27 Atividade in vitro de formulações tópicas contendo extrato e óleo de
Rosmarinus officinalis frente à Malassezia furfur e Candida spp.
Thiane M. Messina1; Rodrigo A. Vaucher2; *Janice L. Giongo1
1 Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Faculdade de Farmácia, Universidade Regional
Integrada do Alto Uruguai e das Missões (URI) Santiago, Rio Grande do Sul, Brasil. www.urisantiago.br
2 Programa de Pós Graduação em Bioquímica e Bioprospecção, Centro de Ciências Químicas
Farmacêuticas e de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. www.ufpel.br
*janicegiongo@hotmail.com
Avenida Batista Bonoto Sobrinho, s/n, CEP 97700-00
Resumo
Nos últimos anos tem se utilizado produtos naturais como novas estratégias de controle das dermatomicoses. Rosmarinus officinalis pode ser uma alternativa interessante, por possuir amplas propriedades farmacológicas comprovadas, como atividade antibacteriana e antifúngica, sendo candidato ao controle de dermatomicoses. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica in vitro de formulações tópicas contendo o extrato ou óleo de
Rosmarinus officinalis frente aos fungos Malassezia furfur e Candida spp. Os
28 Abstract
In recent years has used natural products as new control strategies dermatomycoses, including the Rosmarinus officinalis may be a new alternative, proven to possess broad pharmacological properties including antibacterial and antifungal activity mainly for control of opportunistic dermatomycoses and human microbiota. This study aims to evaluate the in vitro antifungal activity of topical formulations containing R. officinalis extract and oil forward to dermatomycoses caused by Malassezia furfur and Candida sp. The results showed that the R.
officinalis oil has activity against Candida albicans, Candida guilliermondii and Candida kefyr, with inhibition zones were 20 mm, 18 mm and 18mm, respectively.
When the R. officinalis oil was incorporated into the formulations, was observed that increasing its concentration was proportional to the inhibitory effect. The determination of the MIC for R. officinalis oil front M. furfur was 112 µg/ml. This study demonstrates the importance of research on alternative assets to combat these fungi which are the main cause of mycosis.
Introdução
Nos últimos anos as infecções fúngicas têm aumentado consideravelmente, principalmente as dermatomicoses. Este aumento tem se dado por inúmeros fatores como: o melhor diagnóstico laboratorial e clínico, o aumento da sobrevida de pacientes com doenças imunossupressoras e o emprego de medicamentos imunossupressores, utilizados às vezes de forma abusiva, permitindo a instalação de micro-organismos convencionalmente saprófitos (Fenner et al. 2006).
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por leveduras e outros fungos filamentosos, além de agentes da microbiota humana, como a Malassezia furfur e Candida spp. (Rotta, 2011).
A Malassezia spp. é uma levedura que coloniza o hospedeiro já nas primeiras semanas de vida, com prevalência elevada na população adulta. O fungo tem sido associado a outras entidades clínicas como doenças com componente seborreico, fundamentalmente a dermatite seborreica, onicomicoses e infecções sistêmicas (Sidrim, 2004). De acordo com estudos morfológicos, bioquímicos e biomoleculares, divide-se em sete espécies capazes de provocar infecções no homem e nos animais: M. furfur, M. globosa, M. obtusa, M
pachydermatis, M. restricta, M. sloffiae e M. sympodialis (Vidotto 2004).
Candida spp. é reconhecida como a levedura mais usualmente envolvida na
etiologia de infecções micóticas, sendo denominadas candidíase. A Candida
albicans é seu agente etiológico mais frequente. Ainda, outras espécies inseridas
no gênero Candida (C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. stellatoidea, C.
tropicallis) também podem estar envolvidas na etiologia da candidíase. Os
quadros clínicos mais rotineiramente reportados relacionados à candidíase são a do tipo cutâneo-mucosa, sistêmica/visceral e alérgica (Lima et al. 2006).
