JAIME APARECIDO CURY
CONSTITUINTES DA PAREDE CELULAR DE PiCfiOPORUS CIHHABARINUS EM FUNÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO
TESE DE MESTRADO APRESENTADA AO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA DA U N I V E R S I D A D E F E D E R A L DO
P A R A N Á
CURITIBA
1974
CONSTITUINTES DA PAREDE CELULAR DE P ic n o p o ru s c in n a b a r i n u s EM FÜNÇÍ53
■ ■ » ■ ■ ■ ■ ■ •■ !_ I I I ' ■■ - _ 4 °DAS CONDIÇ0ES DE CULTIVO.
T ese de M e strad o a p r e s e n t a d a ao D e p a rta n e n to de B io q u ím ic a da U n iv e r s id a d e F e d e r a l do P a r a n á .
CURITIBA
1974
T ese o r i e n t a d a p e l a
D ra . Dea A m aral F . do A m aral
1 5 5 5 5 6 6
7 7 7 7 7 7 8 9
9 9 9 11 11 11 13 13 13 13 14 15 15 16 INTRODUÇÃO
MATERIAIS E MÉTODOS M icro rg an ism o
C o n d içõ es de C u ltiv o
C re sc im e n to em Meio S ó lid o
P u r i f i c a ç ã o das P a r e d e s C e l u l a r e s Exame ao M ic ro s c ó p io E l e t r ô n i c o D ete rm in ação de A ç ú c a re s T o t a i s D ete rm in ação de P r o t e í n a s
A n á lis e de L ip íd e o s
Dosagem de F ó s fo ro T o t a l
E stu d o dos A çú c are s N e u tro s da P a re d e C e l u l a r de P ic n o p o ru s c in n a b a r in u s
C o n d içõ es (Ótimas de H i d r ó l i s e
D eterm in aç ão Q u a n t i t a t i v a e C a r a c t e r i z a ç ã o
Ação E n z i n á t i c a do Suco D ig e s tiv o de M e g a lo b o li—
n u s p a ra n a g u e n s e s s o b r e a s P a re d e s C e l u l a r e s de P . c in n a b a r in u s
E stu d o dos A ç ú c a re s A n in ad o s da P a re d e C e l u l a r — de P . c in n a b a r in u s
C o n d içõ es (Ótimas de H i d r ó l i s e F ra c io n a n e n to e C a r a c t e r i z a ç ã o
D e te rm in a ç ã o . de N - a c e tilg lu c o s a m in a E stu d o dos A ç ú c a res Á cid o s
R e a g e n te s U t i l i z a d o s RESULTADOS E DISCUSSÃO
4
C resc im e n to de P«c i n n a b a r i n u s em Melo S ó lid o M ic ro s c o p ia E l e t r ô n i c a de P . c i n n a b a r i n u s
P u r i f i c a ç ã o d as P a re d e s C e l u l a r e s de P . c i n n a b a r l -
n u s t
C onteúdo de L ip íd e o s d as P a re d e s C e l u l a r e s de P*
c in n a b a r in u s
D ete rm in ação de F ó s fo ro T o t a l d as P a r e d e s C e l u l a r e s de P . . c in n a b a r in u s
D ete rm in aç ão de P r o t e í n a s das P a re d e s C e l u l a r e s de P , c i n n a b a r in u s •
D ete rm in aç ão de A ç ú c a re s T o t a i s d as P a r e d e s C e lu
l a r e s de P* c in n a b a r in u s
8» C o m p o siç ã o ,en A çú e aro s N e u tro s d a s P ared.ee C o lu — 16 l a r e s de P . c i n n a b a r in u s
9 - — - "» r V - —
9 . Com posição em A çú c a re s Aminados d as P a r e d e s C e lu 18
^ l a r e s de P# c i n n a b a r i n u s
20 • Ação E n z im ú tic a do Suco D ig e s tiv o de. M e g a lo b o li- 20 nus p a ra n a g u e n s es s o b r e a s P a r e d e s C e l u l a r e s de
P . c in n a b a r in u s FIGURAS
F ig 3 , 1 e 2 C re s c im e n to de P . c i n n a b a r i n u s em meio s ó l i d o 22 F i g s . 3 e 4 M i c r o f o t o g r a f i a de P . c i n n a b a r i n u s c r e s c i d o - 23
, . em meio s ó l i d o
F ig s* 5 e 6 M i c r o g r a f i a e l e t r ô n i c a de P . c i n n a b a r i n u s — 24 , c r e s c i d o . em meio l í q u i d o
F ig , 7 Comppovação da p u r i f i c a ç ã o da p a r e d e c e l u l a r 25 , de P «c i n n a b a r i n u s c r e s c i d o em D -g lu c o s e _ F i g , 8 Comprovação da P u r i f i c a ç ã o da p a r e d e c e l u l a r 26
, de P . C in n a b a r in u s c r e s c i d o em a c e t a t o
F i g § * 9 e l 0 M i c r o g r a f ia e l e t r ô n i c a das p a r e d e s c e l u l a r e s 27 Fig» 11 C urva de H i d r ó l i s e p a r a o e s tu d o s dos a ç ú c a - 28
, r e s n e u t r o s
F i g e 12 C ro m a to g ra f ia em f a s e g a s o s a dos a ç ú c a r e s / 29
, n e u t r o s
Fig® 13 C urva de H i d r ó l i s e p a r a o e s tu d o dos a ç ú c a - 30
, r e s am inados
F ig , 14 F ra c io n a n e n to das h ex o sam in n s 31
F i g , 15 Ação do suco d i g e s t i v o de M, p a ra n a g u e n s es 32 n a s p a r e d e s c e l u l a r e s
TABELAS
T abj I Com posição das P a r e d e s C e l u l a r e s 33
T ab, I I C a r a c t e r i z a ç ã o das h e x o s a n in a s d as p a r e d e s 33 c e l u l a r e s em fu n ç ã o de s e u s R g iu c o sa m in a
T ab, I I I R e la ç ã o e n t r e o t e o r de g lu c o s e e N - a c e t i l - 34 g lu c o s a m in a d as p a r e d e s c e l u l a r e s e o l i b e
ra d o p e l a s en zim as do su co d i g e s t i v o de M.
p a r a n a g u e n s e s RESUMD
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
35
36
A p a r e d e c e l u l a r dos fu n g o s é um e n v o l t ó r i o perm anen—
t e e v e r s á t i l , que e x p a n d in d o - s e c o n tin u a m e n te d u r a n te o c r e s cim en to e re m o d e lan d o —se no s e u d e s e n v o lv im e n to , p e r m ite ao fu n go a s s u m ir uma v a r ie d a d e de c a r a c t e r í s t i c a s m o r f o l ó g i c a s , a d a p ta n d o -o a d i f e r e n t e s f u n ç õ e s . 0 e s tu d o de s u a co m p o sição e s t á r e la c io n a d o com a ta x o n o m ia ( P i l o g e n i a ) , com a m o rfo ^ e n e se (On
t o g e n i a ) , e com o com portam ento p a to g ê n ic o de f u n g o s .
Uma c o r r e l a ç ã o e n t r e a co m p o sição q u ím ic a da p a re d e / c e l u l a r e os p r i n c i p a i s g ru p o s ta x o n õ m ic o s - e l a b o r a d a com c r i t á r i o s m o r f o l ó g ic o s , f o i m o s tra d a j á no ú ltim o s e c u l o . P orém , com o ap rim o ram en to te c n o ló g i c o n o v as c a r a c t e r í s t i c a s p e c u l i a r e s / s u r g ir a m , e uma c l a s s i f i c a ç ã o f o i a p r e s e n t a d a ( l ) r e l a c i o n a n d o - a s c a t e g o r i a s q u ím ic a s com os g ru p o s taxonõm icos-,; conform e ta b e l a a b a ix o .
