÃO
Os extratos aquosos das plantas testadas, a 10%, não promoveram a formação de halos de inibição sobre S. aureus, S. choleraesuis, S. mitis e S. mutans. No caso de S. choleraesuis, o extratos aquosos a 10 e 20% não levaram à formação de halo de inibição, verificando-se resistência ou insensibilidade a estes extratos. No caso de S. aureus, S. mitis e S. mutans os extratos aquosos a 10% não formaram halo. Os extratos aquosos a 20% de gengibre e de hortelã apresentaram halos de inibição superiores àquele observado pela ação da vancomicina sobre S. aureus (Tabela 1). Os demais extratos aquosos estudados apresentaram halos de inibição inferiores aos apresentados pelos antibióticos correspondentes a cada espécie bacteriana.
Na Tabela 2 podem ser observados os resultados da atividade antibacteriana dos extratos etanólicos testados. Os extratos etanólicos a 10% de todas as plantas testadas não causaram qualquer inibição no crescimento de L. monocytogenes, S. choleraesuis e S. aureus, sendo que para este, o extrato etanólico a 20%, também não apresentou formação de halo.
À exceção dos dados observados em S. flexneri, nenhum dos extratos foi capaz de inibir o crescimento bacteriano de forma intermediária ou sensível sendo os halos formados considerados na faixa de resistência microbiana. Todos os extratos vegetais etanólicos, na concentração de 20%, levaram à formação de halos de inibição intermediária de S. flexineri. Os halos encontrados neste trabalho são superiores aos valores encontrados na literatura, sobre o gênero Shigella, quando submetido à ação de extratos de goiabeira, cujo halo foi de 15 mm (Carvalho et al., 2002). Quando testados na concentração de 10% contra o mesmo microrganismo, os extratos de alecrim, capim-limão e gengibre produziram halos de inibição intermediária cujos valores foram superiores ao gerado pelo solvente e também superiores aos respectivos halos a 20%, enquanto que os extratos de hortelã, orégano e sálvia levaram à formação de halos de forma inversa, sendo inferiores na concentração de 10%.
Os resultados obtidos mostraram que os microrganismos Gram-positivos testados (S.aureus, L.
TABELA 1. Halos de inibição (mm) das colônias bacterianas, formados pelos extratos vegetais aquosos nas concentrações de 10 e 20%.
R Resistente = halo de inibição inferior a 15 mm; I Intermediário = halo de inibição de 15 a 29 mm; S Sensível
= halo de inibição de 30 a 35 mm; n = não adicionado. Os espaços em branco (-) indicam ausência de halo de inibição. S. a = Staphylococcus aureus; L. m = Listeria monocytogenes; S. f = Shigella flexneri; S. mitis = Streptococcus mitis; S. mutans = Streptococcus mutans
TABELA 2. Halos de inibição (mm) formados pelos extratos vegetais etanólicos nas concentrações de 10 e 20%.
R Resistente = halo de inibição inferior a 15 mm; I Intermediário = halo de inibição de 15 a 29 mm; S Sensível =
halo de inibição de 30a 35 mm; n = não adicionado. Os espaços em branco (-) indicam ausência de halo de inibição. L. m = Listeria monocytogenes; S. c = Salmonella choleraesuis; S. f = Shigella flexneri; S. mitis = Streptococcus mitis; S. mutans = Streptococcus mutans
monocytogenes, S. mitis e S. mutans) apresentaram resistência aos extratos vegetais, tanto alcoólicos quanto aquosos. Entre os dois Gram-negativos, S. choleraesuis e S. flexneri, houve inibição intermediária da S. flexneri pelos extratos alcoólicos a 10% e 20%, exceto da hortelã e orégano a 10%. Estes resultados corroboram as informações reportadas por outros autores (Deans & Ritchie, 1987; Zaika, 1988; Dorman & Deans, 2000) a respeito da tendência de maior resistência a extratos vegetais em microrganismos Gram-positivos. Em outros relatos, porém, foi observada maior susceptibilidade de microrganismos
Gram-positivos a óleos essenciais (Smith-Palmer et al.,1998; Hussein, 1990). Gonçalves et al. (2005) testaram extratos hidro-alcoolicos de 17 espécies vegetais no controle de S. aureus e verificaram que para 7 destes extratos, a bactéria apresentou-se resistente, demonstrando sensibilidade para os demais.
