DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR ELETROQUÍMICO PARA DETECÇÃO SIMULTÂNEA DE DIFERENTES COMPOSTOS FENÓLICOS USANDO CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA

DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR ELETROQUÍMICO

PARA DETECÇÃO SIMULTÂNEA DE DIFERENTES COMPOSTOS

FENÓLICOS USANDO CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA

Marcos Venicios Correr Dantas

CEATEC fufuh@live.com

Renata K. Mendes Valente

Química Analítica CEATEC

renatavalente@puc-campinas.edu.br

Resumo: A utilização da ferramenta de calibração

multivariada é importante na determinação de dois ou mais contaminantes simultaneamente em uma amostra. Além disso, a novidade do uso de esferas magnéticas para o desenvolvimento de biossensores mais estáveis, sensíveis e seletivos tem aumentado nos últimos anos. As partículas magnéticas possibili-tam que o processo de imobilização do elemento de bioreconhecimento seja realizado em solução, inde-pendentemente do tipo de suporte escolhido como eletrodo, com o auxílio de um imã para separação das fases. Neste sentido,o trabalho teve como obje-tivo a utilização de nanopartículas magnéticas para imobilização enzimática na construção de biossen-sor, para posterior aplicação na determinação de dois compostos fenólicos, simultaneamente, em ma-trizes ambientais, diminuindo o custo e o tempo da análise.

Palavras-chave: Biossensor enzimático, compostos fenólicos, calibração multivariada

Área do Conhecimento: Ciências Exatas e da Terra – Química – CNPq.

1. INTRODUÇÃO

Fenóis são uma classe de compostos químicos ca-racterizados pela presença de um grupo hidroxila (-OH) ligado diretamente a um anel aromático. São substâncias que constituem uma grande grade de poluentes devido à sua alta permeação e toxicidade, o que inclui, em casos de ingestão, efeitos cardio-vasculares, problemas de respiração, acidose meta-bólica, falha renal, efeitos neurológicos, coma e até morte [1,2]. Logo, a sua detecção e quantificação são de extrema importância para ajudar na descon-taminação e prevenção, principalmente quando tal substância é amplamente utilizada em diversos pro-cessos industriais (produção de fármacos, fragrân-cias, materiais poliméricos, detergentes, plásticos, corantes, pesticidas etc.).

Os biossensores são sensores químicos que utilizam material biológico (enzimas, anticorpos, DNA, bacté-rias, tecidos etc.) como reconhecedor. Têm sido uma excelente escolha pra a determinação de substân-cias in situ devido à sua alta seletividade e portabili-dade [3], qualiportabili-dades que são superiores em relação a métodos mais comuns de determinação, como cromatografias e espectrofotometrias.

O material biológico, enzima, tem grande importân-cia, pois o mesmo possui uma alta seletividade a um específico tipo de substrato, o que, aliado a um mé-todo eletroquímico como transdução do sinal, tam-bém garante uma alta sensibilidade ao biossensor [4]. O transdutor monitora as interações físico-químicas entre o substrato a ser analisado e a enzi-ma, o que no caso de um método eletroquímico, envolve uma reação redox, entre os potenciais traba-lhados, do substrato e uma consequente transferên-cia de elétrons, que é o sinal captado na interface solução/eletrodo, na forma de corrente [5]. Logo, a escolha do agente biológico (no caso, enzima tirosi-nase) e do transdutor (eletroquímico, método volta-métrico) são de extrema importância para a eficácia do biossensor que será usado para analisar o subs-trato escolhido (fenóis em amostras ambientais). Entretanto, os biossensores podem possuir baixa estabilidade e, por isso, necessitam de um compo-nente que imobilize a enzima eficientemente no ele-trodo, evitando sua lixiviação para solução, sendo, portanto, uma das etapas mais críticas da construção do dispositivo. Nanopartículas magnéticas têm sido usados para esta finalidade com bastante sucesso [6], pois não só possuem uma alta eficiência em imobilizar a enzima na superfície do eletrodo, mas também possuem a vantagem de serem separadas por um imã da solução inicial contendo a enzima, facilitando no processo de construção do biossensor. Devido a sua alta área superficial, as nanopartículas podem aumentar a quantidade de biomolécula

imobi-lizada, com consequente incremento na sensibilidade do aparato.

