Obtenção de carotenoides microbianos com atividade antioxidante a partir de coprodutos agroindustriais

1 Universidade Federal do Rio Grande – FURG

Escola de Química e Alimentos

Programa de Pós Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos

Obtenção de carotenoides microbianos com atividade antioxidante a partir de coprodutos

agroindustriais

Engª Alimentos Eliane Pereira Cipolatti

Profª Drª Janaína Fernandes de Medeiros Burkert Orientadora Profª Drª Eliana Badiale Furlong Co-orientadora

Rio Grande, RS

2012

2 Universidade Federal do Rio Grande – FURG

Escola de Química e Alimentos

Programa de Pós Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos

Obtenção de carotenoides microbianos com atividade antioxidante a partir de coprodutos agroindustriais

Engª Alimentos Eliane Pereira Cipolatti

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos da FURG, como requisito necessário para obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos.

Profª. Drª. Janaína Fernandes de Medeiros Burkert Orientadora Profª Drª Eliana Badiale Furlong Co-orientadora

Rio Grande, RS

2012

ii

3

Seu trabalho vai preencher uma grande parte da sua vida, e a única maneira de estar verdadeiramente satisfeito é fazer o que você acredita que seja um grande trabalho. E o único modo de fazer um grande trabalho é amar o que você faz.

Steve Jobs iii

4

AGRADECIMENTOS

À Deus.

Aos meus pais, Rose Mary e Ailton, meus maiores incentivadores, e a quem não encontro palavras suficientes para agradecer. Amo vocês.

Ao Gabriel pelo amor, cumplicidade, compreensão, paciência e por estar sempre ao meu lado.

Às minhas avós, que sempre demonstraram seu orgulho, muito obrigada.

À minha orientadora Janaina Burkert por me receber, por acreditar no meu potencial e tolerar minha teimosia. Agradeço também pelos momentos de descontração, pela

amizade e confiança.

À professora Eliana Furlong pelo constante incentivo, por ser mestre e amiga e, principalmente, por me fazer chorar quando foi necessário. É de fundamental

importância em minha vida

Ao professor André Burkert, por disponibilizar o laboratório, pelas contribuições ao longo do trabalho e pelo incentivo.

Ao professor Luiz Antônio Pinto por me fazer acreditar que estou no caminho certo e não me deixar desistir.

À professora Susana Kalil pelas valiosas contribuições ao longo do trabalho e pela amizade, é admirável a maneira com que trata o que faz e a todos ao seu redor.

À professora Jaqueline Buffon pelas contribuições neste trabalho e em outros tantos ao longo da graduação, e pelos inúmeros conselhos.

À Franciela, grande amiga que conheci durante o mestrado, obrigada pelas risadas, lanches, conversas e pelo apoio. Nunca esquecerei.

Às amigas de sempre: Larine e Thaisa, irmãs que encontrei na graduação, agradeço por fazerem parte da minha vida. E a Fernanda e Ana Cláudia pela amizade.

À Elisane por estar sempre pronta a ajudar, pela paciência, conselhos, amizade e muitos cafezinhos.

Aos meus companheiros de trabalho: Angelina, Bruna, Carolina, Julia e Rafael, pelo empenho, responsabilidade, apoio e amizade! Muito obrigada “Familia Feliz“!

À Deborah, Mariano, Thais e Nina por me receberem tão bem no laboratório, e pelo auxilio no início dos experimentos.

À Helen por me ensinar a “domar” o cromatógrafo, pela paciência e amizade.

Aos amigos Bruno Ladeira e Raphael, pela companhia, risadas e lanches, tornando o trabalho e discussões de resultados muito mais leves.

Ao pessoal do Laboratório de Engenharia de Bioprocessos, sentirei saudades.

iv

5

Ao pessoal do Laboratório de Ciência de Alimentos por me fazerem sentir “em casa”, e

em especial a Jesus pelo apoio e amizade.

À professora Itaciara pela atenção disponibilizada.

À Simone Teixeira, representante da CornProducts Brasil, pelas amostras de água de maceração de milho disponibilizadas, e pelo interesse que demonstrou pelo trabalho.

À BSBios e Rapadura Guimarães pelo glicerol e melaço disponibilizados.

Também agradeço a professora Leonor Soares, Melissa Oliveira, Vivian Feddern, Michele Souza e Giniani Dors, que fizeram parte do meu crescimento profissional e

pessoal.

À FURG.

Ao CNPq e Capes pelo apoio financeiro.

À todos que contribuíram de forma direta ou indireta para realização deste trabalho.

v

6

Sumário

AGRADECIMENTOS ... 4

Sumário ... 6

Lista de Tabelas ... 9

Lista de Figuras ... 11

Lista de Abreviaturas e Siglas ... 13

Resumo ... 14

Abstract ... 15

CAPÍTULO I ... 16

INTRODUÇÃO GERAL ... 16

1. Introdução ... 17

2. Objetivos ... 19

2.1. Objetivo Geral ... 19

2.2. Objetivos específicos ... 19

CAPÍTULO II ... 20

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 20

3. Revisão Bibliográfica ... 21

3.1. Carotenoides ... 21

3.2. Funções dos carotenoides ... 25

3.2.1 Cor ... 25

3.2.2 Atividade pró vitamínica ... 25

3.2.3 Antioxidantes ... 26

3.2.2 Métodos para determinação da atividade antioxidante ... 28

3.3. Leveduras produtoras de carotenoides ... 30

3.4. Coprodutos agroindustriais ... 33

3.4.1. Água de maceração de milho ... 33

3.4.2. Melaço de cana de açúcar ... 34

3.4.3. Glicerol ... 34

CAPÍTULO III ... 36

DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO ... 36

Artigo 1 ... 37

Resumo ... 38

Abstract ... 39

1 Introdução ... 40

2 Material e métodos ... 41

2.1 Micro-organismo ... 41

2.2 Manutenção e reativação das culturas microbianas ... 41

2.3 Preparo do inoculo ... 41

2.4 Cultivos ... 42

2.5 Caracterização da biomassa ... 42

2.6 Procedimentos para ruptura celular da biomassa ... 42

2.6.1 Ruptura química com DMSO... 42

2.6.2 Ruptura química com ácido clorídrico ... 42

2.6.3 Maceração com Terra Diatomácea ... 42

2.6.4 Ruptura enzimática ... 43

2.7 Extração de carotenoides ... 43

2.8 Identificação e quantificação dos carotenoides ... 43

2.9 Padronização do tamanho da partícula da biomassa ... 44

2.10 Estabilidade dos carotenoides frente ao congelamento da biomassa .. 44 iv vi x xii xiv xv xvi

vi

7 2.11 Determinações da atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos

... 44

2.12 Análises estatísticas ... 45

3. Resultados e discussão... 45

3.1 Caracterização da biomassa ao final de 168 h de cultivo ... 45

3.2 Influência do tamanho da partícula e do tempo de congelamento da biomassa na recuperação dos carotenoides ... 46

3.3 Influência do congelamento da biomassa de P. rhodozyma na atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos ... 47

3.4 Medida da atividade antioxidante para o método enzimático de ruptura da parede celular de P. rhodozyma ... 53

4. Conclusão ... 55

5. Referências Bibliográficas ... 55

Artigo 2 ... 59

Produção de carotenoides por leveduras a partir de coprodutos agroindustriais ... 59

