Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador-Bahia 2010
Brucelose ovina: estudo soroepidemiológico no semi-árido baiano e utilização de antígeno para teste de diagnóstico
Iuri Coelho Greve
IURI COELHO GREVE
BRUCELOSE OVINA: ESTUDO SOROEPIDEMIOLÓGICO NO SEMI-ÁRIDO BAIANO E UTILIZAÇÃO DE ANTÍGENO PARA TESTE DE DIAGNÓSTICO
Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal.
Orientador: Prof. Dr. Maurício Costa Alves da Silva Co-orientador: Prof. Dr. Robson Bahia Cerqueira
Salvador – Bahia 2010
FICHA CATALOGRÁFICA
GREVE, Iuri Coelho
Brucelose ovina: Estudo soroepidemiológico no semi-árido baiano e utilização de antíeno para teste diagnóstico/ Iuri Coelho Greve. – Salvador, 29/09/2010.
40p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, 2010.
Professor Orientador – Prof. Dr. Maurício Costa Alves da Silva Professor Co-orientador- Prof. Dr. Robson Bahia Cerqueira
Palavras-chave – Brucelose ovina, diagnóstico, epididimite, ELISA, IDGA.
1 – Greve, Iuri Coelho 2 – Brucelose ovina I- Estudo soroepidemiológico no semi- árido baiano e utilização de antíeno para teste diagnóstico
BRUCELOSE OVINA: ESTUDO SOROEPIDEMIOLÓGICO NO SEMI-ÁRIDO BAIANO E UTILIZAÇÃO DE ANTÍGENO PARA TESTE DE DIAGNÓSTICO
IURI COELHO GREVE
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Salvador, 29 de Setembro de 2010.
Comissão Examinadora:
__________________________________________________
Prof. Dr. Robson Bahia Cerqueira Co-Orientador/ Presidente
__________________________________________________
Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes – Universidade Federal da Bahia
__________________________________________________
Prof. Dra. Melissa Hanzen Pinna – Universidade Federal da Bahia
Aos meus pais, Lúcia e Hans, pelo incentivo constante e amor, em todos os momentos e Renata Leal pelo amor, dedicação e compreensão.
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me proporcionado essa conquista e está presente em todos os momentos quando mais precisei.
A professora Eugênia de Deus (in memorian) por ter me dado esta oportunidade e sua confiança principalmente, que foi indispensável ao meu êxito.
Ao meu grande amigo Professor Robson Bahia que me apoiou, me incentivou, acreditando sempre que eu seria capaz, sendo um precursor do meu progresso.
Ao meu orientador Professor Maurício Costa pela sua confiança e acolhimento.
A Professora Tereza Mascarenhas e Soraia Trindade e o mestrando Thiago Sampaio por ter me ajudado sem medir esforços.
Aos meus Pais Lúcia Maria e Hans Walter por me apoiarem sempre em todas as etapas de minha vida.
A Walter Leal e Maria Leal, que me acolheram como um filho me proporcionando sempre momentos de alegria e felicidade.
A Renata Leal minha companheira que me ajudou em todos os momentos que estive ao seu lado, com seu amor, paciência, dedicação e compreensão, me tornando a cada dia um homem realizado.
A Diógenes, um amigo que sempre me ajudou e nunca mediu esforços.
A meu avô Hilton Coelho (in memorian) que me ensinou a crescer e a enfrentar os obstáculos da vida, sempre me confortando com palavras sábias nos momentos de dificuldade.
A minha tia Fátima que me criou, me incentivou e sempre esteve ao meu lado.
"Sonho que se sonha só é só um sonho que se sonha só, mas sonho que se sonha junto é realidade."
(Raul Seixas)
ÍNDICE
LISTA DE TABELA... ix
LISTA DE FIGURAS... x
LISTA DE SIGLAS E ABREVEATURAS... xi
RESUMO... xii
SUMMARY... xiii
1.INTRODUÇÃO GERAL... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA... 3
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO... 3
2.2 EPIDEMIOLOGIA... 4
2.2.1 TRANSMISSIBILIDADE... 5
2.3 RESPOSTA IMUNE... 6
2.3.1 RESPOSTA HUMORAL ... 6
2.3.2 RESPOSTA CELULAR... 7
2.4 ETIOPATOGENIA... 9
2.5 SINAIS CLÍNICOS... 10
2.6 DIAGNÓSTICO... 11
2.6.1. DIAGNÓSTICO CLÍNICO... 11
2.6.2. SOROLOGIA... 12
2.6.3 ANTÍGENOS DE BRUCELLA SPP... 13
2.6.4 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL... 14
2.7 CONTROLE E PROFILAXIA... 15
3.OBJETIVOS... 17
3.1 OBJETIVO GERAL... 17
3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO... 17
4. ARTIGO CIENTÍFICO... 18
4.1 ARTIGO: UTILIZAÇÃO DE UM ANTÍGENO COMERCIAL PARA O TESTE ELISA INDIRETO NO DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS CONTRA A BRUCELOSE OVINA... 18 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 33
LISTA DE TABELAS
ARTIGO
UTILIZAÇÃO DE UM ANTÍGENO COMERCIAL PARA O TESTE ELISA INDIRETO NO DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS CONTRA A BRUCELOSE OVINA
TABELA 1- Estudo da sensibilidade, especificidade e ponto de corte... 25
LISTA DE FIGURAS
ARTIGO
UTILIZAÇÃO DE UM ANTÍGENO COMERCIAL PARA O TESTE ELISA INDIRETO NO DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS CONTRA A BRUCELOSE OVINA
FIGURA 1 – Amostras de soro ovino com e sem histórico clinico da Brucelose ovina submetidas ao teste ELISA indireto para a detecção de anticorpos contra a brucelose ovina...
24
FIGURA 2 – Curva ROC para avaliação da sensibilidade X especificidade de ELISA indireto com antígeno Reo 198...
25
LISTA DE ABREVIATURAS
IDGA Imunodifusão em gel de ágar ELISA Ensaio imunoenzimático IgG`s Imunoglobulinas
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
IL-2 Interleucina dois
IL-4 Interleucina quatro
IFN-λ Interferon gama
CO2 Gás carbônico
PCR Reação em cadeia polimerase
2-ME 2 mercaptoetanol
°C Grau Celsius
% Porcentagem
TECPAR Instituto tecnológico do Paraná
µL Microlitro
pH Potencial de hidrogênio
M Molar
PBS Solução tampão fosfato bibásico
H2O2 Água oxigenada
Mg Miligrama
H2SO4 Ácido sulfúrico
Nm Nanômetro
ROC Receiver operator characteristic
D.O Densidade ótica
g Grama
CUT-OFF Ponto de corte
FC Fixação de complemento
GREVE, I. C. Brucelose ovina: estudo soroepidemiológico no semi-árido baiano e utilização de antígeno para teste de diagnóstico. Salvador, Bahia, 2010. 44p.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2010.
RESUMO
A Brucelose ovina é caracterizada por epididimite em carneiros, aborto em ovelhas e nascimento de cordeiros debilitados responsável por perdas econômicas á ovinocultura.
Este trabalho teve como objetivo padronizar um teste imunoenzimático utilizando um antígeno comercial e 90 amostras de soro ovino com histórico e sem histórico de brucelose ovina provenientes da região de Andorinha-Ba e posteriormente foram submetidas 448 amostras de soro ovino proveniente de 7 regiões do semi-árido baiano com a finalidade de demonstrar o desempenho do teste. O antígeno foi diluído na proporção de 1:25, 1:50, 1:100 e 1:200, sendo observada a melhor resposta com a diluição de 1:200. A sensibilidade e especificidade do teste foi detectada 100% e 95,6%
respectivamente e o ponto de corte foi 0,408. Estes dados comprovam o desempenho do teste de ELISA indireto, sugerindo que o mesmo pode constituir um recurso útil para o diagnóstico sorológico da brucelose em ovinos.