Para obtenção de melhores resultados analíticos, métodos de calibração têm sido usados para propici-ar maiores informações sobre o sistema. A calibra-ção, em geral, é uma operação que relaciona uma grandeza de saída com uma grandeza de entrada, para um sistema de medida sob determinadas condi-ções [7]. A calibração se inicia a partir da construção de um modelo matemático, relacionando o sinal de um determinado instrumento analítico com alguma propriedade de interesse das amostras estudadas. Selecionado o modelo adequado, a quantificação da propriedade em amostras é possível. A calibração univariada relaciona uma única resposta (variável) com essa propriedade de interesse, enquanto que na multivariada existe uma relação de um conjunto de respostas [8].

Dessa forma, tratando-se de análises em amostras complexas, como as de interesse ambiental (matri-zes com várias substâncias presentes, cujos sinais podem causar interferência no analito), a calibração multivariada pode proporcionar informações sobre várias espécies de interesse (no caso, fenóis), numa mesma análise, diminuindo o tempo de resposta e tornando o procedimento menos laborioso e, princi-palmente, gerando menos resíduos.

Neste contexto o trabalho teve como objetivo a avali-ação da possibilidade de determinavali-ação de mais de um composto fenólico, simultaneamente, usando um biossensor de pasta de carbono a base de tirosinase extraída do inhame sobre nanopartículas magnéticas de Fe2O3.

2. METODOLOGIA

2.1 Equipamentos e materiais

Equipamentos utilizados: balança de precisão Shi-madzu AW 220, centrífuga Excelsa II Modelo 206 MP Fanem, espectrofotômetro UV/Vis HP Agilent 8453, pHmetro Digimed DM 20 e potenciostatoPGSTAT 101, Metrohm.

Reagentes utilizados: solução de guaiacol 2% (Di-nâmica), óleo mineral Nujol® (Mantecorp), fosfato de sódio bibásico heptahidratado P.A (Synth), fosfatode potássio monobásico P.A (Synth), hidroquinona P.A (Synth), pó deGrafite (Aldrich), peróxido de hidrogê-nio (Dinâmica) e nanopartíoculas magnéticas de Fe2O3 - preparadas e fornecidas pela Profª Drª Eliza-beth Fátima de Souza.

2.2. Obtenção do extrato enzimático do inhame

Com a finalidade de usar o mesmo produto, foi sele-cionada uma área do plantio exclusivamente para retirada do inhame. Após lavagem e secagem, 25 g do vegetal descascado foram picados e homogenei-zados em um liquidificador com 100 mL de tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,0). Em seguida, o extrato foi filtrado em quatro camadas de tecido (gaze) e centri-fugado a 1800 rpm durante 20 min a 4 ºC. A solução sobrenadante foi então separada e dividida em di-versas alíquotas de 250 µL que foram armazenadas em refrigerador a 4ºC e usadas como fonte enzimáti-ca de tirosinase.

2.3 Preparação do biossensor usando nanopartí-culas magnéticas de Fe2O3

As esferas magnéticas foram primeiramente lavadas com solução tampão fosfato pH 7,0. Para isso, 50 µL da solução contendo as esferas foram transferidas em um Eppendorf®, em seguida foram adicionados 200 µL da solução tampão e o frasco foi agitado durante 1 minuto. Com o auxílio de um imã a solução foi retirada e o processo foi repetido mais duas ve-zes.