O uso de medicamentos tradicionais para a cura de doenças de pele na dermatologia tem um longo fundo histórico. Pesquisas mais recentes revelaram que alguns produtos à base de plantas possuem melhor eficácia antifúngica e menos efeitos indesejáveis em seres humanos, em comparação com determinados agentes quimioterapêuticos (Shukla et al. 2011).
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preparações galênicas ou na aromatização de fórmulas destinadas a uso oral, semelhante a drogas vegetais ricas em óleos voláteis (Hentz & Santin, 2007).
Dentre suas propriedades podemos citar as atividades antiespasmódica, anti-inflamatória, antisséptica, antifúngica e antibacteriana, contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (Teixeira, 2012). Seus constituintes químicos são: óleo essencial (alfa-pineno, cânfora, eucaliptol, borneol e canfeno); flavonoides (que representam os compostos fenólicos); ácidos polifenólicos e ácido rosmarínico. Além desses, ainda estão presentes, em menor concentração, substâncias como taninos, ácidos e álcoois (Cunha et al. 2005).
O desenvolvimento de produtos naturais com potencial aplicabilidade clínica pode criar novas estratégias de controle para dermatomicoses, bem como suprir os inconvenientes e fragilidades dos produtos disponíveis comercialmente, como a resistência aos antifúngicos comumente utilizados. Destaca-se que o estudo dos produtos naturais pode trazer ao profissional de saúde uma alternativa terapêutica de menor custo e viável ao tratamento de dermatomicoses. Diante do exposto, esse trabalho teve como objetivo, avaliar a atividade in vitro de formulações tópicas com diferentes concentrações contendo extrato e óleo de Rosmarinus
officinalis frente à dermatomicoses causadas por Malassezia furfur e Candida spp.
Materiais e métodos
Local
O presente estudo foi realizado nos laboratórios de Tecnologia Farmacêutica e Controle de Qualidade da Faculdade de Farmácia, da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões (URI) em Santiago/RS.
Amostras
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Laboratório de Farmacognosia da mesma instituição. Em seguida, as folhas foram pesadas, lavadas em água corrente e submetidas ao processo de maceração por um período de 15 dias à temperatura ambiente. A solução extratora utilizada foi uma solução hidroalcoólica a 70% v/v por se tratar de uma planta aromática, rica em óleos essenciais, visando à obtenção de todos os componentes químicos do alecrim durante a maceração. Assim, foram utilizados 1000 mL de solução hidroalcoólica para 450 g de matéria prima fresca. Decorrido o período de maceração, o material foi filtrado para remoção de resíduos sólidos, obtendo-se 935 mL de extrato, havendo perda por evaporação de 65 mL. Após filtração, o extrato foi acondicionado em frascos âmbar, previamente limpos e secos e foram estocados em câmara fria. Obteve-se um extrato de cor verde-oliva, odor cítrico adocicado e sabor adstringente, levemente amargo.
O óleo de Rosmarinus officinalis foi obtido comercialmente da empresa Phytoterápica.
Formulação contendo Rosmarinus officinalis
As formulações desenvolvidas utilizaram diferentes concentrações de extrato e óleo de R. officinalis. A fase aquosa foi aquecida a uma temperatura de 75 ºC e a fase oleosa a uma temperatura de 65 ºC. A fase aquosa foi vertida lentamente sobre a oleosa, sob constante agitação até seu resfriamento. Após obterem homogeneidade e consistência foi adicionado o extrato ou o óleo de
Rosmarinus officinalis nas concentrações de 5% e 10%. Todas as formulações
foram preparadas e avaliadas em triplicatas. A Tabela I descreve a composição qualitativa e quantitativa das formulações, que foram preparadas de acordo com técnica usual de preparação de emulsões, pelo método de inversão das fases.
Tabela I – Composição qualitativa e quantitativa das formulações.