Palavras chave: Brucelose ovina, diagnóstico, Epididimite, ELISA, IDGA.
GREVE, I. C. Ovine brucellosis: seroepidemiological study in semi-arid region and use antigen for diagnostic test Salvador, Bahia, 2010. 44p. Dissertation (Master in Animal Science in the Tropics) - School of Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, 2010.
SUMMARY
Brucellosis is characterized by ovine epididymitis in rams and abortion in ewes and lambs born weak economic losses will be responsible for sheep production. This study aimed to standardize an assay using a commercial antigen and serum samples from 90 sheep with a history of brucellosis in sheep from the region of Andorinha-BA and then underwent serum samples from 448 sheep from seven regions of the semi-arid region in order to demonstrate the performance of the test. The antigen was diluted in 1:25, 1:50, 1:100 and 1:200, the best response was observed with a dilution of 1:200. The sensitivity and specificity of the test detected 100% and 95.6% respectively and the cutoff was 0.408. These data confirm the performance of the ELISA test, suggesting that it may constitute a useful tool for the serologic diagnosis of brucellosis in sheep.
Keywords: ovine brucellosis, diagnosis, Epididymitis, ELISA, AGID.
1.INTRODUÇÃO
A pecuária de ovelhas do Nordeste brasileiro foi considerada durante muito tempo como uma atividade destinada principalmente à alimentação das populações rurais por constituir-se numa fonte barata de proteína animal para as famílias de baixo poder aquisitivo e pela capacidade que tem os ovinos deslanados de produzir em terras que, muitas vezes, não se prestam para a exploração agrícola nos quais outras espécies animais têm dificuldade em produzir (CORREIA et al., 2000). Nos últimos anos, a caprino-ovinocultura vem ganhando destaque, seja pela busca de carne com menor teor de gordura, seja pelo maior retorno que a atividade traz quando comparado a outras espécies de explorações, principalmente à bovinocultura de corte. No momento cerca de 50% da carne ovina consumida no Nordeste e Centro-Oeste são provenientes do Uruguai, da Argentina e da Nova Zelândia. Esta informação mostra uma possibilidade enorme de mercado a ser conquistado, principalmente porque no Brasil, especialmente no Nordeste, tem-se potencial para produzir carne de melhor qualidade do que àquela importada (LEITE; SIMPLÍCIO, 2005). O Estado da Bahia conta com a maior população caprina e a segunda maior ovina do Brasil, com 4,8 e 3,0 milhões de cabeças, respectivamente. Entretanto, os sistemas de criação predominantes são caracterizados por baixos índices zootécnicos, em conseqüência da precária nutrição, dos problemas sanitários, do manejo ineficiente e do baixo potencial genético dos animais. A maioria dos produtores interessados neste ramo de criação é iniciante e muitos outros desejam desenvolver esse tipo de atividade. Assim, o primeiro passo é o planejamento das etapas da criação, utilizando a tecnologia adequada ao nível de investimento. A ovinocultura, como para todas as áreas da pecuária, a falta de manejo sanitário trazem inúmeros prejuízos econômicos e reprodutivos. Doenças que acometem o sistema reprodutivo sejam infecciosas, parasitárias, nutricionais ou outras, trazem grandes perdas econômicas, por conta do aumento da taxa de parição, abortamentos, natimortos e infertilidade (MOLENTO et al., 2004). Para tanto, é imprescindível o apoio técnico qualificado, resultando em alta relação benefício no qual o controle sanitário seja determinante definição do sistema produtivo (GUSMÃO, 2005). Dentre as enfermidades infecciosas de maior relevância em ovinos, pode-se destacar a brucelose
ovina. Tendo como agente uma bactéria que provoca epididimite nos machos, além de apresentar aborto em ovelhas e mortalidade perinatal de cordeiros (ESTEIN, 1999). Em inoculações experimentais, a enfermidade apresenta um período de incubação que varia entre quatro a seis semanas, e o período de eliminação da bactéria no sêmen pode variar de meses a anos (MANTEROLA, et al., 2003). Principalmente pelo seu mecanismo de etiopatogenia o diagnóstico clínico e laboratorial é dificultoso. Assim, recomenda-se que, para considerar um animal negativo, além do exame clínico, seja realizado o exame bacteriológico do sêmen e/ ou testes sorológicos, como IDGA, RFC e ELISA, por serem os mais utilizados em vários países (NIELSEN et al., 2008; LIRA; MEGID, 2009). Marinho; Mathias (1996) recomendam que o diagnóstico através dos testes sorológicos deva ser associado ao histórico do rebanho e ao quadro clínico da doença. O diagnóstico da infecção em ovinos é baseado no diagnóstico clínico, isolamento e identificação através da cultura de sêmen e testes sorológicos. Dentre as provas sorológicas mais amplamente utilizadas na detecção de anticorpos anti-Brucella ovis encontra-se o teste de imunodifusão em gel de Agarose, que apresenta alta sensibilidade, baixo custo e fácil execução (BAIGÚN; CONIGLIARO; LUNA, 2000).
O teste de fixação de complemento rotineiramente preconizado pelo Ministério da Agricultura no Canadá, sendo utilizado no diagnóstico da brucelose ovina. O ELISA indireto tem sido utilizado para detecção de anticorpos contra Brucella ovis, já que o fixação de complemento apresenta algumas desvantagens como efeito prozona, incompatibilidade com o anti-complemento e ocasionalmente reações falso-positivas e falso-negativas (SARGISSON; WEST, 2000). Vários estudos sorológicos, empregando o teste ELISA indireto, realizado com amostras de ovinos, retratam a variabilidade da freqüência de animais reagentes em diferentes localidades do Brasil e em diferentes países podendo destacar a importância dessa técnica quando se refere a sensibilidade, especificidade e sua eficácia (AZEVEDO, et al., 2004). Logo, faz necessário técnicas de diagnóstico eficazes e capazes de identificar rebanhos infectados, contribuindo assim com as medidas de controle e prevenção.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO
A Brucelose ovina foi relatada inicialmente na Nova Zelândia, por Buddle; Boyes (1953), então a doença foi disseminada em todos os países que exploram a pecuária da ovinocultura. Foi relatada na Austrália, América do Norte, Ásia Central, África do Sul e Europa (RADOSTITS, 2000). Ramos et al., (1966), trabalhando com ovinos no Rio Grande do Sul em 1964, foi o pioneiro a observar quadros de epididimite em ovinos sugerindo sinais clínicos da enfermidade. No Brasil a Brucella ovis foi isolada pela primeira vez em 1972 no Estado do Rio Grande do Sul (BLOBEL et al., 1972).
O gênero Brucella apresenta bactérias na forma de cocobacilos gram-negativos não capsulados, imóveis e que não apresentam capacidade de formar esporos, são parasitas intracelulares facultativos. Atualmente é composto por sete espécies a destacar:
Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella neotomae e Brucella maris (PESSEGUEIRO; BARATA CORREIA, 2003).
As espécies de Brucella são aeróbias, capnofílicas e catalase positivas. Alguns biótipos da B. ovis requerem 5 a 10% de CO₂ para isolamento primário, assim como meios enriquecidos com sangue ou soro para seu cultivo (QUINN et al., 2005). No isolamento inicial, a maioria das colônias é detectada entre o 10° e o 14° dia, sendo às vezes necessário prolongar esse período até o 21° dia. O ideal para o crescimento das colônias é um ambiente aeróbio a 37°C, porém também ocorre entre 20 a 40°C, seu pH ideal está entre 6,6 a 7,4 se aproximando da neutralidade (HISH; ZEE, 1998).
A morfologia da bactéria está relacionada com sua composição química da parede celular, envolvida por uma estrutura lipopolissacarídica (cadeia O) e são classificadas como lisas ou rugosas. A B. ovis apresenta uma morfologia colonial rugosa, desta forma não apresentam a cadeia O. A estrutura das brucelas rugosas é parecida com as da lisa, porém nas rugosas a cadeia O está totalmente ausente ou presente de forma residual (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003; NOGUEIRA; FERRARI; CURCI, 2007).