Após a lavagem, 50 µL da solução contendo as esfe-ras magnéticas de Fe2O3 foram adicionadas à um Eppendorf contendo 200 µL do extrato bruto de i-nhame, fonte da enzima tirosinase usada no trabalho para a mesma ser adsorvida nas nanopartículas. Agitou-se por um minuto e o Eppendorf® foi coloca-do na geladeira por 30 minutos e a cada 5 minutos agitou-se por 1 minuto para garantir que a enzima interagisse com as partículas. Após completar-se o tempo, separaram-se as partículas do líquido enzi-mático e adicionaram-se as mesmas a 0,175g de pó de grafite. A pasta foi então homogeneizada no al-mofariz por 10 minutos e em seguida por mais 10 minutos com três gotas de óleo mineral Nujol. A pas-ta então foi embutida no eletrodo para a realização das leituras.

Para estudar o efeito de imobilização da enzima tirosinase no eletrodo via nanopartículas de Fe2O3, outro biossensor foi construído, sem a adição das partículas para ser usado como controle.

2.4 Parâmetros analíticos avaliados com o bios-sensor

Foram realizados estudos para obtenção de dados analíticos usando o biossensor proposto. Primeira-mente, foi avaliado se as nanopartículas de Fe2O3 realmente estavam aumentando a sensibilidade do dispositivo. Para isso, construiu-se um

biossensor-com apenas o extrato enzimático e um biossensor modificado com as nanopartículas de Fe2O3 mais o extrato de tirosinase. Mediu-se a corrente de cada um com a solução tampão fosfato contendo 1mmol.L-1 de hidroquinona, 1,8mmol.L-1 de guaiacol e uma mistura de mesma concentração dos dois – com o auxílio de um potenciostato.

Após foram realizados os estudos de repetibilidade das medidas para verficação de possíveis variações das medidas no decorrer o tempo, diminuindo a es-tabilidade do sensor. Para isto foram realizados dois testes de repetibilidade, avaliando seis medições em sequência, sem a troca da pasta e na mesma solu-ção contendo 5mL do tampão fosfato 0,1 mol.L-1 pH 7,0 e 1,8 mmol.L-1 de guaiacol. Um segundo teste também foi realizado por seis medidas em sequên-cia, sem trocar a pasta, mas em solução tampão fosfato 0,1 mol.L-1 pH 7,0 contendo 1 mmol.L-1 de hidroquinona.

2.5 Calibração multivariada

Na construção do modelo de calibração, o conjunto original de dados: matriz X e vetor y com a proprie-dade a ser calibrada, normalmente é dividido em dois conjuntos disjuntos denominados de calibração e previsão. O conjunto de calibração normalmente contêm 70% das amostras é e utilizado para cons-trução do modelo e determinação do número ótimo de variáveis latentes a ser utilizado. O conjunto de previsão é utilizado para verificar a capacidade de previsão do modelo a novas amostras que não parti-ciparam de sua construção. Assim, para a realização do estudo, foram produzidas 30 amostras, sendo 20 para calibração e 10 para previsão, cada uma con-tendo uma razão distinta de concentração dos com-postos avaliados: guaiacol e hidroquinona.

Os voltamogramas cíclicos foram constituídos por 220 variáveis e estas foram centradas na média an-tes da construção do modelo PLS. Este procedimen-to foi adotado para dar a procedimen-todas as variáveis a mesma importância durante a modelagem.

O número de variáveis latentes do modelo PLS foi otimizado pelo método venetianblind5-fold. Os inter-valos de confiança foram determinados de acordo com a norma ASTM E 1655-12.O software usado para a obtenção destes dados foi o Matlab 7.1.

3. RESULTADOS

3.1. Avaliação da eficiência do processo de imo-bilização das enzimas por nanopartículas magné-ticas de Fe2O3

Para avaliar se as nanopartículas de Fe2O3 estavam, de fato, aumentando o sinal, devido ao aumento do

número de enzimas aderidas à pasta, foram realiza-dos três medições em sequência: uma sem fenol, uma utilizando a pasta sem nanopartículas de Fe2O3 (controle) mas com guaiacol e uma com a pasta contendo as nanopartículas com guaiacol na solu-ção. A Figura 1 mostra os resultados obtidos.