Resumo ... 60

Abstract ... 61

1. Introdução ... 62

2. Material e métodos ... 63

2.1 Micro-organismos ... 63

2.2 Manutenção e reativação das culturas microbianas ... 63

2.3 Coprodutos agroindustriais ... 63

2.3.1 Caracterização parcial dos coprodutos agroindustriais ... 63

2.4 Preparo do inoculo ... 64

2.5 Cultivo em frascos agitados ... 64

2.7 Caracterização da biomassa ... 65

2.8 Determinação da concentração de carotenoides totais ... 65

2.9 Identificação e quantificação dos carotenoides ... 66

2.10 Determinação de açúcares redutores totais (ART) ... 67

2.11 Determinação dos fatores de conversão do cultivo ... 67

3. Resultados e discussão... 68

3.1. Caracterização parcial dos substratos ... 68

3.2 Cinéticas de crescimento das leveduras nos diferentes meios de cultivo ... 69

3.3 Identificação dos carotenoides produzidos nos diferentes meios de cultivos ... 78

4. Conclusão ... 79

5. Referências Bibliográficas ... 80

Artigo 3 ... 84

Produção de extratos carotenogênicos com potencial antioxidante ... 84

Resumo ... 85

Abstract ... 86

1. Introdução ... 87

2. Material e métodos ... 88

2.1 Micro-organismos ... 88

2.2 Coprodutos agroindustriais ... 88

2.3 Manutenção e reativação das culturas microbianas ... 88

2.4 Preparo do inoculo ... 88

2.5 Cultivo em frascos agitados ... 89

vii

8

2.6 Determinação de carotenoides totais... 89

2.7 Determinações da atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos 89 3 Resultados e discussão... 90

3.1 Determinação de carotenoides e biomassa ... 90

3.2 Atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos ... 91

4. Conclusão ... 95

5. Referências Bibliográficas ... 95

Artigo 4 ... 99

Carotenoides produzidos pelas leveduras Phaffia rhodozyma, Pichia

fermentans, Rhodotorula mucilaginosa e Sporidiobolus pararoseus em

coprodutos de agroindústrias de alimentos ... 99

Resumo ... 100

Abstract ... 101

1. Introdução ... 102

2. Material e métodos ... 102

2.1 Amostras ... 102

2.2 Reagentes e Solventes ... 103

2.3 Cultivos submersos... 103

2.4 Determinação de carotenoides totais... 103

2.4 Identificação e quantificação dos carotenoides astaxantina, luteína e - caroteno ... 104

2.4.1 Instrumentação ... 104

2.4.2 Validação do método ... 105

3. Resultados e discussões ... 106

3.1 Validação do método cromatográfico... 106

3.1.1 Curva analítica e linearidade ... 106

3.1.2 Limite de detecção e quantificação ... 107

3.2.3 Precisão e precisão intermediária ... 108

3.3 Identificação e quantificação dos carotenoides ... 108

4. Conclusão ... 112

5. Referências Bibliográficas: ... 113

CAPÍTULO IV ... 116

CONCLUSÕES GERAIS ... 116

Sugestões para trabalhos futuros ... 118

CAPÍTULO V ... 119

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 119

Referências Bibliográficas: ... 120

Apêndice 1 – Curvas padrão das leveduras utilizadas ... 134

Apêndice 2 – Curvas padrão de trolox para as metodologias de atividade antioxidante ... 136

Apêndice 3 – Curva padrão de glicose ... 138

viii

9

Lista de Tabelas

CAPÍTULO III

Artigo 1- Comparação da atividade antioxidante pelos métodos ABTS, DPPH e FRAP de extratos carotenogênicos de Phaffia rhodozyma

Tabela 1 – Caracterização da biomassa de P. rhodozyma ao final de 168 h de cultivo Tabela 2 - Recuperação de carotenoides totais para diferentes diâmetros de partícula da biomassa de P. rhodozyma

Tabela 3 - Influência do tempo de congelamento na recuperação de carotenoides totais da biomassa de P. rhodozyma NRRL-Y 17268

Tabela 4 – Atividade antioxidante de extratos carotenogênicos de P. rhodozyma NRRL-Y 1728 (% inibição.µg^-1) pelo método do DPPH em diferentes tempos de congelamento da biomassa

Tabela 5– Atividade antioxidante de extratos carotenogênicos de P. rhodozyma NRRL- Y 1728 (% inibição.µg^-1) pelo método do ABTS em diferentes tempos de congelamento da biomassa

Tabela 6 – Comparação das metodologias de atividade antioxidante (mM trolox/µg) para os extratos carotenogênicos de P. rhodozyma NRRL-Y 1728

Tabela 7 – Quantificação de carotenoides totais de P. rhodozyma NRRL-Y 17268 Tabela 8 - Atividade antioxidante (% inibição.µg^-1) pelo DPPH para os diferentes métodos de recuperação de carotenoides

Tabela 9– Atividade antioxidante pelo método do ABTS de extrato carotenogênico proveniente de ruptura enzimática da biomassa de P. rhodozyma

Artigo 2 - Produção de carotenoides por leveduras a partir de coprodutos agroindustriais

Tabela 1 - Formulação dos meios de bioprodução de carotenoides.

Tabela 2 - Caracterização parcial dos substratos presentes nos meios de cultivo Tabela 3 - Carotenoides específicos e volumétricos obtidos pelas leveduras estudadas em diferentes meios de cultivo

Tabela 4 - Parâmetros cinéticos relativos aos cultivos

Tabela 5 - Astaxantina (1), Luteína (2) e β-caroteno (3) presentes nos extratos microbianos (μg.L^-1)

Artigo 3- Produção de extratos carotenogênicos com potencial antioxidante Tabela 1 - Carotenoides volumétricos (CV) e biomassas produzidas pelas leveduras estudadas em 168 h de cultivo.

Tabela 2 – Atividade antioxidante de extratos carotenogênicos das leveduras estudadas pelo método do DPPH (% inibição.µg^-1)

ix

10

Tabela 3 – Atividade antioxidante de extratos carotenogênicos das leveduras estudadas pelo método do ABTS (% inibição.µg^-1)

Artigo 4- Carotenoides produzidos pelas leveduras Phaffia rhodozyma, Pichia fermentans, Rhodotorula mucilaginosa e Sporidiobolus pararoseus em coprodutos de agroindústrias de alimentos

Tabela 1 - Gradiente de eluição da fase móvel.

Tabela 2 - Curvas analíticas e linearidade

Tabela 3 – Tempos de retenção e limites de detecção e quantificação dos carotenoides

Tabela 4 – Conteúdo de carotenoides nos extratos microbianos (μg.L^-1)

x

11

Lista de Figuras

CAPITULO II

Figura 1 – Esquema dos estágios da biossíntese de carotenoides Figura 2 – Isômeros configuracionais de astaxantina

Figura 3 – Estrutura e clivagem do β-caroteno

Figura 4 - Principais causas e consequências da ação dos radicais livres Figura 5 – Reação entre o radical DPPH e o antioxidante

Figura 6 - Interação do antioxidante com o radical ABTS Figura 7 – Complexos formados durante o método FRAP Figura 8 – Representação da parede celular de leveduras CAPÍTULO III

Artigo 1- Comparação da atividade antioxidante pelos métodos ABTS, DPPH e FRAP de extratos carotenogênicos de Phaffia rhodozyma

Figura 1 – Cromatograma dos carotenoides obtidos do extrato carotenogênico da biomassa sem congelamento de P. rhodozyma

Figura 2 – Absorvância dos extratos carotenogênicos obtidos pelas biomassas de P.

rhodozyma NRRL-Y 17268 nos diferentes tempos de congelamento pelo método FRAP

Figura 3 – Absorvância do extrato carotenogênico obtido pela biomassa de P.

rhodozyma pelo método enzimático

Artigo 2- Produção de carotenoides por leveduras a partir de coprodutos agroindustriais

Figura 1 – Esquema da metodologia empregada

Figura 2 – Cinética de crescimento das leveduras P. rhodozyma NRRL-Y 17268 (a), P. fermentans (b) R. mucilaginosa (c) e S. pararoseus (d) ao longo de 168 h de cultivo a 25ºC e 180 rpm em meio YM.

Figura 3 – Cinética de crescimento das leveduras P. rhodozyma NRRL-Y 17268 (a), P. fermentans (b) R. mucilaginosa (c) e S. pararoseus (d) ao longo de 168 h de cultivo a 25ºC e 180 rpm em meio contendo água de maceração de milho e glicerol (M1).