Dos antibióticos testados, a ciprofloxacina foi capaz de inibir o crescimento de S. choleraesuis de forma sensível (halo médio de 39,0 mm). Sobre Shigella flexneri a inibição foi intermediária (halo médio de 21,0 mm). Ampicilina promoveu inibição
intermediária sobre L. monocytogenes, com halo médio de 29,0 mm. Os demais microrganismos apresentaram resistência aos respectivos antibióticos contra eles testados, de acordo com o preconizado pela NCCLS (2000). Alguns autores (Salyers & Amábile-Cuevas, 1997; Levy, 1997; Chartone-Souza, 1998) citam a existência de cepas de S. aureus multiresistentes, limitando as opções terapêuticas apenas aos antibióticos vancomicina e teicoplamina. Neste trabalho, a cepa de S. aureus testada apresentou resistência a vancomicina (halo médio de 7,5 mm), resultados também observados por outros autores, que isolaram linhagens com sensibilidade reduzida a vancomicina e meticilina (Domin, 1998; Labischinski et al., 1998; Fridkin, 2001).
Os extratos alcoólicos de todas as plantas testadas apresentaram atividade inibitória sobre Shigella flexineri. Para a maioria dos extratos houve formação de halo. Podem ser pesquisadas novas concentrações ou testar as plantas durante o fracionamento químico dos componentes, como perspectivas de melhores resultados e aplicação desses extratos como antibióticos.
AGRADECIMENTO
Os autores agradecem a Vilmar Arlindo de Oliveira e Prof. João Antonio Argenta (Unilavras), por disponibilizar os extratos de plantas testados neste trabalho.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
AURICCHIO, M.T.; BACCHI, E.M. Folhas de Eugenia uniflora L. (pitanga): Revisão. Revista Instituto Adolfo
Lutz, v.62, n.1, p.55-61, 2003.
Barraca, A.S.; Minami, K. Manejo e produção de plantas
medicinais e aromáticas. Relatório de Estágio
Supervisionado Produção vegetal II. ESALQ: Piracicaba, 1999. 51p.
BURT, S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods - a review. International
Journal of Food Microbiology, v.94, p.223- 53, 2004.
CAI, S. et al. Effects of sub-inhibitory concentrations of chemical agents on hydrophobicity and in vivo adherence of Streptococcus mutans and Streptococcus sanguis.
Caries Research, v.28, p.335-41, 1994.
CARVALHO, A.A.T. et al. Atividade antimicrobiana in vitro de extratos hidroalcoólicos de Psidium guajava L. sobre bactérias Gram-negativas. Acta Farmaceutica
Bonaerense, v.21, n.4, p.255-8, 2002.
CASTRO, D.M. et al. Plantas medicinais. Viçosa: Editora UFV, 2000. 220 p.
CHARTONE-SOUZA, E. Bactérias ultra-resistentes: uma guerra quase perdida. Ciência Hoje, v.23, n.138, p.26-35, 1998.
CHINIVASAGAM, H.N. et al. Microbiological status of piggery effluent from 13 piggeries in south east
Queensland region of Australia. Journal of Applied
Microbiology, v.97, n.5, p.883-91, 2004.
DEANS, S.G.; RITCHIE, G. Antibacterial properties of plant essential oils. International Journal of Food
Microbiology, v.5, p.165-80, 1987.
DOMIN, M.A. Highly virulent pathogens – a post antibiotic era? British Journal of Theatre Nursing., v.8, n.2, p.14-8, 1998.
DORMAN, H.J.D.; DEANS, S.G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal
Applied Microbiolology, v.88, n.2, p.308-16, 2000. EJECHI, B.O.; NWAFOR, O.E.; OKOKO, F.J. Growth inhibition of tomato-root fungi by phenolic acid and essential oil extracts of pepper fruit (Dennetia tripetala).