CATEGORIA QUÍMICA GRUPO TAXO NO MICO
I . C e lu lo s e - G lic o g õ n io A c r a s i a l e s I I . C e l u l o s e -G lu c ano O o m ie e to s
I I I . C e l u l o s e -Q u i t i n a H i f o q u i t r i d i o m i c e t o s IV . Q u ito s a n a - Q u itin a Z ig o m ic e to s
é
V . Q u i t i n a —G lucano
Q u i t r i d i o m i e e t o s A sc o m ic e to s
B a s id io m ic e to s D e u te ro m ic e to s
V I . M anano-Gluc ano S ac c h a ro mic e t ac e ae C r y p to c o c c a c e a e
4
V I I . M anano-Qui t i n a S po ro bo lomyc e t ac e ae Rho do t o r u l a c e ae
V I I I . Po1 i g a l a c t o s a m i n a - G a la c ta n o
Grupo h e t e r o g é n e o , p a r a s i t a s de a r t r ó p o d o s .
D e n tro de c a d a grupo tax o n õ m ico e x i s t e uma g ra n d e vé.~
r i a ç ã o do c o n te ú d o dos p o l i s s a c a r í d e o s d e t e r m in a n t e s de s u a
c l a s s i f i c a ç ã o . A ssim , no grupo V a c o n c e n tr a ç ã o de q u i t i n a o s c i l a e n t r e 3 -5 Í° no A llom yces commune a t é ap ro x im a d am e n te 60 # da p a re d e c e l u l a r de Allo.myces m acrogynus o u a de S c le r o ti u m r o l f i s i i . As p r i n c i p a i s c l a s s e s de f u n g o s , i n c l u í d a s n a c a te g o r i a q u i t i n a - g l u c a n o , d if e r e m uma das o u t r a s com r e s p e i t o a a ç ú c a r e s não d e t e r m i n a n t e s . As s e g u i n t e s r e g r a s s e r ia m a p l i c á v e i s * A g a l a c t o s e e a g a la c to s a m in a s e r ia m c a r a c t e r í s t i c a s da / p a re d e c e l u l a r dos A s c o m ic e to s , e n q u a n to a x i l o s e e a f u c o s e o s e ria m dos B a s id io m ic e to s ( l ) .
No t o c a n t e ao p r o c e s s o de m o rfo g ê n e se em f u n g o s , o que m ais d e s p e r to u a a te n ç ã o dos p e s q u is a d o r e s é o d im o rfis m o / le v e d u r a - m ic é lio ( y e a s t - m o l d ) . P ensando em te rm o s de que a pa re d e c e l u l a r d e v e r i a e s t a r r e l a c i o n a d a com e s t a e x tre m a a l t e ra ç ã o m o r f o l ó g ic a , BARTNIÇKI-GARCIA ( 2 ) e s tu d o u a com posição / da p a re d e de Mucor r o u x i i , o q u a l a p r e s e n t a d im o rfism o com a v a r i a ç ã o da p r e s s ã o de 00 ^ A ssim , h a v i a a l t e r a ç ã o som ente no^
co n teú d o de manose e p r o t e í n a s ^ os q u a i s e s ta v a m em m a io r p r o p o rçã o n a c é l u l a l e v e d u r i f o r m e , R e s u lta d o s s e m e lh a n te s fo ra m - o b tid o s p o r EROWN & NICKERSON (3 ) com P u l l u l a r i a p u l l u l a n s j a p a re d e do t i p o le v e d u r a p o s s u i uma q u a n tid a d e l i g e i r a m e n t e m a io r de manose que a da fo rm a f i l a m e n t o s a . Embora os dados s u g e r is s e m que a manose p o d e r i a e s t a r e n v o l v id a n e s t e t i p o de / m o rfo g ê n e se , a p a re d e de c é l u l a s le v e d u r if o r m e s i n d u z id a s t e r - m icam ente de H is t o p l á s n a c a p s u la tu m te m , a p ro x im a d a m e n te , 1 / 5 da q u a n tid a d e de manose que a d as f i l a m e n t o s a s ( 4 ) . P o r o u tr o l a do , S accharom yces c e r e v i s i a e c r e s c i d o em c o n d iç õ e s l i m i t a n t e s / do- am o n ia, a p r e s e n t a uma v a r i a ç ã o m o r f o ló g ic a de e s f e r ó i d e p a r a c i í i n d r ó i d e , sem a l t e r a ç ã o do c o n te ú d o de manose da p a r e d e / c e l u l a r ( 5 ) . O u tr o c a so de d im o rfism o l e v e d u r a - m i c é l i o , in d u z i, do te rm ic a m e n te , f o i c o n s e g u id o p o r KANETSUNA e t a l i i ( 6 ) em B lasto m y ces d e r m a t i t i d i s . A p a re d e d as c é l u l a s t i p o le v e d u r a / t i n h a um m enor co n teú d o de h e x o s e s (com menos m anose) e
* 4 '
um m a io r c o n te ú d o de a m in o a ç ú c a r e s 'q u e a d as f i l a m e n t o s a s . E s
tu d o s m ais r e f i n a d o s fo ra m r e a l i z a d o s com P a r a c o c c i d i o i d e s
b r a s i l i e n s i s , o q u a l a p r e s e n t a uma a l t e r a ç ã o m o r f o ló g ic a c a r a c
t e r i z a d a p e l a m udança' da fo rm a l e v e d u r a ( 3 7 °C) à fo rm a
j a i o o l i a l (20 ° C ). E s tu d o d a co m p o sição d a p a re d e m o s tro u , a lé m de d i f e r e n ç a s e s t r u t u r a i s e n t r e os p o l i s s a c a r í d e o s n e u t r o s ,q u e a form a de le v e d u r a p o s s u i m ais h e x o sa m in a e menos p r o t e í n a que a f i l a m e n t o s a ( 7 ) ,
E stu d a n d o c o n d iç õ e s que to r n a s s e m a p a r e d e . c e l u l a r de C ordyceps m i l i t a r i s m ais s u s c e p t í v e i s ao rom pim ento ,MAEKS e EBLLER ( 8 ) o b s e rv a ra m que , quando a g lu c o s e e r a au m en tad a dô 1-3D1° no meio de c u l t i v o , fo rm as u n i c e l u l a r e s d e s t e fungo f i l a m entoso p assav am a p r e d o m in a r. Em s u a s p a r e d e s e x i s t i a m m ais / g lu c o s e e p r o t e í n a s j po rém , menos l i p í d e o s e h e x o sa m in a s que n a s do t i p o m i c e l i a l . Ação de g l u s u l a s e (s u c o d i g e s t i v o de c a ra m u jo ) s u g e r i a que a e s t r u t u r a da3 p a r e d e s p o d e r i a s e r d i f e r e n t e , p o is en q u a n to to d a g lu c o s e e r a l i b e r a d a da p a re d e c e l u l a r da form a f i l a m e n t o s a , som ente a m etad e da g lu c o s e e r a l i b e r a d a d a l e v e d u r i f o r m e »
E n t r e t a n t o , o d e s e n v o lv im e n to em fo rm a de l e v e d u r a / deve s e r v i s t o como uma e x tre m a a l t e r a ç ã o da m o r f o l o g ia das h i f a s . Em N e u ro sp o ra c r a s s a f o i e s tu d a d a p o r TATUM e c o la b o r a d o r e s ( 9 , 3D) uma m o d ific a ç ã o menos p r o n u n c ia d a , o u s e j a , a in d u