Paulin; Ferreira Neto (2003) descrevem a existência de onze epítopos, presentes na camada lipopolissacarídicas da parede celular, que foram relatados. Quatro estão da cadeia O (C/Y, C, A e M); C/Y e C estão presentes em todas as brucelas lisas, e A e M variam sua concentração na dependência da espécie de Brucella; dois estão no oligossacarídeo central das brucelas rugosas (R1 e R2); três no lipídeo A (LA1, LA2, LA3) e dois associados ao peptídeo da proteína de membrana externa OMP3 (LA Omp3-1 e LA Omp3-2).
2.2 EPIDEMIOLOGIA
O primeiro estudo sorológico no Brasil foi realizado por Ramos et al. (1996), no Rio Grande do Sul., pela técnica de imunodifusão em gel de ágar (IDGA), no qual 6,5% dos soros dos animais testados foram reagentes ao teste. A brucelose tem sido uma doença que vem se destacando e se disseminando desde a identificação da B. melitenses, por Bruce, em 1887. Contudo, a prevalência da infecção por B. ovis é variável em diversas partes do mundo e depende, também, do método e/ou da prova diagnóstica utilizada, variando de 2,4 a 26% dos carneiros examinados nos trabalhos realizados em outros países (TAMAYO; VALENTIN; SCHUZBITZ, 1989; TORRES et al., 1997).
Tendo como base os dados estatísticos, as raças nativas da Espanha e a raças derivadas da raça Merina são mais resistentes a brucelose ovina do que as raças européias importadas. Embora a resistência genética a doença possa ser importante, se tem sugerido que a suscetibilidade possa também estar relacionada à taxa de crescimento e precocidade e atividade sexual (GOMES, 2007).
No Brasil a presença da infecção foi constatada no Rio Grande do Sul por Magalhães Neto; Gil-Turnes (1996), no qual a doença foi diagnosticada em 11 dos 12 municípios estudados, demonstrando que a brucelose ovina é uma doença de expressiva importância, em cujo controle não tem havido progresso desde que foi diagnosticada no Estado, principalmente pelo fato de ser um estado importador e exportador de
reprodutores (MARINHO; MATHIAS, 1996; NOZAKI et al., 2004). Contudo, Fernades; Lindermann; Soares, (1981) constataram a positividade para brucelose ovina de 14% dos 100 carneiros vazectomizados examinados pelo teste de imunodifusão na cidade de Porto Alegre, RS.
Clementino et al., (2007), desenvolveu uma pesquisa no semi-árido da Paraíba, para investigar fatores de risco como o sistema de criação, contato com outros animais, freqüência de higienização das instalações, aglomeração dos animais durante a vacinação e vermifugação. Foram investigadas 283 propriedades sendo que em 25 delas um ou mais carneiros apresentaram soropositividade para Brucella ovis pelo teste de imunodifusão em gel de ágar e reação de fixação do complemento, concluindo que as propriedades que realizavam a higienização das instalações freqüentemente apresentavam índices reduzidos da doença.
Com os resultados obtidos no trabalho de Azevedo et al., (2004), demonstraram que a ocorrência de anticorpos anti-Brucella ovis indica que a doença encontra-se presente, tornando-se um problema sanitário no rebanho ovino do estado do Rio Grande do Norte. Silva et al., (2003), estudando a prevalência de Brucelose ovina causada por B.
ovis em rebanhos do Estado do Rio Grande do Norte, Brasil, detectaram 13 municípios dos 14 estudados, concluindo que a infecção por B. ovis esta amplamente distribuída na região, afetando ovinos de ambos os sexos, adultos e jovens e de diferentes raças.
2.2.1 Transmissibilidade
A transmissão ocorre através de águas contaminadas, pastos devido ao contato com corrimento uterino pós-parto ou aborto, restos de placenta e fetos abortados. Os ovinos infectados podem transmitir a Brucella pelo sêmen contaminado, sendo de extrema importância quando utilizado para inseminação artificial. Outra forma de transmissão é pela ingestão de produtos de origem animal contaminados, como o leite cru e derivados (SANTOS; POESTER; LAGE, 2005).
Grasso, (1998) relata que é necessário manter as pastagens baixas para facilitar a incidência de raios solares, visto que a Brucella spp é sensível a altas temperaturas, orientar a população sobre o risco da ingestão de alimentos que não passaram por processamento adequado, como leite não pasteurizado. Porém o método mais comum de transmissão está relacionado à monta natural e inseminação artificial entre animais positivos para a enfermidade (CORREA; CORREA, 2002).
As infecções das glândulas sexuais acessórias dos machos permitem disseminação das brucelas através do sêmen, podendo existir lesões ou não nos testículos e nos epidídimos (HISH; ZEE, 1998). A B.ovis pode estar presente no sêmen cerca de três semanas após a infecção, e lesões no epidídimo podem ser detectadas por palpação cerca de nove semanas (TIMONEY et al., 1988). As mucosas orais, conjuntivais, prepuciais, vaginais e retais, são as principais vias de penetração da Brucella ovis, porém as vias de transmissão ainda não são completamente conhecidas (PAOLICCHI, 2001).
2.3 RESPOSTA IMUNE
2.3.1 HUMORAL
Após a infecção o hospedeiro não adquire a imunidade contra a Brucelose, pois a presença de anticorpos circulantes não garante a proteção, sendo medidos por provas de aglutininas, precipitinas, opsoninas ou provas bactericidas. Na realidade, anticorpos séricos são geralmente detectáveis desde o tempo dos primeiros sinais e sintomas e sua presença na circulação não impede a bacteremia. (DAVIS et al., 1979). Walker (2003) ressalta que após a entrada no hospedeiro, o organismo Brucella spp, tanto no meio extracelular ou dentro das células fagocitárias, multiplicam-se em linfonodos regionais.
Neste local, eles proliferam e infectam outras células ou são destruídos, eliminando a infecção, demonstrando que anticorpos IgM, aparecem inicialmente após infecção, e níveis de IgG irão surgir mais tardiamente.
Shurig (1997) descreve que a cadeia O é o componente antigênico mais importante das brucelas lisas, pois ela é responsável pela resposta humoral, sendo essencial no sorodiagnóstico da doença, já que os testes demonstram a presença de imunoglobulinas séricas antibrucela em animais vacinados e naturalmente infectados. Ao contrário das brucelas rugosas que não apresentam a cadeia O em sua parede celular tornando-as menos patogênicas. A resposta humoral caracteriza-se pelo aumento das concentrações de IgG e IgM, depois que a brucela invade o organismo do hospedeiro. Após algumas semanas, as IgM´s diminuem consideravelmente até seu desaparecimento, já as IgG´s permanecem com altas concentrações durante a fase de crônicidade (SUTHERLAND,1980).
Os anticorpos que são produzidos em resposta a Brucelose possuem um papel tanto protetor quanto nocivo. As imunoglobulinas IgM, que aparecem inicialmente após a infecção, e as imunoglobulinas IgG em níveis mais baixos, são responsáveis pela lise da brucela mediada pelo complemento. Entretanto, níveis elevados de IgG parecem agir como anticorpos bloqueadores que modulam a capacidade do complexo de ataque da membrana do complemento de lisar as células (HISH; ZEE, 1998). No entanto, Paulim (2003) relata que a vacinação provoca uma resposta humoral, onde as imunoglobulinas do tipo M desaparecem em alguns meses e as imunoglobulinas G do tipo 2 reduz a sua concentração gradativamente. Contudo, as do tipo G1 devido a estímulos antigênicos, permanecem a sua produção.