Food Research International, v.32, n.6, p.395-9, 1999.
FRIDKIN, S.K. Vancomycin-intermediate and resistant Staphylococcus aureus: What the infectious disease specialists needs to know. Clinical Infectous Disease, v.32, p.108-15, 2001.
FURLAN, M.R. Cultivo de plantas medicinais. Cuiabá: SEBRAE , 1998. 137p. (Coleção Agroindústria, 13.). GONÇALVES A.I.; ALVES FILHO, A.; MENEZES, H. Estudo comparativo da atividade antimicrobiana de extratos de algumas árvores nativas. Arquivo Instituto Biológico, v.72, n.3, p.353-8, 2005.
HUSSEIN, A.M.S. Antibacterial and antifungal activities of some Libyan aromatics plants. Planta Medica, v.56, p.644-9, 1990.
KOO, H. et al. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.52, p.782-9, 2003.
KUMAR, M.; BERWAL, J.S. Sensitivity of food pathogens to garlic (Allium sativum). Journal of Applied
Microbiology, v.84, n.2, p.213-5, 1998.
LABISCHINSKI, H.; EHLERT, K.; BERGER-BÄCHI, B. The targeting of factors necessary for the expression of methicillin resistance in staphylococci. Journal
Antimicrobial Chemotherapy, v.41, p.581-4, 1998.
LEVY, C.E. Aspectos microbiológicos In: RODRIGUES, E.A.C. et al. Infecções hospitalares: prevenção e controle. Sarvier: São Paulo, 1997. p.591-8.
MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; PARKER, J. Brock
biology of microorganisms. 8.ed. New Jersey:
Prentice-Hall, 1997. p.606-768.
MURRAY, P.R. Microbiologia médica, 3.ed. São Paulo: Guanabara Koogan, 2000. 726p.
NAKAMURA, C.V. et al. Antibacterial activity of Ocimum gratissimum L. essential oil. Memória Instituto Oswaldo
Cruz, v.94, n.5, p.675-8, 1999.
NASCIMENTO, G.G.F. et al. Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, v.31, n.4, p.247-56, 2000.
NATIONAL COMMITTEE OF CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS). Performance standards for
antimicrobial disc susceptibility tests. Wayne, 2000.
PAZHANI, G.P. et al. Clonal multidrug-resistant Shigella dysenteriae Type 1 strains associated with epidemic and sporadic dysenteries in Eastern India. Antimicrobial
Agents Chemotherapy, v.48, n.2, p.681-4, 2004.
POZETTI, G.L. et al. Determinação da atividade antimicrobiana de plantas brasileiras. Revista da
Faculdade de Farmácia e Odontologia, v.6, p.29-33, 1972.
SALYERS, A.A.; AMÁBILE-CUEVAS, C.F. Why are antibiotic genes so resistant to elimination? Antimicrobial Agents
Chemotherapy, v.41, p.2315-21, 1997.
SILVER, S. Bacterial silver resistance: molecular biology and uses and misuses of silver compounds. FEMS
Microbiology Review, v.27, n.2-3, p.341-53, 2003.
SIMÕES, C.M.O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento, 2.ed. Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2001. 821p.
SMITH-PALMER, A.; STEWART, J.; FYFE, L. Antimicrobial properties of plant essential oils and essences against
five important food-borne pathogens. Letters Applied
Microbiology, v.26, p.118-22, 1998.
Tauxe, R.V. Emerging foodborne pathogens. International Journal of Food Microbiology, v.78, p.31-41, 2002.
Yamashita, Y. et al. Role of the Streptococcus mutans gtf genes in caries induction in the specific-pathogen-free rat model. Infection and Immunity, v.61, n.9, p.3811-17, 1993. Zaika, L.L. Spices and herbs: their antimicrobial activity and its determination. Journal Food Nutrition, v.9, p.97-118, 1988.