ção f e n o t i p i c a ou g e n o t i p i c a da r e s t r i ç ã o do e s p a lh a m e n to r a d i a l do m i c é l i o , chamado de " c r e s c im e n to c o l o n i a l " , 0 c r e s c i — / mento c o l o n i a l é c a r a c t e r i z a d o p o r um c r e s c im e n to a lta m e n te r e j3 t r i t o em meio s o l i d o e c r e s c im e n to em e s f e r a s ( p e l l e t s ) em m eio l í q u i d o , em c o n t r a s t e ao c r e s c im e n to f ila m e n to s o do t i p o s e l v a gem. As h i f a s também são m e n o re s, com n u m ero sas r a m i f i c a ç õ e s e c o n to rn o o n d u l a n t e , 0 e s tu d o da co m p o sição da p a r e d e c e l u l a t d e s te novo t i p o m o rfo ló g ic o d em o n stro u vim aum ento n a r e l a ç ã o h e x o s a m in a /g lu c o s e , 0 fra c io n a m e n to da p a r e d e com provou e s t a r a p r i n c i p a l m o d ific a ç ã o n a f r a ç a o a l c a l i s o l ú v e l , a q u a l p o r h i d r ó l i s e f o r n e c e u p r in c i p a l m e n t e g l u c o s e , g a la c to s a m i.n a e anu n o á c id o s , P o i v e r i f i c a d o que o c r e s c im e n to t i p o c o l o n i a l e r a a companhado p o r um d e c ré s c im o da a f i n i d a d e da g lu c o s e — 6—P de s i — d ro g e n a se p o r g l u c o s e - 6- P e NADP, o que l e v a r i a , p ro v a v e lm e n te p o r um e f e i t o p l e i o t r ó p i c o , a uma a l t e r a ç ã o n a m o r f o lo g ia ( —
( 1 1 ) , Ifão o o n se g u in d o uma e x p l ic a ç ã o r a c i o n a l de como e s s e s
- 4 -
a ç ú c a re s e s t a r i a m e n v o lv id o s n a s m o d if ic a ç õ e s m o r f o l ó g i c a s , - MAHADEVAN e MAHADKAR (1 2 ) d em o n strara m que o c r e s c im e n to t i p o c o l o n i a l de N e u ro sp o ra c r a s s a pode e s t a r r e l a c i o n a d o com o te_
o r das enzim as h i d r o l í t i c a s l i g a d a s à p a re d e ( p r o t e a s e s e g l u - c a n a s e s ) , p o is a m u ta n te p o s s u i um m a io r c o n te ú d o d e s s a s e n z i nna a u t o l í t i c a s . P ro c u ra n d o v e r i f i c a r s e a co m p o sição da p a r e de e s t a v a r e l a c i o n a d a com s u a s p r o p r i e d a d e s , TREVITHICK e I.3ET—
ZEITBERG (1 3 ) e s tu d a ra m uma m u ta n te o s m ó tic a de N e u ro sp o ra e r a s s a , a q u a l p o s s u i uma ç a r e d e menos e s p e s s a e m ais i r r e g u l a r / que a do t i p o s e lv a g e m . Os a u t o r e s c o n s ta ta r a m que n a p a re d e - da m u ta n te a r e l a ç ã o g a la o to s a m in a /g lu c o s a m i n a e r a t r i n t a v e - / z e s m a io r que n a do t i p o s e lv a g e m .
B0NA1Y e t a l i i ( 1 4 ) e s tu d a r a m a i n f l u e n c i a das co n d iç õ e s de c u l t i v o n a co m p o sição da p a re d e c e l u l a r de le v e d u r a s do g en ero R h o d o t o r u la . E s t e s m ic ro rg a n is m o s eram c r e s c i d o s em
1 1 J 1 1 ■ ■ ■ ■ ■ ■ ^ z *
d o is m e io s , um c o n te n d o ' g lu c o s e e o u tr o s a c a r o s e . As a m o s tr a s - RMP e 3044 a p r e s e n ta r a m um c o n te ú d o m a io r de g lu c o s a m in a e me
n o r de p r o t e í n a s , quando c r e s c i d a s em s a c a r o s e , e n q u a n to a a - / m o s tra 2200 a p r e s e n t o u a mesma co m p o sição q u ím ic a n a p a re d e ', / c r e s c i d a em ambas f o n t e s de carb o n o *
Quando P ic n o p o r u s c i n n a b a r i n u s f o i c u l t i v a d o em meio l í q u i d o , c u j a f o n te de c a rb o n o e r a D -g lu c o s e o u a c e t a t o , a p r e s e n to u um d e s e n v o lv im e n to m i c e l i a l d i s t i n t o . A ssim ,, em g lu c o s e , o m ic é lio e r a e s f é r i c o e c o m p a c to , e n q u a n to em a c e t a t o e r a l i g e ira m e n te f i l a m e n t o s o , sen d o p o s s í v e l im a g in á - lo como fo rm a
do p o r p r o je ç õ e s f i l i f o r m e s p a r t i n d o de u m e ix o c e n t r a l ( o b s e r v a ç õ e s p e s s o a i s da o r i e n t a d o r a d e s t a t e s e ) .
E s s a d i f e r e n ç a m i c e l i a l m o r f o ló g ic a n o s m o tiv o u pa
r a o e s tu d o da com posição de s u a s p a r e d e s , j á que n e s t a s c o n d i
çõ es e s t e f a t o não t i n h a s id o r e l a t a d o , e s e r i a m ais uma c o n - /
t r i b u i ç ã o p a r a 0 e s tu d o de m o rfo g e n e se em f u n g o s .
1 . M icro rg an ism o
A a m o s tra de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s , fungo da c l a £ se dos B a s i d i o n i c e t o s , f o i i s o l a d a e c l a s s i f i c a d a no I n s t i t u to de B i o l o g i a e P e s q u is a s T e c n o ló g ic a s do E s ta d o do P a r a n á ,
* /
Sua c o lo c a ç ã o ta x o n ó m ic a f o i r e a l i z a d a tam bón ç e lo D r. O sw al do P id a lg o do I n s t i t u t o de B o t â n i c a , São P a u l o ,
2 • C o n d iço es de C u ltiv o
A c u l t u r a f o i m a n tid a em a g a r S a b o u ra u d g l u c o s e , e a in o c u la ç ã o f e i t a d ir e ta m e n t e d e s t e p a r a o s m eios l í q u i d o s s Meio I s - D -g lu ç o s e 1 g $ , KH^ID^ 0 , 9 gf°t Na^HIO^ - 0 , 8 gf°, (NH4 ) 2S 0 4 0 , 2 gfo, MgS040 ,0 2 g?S, U R) 0 , 1 e x t r a
to de l e v e d u r a o , l g $ , MnSO 0,00 2 g $ , CuSO 0 ,0 0 2 g ^ .
T T .
Meio I I ; - S e m e lh a n te ao m eio I em que a D -g lu c o s e / f o i s u b s t i t u i d a p e lo a c e t a t o de s ó d io ( l g $ ) como f o n t e de c a rb o n o •
OpH dos m eios de c u l t i v o I e I I f o i a j u s t a d o p a r a 6 ,2 e e s t e s m eios fo ra m d i s t r i b u í d o s (300 m l) em f r a s c o s de lOOOml, Os r e f e r i d o s m eios fo ra m a u t o c la v a d o s p o r 20 m in , a 1 atm , sendo que a s o lu ç ã o de D -g lu c o s e f o i e s t e r i l i z a d a du
r a n t e 30 m in . em v a p o r f l u e n t e , ^e em s e g u id a a c r e s c e n t a d a ao meio I no momento da i n o c u l a ç ã o •
A in c u b a ç ã o f o i f e i t a a 28 nC em um a g i t a d o r r o t a t ó —
4
r i o a 100 rpm . Após 72 h o r a s os m i c ó l i o s fo ra m c o l e t a d o s p o r f i l t r a ç ã o e la v a d o s com á g u a d e s t i l a d a g e l a d a ,
3 . C re sc im e n to em Meio s ó l i d o
P e z - s e a in o c u la ç ã o de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s -
e n p l a c a s co n te n d o S a b o u ra u d D -g lu c o s e 2 g^ e S a b o u ra u d a -
o e t a t o 2 g^* Após 72 h o r a s de c r e s c im e n to a 28°C , a s p l a c a s -
f o r a n f o t o g r a f a d a s e a s c o l o n i a i s m ic ro f o to g r a f a d a s em-MicrojJ
- 6 -
c é p io O ly n p u s -P h o to n a x .