32 Propilparabeno (nipazol) 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% BHT 0,03% 0,03% 0,03% 0,03% 0,03% Óleo de R. officinalis 5,0% 10,0% - - - Extrato de R. officinalis - - 5,0% 10,0% - Água destilada Qs Qs Qs Qs Qs Micro-organismos
Foram utilizadas cepas de: Candida albicans ATCC 14053, C. tropicalis ATCC 66029, C. parapsilosis ATCC 22019, C. glabrata ATCC 66032, C.
dubliniensis CBS 7987, C. krusei ATCC 6258, C. guilliermondii ATCC 6260, C kefyr ATCC 66028 e Malassezia furfur ATCC 14521.
Meio de cultura
O meio de cultura empregado para os testes de atividade antifúngica no método de disco-difusão em Candida spp., e preconizado pelo CLSI foi o ágar
Mueller-Hinton suplementado com 2% de glicose e 0,5 µg/mL de azul de metileno. Para os ensaios com Malassezia furfur foi usado o ágar Sabouraud
dextrose (ASD) a 2%, preparado conforme as instruções do fabricante, adicionado de óleo de oliva a 1%. Este meio foi distribuído em alíquotas de 21 mL, em tubos de ensaios (18 x 180 mm), esterilizados em autoclave a 121ºC, durante 15 min.
Inóculo
33 Inativação do sistema conservante das formulações
Para a realização dos ensaios de atividade antifúngica é necessário que se realize a inativação do sistema conservante. Os constituintes da formulação podem interferir na difusão do ativo na placa. Em cada uma das fórmulas (F1, F2, F3 e F4) adicionou-se polissorbato 80 a 1%, pois as mesmas continham o conservante metilparabeno. A inibição do conservante é fundamental para que este não atue sobre o micro-organismo. Foram feitas formulações controles sem o óleo ou extrato de R. officinalis, contendo também polissorbato 80 a 1%.
Ensaio de Disco de Difusão para Candida spp.
34 Leitura dos resultados:
Após o período de incubação de 24 horas, foi realizada a leitura dos resultados. A visualização dos halos (zonas) de inibição obtidos foi realizada sob iluminação contra um fundo escuro e mensurado utilizando paquímetro digital. Os resultados foram expressos em (mm) de diâmetro do halo de inibição. Segundo CLSI, o protocolo M44-A2 cita que caso, a leitura de 24 h não for satisfatória, deve-se fazer nova leitura com período de 48 h de incubação (CLSI 2009).
Interpretação dos resultados:
A interpretação dos resultados foi estabelecida conforme os critérios definidos pelo protocolo M44-A2 (CLSI 2008) e descritos na tabela II. Os testes foram interpretados 48 h após a incubação de 37ºC.
Tabela II: Zonas de inibição (mm) em Ágar Miller-Hinton adicionado de 2 % de glicose e azul de metileno, segundo CLSI protocolo M44-A2 (2008).
Antifúngicos Sensível Intermediário Resistente
Anfotericina B 100 μg ≥ 15 15 – 18 (DD) < 10
Fluconazol 25 μg ≥ 19 10 -14 ≤ 13
Voriconazol 1μg ≥ 17 14 – 16 (DD) ≤ 14
Concentração Inibitória Mínima (CIM) para M. Furfur
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realizada de forma visual em microscópio invertido. Foi realizado um controle negativo, somente com RPMI e o inóculo.
Resultados e discussões
A atividade antifúngica do óleo essencial de Rosmarinus officinalis tem sido objeto de estudo de várias pesquisas, sendo essa planta de grande importância econômica, e muito utilizada na indústria de alimentos, cosméticos e também para fins medicinais (Castro 2011). Entre os resultados obtidos, ressalta-se a atividade frente às cepas de Candida. Quando o óleo de R. officinalis foi utilizado frente à C.
albicans, C. guilliermondii e C. kefyr, observaram-se halos de inibição com
diâmetro de 20 mm, 18mm e 18mm, respectivamente (Tabela III). Tais halos foram superiores se comparados aos antifúngicos convencionais preconizados pelo CLSI, conforme observado na tabela II.
Dentre as leveduras testadas, C. krusei foi a mais sensível ao extrato utilizado, enquanto que as cepas de C. albicans, C, dubliniensis e C. guilliermondii apresentaram halo de inibição de 10mm. Estes dados são relevantes, uma vez que a C. albicans apresenta baixa susceptibilidade aos antifúngicos convencionais.