Figura 4 – Cinética de crescimento das leveduras P. rhodozyma NRRL-Y 17268 (a), P. fermentans (b) R. mucilaginosa (c) e S. pararoseus (d) ao longo de 168 h de cultivo a 25ºC e 180 rpm em meio contendo água de maceração de milho e melaço (M2).

Artigo 3- Produção de extratos carotenogênicos com potencial antioxidant Figura 1 - Absorvância dos extratos carotenogênicos obtidos pelas biomassas de S.pararoseus pelo método FRAP

xi

12

Figura 2 - Absorvância dos extratos carotenogênicos obtidos pelas biomassas de P.

fermentans pelo método FRAP

Figura 3 - Absorvância dos extratos carotenogênicos obtidos pelas biomassas de R.

mucilaginosa pelo método FRAP

Artigo 4- Carotenoides produzidos pelas leveduras Phaffia rhodozyma, Pichia fermentans, Rhodotorula mucilaginosa e Sporidiobolus pararoseus em coprodutos de agroindústrias de alimentos

Figura 1 - Cromatograma da mistura de padrões dos carotenoides estudados no detector de ultravioleta em 450nm.

Figura 2 – Cromatograma dos carotenoides proveniente de cultivo com P. rhodozyma em meio extrato de malte e levedura (YM.)

Figura 3 - Cromatograma dos carotenoides provenientes de cultivo com P. fermentans em meio contendo água de maceração e melaço (M2).

Figura 4 – Cromatograma dos carotenoides provenientes de cultivo com S.

pararoseus em meio contendo água de maceração de milho e glicerol

Figura 5 – Cromatograma dos carotenoides provenientes de cultivo com R.

mucilaginosa em meio extrato de malte e levedura (YM)

xii

13

Lista de Abreviaturas e Siglas

µmáx - velocidade específica máxima de crescimento (h^-1) ABTS - 2-2'-azino-bis (3-etilbenzo-tiazol-6ácido sulfônico) CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

DPPH - 1,1-difenil-2-picrihidrazil

FRAP - Ferric reducing antioxidante assay (Ensaio do poder de redução do ferro) P - produto (carotenoide) (μg.g^-1)

PC - Produtividade em carotenoide (µg.L^-1.h^-1) P_X - Produtividade em biomassa (g.L^-1.h^-1)

rP - velocidade de produção de carotenoides (μg L^-1.h^-1) r_S - velocidade de consumo de substrato (g.L^-1.h^-1) r_X - velocidade de crescimento das células (g. L^-1.h^-1) S - substrato (glicose) (g.L^-1)

Trolox - 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico X - biomassa (g.L^-1)

Y_{P/S -} fator de conversão de substrato em produto (μg.g^-1) YP/X - fator de conversão de biomassa em produto (μg.g^-1) YX/S - fator de conversão de substrato em biomassa (g.g^-1)

xiii

14

Resumo

O objetivo deste trabalho foi produzir carotenoides pelas leveduras Sporidiobolus pararoseus, Pichia fermentans, Rhodotorula mucilaginosa, isoladas de ecossistema do Escudo Sul-Rio Grandense, e Phaffia rhodozyma NRRL Y-17268, utilizando coprodutos agroindustriais (água de maceração de milho, melaço e glicerol), bem como o estudo da atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos. Todos os cultivos foram realizados em frascos agitados, a 180 rpm, 25ºC por 168 h. A primeira etapa do trabalho objetivou estabelecer condições para recuperar carotenoides e determinar a atividade antioxidante dos extratos de P. rhodozyma, avaliando o efeito do congelamento da biomassa sobre estas determinações. A maior recuperação de carotenoides foi obtida no diâmetro de partícula inferior a 125 mm com 48 h de congelamento (271,7 µg.g^-1), porém o extrato da biomassa sem congelamento apresentou atividade antioxidante superior aos demais, com 0,77; 2,05 e 4,30 mM trolox.µg^-1 para os métodos do ABTS, FRAP e DPPH. Ao avaliar a influência de métodos de rupturas celular no potencial antioxidante, o uso de Glucanex® obteve as maiores atividades deste trabalho, 344,1% inibição.µg^-1 e 0,5 de absorvância, para ABTS e FRAP, respectivamente. A segunda etapa consistiu na produção de carotenoides a partir de meios contendo água de maceração de milho e glicerol (M1), e água de maceração de milho e melaço (M2), comparando com o meio convencional (YM), em cultivos com R. mucilaginosa, S. pararoseus, P. fermentans e P. rhodozyma.

S. pararoseus se destacou nos cultivos nos meios altenativos, apresentando 634,5 e 830,3 µg.L^-1 e 87,3 e 68,1 µg.L^-1 para os meios M1 e M2, respectivamente. Se destacou, ainda, em relação a produção de β-caroteno, com 96, 89,2 e 94,4% dos carotenoides identificados nos meios YM, M1 e M2, respectivamente. Esta também apresentou elevados valores de biomassa, com 7,3; 9,8 e 12,2 g.L^-1 para o M1, YM e M2, respectivamente. A terceira etapa objetivou a produção de carotenoides com potencial antioxidante a partir de S. pararoseus, P. fermentans e R. mucilaginosa nos meios YM, M1 e M2. R. mucilaginosa apresentou uma quantificação de carotenoides totais de 1068,5 μg.L^-1 no YM, superior aos demais meios e leveduras estudadosOs extratos de P. fermentans no M2 foram mais promissores com relação a atividade antioxidante, 129,6 e 293,1 % inibição.µg^-1 para DPPH e ABTS, respectivamente, e absorvância superior a 1,0 para o FRAP. A última etapa do trabalho foi iniciar uma metodologia de identificação e quantificação dos extratos carotenogênicos das leveduras estudadas nos meios YM, M1 e M2. P. rhodozyma se destacou pela produção de astaxantina no M2 (3390 μg.L^-1) e elevada quantificação de β-caroteno (1133 μg.L^-1). A maior produção de luteína foi obtida pela levedura S. pararoseus no M1 (93 μg.L^-1). β-caroteno foi produzido em maior quantidade pela R. mucilaginosa no YM (4430 μg.L^-1. O método apresentou linearidade entre 0,1 e 7 μg.mL^-1 para astaxantina e β-caroteno, e entre 0,05 e 6 μg.mL^-1 para luteína, com boa precisão e repetitividade.

Palavras-chave: leveduras, extratos carotenogênicos, potencial antioxidante

xiv

15

Abstract

The aim of this study was to produce to carotenoids by yeasts Sporidiobolus pararoseus, Pichia fermentans, Rhodotorula mucilaginosa, isolated by ecosystems at Escudo Sul-Rio Grandense and Phaffia rhodozyma NRRL Y-17268, using industrial co- products (corn steep liquor, molasses and glycerol) and the study of antioxidant activity of carotenogenic extracts. All cultures were performed in shake flasks at 180 rpm, 25ºC for 168 h. The first step of this study aimed to establish conditions for recovering carotenoids and measuring antioxidant activity of extracts from P. rhodozyma, assessing the effect of freezing the biomass on such measurements. The highest recovery of carotenoids was obtained in particle diameter less than 125 mm with 48 h of freezing (271.7 µg.g^-1), but the extract of the unfrozen biomass had an antioxidant activity higher than the others, with 0.77, 2.05 and 4.30 mM trolox.µg^-1, for the ABTS, FRAP and DPPH methods. In assessing the influence of methods of cell disruption in the antioxidant potential, the use of Glucanex® had the highest activities of this study, 344.1 % inhibition.µg^-1 and 0.5 absorbance for ABTS and FRAP, respectively. The second step aimed the production of carotenoids from medium containing corn steep liquor and glycerol (M1), and corn steep liquor and molasses (M2) in comparison with the conventional medium (YM) in cultures with R. mucilaginosa, S. pararoseus, P.

fermentans e P. rhodozyma. S. pararoseus stood out in the cultures in the alternative medium, with 634,5 and 830,3 µg.L^-1 and 87,3 and 68,1 µg.L^-1 for the M1 and M2, respectively. In addition, showed in relation to the production of β-carotene, 96.0, 89.2 and 94.4 % of carotenoid in the YM, M1 and M2, respectively. It also showed high values of biomass 7.3; 9.8 and 12.2 g.L^-1 for M1, YM and YM, respectively. The third step aimed the production of carotenoids with antioxidant potential by S. pararoseus, P.

fermentans e R. mucilaginosa in the YM, M1 and M2. The extracts of P. fermentans in M2 were most promising in relation to antioxidant activity, 129.6 and 293.1 % inhibition.