4« P u r i f i c a ç ã o das P a r e d e s C e l u l a r e s
Os m i c é l i c s c o l e t a d o s e s u s p e n s o s e n á g u a d e s t i l a da fo ram h o m o g e in iz a d o s p o r 1 m in . em "W arin g B le n d o r" e / l i o f i l i z a d o s e n l i o f i l i z a d o r " V i r t i s " . B a s ic a m e n te , f o i u t i l i z a d o o m étodo de p u r i f i c a ç ã o d e s c r i t o p o r MAHAEEVAIT ( 1 0 ) , com a s s e g u i n t e s m o d if ic a ç õ e s ! 1 g de po m i c e l i a l e r a . t r a t a do com 300 m l de SDS ( d o d e c i l s u l f a t o de s o d io ) a 1 a4°C e com a g i t a ç ã o . A i n t e r v a l o s de tem pos v a r i á v e i s s u s p e n d i a - s e o tr a ta m e n to acim a d e s c r i t o , c e n t r i f u g a v a - s e a 20000 g / p o r 30 m in . e a n a l i s a v a - s e o e s p e c t r o de a b s o r ç ã o do s o b r e - n a d a n te n a r e g i ã o do U .V . (220 a 340 ) em um e s p e c tr o f o tõ m e t r o r e g i s t r a d o r " P e r k in - E l m e r " . 0 p r o c e s s o e r a r e p e t i d o , s u £ p e n d e n d o -se o p r e c i p i t a d o em novo volum e de SDS a 1 g $ , a t é o d e s a p a re c im e n to de q u a l q u e r a b s o rç ã o n a f a i x a de 260- 280
nm.
Após e s t e t r a t a m e n t o , a s p a r e d e s c e l u l a r e s f o r a m / la v a d a s com á g u a d e s t i l a d a p o r v á r i a s v e z e s (m ínim o de d e z ) d i a l i s a d a s em tampão f o s f a t o 0 , 0 1 M pH 7*0 p o r 36 h s a 4 °C , e p o r i g u a l p e r ío d o de tempo em á g u a d e s t i l a d a . A s e g u i r , f £ ram h o m o g en eizad as p o r 1 m in . em "W arin g B l e n d o r " , l i o f i l i - i za d as e a rm azen a d as em d e s s e c a d o r à v ác u o so b Sempre a n t e s de cqualquer a n á l i s e , a s p a r e d e s c e l u l a r e s , em d e s s e c a d o r sob Po0 _ , fo ra m a q u e c id a s a 5 0 °C p o r 16 h s .
As s e g u i n t e s a b r e v i a t u r a s s e r ã o u t i l i z a d a s - !
P a re d e I = p a re d e c e l u l a r de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s c r e s c i
do no meio I . .
P a re d e 1 1 = p a re d e c e l u l a r do mesmo f u n g o , c r e s c i d o em m eio I I .
5* Exame ao M ic ro s c ó p io E l e t r ô n i c o
Os n i c é l i o s c o l e t a d o s como t a l , e a s p a r e d e 3 s u s p e n s a s em
ág u a d e s t i l a d a , fo ra m f i x a d a s em g l u t a r a l d e í d o 5$ e r e f i x a -
das em osm io 1!^. Após i n c l u s ã o em E pon 8 1 2 , os c o r t e s fo ra m
c o ra d o s com a c e t a t o de u r a n i l a 2% e c i t r a t o de chumbo ( 1 5 )»
E s ta s a n á l i s e s fo ra m f e i t a s p e lo C e n tro de M ic ro s c o p ia E l e t r ô n i c a da U n iv e r s id a d e F e d e r a l do P a r a n á , u t i l i z a n d o - s e / u n u l t r a n ic ro to m o " S o r v a l l MD-2", t i p o P o r t e r B lu n e um mi c r o s c ó p io " P h i l i p s EM -300".
6 # D ete rm in aç ão dos A ç ú c a re s T o t a i s
A d e te rm in a ç ã o dos a ç ú c a r e s t o t a i s f o i r e a l i z a d a / p e lo método do F e n o l - S u l f ú r i c o ( 1 6 ) em s u s p e n s õ e s de p a r e de c e l u l a r .
7# D eterm in ação de P r o t e í n a s
F e z - s e a e x t r a ç ã o d as p r o t e í n a s d as p a r e d e s c é l u l a r e s com NaOH N p o r 1 h o r a em b a n h o -m a ria f e r v e n t e . A s e g u i r c e n t r i f u g o u - s e a 700 g p o r 10 m i n . , e a l í q u o t a s dos s o b r e - n a d a n te s fo ra m a n a l i s a d a s p e lo m étodo de LOWRY ( 1 7 ) . P ad rão
- 4
de so ro a lb u m in a b o v in a f o i su b m e tid o à s mesmas c o n d iç õ e s , 8 , A n á lis e dos L ip íd e o s
A e x tr a ç ã o dos l i p í d e o s d as p a r e d e s c e l u l a r e s f o i f e i t a com c l o r o f o r n i o : m e ta n o l ( 2 : 1 ) p o r 12 h s , em S o x h l e t . A d e te rm in a ç ã o q u a n t i t a t i v a f o i o b t i d a p o r g r a v i m e t r i a .
9* Dosagem do F ó s fo ro T o t a l
A d e te rm in a ç ã o do f ó s f o r o t o t a l f o i r e a l i z a d a p e lo método de FISKE-SUBBARDW ( 1 8 ) , a p a r t i r de s u s p e n s õ e s de pa r e d e o e l u l a r .
3 0 . E stu d o dos A ç ú c a res H e u tro a
3 0 ,1 . C o n d içõ es O tim as de H i d r ó l i s e : — As s u s p e n s õ e s de p a r e
de c e l u l a r , c o lo c a d a s em a m p o la s , a c r e s c e n t o u - s e á c i
do t r i f l u o r o a c é t i c o (TFA) a t é c o n c e n tr a ç ã o f i n a l de 1
N (3m g/m l de p a r e d e ) . As am polas fo ra m s e l a d a s , c o l o
c a d a s p o r 2 m in . em a u t o c la v e a 1 atm e , a s e g u i r , p o r
d i v e r s o s tem pos de h i d r ó l i s e em b a n h o -M a ria f e r v e n t e .
Após a h i d r ó l i s e , o r e s íd u o i n s o l ú v e l f o i e lim in a d o /
p o r f i l t r a ç ã o em f u n i l do p l a c a p o r o s a , e o f i l t r a d o /
- • U 8 - ' ’
c o n c e n tra d o à v ác u o p a r a e l i m i n a r o .'e x c e s s o de á c i d o . / As f r a ç õ e s s o l ú v e i s dos h i d r o l i s a d o s f o r a n a p l i c a d a s / à s c o lu n a s de Dowex 30 W-X8 (H ^ ), 200-400 n e s h , a c o p la das à s c o lu n a s de Dowex 1-X8 (HCOO ) , ’200-400 m esh,am b a s de 0 ,8 x 5 cm ( f lu x o de 0 , 1 m l/m in .) « Os a ç ú c a r e s / n e u t r o s fo ra m e l u í d o s com á ^ u a d e s t i l a d a d e i o n i z a d a , a t á u n volum e f i n a l de 20 m l. Em a l í q u o t a s dos e l u a t o s / fo ra m d e t e r m in a d o s : a ç ú c a r t o t a l p e lo F e n o l - S u l f ú r i c o ( 1 6 ) , a ç ú c a r e s r e d u t o r e s p e lõ S0M3GY-NELS0N (19>20) e D -g lu c o s e p e l a g lu c o s e o x id a s e ( 2 1 ) , D—g lu c o s e f o i u t i l i z a d a como p a d r ã o .