Figura 1 - Voltamograma mostrando o comportamento do biossensor com e sem nanopartículas em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 7,0, contendo 1,8 mmol L-1 de guaiacol.

Ao observar a Figura 1, percebe-se que com apenas a solução tampão não há nenhum pico referente ao processo de oxirredução devido à ausência de fenol. No entanto, percebe-se a atividade do biossensor com a adição de guaiacol, com a existência de picos referentes à oxidação e redução do fenol entre 50 e 150 mV, como visto na linha vermelha. A linha verde, referente ao biossensor modificado com as partículas de Fe2O3, mostra um aumento de sinal, que indica que as enzimas estão aderindo às partículas e à pasta em maior quantidade como esperado, o que justifica aumento na sensibilidade do aparato.

3.2 Avaliação da resposta do biossensor com mais de um composto fenólico em solução

Com o intuito de medir as diferentes respostas gera-das por distintos compostos fenólicos e identificá-los individualmente, foram realizadas diversas medições em um potenciostato com dois compostos fenólicos: guaiacol e hidroquinona (Figura 2). As medições foram realizados separadamente em 5,0 mL de solu-ção tampão fosfato 0,1 mol.L-1 pH 7,0 com 1,8mmol.L-1 de guaiacol, 1 mmol.L-1 de hidroquinona e um terceiro com ambos.

-5,00E-06 0,00E+00 5,00E-06 1,00E-05 1,50E-05 2,00E-05 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 I (A ) E (V) Tampão

Sem nano + Guaiacol Com nano + Guaiacol

Figura 2 - Voltamogramas obtidos nas corridas com guaiacol, hidroquinona e mistura de ambos.

Como podemos observar na Figura 2, na solução contendo guaiacol pode-se verificar os picos referen-tes ao processo de oxirredução do fenol, assim como na linha vermelha foi-se verificado os picos referen-tes à hidroquinona. Na linha roxa, entretanto, pode ser verificado uma mistura de sinais. Será necessário um processo avaliativo de quimiometria para poder-se poder-separá-los e identificá-los poder-separadamente, uma vez que os sinais referentes à hidroquinona e ao guaiacol estão sobrepostos e, logo, impossível de analisar numa mistura simultaneamente.

3.3 Avaliação da repetibilidade do biossensor

As medições foram realizadas utilizando um único dispositivo contendo as nanopartículas de Fe2O3 e foram realizadas seis medições subseqüentes em 1,8 mmol.L-1 de guaiacol em solução tampão fosfato 0,1 mol.L-1 pH 7,0 e 6 medições em 1,0 mmol.L-1 de hidroquinona em solução tampão fosfato 0,1 mol.L-1, sem a troca da pasta ou da solução entre o mesmo fenol. Os resultados obtidos estão indicados na Ta-bela 1.

Tabela 1 - Valores de corrente das 6 medidas realiza-das em guaiacol e hidroquinona em solução tampão fosfato 0,1 mol.L-1 e os erros obtidos, respectivamente.

Medição Corrente / A Guaiacol Corrente / A Hidroquinona 1 2,35 x 10-6 7,06 x 10-6 2 2,46 x 10-6 6,91 x 10-6 3 2,54 x 10-6 6,87 x 10-6 4 2,54 x 10-6 6,82 x 10-6 5 2,61 x 10-6 6,67 x 10-6 6 2,57 x 10-6 6,65 x 10-6 Coeficiente de Variação (%) 3,759% 2,296%

Como podemos observar ambos os coeficientes de variação estão abaixo dos 4%, o que indica a boa repetibilidade do biossensor para os fenóis avalia-dos. No entanto, se compararmos os compostos fenólicos, percebe-se que as curvas obtidas em hi-droquinona sofrem menores variações e, portanto, são mais robustas.