2.3.2. RESPOSTA CELULAR
As bactérias do gênero Brucella spp. são usualmente classificadas como parasitas intracelulares facultativos. No entanto, Gorvel; Moreno (2002) admite que a melhor classificação fosse a de parasita facultativamente extracelular devido á preferência do microrganismo pelo meio intracelular. Ao contrário das outras bactérias patogênicas, fatores clássicos de virulência como exotoxinas, flagelos, fímbrias, cápsulas e outros não são encontrados em Brucella spp. Os fatores envolvidos com a patogenicidade são aqueles que permitem a invasão, a sobrevivência e a multiplicação intracelular nas
células do hospedeiro. O local preferido das brucelas no sistema digestivo é o epitélio que recobre as placas de Peyer do íleo, que após a sua entrada podem ser fagocitadas por células específicas. As brucellas possuem vários mecanismos de defesa que inibem a fusão do fagolisossoma, podendo esta sobreviver e se multiplicar dentro destas células (HISH; ZEE, 1998).
A imunidade celular representa um papel crítico na doença. As Brucellas sobrevivem mais em células mononucleares cultivadas de animais não-imunes do que em células análogas de animais ativamente imunizados. Quando a Brucella invade o organismo do hospedeiro o sistema mononuclear fagocitário é ativado, e os macrófagos por sua vez, através de receptores ou anticorpos opsonizantes, ligam-se à bactéria com o intuito de neutralizá-las. A Brucella pode ser fagocitada e destruída pelos macrófagos e algumas de suas frações podem ser apresentadas na superfície para que sejam reconhecidas pelos linfócitos T e B (TIZARD, 2002). Contudo, Corbel (1997) refere que uma das explicações para a sobrevivência da bactéria dentro dos macrófagos é a capacidade que a Brucella spp. tem de produzir adenina e guanina monofosfato, substâncias que inibiriam o processo de fusão fagolisossômica. As células do sistema fagocitário, sobretudo macrófagos, ligam-se à Brucella através de receptores específicos ou com ajuda de anticorpos opsonizantes. No entanto, estudo realizado por Salas-Téllez et al.
(2004), com uma fração sub-celular de proteína da Brucella ovis inoculada em camundongos, com coletas de sangue 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a inoculação sendo observadas e mensuradas a concentração de citocinas como IL-2, IL-4, e a IFN- gama, verificou-se que até 120 horas após a inoculação o animal apresentava índices elevados de citocinas possibilitando utilizar a fração subcelular para a produção de antígenos.
Em um estudo experimental realizado por Thoen; Enright; Cheville, (1986), os ovinos foram inoculados com uma cepa de B. ovis com o objetivo de avaliar a resposta celular do hospedeiro, quatro dias após a inoculação, percebeu-se a existência de focos de infiltrados inflamatórios, especificamente, dentro do córtex dos linfonodos no qual se identificou reações inflamatórias constituídas por macrófagos e células epitelióides.
Também foi observado um grande número de neutrófilos e eosinófilos maduros dentro
de vasos sanguíneos de pequeno calibre, nos linfonodos e na cápsula. O tecido que circunda os vasos também apresentava células inflamatórias.
Santos; Poester; Lage, (2005), com o objetivo de investigar a resposta celular, realizaram inoculação experimental de uma cultura de B. ovis, diretamente no epidídimo, sendo constatado intenso infiltrado inflamatório misto, constituído por neutrófilos e linfócitos, detectável aos quatro dias da inoculação. No oitavo dia após a inoculação, além do infiltrado de células inflamatórias no tecido conjuntivo de sustentação e no epitélio epididimário, também foi observado grande quantidade de neutrófilos no lúmen epididimário. As lesões iniciais progrediram com fibrose intersticial, degeneração do epitélio epididimário e desenvolvimento de granuloma espermático.
2.4. ETIOPATOGENIA
A infecção de superfície de mucosas depende da capacidade da bactéria de se aderir às células e colonizar as mucosas. Após a aderência, as bactérias podem causar um processo inflamatório pela destruição de células da mucosa e/ou invasão do tecido adjacente pela ação direta do microrganismo sobre as células ou por componentes de secreção como enzimas e toxinas. A Brucella spp pode infectar células fagocitárias ou não fagocitárias. No interior das células não fagocitárias as brucelas tendem a localizar- se no retículo endotelial rugoso. Nos polimorfonucleares ou células mononucleares, estes microrganismos usam vários mecanismos para evitar ou suprimir a resposta bactericida (PESSEGUEIRO; BARATA; CORREIA, 2003).
A infecção nas ovelhas tem vida curta e só persiste em alguns poucos animais, mas o microrganismo, após o aborto, permanece na placenta, nas secreções vaginais e no leite.
Em muitos reprodutores, uma eliminação ativa da bactéria pelo sêmen persiste, provavelmente por tempo indeterminado. Os cordeiros nascidos de ovelhas infectadas e que ingerem leite contaminado não adquirem a enfermidade (BLASCO et al., 1987, KREUTZ; MADRUGA; ARAÚJO, 2001).
Devido à propriedade de resistir à destruição intrafagocitária a B. ovis se multiplica lentamente e ao final do segundo mês de infecção, há produção de uma bacteremia e o agente localiza-se nos órgãos sexuais, baço, rins e fígado, no qual, devido à ineficiência dos fagócitos em sua destruição, com posterior produção de abscessos e reações inflamatórias crônicas, caracterizadas por fibrose e calcificação (GIL TURNES, 2001).
2.5 . SINAIS CLÍNICOS
Os carneiros acometidos por Brucella ovis normalmente apresentam orquite e epididimite, e em geral as lesões são unilaterais, sendo comum o aumento palpável do epidídimo, envolvendo especialmente a porção caudal. As lesões do epidídimo são caracterizadas por hiperplasia e degeneração hidrópica do epitélio tubular. Como resultado de extravasamento de esperma ocorre a formação de um granuloma espermático. Nos casos agudos da doença, exames do esperma demonstram aumento do número de neutrófilos sendo o inverso em animais com a doença em estágio mais avançado (BAIGÚN; CONIGLIARO; LUNA, 2000).
As conseqüências da infecção incluem infertilidade ou fertilidade reduzida em carneiros, aborto esporádico em ovelhas e mortalidade perinatal aumentada. Carneiros cronicamente afetados têm freqüentemente atrofia testicular unilateral ou bilateral com aumento de volume e endurecimento do epidídimo. O efeito primário da infecção é uma placentite que interfere com a nutrição do feto, podendo levar a óbito, porém é mais comum o nascimento com baixo peso corpóreo e pouca viabilidade (CORREA;
CORREA, 2002, QUINN et al., 2005). O edema e a exsudação de líquido viscoso são decorrentes dos processos inflamatórios, que afeta tanto o cordão umbilical do feto quanto o espaço intercotiledonário. Há também presença de líquido serosanguinolento nas cavidades abdominal e torácica (MOLNAR, et al., 1997).
A interrupção da espermatogênese pode resultar em atrofia testicular. As vesículas seminais podem apresentar aumento de volume; com ductos preenchidos por líquido.
As glândulas bulbouretrais, a próstata e as ampolas seminais normalmente não apresentam alterações significativas. Animais assintomáticos que eliminam o organismo no sêmen podem ser subférteis ou apresentarem fertilidade normal. Na ovelha, a principal conseqüência da infecção por B. ovis é o aborto ou nascimento de cordeiros fracos (SANTOS; POESTER; LAGE, 2005).
Foster; Ladds; Briggs, (1989) relataram em um estudo realizado nos Estados unidos e Nova Zelândia, o aborto de ovelhas com quadro de placentite, causado por infecção experimental e/ou naturalmente infectada, constatando que a infecção intra-uterina, produzida experimentalmente, também pode causar lesões e morte dos fetos, porém com relação aos animais que abortaram em condições naturais, a causa não foi determinada. A evidência é de que a B. ovis apresenta patogenicidade para as ovelhas, apresentando como efeito primário da infecção uma placentite que interfere com a nutrição do feto, chegando algumas vezes, a provocar sua morte, porém é mais comum o nascimento de cordeiros com baixo peso corpóreo e pouca viabilidade.