30*2. D ete rm in a ç ã o Q u a n t i t a t i v a e C a r a c t e r i z a ç ã o s - A m o s tra s - e n d u p l i c a t a s de 5 mg d as p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I f o ram h i d r o l i s a d a s p o r 8 h o r a s , como ac im a d e s c r i t o . Os h i d r o l i s a d o s fo ra m c e n t r i f u g a d o s a 20000 g e os p r e c i p i t a d o s la v a d o s t r e s v e z e s com e t a n o l . Os s o b r e n a d a n te s fo ra m r e u n i d o s , e o á c id o e lim in a d o à v ác u o com tem pe
r a t u r a não s u p e r i o r a 50 °C . A p u r i f i c a ç ã o dos a ç ú c a r e s n e u t r o s f o i r e a l i z a d a segundo a t é c n i c a d e s c r i t a no í - t e n a n t e r i o r . Os e lu a iro s d as d u p l i c a t a s fo ra m r e u n id o s / e a c e t i l a d o s de a c o rd o com ALBERSHEIM ( 2 2 ) . D - g l u c o s e / r e c r i s t a l i z a d a 3 x em m e ta n o l, e s u b m e tid a à s mesmas c o n d iç õ e s que a s a m o s tr a s , f o i a e l a s a c r e s c e n ta d a ^ a n t e s da a c e t i l a ç ã o , p a r a s e r v i r como p a d rã o i n t e r n o . Os p o l i o i s a c e t i l a d o s , e x t r a í d o s q u a n t i t a t i v a m e n t e com di.
c lo ro m e ta n o , fo ra m a n a l i s a d o s em um crom at á g r a f o E & M m odelo 830 R -1 2 , n a s s e g u i n t e s c o n d iç õ e s ? c o lu n a de / 200 x 0 , 2 cm de d . i . com 3$ p / p de ECNSS-M em Gas Chrom Q de 300—120 m esh (23)> o p eran d o a l8 0 ° C s câm ara de i n
je ç ã o e d e t e t o r a r e s p e c tiv a m e n t e 220 e 240°C; He, Hg e a r a r e s p e c tiv a m e n t e 1 2 , 20 e 300 m l/ m in .; a te n u a ç ã o
4 -
8 x 3 0 , 0 c á l c u l o d a3 á r e a s f o i f e i t o p o r t r i a n g u l a ç ã o e os a l d i t o i s a c e t i l a d o s c a r a c t e r i z a d o s , com parando se_
u s tem pos de r e t e n ç ã o com os de p a d rõ e s conhecidos^.
Os e l u a t o s fo ra m também crom at o g r a f a d o s em p a -
p e l W hatnan n£ 1 , te n d o cono s o l v e n t e A c e ta to de E t i l a s P i r i d i n a : Àgua ( 8 : 2 : 1 ) , As n a n c h a s f o r a n v i s u a l i z a d a s / c o n c l o r i d r a t o de p - a n i s i d i n a ( 2 4 ) e c o n n i t r a t o de
/
p r a t a a l c a l i n o (2 5 )*
11* Ação E n z i n á t i c a do Suco D ig e s tiv o de M e g a lo b o lin u s p a r a n a - / g u en ses n a s P a re d e s C e l u l a r e s
S u sp e n sõ e s de p a re d e c e l u l a r (2 n g / n l ) , e n d u p l i c a t a s , f o r a n s u b n e t i d a s à ação do su co d i g e s t i v o de M, p a r a n a - / g u e n s e s t n a s s e g u i n t e s c o n d i ç õ e s : 50 u l de su co ( 5»8 n g / n l - p r o t e í n a ) , 250 u l de s u s p e n s ã o de p a r e d e e 200 ;ul de ta n p ã o / c i t r a t o 0 , 0 , M pH 6 , 0 , a 37°C , c o n a g i t a ç ã o , e e n a t n o s f e r a - de t o l u e n o • De te n p o s e n te n p o s a r e a ç ã o e r a p a r a l i s a d a p o r a q u e c in e n to 5 n i n . a 100 C, C e n t r i f u g a v a - s e p o r 10 n i n , a 700g e a n a l i s a v a n - s e os s o b r e n a d a n te s p a r a g lu c o s e p e lo n á to d o da g lu c o s e - o x id a s e (2 1 ) e , p a r a N—a c e t i l h e x o s a n i n a p e lo m étodo de BEISSIG ( 26 ) , te n d o - s e r e s ç e c t i v a n e n t e cono p a d r õ e s , D -g lu c o se e N -a c e til~ D —g l u c o s a n i n a .
Os p r o d u to s da ação e n z i n á t i c a f o r a n , ta n b é n , c a ra ç . t e r l z a d o s p o r c r o n a t o g r a f i a e n p a p e l W hatnan nQ 1 com os s e g u in te s s i s t e n a s de s o l v e n t e s : B u ta n o 1 : P i r i d i n a : H^O ( 6 : 4 : 3 )
( 2 7 ) t A c e ta to de E t i l a : P i r i d i n a : á c i d o A c é t i c o : H^O ( 5 í 5 í 1 í 3 ) » e v i s u a l i z a d a s co n n i t r a t o de p r a t a ( 2 5 ) e c l o r i d r a t o de p - a - n l s i d i n a ( 2 4 )#
1 2 , E stu d o s dos A çúcar e s A n in a dos
— m p r q r t 1 *— m i . - ^ j -ll 4 ^ h . - j - ■ . -u —— • 1 ■ - , — 1— j1 2 ,1 , C o n d içõ es O tin a s de H i d r é l i s e : - As p a r e d e s c e l u l a r e s / f o r a n h i d r o l i s a d a s e n am põlas s e l a d a s , e n a t n o s f e r a de Ng» en banho O l a r i a f e r v e n t e , n a p ro p o rç ã o de 2 ,5 mg de p a ro d e /m l de HC1 6 N, Os h i d r o l i s a d o s f .- r o n f i l t r a d o s e n f u n i l de p l a c a p o r o s a , e o e x c e s s o de á c id o e l i n i n a do à v á c u o , Apás a n e u t r a l i z a ç ã o , os a ç ú c a r e s a n i n a d o s / f o r a n p u r i f i c a d o s segundo BOAS ( 2 8 ) , e d e te rm in a d o s p e lo m étodo de SOMO GYI—NELSON ( 1 9 , 2 0 ) , t e n d o - s e cono p a - • * * / d rao de r e f e r e n c i a iW g a la o to s a n in a . HC1 ,
12»2, P ra c io n a m e n to e C a r a c t e r i z a ç ã o : — A m o stras em D u p l i c a - /
t a s (2 mg) d as p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I fo ra m h i d r o l i -
- 30 -
s a d a s p o r 8 h s , segundo a s c o n d iç õ e s p r é - e s t a b e l e c i - das ( i t e m 1 2 . 1 ) . Os h i d r o l i s a d o s fo ra m r e u n i d o s , f i l t r a d o s q u a n t i t a t i v a m e n t e em f u n i l de p l a c a p o r o s a a pós a d i ç õ e s e l a v a g e n s ' s u c e s s i v a s com e t a n o l . Tendo / s id o o e x c e s s o de á c id o e lim in a d o à v á c u o com a q u e c i
mento não s u p e r i o r a 50 °C , os a m in o a ç ú c a re s f o ra m : - • a ) D e te rm in a d o s segundo BOAS ( 2 8 ) : A ssim , a l í - / q u o ta s dos h i d r o l i s a d o s d as p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I , fo ra m a p l i c a d a s à c o lu n a s de Dowex 50 W-X 8 (H-^ ), 2 0 0 - 400m esh, de 0 , 8 x 5 cm. A c o lu n a f o i la v a d a com ág u a d e s t i l a d a d e i o n iz a d a a t é e lim in a ç ã o t o t a l dos a ç ú c a - / r e s n e u t r o s . A s e g u i r , os a m in o a ç ú c a re s fo ra m e l u í d o s com HC1 2 N, num f lu x o de 0 , 1 m l / m i n ., a t é um volum e t o t a l de 30 ml de e l u a t o . 0 e x c e s s o de á c id o das f r a ç õ e s dos e l u a t o s f o i n e u t r a l i z a d o à v á c u o no p r ó p r i o tu b o de a n á l i s e , ap ó s o que o c o n te ú d o t o t a l de h e x o - sa m in as f o i d e te rm in a d o p e lo m étodo de ELSON-MDRGAN /
4 4 4
( 2 9 ) . D -g lu c o s a m in a . HC 1 e D - g a la c to s a m in a . HC1 fo ra m u t i l i z a d a s como p a d r õ e s ,
b ) E r a c io n a d a s de a c o rd o com GARDELL ( 3 0 ) : H id ra l i s a d o s das p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I fo ra m a p l i c a d o s / h c o lu n a s de Dowex 50 W-X8 (H+) , 200-400 m esh, de 0 , 9 / * x 38 cm. E lu i n d o - s e com HC 1 0 , 3 N e f lu x o de 1 m l/h , f r a ç õ e s de 1 ml fo ra m c o l e t a d a s em c o l e t o r "GM". As a n á l i s e s fo ram f e i t a s p e lo m étodo de ELSON-MDRGAN, em a l í q u o t a s de 0 , 5 ml dos e l u a t o s .