Tabela III: Médias dos halos (mm) de inibição do extrato e óleo de R.
officinalis frente à Candida sp.
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Castro (2011), verificou a susceptibilidade da C. albicans e C. tropicalis frente ao óleo de R. officinalis, e todas as cepas mostraram-se sensíveis, exceto em algumas cepas com diferentes ATCC. Outros estudos relatam que os diferentes extratos, como o etanólico, diclorometânico e metanólico, além do óleo essencial de R. officinalis, apresentaram propriedade antifúngica sobre cepas de
C. albicans e C. tropicalis (Castilho 2007). Nascimento et al. (2000) também
verificaram a susceptibilidade da C. albicans frente ao extrato de R. officinalis. Quanto ao óleo essencial, Packer & Luz (2007) observaram, a partir do teste de difusão em meio sólido, atividade fungistática do mesmo, identificando halos de inibição maiores que 60 mm.
Diferentemente do nosso estudo, Lima et al. (2006), verificaram que o óleo essencial de R. officinalis apresentou baixa atividade antifúngica sobre as cepas de C. albicans, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis e C. stellatoidea. Resultados semelhantes também foram observados por Araújo et al. (2004), que avaliaram a atividade antifúngica do óleo essencial dessa planta frente às cepas de Candida.
A maior ou menor atividade biológica dos óleos essenciais tem se mostrado dependente da composição de seus constituintes químicos. Os constituintes majoritários do óleo de R. officinalis são o α-pineno, β-mirceno, 1,8 cineol e verbenona, correspondendo a 75,5 % do total do óleo (Ribeiro et al. 2012). Estes constituintes demonstram ser os responsáveis pelas propriedades antissépticas, antibacterianas, antifúngicas e antiparasitárias (Lima 2006).
Cabe salientar que o óleo de R. officinalis utilizado em nosso estudo, foi obtido comercialmente, em consequência, desconhecemos as reais condições de coleta e processamento do material botânico. Este fator como já mencionado, pode interferir nos resultados obtidos. Segundo Carvalho Junior (2004), variações
6260
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significantes na composição química do óleo essencial de alecrim, dependem da região de cultivo, do método de extração utilizado, do método de análise, da parte da planta utilizada (folha ou planta inteira) e do preparo da matéria prima (in natura ou seca).
Após a obtenção dos resultados com o óleo e o extrato de R. officinalis frente às cepas de Candida, desenvolvemos formulações para uso tópico, já previamente testadas em relação a sua estabilidade (C. Moleta, dados não publicados). Os produtos de origem vegetal são interessantes para área farmacêutica por apresentarem um variado potencial terapêutico.
Pesquisas revelam que cerca de 30% dos medicamentos utilizados são originários de plantas, isolados diretamente ou produzidos por síntese a partir de um precursor vegetal. Os produtos naturais continuam sendo umas das maiores fontes para a descoberta de novos medicamentos com atividade antimicrobiana, cicatrizante, anti-inflamatória, antineoplásica, entre outras (Castilho et al. 2006).
Antifúngicos contendo nistatina, cetoconazol e miconazol têm sido utilizados há muitos anos como padrão-ouro no controle de fungos tópicos, porém, seus efeitos indesejáveis estão estimulando a busca por plantas medicinais com ação antifúngica. Na tabela IV encontram-se os resultados para as formulações desenvolvidas. O ensaio foi realizado somente com as cepas que tiveram uma maior inibição frente ao extrato e ao óleo de R. officinalis.
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Os resultados obtidos neste estudo demonstram que as formulações desenvolvidas com os extratos nas diferentes concentrações não inibiram as cepas de Candida testadas, ou seja, não apresentaram atividade antifúngica. Quando o óleo de R. officinalis foi incorporado observou-se que o aumento de sua concentração foi proporcional ao seu efeito inibitório. Propriedades como volatilidade, insolubilidade em água, viscosidade e complexidade química resultam em difusão irregular dos componentes lipofílicos dos óleos e, consequentemente, em concentrações desiguais do óleo no ágar (Nascimento et al. 2007).