3.4 Previsão do modelo de calibração multivaria-da Partial Least Squares (PLS

)

Após a obtenção dos parâmetros analíticos do bios-sensor para os compostos fenólicos, foi iniciada a construção do modelo de calibração multivariada para poder identificar e quantificar dois diferentes fenóis em uma mesma amostra, guaiacol e hidroqui-nona. À medida que as concentrações de guaiacol e hidroquinona vão sendo aumentadas na solução a corrente de pico se eleva (Figura 3). Esta relação linear entre as concentração dos dois constituintes e o voltamograma pode ser melhor estudada com o modelo de calibração multivariada PLS, pois este leva em consideração todo o voltamograma cíclico obtido, e não somente um pico de corrente máxima ou mínima. Assim, é possível obter mais informações com o mesmo conjunto de dados.

Figura 3 - Voltamograma cíclico da mistura de guaiacol e hidroquinona. Em azul: menores concentrações e em vermelho: maiores concentrações de ambos. -2,00E-05 -1,50E-05 -1,00E-05 -5,00E-06 0,00E+00 5,00E-06 1,00E-05 1,50E-05 2,00E-05 2,50E-05 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 I (A ) E (V) Tampão Guaiacol Hidroquinona Mistura

Os erros médio quadrático de calibração (RMSEC) e previsão (RMSEP) dos modelos para quantificação de guaiacol e hidroquinona são semelhantes, ou seja, não apresenta um sobreajuste, e abaixo do teor mínimo destes componentes na mistura (Tabela 2). A boa relação linear entre os valores de concentra-ção de referência e previsto pelo modelo PLS com quatro variáveis latentes pode ser observado pelo alto coeficiente de determinação (R2) obtido para os modelos, com valores superiores a 0,99. Isto tam-bém pode ser observado pelo bom ajuste apresenta-do pelos modelos na Figura 4, na qual observa-se excelente correlação entre os valores de concentra-ção previstos e medidos.

Tabela 2 - Figuras de mérito do modelo PLS para quan-tificação da concentração de guaiacol e hidroquinona.

Parâmetro estatístico Guaiacol Hidroquinona

RMSEC 8,56·10-5 4,83·10-5 RMSECV 9,30·10-5 5,27·10-5 RMSEP 11,9·10-5 6,73·10-5 R2 calibração 0,9981 0,9981 R2 validação cruzada 0,9970 0,9970 R2 previsão 0,9956 0,9956

Figura 4 - Gráficos dos valores de concentrações de guaiacol e hidroquinona, respectivamente, previstas pelo modelo PLS com 4 variáveis latente em função dos valores de concentração de guaiacol e hidroqui-nona de referência. As barras de erros em cada mar-cador referem-se ao intervalo de confiança de 95% em cada previsão. A reta em azul representa a relação linear ideal.

Não há muitos trabalhos que envolvam calibração multivariada com dados eletroquímicos, porém, com estes bons resultados do emprego da calibração

multivariada PLS e biossensor, destaca-se a vanta-gem de se aproveitar uma maior quantidade de in-formações do voltamograma para o desenvolvimento do modelo matemático de regressão por mínimos quadrados parciais (PLS), e a possibilidade de, a partir de um único modelo, poder determinar a con-centração simultânea de multicompostos.

4. CONCLUSÕES

Dadas as propriedades tóxicas e ao largo uso de compostos fenólicos em indústrias, a sua identifica-ção e quantificaidentifica-ção é de importância ambiental. Bi-ossensores enzimáticos têm tido um grande sucesso como método de detecção e quantificação de com-postos em amostras ambientais, devido à sua alta seletividade e precisão, o que junto à facilidade de uso, rapidez dos resultados e relativo baixo custo, os tornam uma boa escolha para a análise de amostras ambientais. Os estudos realizados demonstram que as nanopartículas magnéticas não só melhoram a resposta do biossensor, mas também mantêm a boa precisão nas respostas e estabilidade das medidas. Além disso, analisando o modelo de PLS construído, é possível fazer a determinação com exatidão de guaiacol e hidroquinona simultaneamente usando o biossensor proposto. Estas características tornam o dispositivo apresentado uma alternativa promissora para uso na área ambiental.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pela bolsa concedida e à PUC-Campinas pela oportunidade.

REFERÊNCIAS

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