Os h id r o lis o .d o s das p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I a p r e s e n ta r a m d u as f r a ç õ e s , que fo ra m c a r a c t e r i z a d a s /
p o r : - -
(A) p e r f i l de e l u i ç ã o ( 3 1 ) ; (B) c r o m a t o g r a f i a a £
c e n d e n te das f r a ç õ e s em p a p e l W hatnan n^ 1 , u t i 3 . i z a n -
d o -s e P i r i d i n a : A c e ta to de E t i l a : A cido A c é t i c o : H20
( 5 * 5 : l s 3 : ) como s o l v e n t e ( 3 2 ) . A r e v e l a ç ã o f o i f e i t a /
com o r e a t i v o de ELSON— M3RGA1T (3 3 ) e com g a l a c t o s e 0*7
x id a .se ( 3 4 ) ; e (C) d e s a n in a ç á o segundo STOFEYN (3 5 ) »
se g u id a, de c r o m a t o g r a f i a dos p r o d u to s em p a p e l Wliat— /
n a n n fi 1 , te n d o como s o l v e n t e B u to n o ls E to n o l: HgO ( - ( 4 : l ; l ) e r e v e l a ç ã o c o n c l o r i d r a t c f de p - a n i s i d i n a ( 2 4 )
Con r e s p e i t o à e s s a s f r a ç õ e s , s e r ã o u t i l i z a d a s a s s e g u i n t e s a b r e v i a t u r a s : -
A j e A j j p a r a a s p r i m e i r a s f r a ç õ e s o b t i d a s dos h i d r o l i s a d o s d as p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I , r e s p e c t i v a m e n t e ,
e p a r a a s c o r r e s p o n d e n te s e l u í d a s p o s t e r io r m e n te •
1 2 .3 . D o term in açã o de N - a c e t i l g l u c o s a n i n a : A d e te rm in a ç ã o de N - a c e t i l g l u c 0s a n l n a f o i r e a l i z a d a a p ó s aç ão de s u co d i g e s t i v o de M e g a lo b o lin u s p a ra n a g u e n s e s n a s p a r e des c e l u l a r e s . As c o n d iç õ e s de e n s a io j á fo ra m d e s c r i t a s a n t e r io r m e n te ( i t e m 1 1 ) , sendo f e i t a 50 h o r a s de in c u b a ç ã o p a r a a p a re d e c e l u l a r I e '/Ohs p a r a a p a r e de c e l u l a r I I , ap ó s 0 que os s o b r e n a d a n te s fo ra m a n a l i s a d o s p e lo mótodo de REISSIG ( 2 6 ) , te n d o como p a - / d rão H-ac e t i l - D - g l u c o s a n i n a .
13* E stu d o dos A çú c ares Á cid o s
As p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I fo ra m h i d r o l i s a d a s / co n á c id o f ó m i c o 98$ e c o n HC 1 1$ ( 3 6 ) . M a t e r i a l i n s o l ú v e l f o i e lim in a d o p o r c e n t r i f u g a ç ã o . Após e l i m i n a r o e x c e s s o dc á c id o à v á c u o , os p r o d u to s de h i d r ó l i s e fo ra m p a s s a d o s a t r a v ó s de u n a c o lu n a de Dowex 1— X8 (HCOO ) , 200—400 m esh. Açú
c a r e s n e u tr o e a n in a d o s fo ra m e l u í d o s com á g u a d e s t i l a d a / d e i o n iz a d a , e os a ç ú c a r e s á c id o s com á c id o f ó r n i c o 2 IT , sendo e s t e ú ltim o e l u a t o a n a l i s a d o p e lo mótodo do C a r b a z o l / ( 29 ) c r o n a t o g r a f i c a n e n t e em A o e ta to de E t i l a s P i r i d i n a 1 A ci
do A c ó tic o : HgO ( 5 s 5 í 1 í 3 ) ( 3 6 ) , 14# R e a g e n te s U t i l i z a d o 3
D o d e c i l s u l f a t o de s ó d io (SD S ), Q u i t i n a , s o ro a l bum ina b o v in a c r i s t a l i n a , p e r o x i d a s e , g lu c o s e o x id a s e ( t i p o
4 * • 1
I I ) , D - g a la o to s a m in a , HC1, D ~glucosom inn«H C l, D ^m an o san in a,
- 12 . -
N-r.c c t i 1 -D -g lu c o 3 a n i n a e N-ac e t i l - D - g n l a c t o s a n i n a e r a n da
S ig n a C h e n ic a l Co. O - d i a n i s i d i n a f o i f o r n e c i d a p e l a N u t r i - /
t i o n a l B io c h e n ic a ls C o r p o r a tio n e D -g lu c o s e e D - x i lo s e p e l a
P f a n s t c h l L ab . D in e t ila n in o b e n z a ld e íd o - ( r e c r i s t . 2 x e n ^ O )
o Kcido t r i f l u o r o a c á t i c o e r a n d a M erck. G a la c to s e o x i d a s e -
f o i p r e p a r a d a a p a r t i r de P o ly p o ru s c i r c i n a t u s , segundo a
td c n i c a de AVIGAD (3 4 )*
C r e s c i n e n t o e n n e i o s ó l i d o
As f i g u r a s 1 e 2 m ostram q u e , e n q u a n to o c r e s c i n e n to e n g lu c o s e é r e s t r i t o , e n a c e t a t o o n i c é l i o é f i l a m e n t o so e se e s p a l h a r a d i a l n e n t e , P e la s n i c r o f o t o g r a f i a s ( f i g u - / r a s 3 © 4 ) , o b s e r v a - s e que a s h i f a s c r e s c i d a s e n g lu c o s e / são b a s t a n t e r a m i f i c a d a s , e n q u a n to que a s c r e s c i d a s e n a c e t a t o são lo n g a a e pouco r a m i f i c a d a s , .
E s t e c o n p o r ta n e n te é s e m e lh a n te ao d e s c r i t o p a r a - a s a l t e r a ç õ e s n o r f o l é g i c a s de N e u ro 3 p o ra c r a s s a ( 9 ) , o q u a l pode s e r in d u z id o p o r n u t a ç ã o , v a r i a ç ã o da f o n t e de ca rb o n o ( a d iç ã o de s a r b o s e ao n e io de c u l t u r a ) , p e l a t e n p e r a t u r a de in c u b a ç ã o , ou p e lo a c ré s c im o de su co d i g e s t i v o de H e lix p o - n a t i a ao n e io de c u l t u r a ,
A fo rm a das h i f a s de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s c r e s c id o e n S a b o u ra u d g lu c o s e é s e n e l h a n t e à s do t i p o c o l o n i a l / de N e u ro s p o ra , e n q u a n to que a das c r e s c i d a s em S a b o u ra u d a c e t a t o co rre sp o n d e m à s da fo rm a s e lv a g e m de N e u r o s p o r a , M ic ro s c o p ia E l e t r ô n i c a
Como s e p o d e . o b s e r v a r p e l a s n i c r o g r a f i a s e l e t r ô n i c a s n a s f i g u r a s 5 e 6 , a p a re d e c e l u l a r d as h i f a s de P ic n o p o ru s c in n a b a rim o s é de m a io r e s p e s s u r a quando e l e é c r e s c i
/
-do no n e io I , I s t o n o s s u g e re que e x i s ta m d i f e r e n ç a s e n t r e a s p a re d e s d e s te fu n g o , n a s c o n d iç õ e s de e s t u d o . E n t r e t a n t o , e s s a a l t e r a ç ã o não p r e c i s a s e r n e c e s s a r ia m e n te q u a n t i t a t i v a p o is pode e s t a r r e l a c i o n a d a co n d i f e r e n t e s d i s p o s i ç õ e s e s - /
*
t r u t u r a i s dos p o l í n e r o s n a s p a r e d e s . P u r i f i c a ç ã o das P a re d e s
M u ito s m étodos p a r a p u r i f i c a ç ã o e x i s t e m , e a o b te n
- 14 *
çSo de parede© o e l u l n r e e l i v r o e de o o n tn n i nn ção o ito p l a s m á t i c a 4 o p r i n e i r o p ro b le m a com. r e l a ç ã o ao s e u e s tu d o ( 3 6 ) .