µg^-1 for DPPH and ABTS, respectively, and with the absorbance higher than 1.0 for FRAP. The last step of this work was to initiate a methodology for identifications and quatification of the carotenogenic extracts in the medium YM, M1 and M2. P.

rhodozyma highlighted for the production of astaxanthin in M2 (3390 μg.L^-1) and quantification of β-caroteno (1133 μg.L^-1). The highest yield of lutein was obtained by the yeast S. pararoseus in M1 (93 μg.L^-1). β-caroteno was produced in greatest quantity by R. mucilaginosa in YM (4430 μg.L^-1). The method was linear between 0.1 and 7 μg.mL^-1 for β-carotene and astaxanthin, and between 0.05 and 6 μg.mL^-1 for lutein, with good precision and repeatability.

Keywords: yeasts, carotenogenic extracts, antioxidant potential

xv

16

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO GERAL

17

1. Introdução

Carotenoides são compostos isoprenoides lipofílicos amplamente presentes na natureza, com mais de 600 estruturas caracterizadas. São responsáveis pelas cores do amarelo ao vermelho de frutas, vegetais, fungos e flores, e utilizados comercialmente como corantes alimentícios e em suplementos nutricionais (FRASER

& BRAMLEY, 2004). Duas classes de carotenoides são encontradas na natureza: os carotenos, tais como β-caroteno, hidrocarbonetos lineares que podem ser ciclizados em uma ou ambas as extremidades da molécula; e os derivados oxigenados de carotenos, como luteína, violaxantina, neoxantina e zeaxantina, denominados xantofilas (RODRIGUEZ-AMAYA, 2001). Pesquisas têm sido desenvolvidas com estes compostos, devido as suas propriedades que resultam em possíveis funções biológicas benéficas a saúde humana como fortalecimento do sistema imunológico e diminuição do risco de doenças degenerativas (UENOJO, JUNIOR & PASTORE, 2007; DELGADO, JIMENEZ & PAREDES-LOPEZ, 2000)

A quantificação de carotenoides em fontes existentes e a descoberta de novas fontes de carotenóides com funções benéficas a saude são de fundamental importância. Dentro deste contexto destacam-se os carotenoides de origem microbiana, que além de possuírem inúmeras vantagens, como: pequeno espaço para produção, não estando sujeita às condições ambientais como clima, estação do ano ou composição do solo, e controle das condições de cultivo, possibilidade de utilização de substratos de baixo custo para a bioprodução e denominação de substâncias naturais (VALDUGA et al, 2009), podendo, ainda, com o ajuste do meio de cultivo, a otimização das condições para a maior produção o carotenoide de interesse.

Uma das funções dos carotenoides que está discutida neste trabalho é a atividade antioxidante, que possui extrema importância na saúde humana, uma vez que o dano oxidativo de biomoléculas pode levar à inativação enzimática, mutação, ruptura de membrana, aumento na aterogenicidade de lipoproteínas plasmáticas de baixa densidade e à morte celular. Estes efeitos tóxicos de processos oxidativos têm sido associados ao envelhecimento e ao desenvolvimento de doenças crônicas, inflamatórias e degenerativas (CERQUEIRA, MEDEIROS & AUGUSTO, 2007), logo, a preocupação em utilizar antioxidantes, que são moléculas capazes de diminuir ou prevenir a oxidação de outras (MOON & SHIBAMOTO, 2009).

A literatura mostra um crescimento em publicações relatando estudos de diferentes aspectos de compostos antioxidantes e estresse oxidativo. Em 1993, os trabalhos publicados eram de 1684, chegando a quadruplicar em 2003, com 6.510 publicações, e atualmente o número de publicações ultrapassa 60.000. Isto tornou

18

consolidada a importância destes antioxidantes e seus efeitos para o público em geral, médicos, especialistas em nutrição e saúde, e pesquisadores da área de alimentos (HUANG, OU & PRIOR, 2005; BARREIROS, DAVID & DAVID, 2006).

Tendo em vista os indícios de danos que podem ser provocados pelo consumo de antioxidantes sintéticos, a maioria das pesquisas tem sido dirigida no sentido de encontrar produtos naturais com atividade antioxidante, os quais permitirão substituir os sintéticos ou fazer associações entre eles, com intuito de diminuir ou eliminar o emprego dos sintéticos em diferentes alimentos e produtos (RAMALHO & JORGE, 2006). Nesta linha, os carotenoides merecem atenção devido aos inúmeros estudos relacionados a sua ação antioxidante, que demonstraram que seu incremento na dieta está relacionado com a diminuição dos riscos de doenças degenerativas, incluindo vários tipos de câncer, doenças cardiovasculares e oftalmológicas. Estes efeitos preventivos têm sido associados com sua atividade antioxidante, protegendo as células e tecidos contra danos oxidativos (STAHL & SIES, 2003).

A alternativa da produção de carotenoides por micro-organismos é obter compostos de elevado valor, além da possibilidade de aumento da produção pela manipulação das condições de cultivo como temperatura, pH, agitação, taxa de aeração, luminosidade e manipulação genética (BHOSALE, 2004; LIU & WU, 2007;

ZENI, 2009). Pode-se, ainda, associar coprodutos e resíduos agroindustriais ao cultivo submerso, consistindo numa estratégia promissora para diminuir custos de produção e agregar valor a substratos diversos. Nesse contexto, foram utilizados para o desenvolvimento deste trabalho, o glicerol, melaço e água de maceração de milho, os quais podem se tornar uma alternativa para a produção de carotenoides. Estes resíduos são encontrados em abundância durante a produção de biodiesel, açúcar e processamento de milho, podendo contribuir tanto como fonte de carbono e/ou de nitrogênio e de outros nutrientes para o metabolismo do micro-organismo (IMANDI et al, 2006; VALDUGA et al, 2007; SOBRINHO, 2007), no caso deles serem produtores de compostos de valor especial pela funcionalidade, são importantes para subsidiar nova tecnologias e baratear os custos de produção.

19

2. Objetivos

2.1. Objetivo Geral

O objetivo deste trabalho foi produzir carotenoides pelas leveduras Sporidiobolus pararoseus, Pichia fermentans, Rhodotorula mucilaginosa, isoladas do ecossistema do Escudo Sul-Rio Grandense, e Phaffia rhodozyma NRRL Y-17268, utilizando coprodutos agroindustriais (água de maceração de milho, melaço e glicerol), bem como o estudo da atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos.

2.2. Objetivos específicos

- Estabelecer procedimento que proporcione maior recuperação de carotenoides de biomassas de leveduras;

- Avaliar a estabilidade da medida da atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos de Phaffia rhodozyma NRRL Y-17268, durante o congelamento;

- Estudar o emprego de coprodutos agroindustriais na produção de carotenoides;

- Medir o potencial antioxidante dos extratos carotenogênicos produzidos pelas leveduras silvestres (Sporidiobolus pararoseus, Pichia fermentans e Rhodotorula mucilaginosa);

- Identificar e quantificar os carotenoides presentes nos extratos utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

20

CAPÍTULO II

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

21

3. Revisão Bibliográfica

3.1. Carotenoides

Os carotenoides formam a classe de pigmentos mais difundida na natureza, sendo amplamente encontrados em plantas, animais e micro-organismos. Possuem maior valor econômico e tecnológico, se comparados a outros pigmentos naturalmente encontrados em micro-organismos, como melaninas, clorofilas, antocianinas e flavonoides (WAGNER, RAMBLA & LEGARRETA, 2008). Além da conhecida utilização como corantes naturais, também apresentam funções biológicas importantes, como precursores de vitamina A e ação antioxidante. Têm uma ampla aplicação na indústria alimentar: preparações oleosas e aquosas têm sido obtidas para produzir emulsões, suspensões coloidais e complexos com proteínas. Essas preparações têm encontrado aplicações em margarinas, manteigas, sucos de frutas e bebidas, sopas, laticínios, sobremesas, açúcar, molhos para saladas, carnes, massas, ovos, maioneses, também em xaropes e medicamentos (GOUVEIA et al, 2006).