2.6. DIAGNÓSTICO
2.6.1. DIAGNÓSTICO CLÍNICO
Para a realização de um diagnóstico seguro das doenças infecciosas devem ser avaliadas algumas informações no que se refere à anamnese do rebanho, epidemiologia, sintomatologia, achados anatomohistopatológico, e o mais importante demonstrar de forma direta e/ou indireta o agente patogênico (MOLNAR et al., 1997). No trabalho de Cardoso et al., (1989), foi possível observar que o diagnóstico da brucelose ovina, realizado somente com o exame clínico, falha na detecção de muitos animais infectados, visto que através deste método foi possível identificar 36,12% dos animais infectados quando associado a técnica sorológica. Contudo, Santos; Poester; Lage (2005) destacam a importância do isolamento da B. ovis do sêmen no diagnóstico definitivo da enfermidade.
A existência de outras bactérias causadoras de epididimite torna extremamente difícil o diagnóstico da brucelose ovina, exclusivamente na palpação testicular. Agentes microbianosrealcionados com epididimite em carneiros inclui: o Actinobacillus seminis Actinobacillus actinomycetem-comitans, Histophilus ovis, Haemophilus spp, Corynebacterium pseudotuberculosis, Chlamydia psitacii e outros. Alem disso, os animais que evidenciam epididimite palpável podem freqüentemente voltar à normalidade dentro de poucas semanas, muito embora as lesões histológicas possam ser demonstradas no epidídimo e glândulas sexuais acessórias (GOMES, 2007). Segundo Ramos et al., (1966) na fase crônica da epididimite ovina, as lesões podem ser determinadas pela palpação do epidídimo e vaginal, formando espermatocele, fibrose e aderências que obliteram, por vezes, a cavidade da vagina. Em ovinos examinados por este método foram coletadas amostras e conduzidas ao laboratório para isolamento e identificação do agente, sendo confirmadas as evidências clínicas.
2.6.2. SOROLOGIA
Diversos métodos sorológicos têm sido usados para detectar anticorpos contra B. ovis como hemaglutinação indireta, imunofluorescência indireta, imunodifusão e ELISA.
(EISTEN, 1999). Keid (2001)com o objetivo de diminuir o número de reações falso- positivas na IDGA, tem sido realizado o tratamento prévio dos soros pelo 2- mercaptoetanol (2-ME).9 O 2-ME desnatura a IgM através da destruição das pontes dissulfídricas. A molécula de IgM tem uma maior característica de aglutinação nãoespecífica que a molécula de IgG2,12, e, dessa forma, o emprego do 2- mercaptoetanol reduz o número de reações inespecíficas. Quinn et al (2005) reforça que os testes sorológicos mais utilizados para detecção da Brucella ovis são: teste de imunodifusão em ágar-gel, teste da fixação do complemento e ELISA indireto. A técnica de immunoblotting também pode ser usada como teste diagnóstico confirmatório. Já, Paulin; Ferreira Neto (2003) demonstra que quando se trabalha com rebanhos, o sorodiagnóstico é a base da luta contra brucelose, por permitir o monitoramento tanto de propriedades como de regiões inteiras, além de vigiar zonas na
qual a doença já foi erradicada. Por tratar-se de procedimento de aplicação massal, deve ser rápido, barato, de fácil realização, desprovido de riscos respeitando as normas técnicas estabelecidas pelos organismos internacionais, com antígenos padronizados e específicos para cada prova
A combinação da IDGA e ELISA parece que dá os melhores resultados em termos de sensibilidade, embora em relação à simplicidade e custo o teste de IDGA é o teste mais prático no diagnóstico da B. ovis. O teste prescrito ou indicado para o comercio internacional permanece sendo o teste de FC (MARIN; ALABART; BLASCO, 1996).
Segundo Nielsen (1995) o ELISA indireto apresenta como vantagens alta sensibilidade e especificidade e a possibilidade de automatização total do processo. O problema está em distinguir animais vacinados dos infectados, a depender da vacina utilizada, além do tempo para sua realização, contudo a utilização deste teste pode facilitar pesquisas soroepidemiológicas o qual tem sido empregado pela quantidade de exames realizados ao mesmo tempo (NIELSEN, 1995).
2.6.3. ANTÍGENOS DE BRUCELLA SPP.
Myers et al., (1972) utilizaram um antígeno produzido a partir da cultura, isolamento e identificação da B. ovis, coletado do epidídimo de um ovino infectado, posteriormente este agente foi utilizado para avaliar os testes de fixação de complemento e gel de agarose no diagnóstico da Brucelose ovina. Os resultados obtidos nos testes sorológicos tiveram uma correlação de 89,7%após a confirmação das amostras positivas.
Em estudo realizado por Koerich; Vaz, (2002) foi observado à diferença nos resultados obtidos quando se comparou antígenos produzidos por dois laboratórios e um antígeno padrão no qual a composição antigênica e a identificação de um antígeno padrão foram comparadas com antígenos comerciais pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida e imunodifusão radial havendo discordância entre os resultados.
Verificou-se que as bandas protéicas observadas ocorreram a aproximadamente 200 KDa, 116.25 KDa, 97.4 KDa, 66.2 KDa e 31 KDa.
A ocorrência de anticorpos anti-Brucella ovis foi detectada em ovinos em quatro municípios do Rio Grande do Norte, utilizando o teste de gel de ágar como técnica de diagnóstico com antígeno composto por lipopolissacarídeos de proteínas de Brucella ovis, amostra Reo 198, fornecido pelo TECPAR. Este antígeno é liberado pelo Ministério da Agricultura de onde atualmente é utilizado no Brasil em pesquisas de soroprevalência e por laboratórios credenciados (AZEVEDO et al., 2004).
Jorge (2007) utilizou uma cepa de B.canis com o objetivo de padronizar um teste ELISA indireto no diagnóstico da brucelose ovina, constatou resultados similares entre as proteínas de superfície das diferentes subespécies, apresentando bom desempenho com relação a sensibilidade e especificidade.
2.6.4. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O diagnóstico padrão para a maioria das doenças infecciosas é o isolamento através do cultivo, com posterior identificação do patógeno. Porém no caso de muitas enfermidades esse é um processo lento e muito oneroso, pois é freqüente a necessidade de investigar muitos animais em programas de vigilância sanitária (MOLNAR et al., 1997). Em geral, a identificação de brucelose como causa de abortamento faz-se pelo isolamento da bactéria em feto abortado (conteúdo de abomaso); placenta (cotilédone) ou secreção vaginal (PUGH et al.; 2004).
Michaux-Charachon et al., (1997) relata que as sensibilidades dos testes (IDGA e ELISA) são semelhantes e algumas vezes o ELISA é de maior sensibilidade do que o teste de FC. A combinação da IDGA e ELISA apresenta melhores resultados em termos de sensibilidade embora em relação a simplicidade e custo o teste de IDGA é o teste mais prático no diagnóstico da B. ovis.
Gil; Turnes, (2001) relatam que o sêmen deve ser coletado assepticamente e remetido refrigerado, não congelado, o mais rápido possível para um laboratório habilitado a fazer o diagnóstico, onde será semeado em placas de Agar nutritivo, adicionadas de soro
bovino ou eqüino a 10% e dextrose a 1%; as quais serão incubadas a 37ºc em ambiente de 10% de CO2 durante não menos de três dias.
Deve-se empregar cuidado especial ao trabalhar com tecidos infectados e culturas de laboratório. Todas as culturas de Brucella spp. devem ser manipuladas com práticas de biossegurança do nível três por causa do potencial para disseminação do patógeno.
Todos os procedimentos laboratoriais devem ser realizados de forma que previnam aerossolização (KATIC, 2002).