C o n s id e ra n d o que os á c id o s n u c l e i c o s e a s p r o te jí n a s a p re s e n ta m a b s o rç ã o n a f a i x a de 260—280 -n n , u t i l i z o u r s e e s t e dado como i n d i c a t i v o da l i b e r a ç ã o do c o n te ú d o end£
c e l u l a r . A ssim , s e i s t o e s t i v e s s e o c o r r e n d o , d e v e r i a h a v e r u n d e s a p a re c im e n to g r a d a t i v o d e s t a a b s o rç ã o em fu n ç ã o do tempo de tr a ta m e n to com SDS, Além d i s s o , os a ç ú c a r e s t o t a i s e p r o t e í n a s fo ra m d e te rm in a d o s n o s s o b r e n a d a n t e s , o b s e r v a n d o -s e o d e s a p a re c im e n to de ambos em fu n ç ã o do tem p o ,
Com b a s e n e s t e s f a t o s , c o n s id e r o u —s e a s p a r e d e s — c e l u l a r e s de P ic n o p o ru s c i n n a b a r in u s p u r i f i c a d a s ap ó s 3 1 h s de tr a ta m e n to ( f i g u r a s 7 e 8 ) , o que f o i co n firm a d o /
* 4
p e l a s a n á l i s e s ao m ic r o s c á p io e l e t r o n i o o ( f i g u r a s 9 e 1 0 ) . MAHADEVAN (2 0 ) c o n s id e r o u a s p a r e d e s de N eurospo
r á c r a s s a p u r a s ap ó s 16 h o r a s de tr a ta m e n t o com SDS, 'ten d o como com provação o exame das h i f a s p o r n i c r o s c o p i a de co n t r a s t e de f a s e , Embora u t i l i z a n d o a mesma t é o n i c a , t o r n a s e d i f í c i l f a z e r algum a c o r r e l a ç ã o , p o i s a l ó n dos c r i t é r i os de p u r i f i c a ç ã o em pregados se re m d i f e r e n t e s , o s n i c r o r g a n is n o s p e rte n c e m a c l a s s e s d i s t i n t a s .
D u ra n te a p u r i f i c a ç ã o d as p a r e d e s c e l u l a r e s de P ic n o p o ru s c i n n a b a r in u s s e o b s e rv o u que o fungo c r e s c i d o / em a c e t a t o l i b e r a v a s e u c o n te ú d o c e l u l a r m ais ra p id a m e n te como se pode o b s e r v a r p e l a s f i g u r a s 7 e 8 , in d ic a n d o uma - m a io r f r a g i l i d a d e ao tr a ta m e n to com d e t e r g e n t e ,
4« Conteúdo de l i p í d e o s
A p o rc e n ta g e m de l i p í d e o s n a p a r e d e c e l u l a r de
fu n g o s ó um c r i t ó r i o de p u r i f i c a ç ã o , p o i s segundo TAYXOR
( 3 7 )s " L ip íd e o s em e x c e s s o de 8—30$ devem s e r c u id ad o sa m en
t e exam inados p a r a s e d e t e r m in a r s e o p r o c e s s o de p r e p a r a
ção de p a re d e f o i r ig o r o s a m e n te s u f i c i e n t e p a r a rem o v e r /
ç o n ta m in a n te s c i t o p l a s u á t i c o s " ^ Como pode s e r o b se rv a d o n a
não havendo d i f e r e n ç a s e n s u a s c o n c e n tr a ç õ e s c o n a v a r i a ção da f o n te de c a rb o n o ,
C ^nteúdo de Pósforo
E n b o ra a p e q u e n a p o r c e n ta g e n de f ó s f o r o ( t a b e l a I ) p o s s a e s t a r r e l a c i o n a d a c o n u n a p o s s í v e l c o n ta m in a ç ã o / p o r á c id o s n u c l e i c o s , o f a t o de a ç ú c a r e s f o s f a t a d o s t e r e n s id o d e t e c t a d o s e n o u t r o s fu n g o s ( 3 8 , 3 9 , 40) , l e v a a s u g e r i r a p o s s i b i l i d a d e da p a r t i c i p a ç ã o de f o s f a t o n a e s t r u f u r a das p a r e d e s de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s . Não o b s t a n t e s o r e s t a p o r c e n ta g e n n u i t o b a i x a , h á u n a s i g n i f i c a t i v a d ^ f c r e n ç a n a c o n c e n tr a ç ã o de f ó s f o r o t o t a l , sen d o que a s p a re d e s c e l u l a r e s do fun g o c r e s c i d o e n g lu c o s e a p r e s e n t a n u n t e o r de 50$ a n a i s .
P a to s e n e l h a n t e o c o r r e n a tr a n s f o r m a ç ã o n ic ó liç ) le v e d u r a do Mucor r o u x i i (4 1 )» p o i s s e o b s e rv o u que a p a re d e c e l u l a r d as f o r n a s f i l a n e n t o s a s a p re s e n ta v a m una^
c o n c e n tra ç ã o n a i o r de f ó s f o r o t o t a l que a s l e v e d u r i f o r n e s . J á , en B la s to n v c e s d e r n a t i t i d i s ( 6 ) se c o n s t a t o u u n a p o r c e n ta g e n n a i o r de f ó s f o r o t o t a l n a p a re d e d a s c ó l u l a s
t i p o l e v e d u r a s . '
Conteúdo de p r o t e í n a s
C o n s id e ra n d o a a d v e r t ê n c i a de BARTNICKI-GARCI à ( ( 4 1 ) , de que a a n á l i s e d i r e t a de p r o t e í n a s da p a re d e p e lo n ó to d o LO V/R Y p r o d u z ia t u r b i d e z , e a p e lo B i u r e to u n preed.
p ita d o a z u l , t e n t o u - s e e x t r a i r a s p r o t e í n a s d as p a r e d e s /
é
s e n s u c e s s o , c o n NaOK a f r i o (1 7 )» S o n e n te a u n e n ta n d o - se
a c o n c e n tr a ç ã o de a l c a l i e c o n a q u e c im e n to ó que s e cons_e
g u iu d o t e r n i n á - l a s ( t a b e l a I ) , sen d o f e i t o tr a ta m e n t o par-
r a l e l o do p a d rã o a f i n de se c o r r i g i r p o s s í v e i s a l t e r a — /
ções nos a n i n o á c i d o s E x t r a ç õ e s de p r o t e í n a s de p a r e d e s
o o l u l a r o c , c o n d iç õ o s e o n e lh o n te s a e s t a s , t e n s id o am
plam en te u t i l i z a d a s (3 7 )*
No p r e s e n t e c a s o , a s a l t e r a ç õ e s n o r f o l é g i c a s ob o c rv a d a s não e s tã o r e l a c i o n a d a s c o n o t e o r de p r o t e í n a s ( ( t a b e l a I ) , f a t o e s t e que não s e v e r i f i c o u n o s c a s o s de d in o r f i s n o n i c é l i o - l e v e d u ra ( 7 , 8 ) e n a a l t e r a ç ã o de mor
f o l o g i a de a m o s tra s de R h o d o to ru la e n d i f e r e n t e s c o n d iç õ e s dc c u l t i v o (1 4 )* E n t r e t a n t o , no c a so do c r e s c im e n to t i po c o l o n i a l de N e u ro sp o ra c r a s s a ( 9 ) ta n b á n não s e c o n s t a t o u m o d ific a ç ã o n a c o n c e n tr a ç ã o p r o t e i c a *
Conteúdo de A ç ú c a res T o t a i s
A p o rc e n ta g e m de a ç ú c a r e s t o t a i s d e te rm in a d a n a s p a re d e s c e l u l a r e s I e I I , n a r e a l i d a d e r o p r e s e n t a a p o rc e n ta g e n de a ç ú c a r e s n e u t r o s t o t a i s , j á que a ç ú c a r e s á c i d o s / não f o r a n d e t e c t a d o s , e os a n in a d o s dão r e a ç ã o n e g a t i v a co n o F e n o l - ^ u l f ú r i c o ( 4 2 ) .