Também são amplamente aplicados na indústria de rações animais (VALDUGA et al, 2009).

A maioria dos carotenoides são tetraterpenoides C40, compostos de 8 unidades isoprenoides, ligados de tal forma que a molécula é linear e simétrica, com a ordem invertida no centro. A estrutura básica acíclica C40 pode ser modificada por hidrogenação, desidrogenação, ciclização ou oxidação (Figura 1). A característica de absorção de luz destes pigmentos dá-se devido à cadeia de ligações duplas conjugadas que atua como cromóforo (STAHL & SIES, 2003; VALDUGA et al, 2009).

A estrutura característica dos carotenoides determina suas ações e o potencial de suas funções biológicas (BRITTON, 1995).

22

Figura 1 – Esquema dos estágios da biossíntese de carotenoides

(Adaptado de Valduga et al, 2009).

Nos primeiros estágios da biossíntese dos carotenoides, o C₅ primário sofre sucessivas adições de unidades de C5, produzindo uma sequencia de compostos C10, C₁₅ e C₂₀.A dimerização deste último forma o primeiro carotenoide, o fitoeno (C₄₀). A introdução sequencial de ligações duplas em lados alternados do fitoeno (3 duplas conjugadas) dá origem ao fitoflueno (5 duplas conjugadas), ζ-caroteno (7 duplas conjugadas), neurosporeno (9 duplas conjugadas) e licopeno (11 duplas conjugadas).

Dos cerca de 600 carotenoides identificados, somente 20 são encontrados em tecidos humanos, e são provenientes da dieta. Dentre eles, os principais incluem licopeno, β-caroteno, astaxantina, cantaxantina, luteína e zeaxantina. São compostos lipofílicos encontrados no tecido adiposo, lipoproteínas e membranas celulares (CERQUEIRA, MEDEIROS & AUGUSTO, 2007).

A luteína é o carotenoide predominante em vegetais verdes e flores amarelas, principalmente na folhas escuras como espinafre, couve, agrião e brócolis. Em menor quantidade pode ser encontrada em kiwi, laranja, milho, couve-de-bruxelas e pimenta (STRINGHETA et al, 2006), normalmente, está presente em tecidos vegetais em proporções superiores à zeaxantina. (RODRIGUEZ-AMAYA, 2001).

A luteína e zeaxantina possuem estrutura química muito similar, dificultando a diferenciação analítica destas. Apresentam o mesmo número de ligações duplas na cadeia, porém há uma diferença na posição de uma dupla ligação no anel da

Fitoeno

Licopeno

β- caroteno

Xantofilas Ácido mevalônico

Geranilgeranil difosfato

Estágios Iniciais

Formação de fitoeno

Desaturação

Ciclização

Hidroxilação

23

extremidade, fazendo da zeaxantina um melhor antioxidante do que a luteína (STRINGHETA et al, 2006).

Na natureza, a luteina apresenta-se como uma mistura das formas trans (60-90

%) e cis (10-40 %), apresentando maior estabilidade na conformação trans. Os isômeros cis da luteína apresentam coloração menos intensa quando comparadoa aos isômeros trans (STRINGHETA et al, 2006).

Segundo Dagnelie et al (2000), este carotenoide protege os fotoreceptores foveais ao filtrar a luz azul prejudicial à macula, reduzindo em 40 % a incidência desta à retina. A perda da sensibilidade visual ocorrida em pessoas com idade avançada e baixa densidade do pigmento macular nos tecidos oculares, pode ser precursora de algumas doenças dos olhos, incluindo a degeneração macular relacionada à idade.

O carotenoide mais abundante nos alimentos é o β-caroteno, este apresenta funções biológicas benéficas, como antioxidante (AMBROSIO, CAMPOS & FARO, 2006; BHOSALE & GADRE, 2001), sendo um dos mais efetivos como precursor de vitamina A, e tem sido estudado devido a sua proteção contra certos tipos de câncer e doenças maculares (QIU, CHEN & LI, 2009)

Outro carotenoide com importante e crescente mercado comercial global á a astaxantina, devido as suas propriedades antioxidantes. A grande maioria da oferta comercial (cerca de 97%) é atribuída a astaxantina sintética (SCHMIDT et al, 2010).

Cada anel da extremidade carrega uma hidroxila característica no carbono 3 e um grupo cetônico no carbono 4. Devido aos dois centros quirais nos carbonos 3 e 3' dos anéis das extremidades, a astaxantina pode existir em três estereoisômeros diferentes: (3S, 3S), (3R, 3R) (enantiômeros) e (3R,3′S) (meso) (Figura 3). O isômero (3S, 3'S) é a forma predominante na natureza, sendo encontrado principalmente em H.

pluvialis e salmão. P. rhodozyma produz astaxantina em sua configuração (3R, 3'R), que é até agora a única fonte natural conhecida para este estereoisômero (RODRIGUEZ-AMAYA, 2001; GREWE, MENGE & GRIEHL, 2007; SCHMIDT et al, 2010).

A astaxantina é formada por diferentes isômeros geométricos com configuração cis e trans. A P. rhodozyma produz principalmente a forma trans, mas alguns isômeros cis também podem ser encontrados em quantidades substanciais.

Estas formas geométricas diferem ligeiramente em seu espectro óptico (SCHMIDT et al, 2010).

24

Figura 2 – Isômeros configuracionais de astaxantina

(Fonte SCHMIDT et al, 2010).

Por ser a síntese da astaxantina complexa e de elevado custo, devido à presença dos centros quirais na sua estrutura molecular, existe um grande interesse no uso de fontes biológicas para obtenção da mesma (CHOCIAI et al, 2002). A presença de hidroxilas e finais cetonas em cada anel ionona explicam algumas características únicas, como a possibilidade de ser esterificada, seu elevado poder antioxidante e configuração mais polar que outros carotenoides (GHIGGI, 2007). Com relação a saúde humana, os carotenoides mais pesquisados são o β-caroteno, α- caroteno, β-criptoxantina, licopeno, luteína e zeaxantina. O β-caroteno, o α-caroteno e a β-criptoxantina são pro-vitaminas A (RODRIGUEZ-AMAYA, 2001).

A separação destes compostos em geral dá-se por métodos cromatográficos, como a Cromatografia de Camada Delgada (CCD) e a cromatografia de Alta Eficiência (HPLC – do inglês High performande liquid chromatography). A CCD é uma técnica ainda amplamente utilizada devido ao seu baixo custo e simplicidade. Enquanto que o HPLC é a técnica preferida, visto que pode ser qualitativa e quantitativa ao mesmo tempo, além de sua alta sensibilidade e resolução nas análises. Esta técnica é ideal para carotenoides, uma vez que estes compostos podem ser monitorados facilmente por detectores UV-visível (PASSOS, 2007).

3S,3’S astaxantina

3R,3’R astaxantina

3S,3’R astaxantina

3R,3’S astaxantina

25

3.2. Funções dos carotenoides

3.2.1 Cor

Os carotenoides são corantes naturais, responsáveis pelas cores amarelo, laranja e vermelho, utilizados na indústria alimentícia, farmacêutica, de cosméticos e ração (VALDUGA et al, 2009). As moléculas de carotenoides possuem um sistema de ligações duplas que constitui o grupo cromóforo responsável pela cor que proporcionam aos alimentos, para que a cor amarela apareça são necessárias no mínimo sete ligações conjugadas e com o aumento dessas ligações a coloração se aproxima do vermelho (RIBEIRO e SERAVALLI, 2004).