Naturalmente existem diferenças com relação ao diagnóstico entre as diversas enfermidades e em certos casos predominam os sinais clínicos, o quadro patológico, e a própria demonstração direta do agente. Em termos genéricos, para o diagnóstico das enfermidades infecciosas agudas o mais importante é a demonstração direta do agente, enquanto o para de doenças crônicas a demonstração indireta, ou seja, as provas sorológicas (NIELSEN; GALL; KELLY, 1992).
A reação de fixação de complemento é amplamente utilizada para o diagnóstico da infecção por Brucella ovis e Brucella abortus e apresenta sensibilidade e especificidade elevadas. Nas campanhas de erradicação da brucelose bovina e ovina realizadas com sucesso em diversos países, essa foi a prova sorológica utilizada como teste confirmatório (HILBINK; WRIGHT; ROSS, 1993).
2.7. CONTROLE E PROFILAXIA
Gil-Turnes (2001) preconiza que a brucelose ovina pode ser controlada através da eliminação dos portadores ou mediante a utilização de vacinas. A vacinação tem sido outra opção de controle utilizada em vários países. Não existe, porém, vacina autorizada pelo Ministério da Agricultura para ser utilizado nos rebanhos brasileiros. Medidas sanitárias rigorosas devem ser adotadas, como por exemplo, o exame clínico e sorológico de qualquer animal introduzido nos plantéis e eliminação dos positivos, de modo a se evitar a propagação da doença nos rebanhos (AZEVEDO et al.; 2004). Já
Nicoletti (1990) reforça que a realização de exames sorológicos periódicos nos ovinos reprodutores é importante e necessário, pois permitirá a detecção e eliminação precoce dos positivos reduzindo a disseminação do agente. Pessegueiro; Barata; Correia (2003) recomenda ainda a pasteurização de leite rápida à temperatura de 72° C em 15 segundos e a lenta a uma temperatura de 62-63° C durante 3 minutos permitindo a destruição da bactéria, porém em algumas áreas onde a prevalência é alta, preconiza-se fazer a pasteurização com temperatura superior a 80°C. Deve-se ter cuidado quanto ao armazenamento do leite e o tempo em que leva para ser refrigerado, pois esses fatores podem influenciar na multiplicação de bactérias, quando não conduzidos de forma adequada
Hish; Zee (1998) relata a importância de medidas preventivas como a utilização de vacinas produzidas a partir da cepa da B. melitenses para imunoproteger contra infecções por B.ovis em ovinos, entretanto ela não pode ser usada em países livres de B.
melitenses, pois os títulos de anticorpos interferem em avaliações sorológicas para infecção pelo microrganismo, preconizando assim como principal forma de controle a remoção de carneiros infectados no rebanho e prevenção de novas infecções, fazendo exames clínicos e sorológicos quando houver ausência de sinais
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Levantamento soroepidemiológico e utilização de um antígeno a partir de preparado comercial na padronização de um ensaio imunoenzimático indireto no diagnóstico da brucelose ovina.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Utilização de um antígeno comercial denominado de Reo198 produzido pela TEC- PAR para padronização de um ensaioimunoenzimático indireto no diagnóstico da brucelose ovina.
- Aplicação do ensaio piloto padronizado para investigar sororeagentes em uma população de 448 amostras oriundas de 07 municípios do semi-árido da Bahia.
- Estudos da sensibilidade e especificidades do ensaio imunoenzimático padronizado.
4. ARTIGO CIENTÍFICO
4.1. ARTIGO
UTILIZAÇÃO DE UM ANTÍGENO COMERCIAL PARA O TESTE ELISA INDIRETO NO DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS CONTRA A BRUCELOSE
OVINA
GREVE, Iuri Coelho 1*; SILVA, Maurício Costa Alves 1; TRINDADE, Soraya1;
SILVA, Diógenes 2; MASCARENHAS, Maria Teresa 2; BAHIA, Robson Cerqueira3.
1Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Avenida Ademar de Barros, 500, Ondina, Salvador, Bahia, Brasil.
² União Metropolitana de Educação e Cultura-UNIME, Avenida Luís Tarquínio Pontes, Lauro de Freitas, Bahia, Brasil.
₃ Universidade Federal do Recôncavo Baiano-UFRB, Cruz das Almas, Bahia, Brasil
* Correspondência para o autor - E-mail: iurigreve@yahoo.com.br
RESUMO
O estudo avaliou um antígeno comercial denominado de Reo 198 composto de fargmentos de lipopolissacarídeos da B.ovis , produzido pelo TECPAR, no diagnóstico de anticorpos contra a B. ovis utilizando o teste ELISA indireto, sendo que o antígeno foi diluído na proporção de 1:200 e submetido à amostras oriundas de animais com histórico e sem manifestação clínica da enfermidade. Foram totalizadas 90 amostras, sendo que das 45 amostras provenientes de animais com histórico de aborto e epididimite e 45 de animais sem histórico da doença. Após padronização e determinação do ponto de corte, 448 amostras de soro ovino com histórico clínico de outras enfermidades foram submetidas ao teste para detectar possível reação ao referido teste. Das 90 amostras submetidas ao IDGA, 36 apresentaram reação e tinham histórico
clínico da enfermidade. Apesar de apresentar clínica compatível 09 amostras não reagiram ao teste. O mesmo total foi submetido ao ELISA indireto no qual das 90, 45 apresentaram reação ao teste com histórico clínico da doença e as 45 que não apresentara histórico clínico 02 apresentaram reação ao teste. O estudo da sensibilidade e especificidade demonstraram um bom desempenho do teste com percentuais de 100%
e 95,6% respectivamente. Das 448 amostras submetidas ao ELISA padronizado 11 foram reagentes ao teste, sendo não reagentes ao IDGA.
PALAVRAS-CHAVE: Brucelose ovina, Sorodiagnóstico, ELISA indireto
COMMERCIAL USE OF AN ANTIGEN FOR INDIRECT ELISA TEST IN THE DIAGNOSIS OF OVUNE BRUCELLOSIS ANTIBODIES AGAINST
ABSTACT
The study evaluated a commercial antigen called Reo 198 fragments compound of lipopolysaccharide from B.ovis produced by TECPAR, in the diagnosis of B. ovis using indirect ELISA, and the antigen was diluted at a ratio of 1:200 and subjected to samples from animals with and without clinical history of the disease. We totaled 90 samples, and from 45 samples from animals with abortion and orchids and 45 animals without disease history. After standardization and determination of the cutoff point, 448 serum samples from sheep with a history of other diseases were submitted to the test to detect possible reaction to such a test. Of the 90 samples tested by AGID, 36 showed clinical response and had a history of the disease. 09 samples although they had not responded to compatible clinical testing. The same was submitted to total indirect ELISA in which the 90, 45 had reactions to the test and with a history of the disease and 45 had no history presented 02 clinical reaction to the test. The study of sensitivity and specificity demonstrates a good performance of the test with percentages of 100% and 95.6%
respectively. Of the 448 samples tested by standard ELISA 11 were positive to the test, not being reactive to IDGA.
KEYWORDS: Brucellosis, sheep, serodiagnosis, ELISA
INTRODUÇÃO
A Brucella ovis é um dos principais agentes etiológicos da epididimite em carneiros, associado à diminuição da fertilidade em muitos animais dessa espécie, causando aborto e esterilidade em fêmeas. O diagnóstico tem sido baseado através da palpação escrotal, isolamento e identificação através da cultura do sêmen ou testes sorológicos (ARSENAULT et al., 2004). Em casos agudos os testículos estão aumentados de tamanho, há edema inflamatório, presença de exsudado fibrinoso na região da túnica vaginal, hiperemia testicular e edema do epidídimo (ROBLES, 1998). Na fase crônica são observadas regiões no testículo hipertrofiadas e endurecidas à palpação, deformações na cauda do epidídimo, bolsa escrotal espessa e com fibrosamento que restringe a mobilidade do testículo, há inclusive aderências fibrosas obstruindo a cavidade que separa as túnicas (RIDLER, 2002). O manejo, a freqüência de higienização das instalações são fatores extremamente importantes para o controle da brucelose. Tais variáveis caracterizam a ovinocultura de subsistência e o sistema extensivo, no qual os animais ficam soltos em grandes áreas e o criador não exerce nenhum controle sanitário ou reprodutivo. Esse perfil predomina nas regiões Norte e Nordeste do Brasil (SOUZA et al., 2007). Na Bahia, Silva et al., (2009) relatam que é necessário a adoção de medidas sanitárias de controle e prevenção para evitar a propagação da doença. Além desse aspecto, ressalta a importância da pesquisa para os produtores que criam animais selecionados de alto padrão genético e valor econômico, que geram ainda mais prejuízos para a ovinocultura no estado. O Estado da Bahia concentra o maior plantel dessa espécie com 2,8 milhões de ovinos. Largamente explorados de forma extensiva, esses animais têm aumentado seu contingente populacional graças à rusticidade e à adaptação ao meio ambiente, onde predomina a vegetação da caatinga (LEITE, 2000).