É importante salientar que a metodologia do ensaio microbiológico pode influenciar nos resultados obtidos. Estudos utilizando poços apresentaram diferenças em relação à técnica de disco de papel filtro. Sabe-se que a forma de apresentação do material pode interferir no perfil de resposta (Salomão et al. 2007). Oliveira (2005) testou os dois métodos utilizando extrato de Syzygium
cumini (jambolão) e observou que existe diferença significativa dos diâmetros
encontrados pelas duas técnicas. Na maioria de seus resultados foi observado que a técnica de poços apresenta maior halo de inibição para uma mesma concentração. A transferência de massa no meio líquido é favorecida em relação ao meio sólido.
Um estudo microbiológico realizado com formulações contendo extrato de própolis demonstrou que o creme-gel sob diferentes pHs apresentou halos de inibição muito pequenos para C. albicans. Porém, a formulação sem incorporação de ativos apresentou halo de aproximadamente 10 mm, inibição esta provavelmente resultante do conservante existente na base (Bittencourt 2008).
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Além das cepas de Candida, utilizou-se o fungo lipofílico Malassezia furfur,
(Pityrosporum orbiculare) que está associado à pitiríase versicolor, foliculite,
dermatite seborreica e atópica, fungemia e infecções sistêmicas. O tratamento é feito com soluções antimicóticas ou derivados imidazólicos.
Dentro das perspectivas de avaliação de novas alternativas para a terapêutica das infecções micóticas, determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) do óleo de R. officinalis frente a esta cepa (Tabela V).
Tabela V: Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato e óleo de R. officinalis Micro-organismo Extrato de R. officinalis
CIM (µg/ml)
Óleo de R. officinalis CIM (µg/ml)
M. furfur 112 µg/ml 112 µg/ml
A M. furfur é considerado um micro-organismo emergente e, nem sempre, sensível aos antifúngicos disponíveis no mercado farmacêutico, exceção feita aos derivados imidazólicos, em particular ao cetoconazol. Os estudos realizados em busca de novos antifúngicos direcionados ao gênero Malassezia são escassos e limitados.
A determinação da CIM do óleo de R. officinalis frente à M. furfur amplia as perspectivas na busca de produtos de origem natural, que possam ser utilizados na produção de fármacos eficientes para tratamento de infecções fúngicas produzidas por micro-organismos oportunistas.
Existem poucos relatos na literatura sobre atividade antifúngica do extrato e óleo de R. officinalis frente à M. furfur. Os extratos e óleos de Aloe vera,
Eucalyptus globulus, Phyllanthus emblica e Wrightia tinctoria já foram estudados e
apresentaram propriedades antifúngicas frente a este fungo.
Bélem et al. (2003), avaliaram a atividade antifúngica de óleos essenciais obtidos de Caryophyllusaromaticus L; Cinnamonum zeilanicum; Citrus limon;
40
testados “in vitro” sobre 20 cepas isoladas de pacientes portadores de pitiríase versicolor. Os resultados constataram que os óleos essenciais de C. citratus e P.
boldus produziram maior atividade inibitória contra as cepas de M. furfur em
relação às demais.
Conclusão
Considerando a resistência das leveduras pertencentes ao gênero Candida e Malassezia frente aos antifúngicos atualmente utilizados, pode-se inferir que a pesquisa de busca de novos compostos antifúngicos de origem vegetal mostra-se muito relevante. É possível observar o potencial antifúngico que o produto vegetal testado possui, e por consequência, a real possibilidade de aplicação destes produtos na prevenção e tratamento de doenças infecciosas de origem fúngica. Porém, é necessário citar a necessidade de realização de estudos de cunho toxicológico, clínico e microbliológico com vista a elucidar a atividade antifúngica do óleo essencial de R. officinalis bem como dos fitoconstituintes, na perspectiva de elaboração de fármaco seguro e eficaz para tratamento de dermatomicoses.
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