Industrialmente os carotenoides, tais como β-caroteno e astaxantina, são utilizados como corantes naturais para alimentos ou adicionados em ração para aquicultura (AKSU & EREN, 2007). Muitos produtos alimentícios utilizam carotenoides como corante em sua formulação, como iogurtes, massas instantâneas, sucos, geleias e cereais.

3.2.2 Atividade pró vitamínica

Carotenoides são conhecidos por serem precursores de vitamina A, sendo que esta conversão ocorre naturalmente no fígado. A simetria da molécula de β-caroteno sugere que a clivagem ocorre na posição central da molécula, produzindo duas moléculas de vitamina A (MOHAMED et al, 2001) Basicamente, a estrutura da vitamina A (retinol) é a metade da molécula do β-caroteno, com uma molécula de água adicionada no final da cadeia poliênica. Consequentemente, o β-caroteno é o carotenoide de maior potência vitamínica A (RODRIGUEZ-AMAYA, KIMURA e AMAYA-FARFAN, 2008).

A Figura 3 mostra um anel β-ionona não substituído, com cadeia lateral poliênica, característico de carotenoides precursores de vitamina A.

26

Figura 3 – Estrutura e clivagem do β-caroteno

(Fonte: AMBROSIO, CAMPOS & FARO, 2006)

3.2.3 Antioxidantes

Antioxidantes são moléculas capazes de diminuir ou prevenir a oxidação de outras moléculas, enquanto que antioxidantes biológicos podem ser definidos como substâncias que, presentes em pequenas concentrações comparadas ao substrato oxidável, retardam ou previnem a oxidação deste substrato (MOON & SHIBAMOTO, 2009). Há uma correlação existente entre atividade antioxidante de substâncias polares e capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de células cancerígenas, além de retardar o envelhecimento das células em geral. Outro interesse ligado aos antioxidantes é a sua aplicação na indústria, para a proteção de cosméticos, fármacos e alimentos, prevenindo a decomposição oxidativa destes pela ação da luz, temperatura e umidade (BARREIROS, DAVID & DAVID, 2006).

A produção de radicais livres é associada a todos os organismos que respiram, e é reforçada em organismos doentes. A maioria destes radicais em sistemas biológicos são derivados do oxigênio (FIRDOUS, PREETHI & KUTTAN, 2010). Sob a forma de radicais livres, o composto apresenta reatividade com a maioria das espécies químicas, podendo causar danos ao organismo. A Figura 4 apresenta algumas causas da formação destes radicais, e possíveis consequências (FERREIRA & ABREU, 2007). O radical HO é o mais deletério ao organismo, pois devido a sua meia-vida curta dificilmente pode ser sequestrado in vivo. Estes radicais frequentemente atacam as células por abstração de oxigênio e por adição de insaturações. Nos experimentos

27

de laboratório o HO pode facilmente ser sequestrado in vitro por inúmeras moléculas, devido a sua alta reatividade (BARREIROS, DAVID & DAVID, 2006).

O ataque intensivo e frequente deste radical pode originar mutações no DNA e, consequentemente, levar ao desenvolvimento de câncer em seres humanos no período de 15 a 20 anos. Existem duas maneiras de controlar a presença do radical HO: reparar os danos causados por ele ou inibir sua formação (BARREIROS, DAVID

& DAVID, 2006).

Figura 4 - Principais causas e consequências da ação dos radicais livres (Adaptado de FERREIRA & ABREU, 2007)

Os componentes celulares não são protegidos totalmente por antioxidantes endógenos, e é bem estabelecido que antioxidantes obtidos da dieta são indispensáveis para a defesa apropriada contra oxidação e, portanto, têm importante papel na manutenção da saúde (CERQUEIRA, MEDEIROS & AUGUSTO, 2007). Os carotenoides destacam-se pela conhecida capacidade de agir com radicais livres, tornando-se eles próprios radicais estáveis devido a deslocalização dos elétrons desemparelhados ao longo da sua cadeia conjugada poliênica. A astaxantina, zeaxantina e luteína são excelentes antioxidantes lipossolúveis que bloqueiam radicais livres (FERREIRA & ABREU, 2007).

Efeitos benéficos de carotenoides contras cânceres, doenças do coração e degeneração macular foram reconhecidos e estimularam intensas investigações sobre o papel desses compostos como antioxidantes e como reguladores de resposta do sistema imune. A capacidade dos carotenoides como agente quelante do oxigênio singlete molecular é bem conhecida. Assim como a prevenção do câncer, o potencial

Consequências

Câncer; doenças cardiovasculares; desordens neurológicas; doenças pulmonares; diabetes; artrite reumatoide; envelhecimento precoce.

Causas

- Poluentes ambientais - Fármacos

- íons metálicos - Radiação

-Exercício excessivo -Processos de inflamação

RADICAIS LIVRES

Alvos - Lipídios de membranas - Proteínas

- Ácidos nucleicos -Glicídios

28

antioxidante dos carotenoides pode ser útil na inibição de outras doenças provocadas pela ação dos radicais livres (UENOJO, JUNIOR & PASTORE, 2007).

Em indivíduos saudáveis, há um equilíbrio entre o sistema de defesa natural e as espécies reativas de oxigênio (ROS), gerados pelos organismos vivos e por fontes exógenas. Quando este equilíbrio é “quebrado”, as ROS podem causar danos oxidativos a varias biomoléculas, incluindo: proteínas, lipídios, DNA e RNA no corpo humano associado com lipídios e peroxidação proteica, danos à estrutura celular, lesão tecidual ou mutação de genes (LIU et al., 2011). Antioxidantes sintéticos, como o butil-hidroxi anisol (BHA) e butil-hidroxi tolueno (BHT) foram criados a fim de proteger alimentos e seres humanos de danos oxidativos causados por radicais livres (MOURE et al., 2001).

Sabe-se que a estrutura dos carotenoides exerce grande influência sobre a atividade antioxidante. A cantaxantina e astaxantina apresentam melhores atividades antioxidantes que β-caroteno ou zeaxantina. A atividade antioxidante aumenta com o aumento do número de ligações duplas conjugadas, grupos cetona e presença de anéis ciclopentano em sua estrutura (UENOJO, JUNIOR & PASTORE, 2007). Existem muitos métodos para estimar a eficiência de antioxidantes sintéticos e naturais, devido principalmente à complexidade dos substratos analisados, como o poder de redução do ferro (FRAP), sistema β-caroteno/ácido linoleico (SZABO et al, 2007), método Rancimat (PROESTOS et al, 2006), inibição da oxidação de lipoproteína com baixa densidade (LDL), método do DPPH (1,1-difenil-2-picrihidrazil) entre outros (SZABO et al, 2007).

3.2.2 Métodos para determinação da atividade antioxidante 3.2.2.1 Método do DPPH ((1,1-difenil-2-picrihidrazil)

O método do DPPH tem se tornado cada vez mais popular em estudos com antioxidantes naturais, por ser simples e ter alta sensibilidade (MOON & SHIBAMOTO, 2009). Este método está baseado na capacidade do DPPH em reagir com doadores de hidrogênio. Na presença de substâncias antioxidantes o mesmo recebe H⁺ sendo então reduzido. O ensaio é iniciado pela adição do DPPH à amostra, em solução. A capacidade da amostra de reduzir o DPPH, ou seja, evitar sua oxidação é evidenciada pela porcentagem de DPPH restante no sistema. Logo, a porcentagem de DPPH restante é proporcional a concentração de antioxidante (BONDET, BRAND-WILLIAMS

29

& BERSET, 1997; SANCHEZ-MORENO, 2002). A Figura 5 mostra a reação de estabilização do DPPH a partir do antioxidante e do radical DPPH.