A prova laboratorial de eleição utilizada para o diagnóstico da B.ovis em países como o Brasil, Chile, Argentina e Uruguai é o teste de imunodifusão em gel de ágar, apresentando sensibilidade em torno de 96,4% e 100% de especificidade, com baixo custo e fácil interpretação (MYERS; SINIUK, 1970). Apesar da prova ser considerada mais barata e de fácil execução, os resultados obtidos não são conclusivos já que outros microrganismos como Actinobacillus seminis, Histophilus ovis, Corynebacterium spp.
também podem produzir epididimite palpável e nem todos os carneiros infectados com
B.ovis desenvolvem epididimite (COLETO et al., 2003). Deste modo Pinheiro et al., (2009) recomenda que para o diagnóstico da B. ovis em machos seja realizado teste sorológico associado ao exame clínico rigoroso, ressaltando que o mais seguro seria o exame microbiológico para o isolamento do agente. O presente estudo teve como objetivo avaliar um antígeno comercial denominado de Reo 198 em um teste ELISA indireto na detecção de anticorpos contra a Brucella ovis.
MATERIAL E MÉTODO
Amostras
Para desempenho do antígeno e padronização do teste ELISA indireto
Foram utilizadas 90 amostras de soros ovinos, fornecidas gentilmente por um laboratório conceituado da região de Andorinha-Ba, composto de animais entre 1 a 8 anos, ambos os sexos, sendo que 45 apresentavam histórico de epididimite nos machos e relato de aborto nas fêmeas, e 45 amostras de animais sem histórico da doença. É importante destacar que todas as amostras foram submetidas ao teste de IDGA recomendado pelo MAPA, utilizando o antígeno Reo 198.
Com a finalidade de conferir o desempenho demonstrado pelo teste ELISA padronizado foram submetidas 448 amostras de soro ovino fornecidas gentilmente pelo Laboratório de Virologia da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia.
Foram coletadas da região do semi-árido da Bahia, dos municípios de Juazeiro, Sobradinho, Casa Nova, Sento Sé, Pilão Arcado, Remanso e Campo Alegre de Lourdes.
Imunodifusão em gel de agarose (IDGA)
O antígeno utilizado foi do laboratório TECPAR partida 003/9, fabricação novembro de 2009 e vencimento novembro de 2010, licenciado pelo Ministério da Agricultura,
seguindo o protocolo recomendado. Foi distribuído 4 mL de gel de ágar em placas na concentração de 1% até a solidificação do gel e feito os cortes dos poços com a roseta, em seguida foi adicionado 30 µL por poço central do antígeno, soro controle positivo e soro teste, fazendo a leitura 48 horas após a execução, sendo observada a linha de precipitação dos soros reagentes, com a ajuda de uma luz indireta em uma caixa de fundo escuro.
Diluição do antígeno
O antígeno produzido a partir do extrato de lipopolissacarídeo de Brucella ovis Reo 198 pelo laboratório TECPAR, partida 003/9, fabricação novembro de 2009 e vencimento novembro de 2010, foi diluído em um tampão carbonato-bicarbonato 0,05M, pH 9,6, na proporção 1:25, 1:50, 1:100, 1:200. Após a diluição foram submetidos a placa de ELISA (COSTAR 3590) para sensibilização e incubada a 4ºC por 12 horas. Após a sensibilização foi realizado o protocolo do teste ELISA indireto, utilizando amostras de soro de animais comprovadamente positivos e animais comprovadamente negativos, na diluição 1:200.
Ensaio imunoenzimático indireto (ELISA i)
As placas de poliestireno de fundo chato (marca COSTAR 3590) foram sensibilizadas com 100ul do antígeno, diluído a 1:200 (padronização descrita na diluição do Ag), em tampão carbonato-bicarbonato a 0,05M, pH 9,6, incubadas a 4ºC por 12 horas. Após duas lavagens com PBS contendo 0,1% de tween-20 (PBS-T20), as placas foram bloqueadas com 200μL/poço de PBS-T20 contendo 5% de leite desnatado, durante duas horas. A seguir, foram incubadas com 100µL/poço dos soros testes diluídos a 1:100 em PBS-T20 contendo 1% de leite em pó desnatado durante 1 hora. Após 5 lavagens em PBS-T20, adicionam-se á placa 100µL de imunoglobulinas de coelho anti- imunoglobulina de ovino, conjugada a peroxidase (DAKO®), diluída a 1:10.000 em PBS-T20. As placas foram incubadas a 37ºC por 45 minutos e, em seguida, foram
lavadas novamente cinco vezes em PBS-T20 e incubadas com 50µL/poço da solução reveladora (12,5 ml de tampão cítrico-fosfato pH 5,1 + 4 mg ortofenilenodiamina + 4µL de H2O2). Deixou-se em temperatura ambiente por 15 minutos e freou a reação com 25 µl de H₂SO₄ 4N em cada poço. A leitura foi feita em leitor de ELISA, usando-se filtro de 490 nm de comprimento de luz.
As 90 amostras submetidas ao teste ELISA indireto serviu para demonstrar que o antígeno comercial é capaz de distinguir animais positivos e negativos associados ao histórico clínico, ressaltando que para o diagnóstico confirmatório é necessário realizar o isolamento e identificação das amostras submetidas ao ELISA indireto. As 448 amostras que foram submetidas posteriormente a padronização do ELISA indireto serviu para avaliar o desempenho do teste.
Determinação do ponto de corte
O ponto de corte foi feito através da curva ROC (Receiver Operator Characteristic) ou curva operacional relativa. Esta análise tem como base uma curva na qual são colocados os valores de corte que tem no eixo das ordenadas a sensibilidade e no eixo das abscissas a taxa de falso positivo (1 - especificidade). O ponto de corte considerado ideal é aquele que permite uma maior especificidade sem perda da sensibilidade. De acordo com Greiner et al (1995), esta análise deve ser utilizada para testes ELISA
RESULTADOS
Das 90 amostras submetidas ao IDGA, 36 apresentaram reação com formação de linha de precipitação. Das 54 não reagentes ao teste, 09 amostras de animais que apresentaram clínica compatível com a enfermidade, foram negativas. O mesmo total foi submetido ao ELISA indireto no qual das 90, 45 apresentaram reação ao teste e com histórico clínico da doença e 45 não apresentaram reação e sem histórico clínico da enfermidade, demonstrando a capacidade do ELISA em discriminar animais reagentes e
não reagentes. As amostras de animais sem histórico clínico da doença com variação da densidade óptica de 0,114 a 0,561. As amostras dos animais que tinham histórico de epididimite e aborto que foram testadas em ambos os testes, no ELISA indireto tiveram uma D.O. média entre 0,468 e 2,576, figura 1. No que se refere as amostras não reagente ao teste de imunodifusão, tiveram uma D.O. média de 0,1787 no teste ELISA indireto. Das 09 amostras que tinham histórico da doença e que não reagiram ao IDGA todas apresentaram reação no ELISA indireto. Das 45 amostras que foram submetidas ao teste ELISA indireto que não tinham histórico da doença 02 apresentaram reação.