Figura 5 – Reação entre o radical DPPH e o antioxidante (Fonte: MOON & SHIBAMOTO, 2009)

3.2.2.2 Método do ABTS (2-2'-azino-bis (3-etilbenzo-tiazol-6ácido sulfônico)) Este método também é conhecido como ensaio TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity), a ideia é monitorar o decaimento do cátion-radical ABTS^*+, produzido pela oxidação do ABTS, gerado pela adição do extrato contendo antioxidantes. Foi relatado primeiramente por Miller et al (1993) e posteriormente melhorado (RE, et. al, 1999). É muito utilizado para medir a atividade em produtos naturais, incluindo carotenoides, compostos fenólicos e plasma (MOON &

SHIBAMOTO, 2009). A Figura 6 ilustra a interação do carotenoide com o radical ABTS.

Figura 6 - Interação do antioxidante com o radical ABTS (Fonte: HUANG, OU & PRIOR, 2005)

3.2.2.3 Poder de redução do ferro (FRAP- Ferric reducing antioxidante assay) Esta metodologia será baseada em Benzie e Strain (1996), e mede a capacidade da solução antioxidante em reduzir o Fe³⁺ em Fe²⁺. Quando isto ocorre, na presença de 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ), a redução é acompanhada pela formação de um complexo corado com o Fe²⁺. A Figura 7 mostra os complexos formados

Antioxidante

30

durante a passagem de Fe(III) a Fe (II), evidenciando a troca de elétrons que ocorre durante a reação.

Figura 7 – Complexos formados durante o método FRAP (Fonte: HUANG, OU & PRIOR, 2005)

Quando o complexo Fe⁺³-TPTZ é reduzido a Fe⁺² por ação de um antioxidante, em meio ácido, é obtida uma intensa coloração azul com máximo de absorção em 593 nm. Logo, o efeito do antioxidante (potencial de redução) pode ser avaliado pelo monitoramento da formação do complexo Fe⁺²-TPTZ com espectrofotômetro (MOON &

SHIBAMOTO, 2009).

3.3. Leveduras produtoras de carotenoides

Muitos micro-organismos produzem carotenoides, porém nem todos são industrialmente interessantes. As leveduras destacam-se pelo seu uso como fonte proteica, capacidade de crescimento em substratos de baixo custo e alto teor de açúcar. Os tipos de carotenoides e a quantidade relativa destes podem variar dependendo das condições do meio de cultura, temperatura, pH, taxa de aeração e luminosidade (RODRIGUEZ-AMAYA, 2001; VALDUGA et al, 2009).

Os carotenoides são produzidos intracelularmente pelas leveduras, logo, é necessário que haja um método de ruptura celular para posterior extração com solvente, para que os pigmentos sejam liberados. A rigidez desta parede celular acaba limitando a extratibilidade dos carotenoides. A Figura 8 mostra uma representação geral da parede celular de leveduras.

Antioxidante

31

Figura 8 – Representação da parede celular de leveduras

(Fonte:http://www.sigmaaldrich.com)

Como apresenta a Figura 9, a parede celular de leveduras é composta por uma estrutura complexa, composta de manoproteinas, e glicoproteínas interligadas. Esta parede além de servir como proteção e estrutura, é responsável pelo transporte de nutrientes. Com isso, constam na literatura estudos que sugerem diferentes formas de romper a parede celular de leveduras. Um exemplo é o estudo realizado por Michelon et al (2012) que estudaram diversos métodos de ruptura: técnicas mecânicas (maceração com terra diatomácea, abrasão com pérolas de vidro, imersão em nitrogênio líquido e ultrassom), químicas (bicarbonato de sódio e dimetilsulfóxido (DMSO) e enzimática (β-1,3- glucanase) da biomassa de Phaffia rhodozyma. Neste estudo, o método utilizando a enzima foi superior aos demais na recuperação dos carotenoides intracelulares e em relação a extratibilidade.

Segundo Squina & Mercadante (2003), que utilizaram DMSO, por ser considerado um método rápido e reprodutível, para o rompimento da parede celular de Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis e Phaffia rhodozyma, verificaram que este solvente mostrou-se bastante eficiente para uma relação biomassa/solvente de 0,02 g/mL, sendo o processo repetido por cerca de 6 vezes. Entretanto, quando maiores quantidades de levedura foram utilizadas, houve a formação de uma interface pigmentada e insolúvel, indicativa de extração incompleta. Fonseca et al (2011) ao estudar diferentes métodos de ruptura das células de P. rhodozyma, concluiu que a melhor condição para recuperar astaxantina da biomassa foi com a utilização da relação 0,025 g/mL, aumentando até 25 vezes a recuperação deste carotenoide.

OTERO (2011) isolou cepas de leveduras silvestres produtoras de carotenoides na região do Escudo Sul-Rio-Grandense e Litoral Médio no estado do Rio Grande do Sul, sendo que três leveduras se destacaram frente a bioprodução de carotenoides, sendo selecionadas e identificadas como Sporidiobolus pararoseus, Pichia fermentans e Rhodotorula mucilaginosa. Dentre estas, a levedura que

Manoproteína Β-Glucana

β-Glucana+quitina Manoproteína

Membrana

32

apresentou uma maior produção de carotenoides foi a Sporidiobolus pararoseus, com 123,64 µg.g^-1, em meio YM (3 g.L^-1 de extrato de levedura, 3 g.L^-1 de extrato de malte, 5 g.L^-1 de peptona, 10 g.L^-1 de glicose). Os cultivos foram realizados à 25ºC, 150 rpm por 168h. Os carotenoides produzidos por esta levedura foram identificados como luteína, β-criptoxantina e β-caroteno.

Maldonade, Rodriguez-Amaya e Scamparini (2008) selecionaram leveduras produtoras de carotenoides do ecossistema brasileiro, em meio extrato de malte e levedura (YM) a 25ºC durante 5 dias à 200 rpm, sem iluminação. As leveduras selecionadas foram Rhodotorula graminis-125, Rhodotorula glutinis e Sporidiobolus roseus (com predominância de β-Caroteno), Rhodotorula mucilaginosa (tendo toruleno como principal pigmento). A levedura R. glutinis obteve a maior produção de carotenoides totais (881 μg.L^-1), seguido por R. graminis (594 μg.L^-1), Rhodotorula mucilaginosa-137 (590 μg.L^-1), Rhodotorula mucilaginosa-108 (562 μg.L^-1) e Rhodotorula mucilaginosa-135 (545 μg.L^-1). Rhodotorula minuta (168 μg.L^-1) e S.

roseus alcançaram a menor produção de carotenoides (237 μg.L^-1). Afirmaram, ainda, que a composição qualitativa e quantitativa de carotenoides em leveduras depende do gênero e das condições de cultivo.

A levedura Phaffia rhodozyma é apontada como uma das maiores produtoras de astaxantina, ela foi isolada por Herman Jan Phaff no início dos anos 70, nas regiões do Japão e Alasca. Em 1995, Golubev sugeriu após diversas investigações em Moscou e na Rússia, que o nome Phaffia rhodozyma é sinônimo de Rhodomyces dendrorhous, e um novo gênero de espécie foi criado, sendo denominado Xanthophyllomyces dendrorhous (BONFIM, 1999). A X. dendrorhous é capaz de produzir astaxantina, opticamente ativa, antioxidante lipossolúvel, para se proteger dos danos oxidativos causados pelas espécies reativas de oxigênio (BLASKO et al, 2008).

E merece atenção especial em função de sua qualidade nutricional e segurança na utilização como aditivo alimentar para peixes, suprindo além da astaxantina, proteínas, carboidratos e lipídios (CHOCIAI et al, 2002; SCHMIDT et al, 2010). Esta levedura pertence a classe dos basidiomicetos, e tem como principais características: a formação de colônias vermelho alaranjadas, capacidade de fermentar glicose e outros açúcares incluindo hemiceluloses, xiloses, amido, maltose, glicerol entre outras, e não é capaz de assimilar açúcares como lactose, galactose, D-ribose e D-arabinose,e é aeróbia facultativa (WAGNER, RAMBLA & LEGARRETA, 2008).

O gênero Rhodotorula é amplamente utilizado em processos fermentativos, devido a sua natureza unicelular, e as altas taxas de crescimento, sendo capaz de produzir β-caroteno, toruleno e torularrodina como produtos finais do seu metabolismo, com uma taxa de produção dependente das condições de incubação. Além disso, não

33

são patogênicas e possuem resistência em relação à desintegração (COSTA et al., 1987; KAISER et al., 2007). São micro-organismos aeróbicos, e a aeração influencia diretamente nas taxas de crescimento e produção de carotenoides (AKSU & EREN, 2005). Outra levedura apontada como produtora de carotenoides é a Sporidiobolus pararoseus, com níveis de toruleno, torularrodina e γ-caroteno (DAVOLI, MIERAU &

WEBER, 2004)

A tendência é o aumento nas pesquisas em relação à produção de carotenoides através de micro-organismos (VALDUGA et al, 2009), inclusive com a utilização de coprodutos agroindustriais, pois se tem a necessidade de redução de custos de produção e aumento no rendimento, tornando assim a bioprodução competitiva com a síntese química.

3.4. Coprodutos agroindustriais

A utilização de coprodutos industriais é de interesse devido ao apelo ecológico e econômico, além de sua ampla aplicação (VALDUGA et al, 2007). Destacam-se o uso de água de maceração de milho, melaço e glicerol para a produção de carotenoides, que serão abordados neste trabalho.

3.4.1. Água de maceração de milho

Água de maceração de milho (CSL = Corn Steep Liquor), um coproduto do processamento do milho, contendo 40% de sólidos totais e correspondendo à água de lavagem e embebição dos grãos quando do fracionamento em amido e germe (óleo), constitui uma fonte de nitrogênio, contribuindo também para o fornecimento de outros nutrientes importantes para o metabolismo do micro-organismo (SOBRINHO, 2007).

Este coproduto possui entre 21 a 45% de proteínas, 20 a 26% de ácido lático, cerca de 8% de cinzas (contendo Ca 2+, Mg 2+, K+, etc), cerca de 3% de carboidratos e baixo teor de gordura (0,9-1,2%) (CARDINAL & HEDRICK, 1947; AKHTAR et al, 1997). Valduga et al. (2007) estudaram pré tratamentos com ácidos (sulfúrico e/ou fosfórico) para a água de maceração de milho e melaço com o objetivo de produzir carotenoide por Sporidiobolus salmonicolor CBS 2636, obtendo valores de carotenoides totais de 541,5 μg.L^-1, com concentrações de melaço de cana-de-açúcar de 10 g.L^-1, água de maceração de milho de 5 g.L^-1 e hidrolisado de levedura de 5 g.L^-

1, a 25ºC, a pH inicial de 4,0, por 120 h e sem iluminação.

34

3.4.2. Melaço de cana de açúcar

O melaço é um coproduto da indústria sucroalcoleira que é utilizado com grande frequência como fonte de carbono na indústria de fermentações (VALDUGA et al, 2007). Para o uso industrial, o melaço é uma das matérias-primas de menor custo, mas a grande concentração de metais pesados é a causa de um problema crítico em sua utilização em cultivos. A presença desses metais pesados pode inibir o crescimento de micro-organismos, influenciando no pH do substrato e está envolvida na inativação de enzimas associadas a biossíntese do produto (HERNALSTEENS, 2006), o que pode ser minimizado com a aplicação de pré tratamentos de clarificação dos coprodutos para a produção de biocompostos (VALDUGA et al, 2007).

A composição do melaço de cana é muito variável, pois depende de fatores agrícolas, industriais, como variedade de cana-de-açúcar, o grau de maturação, clima, condições de cultura, tipo de corte, entre outros. Aproximadamente 60% dos sólidos solúveis são compostos por sacarose, glicose e frutose. Os principais componentes do melaço são: água, carboidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos, vitaminas, proteínas, fenois, entre outros. Segundo Trata-se do produto ideal para a fermentação, uma vez que além de conter em média 60% de açúcares redutores, possui outros nutrientes para que a fermentação ocorra sem a adição de nutrientes (Silva, 2008).

Este coproduto é largamente aplicado em meios para cultivo de carotenoides.

An, Jan & Cho (2001) utilizaram melaço (50% v/v) para a produção de carotenoides por Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffa rhodozyma), obtendo como pH ótimo 4,5- 5,5, e produção de biomassa máxima de 36 g.L^-1e 40 mg.L^-1 de carotenoides, em escala piloto contendo 100 L de meio, a 20ºC. Squina et al (2002) utilizaram melaço de cana de açúcar para o cultivo de Rhodotorula rubra e R. glutinis, e produção de carotenoides, obtiveram um máximo de carotenoides totais e biomassa de 427 e 197 μg.g^-1 e 0,4 e 0,2 mg.g^-1 para R. rubra e R. glutinis, respectivamente.

Bhosale & Gadre (2001) estudaram a produção de β-caroteno por várias cepas de Rhodotorula glutinis e Rhodotorula rubra em melaço de cana de açúcar, com 20 g.L^-1 de açúcares totais, onde a cepa Mutante 32 se destacou por apresentar uma proporção de β-caroteno de 70 %. Os carotenoides totais obtidos foram de 14 mg.L^-1, e biomassa de 8,3 g.L^-1, em 72 h a 28ºC e 500 rpm.

3.4.3. Glicerol

Glicerol é o principal coproduto da conversão do óleo em biodiesel, compreende cerca de 10% em massa do óleo alimentado ao processo (SAENGE et al, 2011), logo, é produzido em proporções apreciáveis nas indústrias de biocombustíveis.

Segundo a ANP (Agência Nacional do Petróleo), o Brasil produziu cerca de 2,4 bilhões

35

de litros de biodiesel em 2011, contra 400 milhões de litros em 2007. De acordo com o site “America economia”, o presidente da Petrobrás Biocombustíveis, Miguel Rossetto, em 2012, o Brasil deverá ultrapassar a Alemanha na produção de biodiesel, se transformando no maior produtor mundial desse tipo de combustível.

O glicerol está disponível por um baixo custo, e pode ser utilizado como substrato em processos fermentativos, pois, a partir dele, podem ser produzidos bens de elevado valor, como o ácido cítrico, ácido ɣ-linolênico e α-amilase (MANTZOURIDOU, NAZIRI & TSIMIDOU, 2008).

Mantzouridou, Naziri & Tsimidou (2008), estudaram o uso do glicerol como fonte de carbono adicional à glicose para a produção de β-caroteno por Blakeslea trispora em cultivo em batelada, obtendo maiores produções deste carotenoide (15 mg.g^-1 de biomassa seca) com concentração inicial de glicerol no meio de 60,0 g.L^-1. Um aspecto importante na obtenção do biodiesel é o destino a ser dado a glicerina obtida no processo. O desenvolvimento de bioprocessos para converter glicerina em produtos de importância comercial viria agregar valor a cadeia de produção do biodiesel, tornando-se uma rica fonte de carbono para os processos biotecnológicos (SILVA, 2010).

Saenge et al (2011), utilizaram glicerol bruto como única fonte de carbono para a produção de lipídios e carotenoides por Rhodotorula glutinis TISTR 5159,em meio com concentração de glicerol de 8,5% e razão C/N de 85, em pH de 6,0 e taxa de aeração de 2 vvm, obtendo valores de produção de lipídios de 6,05 g.L^-1 e de 135,25 mg.L^-1 de carotenoides.

Silva (2010), utilizando a mesma cepa de Phaffia rhodozyma deste trabalho, definiu como condições ótimas o meio de produção de carotenoides em (g.L^-1): 35 glicerol, 7,5 peptona, 6,4 glicose, 90 água de parboilização de arroz, 20 extrato de malte, 1 extrato de levedura e pH inicial 4,0, alcançando concentração de biomassa de 13,5 g.L^-1, produção volumétrica e específica de carotenoides, respectivamente 2,4 µg.mL^-1 e 176,0 µg.g^-1 em 168h, a 25ºC e 180 rpm.

36

CAPÍTULO III

DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO

37

Artigo 1

Atividade antioxidante e estabilidade de extratos carotenogênicos de Phaffia rhodozyma