0,5615 0,538
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Título do eixo
Título do eixo
PC
Figura 1 – Amostras de soros ovino sem histórico clínico e com histórico clinico submetidas ao teste ELISA indireto para a detecção de anticorpos contra a brucelose ovina
O ponto de corte foi definido através da curva ROC. Esta curva avalia a sensibilidade em função da especificidade. Vale ressaltar que a área delimitada pela curva do teste ELISA indireto com antígeno comercial (Reo 198), apresentou bom desempenho com relação à especificidade e sensibilidade, figura 2. A partir do desempenho de sensibilidade e especificidade, verificou-se o melhor valor de ponto de corte, tabela 1.
ROC Curve
1 - Specificity
1,00 ,75
,50 ,25
0,00
Sensitivity
1,00
,75
,50
,25
0,00
Figura 2 – Curva ROC para avaliação da sensibilidade X especificidade de ELISA indireto com antígeno Reo 198.
Na tabela 1 demonstram-se os valores de percentagem do desempenho de sensibilidade, especificidade e ponto de corte.
Tabela 1- Estudo da sensibilidade, especificidade e ponto de corte.
SENSIBILIDADE (%) ESPECIFICIDADE (%) PONTO DE CORTE
100 95,6 0,408
Das 448 amostras submetidas ao ELISA indireto padronizado 11 foram reagentes ao teste, sendo não reagentes ao IDGA, considerando o ponto de corte de 0,408. A densidade óptica variou entre 0,186 a 0,234 referente as amostras que apresentaram-se abaixo do ponto de corte. As amostras com valores acima do ponto de corte
apresentaram oscilação de densidade óptica de 0,412 a 0,782, Figura 5. Verificou-se que a média da densidade óptica das amostras não reagentes foi de 0,21 e das amostras reagentes foi de 0, 597, apresentando amostras com valores de densidade óptica superior ao ponto de corte em total 2,45% da população investigada.
Figura 5- Médias de D.O. referente as 448 amostras testadas no ELISA
DISCUSSÃO
Xu; Lohr; Greiner (1997) ressaltam que a sensibilidade e a especificidade são características intrínsecas fundamentais para validar um teste diagnóstico. Assim, quanto maior a sensibilidade do teste, maior a capacidade do teste negativo afastar a infecção, pois ocorre uma diminuição da probabilidade de falso negativo. Quanto maior a especificidade de um teste, maior a capacidade de o teste positivo indicar a infecção, pois diminui a probabilidade de falso positivo (LOPEZ, 2000). A sensibilidade pode ser definida como a probabilidade do teste ser positivo caso o animal esteja infectado, enquanto especificidade seria a probabilidade do teste ser negativo no animal não infectado. No presente trabalho, constatou-se que o ELISA indireto com antígeno comercial possui uma capacidade maior de discriminar animais infectados de animais
D E N S I D A D E
Ó T I C A
não infectados, no entanto, usando-se antígenos de extrato preparado e padronizado no Laboratório da Doenças Infecciosas da UNIME, como o obtido pela linhagem de B.
canis (JORGE, 2007), observa-se que existe uma diferença nos resultados obtidos dos animais infectados e não infectados, apresentando um desempenho menor com relação ao referido ELISA. O teste ELISA indireto neste estudo demonstrou ser eficaz quando foi relacionado o histórico clínico com os resultados obtidos, sendo proposto um teste de diagnóstico capaz de detectar um maior número de animais facilitando o controle e a prevenção de rebanhos suspeitos da brucelose ovina. Contudo, a carência de técnicas de diagnóstico eficazes, bem como a falta de relato de sinais clínicos da doença no rebanho do estado da Bahia, tem demonstrado a necessidade de se elaborar testes de diagnóstico com bom desempenho com relação a sensibilidade e especificidade, justificando a elaboração de um projeto desta natureza. Jorge (2007), utilizou o teste ELISA indireto para detectar anticorpos contra a B.ovis com um antígeno produzido a partir da B.canis, já que as proteínas de superfície dessas bactérias são similares. Os resultados foram satisfatórios obtendo uma sensibilidade de 93,33% e especificidade de 88,88%. Em relação ao presente estudo, os resultados são diferentes ao de Jorge (2007), mas apresentam boa capacidade de discriminar animais infectados de animais não infectados, no qual o antígeno utilizado, apesar de diluído, é o mesmo preconizado pelo Ministério da Agricultura e testado através do ensaioimunoenzimático indireto demonstrando eficácia estatística com sensibilidade de 100% e especificidade de 95,6%.
Em uma pesquisa realizada por Cho; Niilo, (1986) para avaliar a sensibilidade e especificidade do ELISA indireto foi demonstrado que as diluições do antígeno utilizado no teste influenciou nos resultados obtidos. Os animais foram inoculados com a cepa de B.ovis e o soro desses animais foram submetidos ao teste ELISA indireto com várias concentrações do antígeno que oscilaram de 1:25 á 1:400. Na diluição de 1:25 o teste apresentou 99.4% de especificidade e nas diluições de 1:50 á 1:400 de 100% . No entanto, Afzal et al., (1984), utilizando lipopolissacarídeo de Brucella ovis como antígeno na padronização de um teste ELISA indireto, obtendo a diluição de 1:100 como melhor resultado entre as amostras positivas e negativas. Este trabalho respalda o presente estudo quando foi encontrada melhor sensibilidade e especificidade na diluição de 1:200, demonstrando que a menor concentração do antígeno possibilita o
reconhecimento de proteínas mais específicas diminuindo a probabilidade de reações cruzadas.
As amostras testadas neste estudo foram utilizadas no IDGA e ELISA indireto. Os resultados associados ao histórico clínico observado no IDGA uma similaridade com os resultados do ELISA indireto que foi capaz de detectar 100% dos animais com histórico clínico. Azevedo et al., (2004), utilizando o teste de immunodifusão em gel de ágar para analisar a ocorrência de anticorpos anti-Brucella ovis em ovinos procedentes de quatro municípios do estado do Rio Grande do norte, relataram que dos 115 ovinos submetidos ao teste apenas 13 apresentaram reatividade, sendo que esses animais tinham sido examinados clinicamente e apresentavam histórico de epididimite. Demonstra-se então que o exame clínico não é suficiente para diagnosticar a doença, sugerindo que testes sorológicos de triagem sejam associados a testes confirmatórios, minimizando a possibilidade de reações cruzadas e falsos negativos e positivos. Tentando demonstrar a eficiência entre os testes, Nozaki et al., (2004) compara as técnicas de imunodifusão em gel de ágar e ELISA observando discrepância entre os resultados obtidos. Os soros foram submetidos duas vezes ao teste imunodifusão em gel de ágar, a primeira vez encontrou 12% de animais reagentes e na segunda vez os soros foram submetidos ao tratamento com 2-mercaptoetanol, apresentando apenas 1,1% de animais reagentes. Em relação às amostras submetidas ao ELISA indireto, observou-se que não houve animais reagentes que pudessem ser considerados positivos. Contrariamente ao estudo anterior esta pesquisa apresentou resultados mais diferenciados com relação a imunodifusão e o ELISA indireto, demonstrando que os testes podem ser utilizados com segurança e confiabilidade. Essa teoria é colaborada pela OIE (2000) quando preconiza que o ELISA apresenta maior sensibilidade que o teste de imunodifusão em gel de ágar ou Fixação de complemento, porém em função de alguns resultados ELISA negativos e Imunodifusão positivos, a combinação do ELISA com o imunodifusão resultaria em melhor desempenho da sensibilidade.
Com a finalidade de verificar o desempenho do teste ELISA padronizado, foram submetidas 448 amostras de soro ovino provenientes de 7 regiões do semi-árido baiano.
Verificou-se que 11 amostras apresentaram densidade óptica acima do valor de ponto de