A n a lis a n d o - s e os dados da t a b e l a I , c o n c l u i n o s - quo a s p a r e d e s c e l u l a r e s de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s c re s -r e id o en g lu c o s e ou a c e t a t o , não a p r e s e n t a n a l t e r a ç õ e s / q u an to à c o n c e n tr a ç ã o de a ç ú c a r e s n e u t r o s t o t a i s .
Conpo3lção e n A ç ú c a re s N e u tro s
As c o n d iç õ e s pa„ra o e s tu d o dos a ç ú c a r e s n e u
t r o s f o r a n b a s t a n t e d i f i c u l t a d a s d e v id o à i n s o l u b i l i d a d e /
das p a r e d e 3 c e l u l a r e s , As c u r v a s de h i d r ó l i s e da f i g u r a —
1 1 , m ostram que o tempo de 8 h o r a s pode s e r c o n s id e r a d o /
cono é tim o , e n t e r n o s de r e n d in e n to d e s t e s a ç ú c a r e s l i b e
r a d o s . Os a ç ú c a r e s n e u t r o s f o r a n d e te rm in a d o s p o r c r o n a
to g r a f i a g a s o s a ( f i g u r a 12 ) , e s ta n d o s u a s p o r c e n t a g e n s /
a p r e s e n ta d a s n a t a b e l a 1 , 0 c o n te ú d o de g lu c o s e d a s p a r e
des c e l u l a r e s I e I I f o i c o n firm a d o p e l a r e a ç ã o e s p e c í f i c a
da g lu c o s e oxida.se*
P a r a o f a t o de s e r a p o r c e n t a g e n e n a ç ú c a r e s - n e u tr o s l i b e r a d o s p o r h i d r ó l i s e ( g lu c o s e -t- n a n o s e ) i n f e r i o r à de a ç ú c a r e s n e u t r o s t o t a i s ( í t e n a n t e r i o r - t a b e l a I ) , duas e x p l i c a ç õ e s sã o v i á v e i s : a p r i n e i r a s e r i a de
v id o às c o n d iç õ e s á c i d a s de h i d r ó l i s e , n a s cono s e o b se r-r v a p e l a s c u r v a s da f i g u r a 1 1 , n e sn o ap ó s 8 h o r a s não ho u ve d e s t r u i ç ã o s i g n i f i c a t i v a dos a ç ú c a r e s . O u tr a p o s s i b i l i
dade s e r i a que os p o l í n e r o s d as p a r e d e s não f o r a n t o t a l — / n e n te h i d r o l i s a d o s . C o n s id e ra n d o a s d i f e r e n t e s l a b i l i d a - / dos a á c id o s d as l i g a ç õ e s g l i c o s i d i c a s , i s t o s e r i a j u s t i f i c á v e l , p o is e n p a r e d e s c e l u l a r e s de f u n g o s , os p o l i s s a - c a r í d e o s v a r i a n , n o r a a l n e n t e , q u a n to a s u a e s t r u t u r a ( l ) . A lón d is s o -, cono se o b s e r v a p e l a f i g u r a 1 1 , a p o r c e n ta g e n do a ç ú c a r e s t o t a i s ó n a i o r que a d as r e d u t o r e s , s u g e rin d o g e x i s t ê n c i a de o l i g o s s a c a r í d e o s .
Na m a i o r i a .d o s c a s o s de d i n o r f i s n o l e v e d u r a - n i e ó l i o e s tu d a d a s ( 2 , 3 , 4 , 6 , 7 © 8 ) c o n s t a t o u - s e u n a a l te r a ç ã o n a c o n c e n tr a ç ã o de a ç ú c a r e s n e u t r o s d as p a r e d e s / c e l u l a r e s . E n t r e t a n t o , n a m o d ific a ç ã o t i p o c o l o n i a l de N e u ro sp o ra ( 9 ) e n a s a l t e r a ç õ e s p o r v a r i a ç ã o do n e io de c u l t i v o e n R h o d o to ru la (1 4 ) não f o r a n o b s e rv a d a s d i f e r e n ç a s s i g n i f i c a t i v a s , o n e sn o a c o n te c e n d o no p r e s e n t e c a so ( t a b e l a I ) .
CROOK (4 3 ) e s tu d a n d o a com posição e n a ç ú c a r e s / n e u t r o s da p a re d e de algum as e s p é c i e s de B a s i d i o n i c e t o s ,
d e n o n s tro u que a g lu c o s e e a n e n o s e e s t a v a n s e n p re ç r e s e n
t e s , en q u a n to a g a l a c t o s e , x i l o s e e f u c o s e v a r i a v a n . En
D en d ry p h ie 1 1 a v in o s a ( 44 ) f o i o b s e rv a d a a p r e s e n ç a de g a
l a c t o s e , ju n ta m e n te c o n g lu c o s e e n a n o s e , e n q u a n to que e n
P o ly p o ru s t u n u l o su s ( 4 5 ) a l ó n de g lu c o s e d e t e c t o u - s e nano
s e e x i l o s e . V e r i f i c a - s e , p o r t a n t o , que g lu c o s e e n a n o s e /
são com ponentes c o n s t a n t e s d as p a r e d e s de B a s i d i o n i c e —
t o s , en q u a n to os d e n a is a ç ú c a r e s n e u t r o s sã o v a r i
á v e i s .
- 18 -
9 . Cor-t»osicão e n A ç ú c a res A ninadoa
As c o n d iç õ e s de h i d r ó l i s e e s t a b e l e c i d a s p a r a a de te rm in a ç ã o de a m in o a ç ú c a re s m o stram que o tempo àe 8 h o ra s pode s e r c o n s id e r a d o como ó tim o p a r a a l i b e r a ç ã o / d e s te s a ç ú c a r e s d as p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I ( f i g u r a 13)« ‘
Como s c o b s e r v a p e l a f i g u r a 14» o s a ç ú c a r e s n n i nados de ambas a s p a r e d e s fo ra m s e p a r a d o s em c o lu n a s t r £ c a d o ra de ío n s em duas f r a ç õ e s , a s q u a i s fo ra m c a r a c t e r i z a d as p e l a s s e g u i n t e s p r o p r ie d a d e s í -
a ) P o r d e s a n in a ç ã o a s f r a ç õ e s A j e App deram o
rig e m à a r a b i n o s e e B j e B j j à l i x o s e , o mesmo o c o r r e n d o / r e s p e c tiv a m e n te com os p a d rõ e s de D - g lu c o s a n in a e D -g a la £ t o s a n i n a . E n t r e t a n t o , D -n an o sam in a e D - t a l o s a n i n a tambem o rig in a m p o r d e s a n in a ç ã o r e s p e c tiv a m e n t e a a r a b i n o s e e l i x o s e . L ogo, p o r e s t e s r e s u l t a d o s a s f r a ç õ e s A j e A j j a e - v e n c o r r e s p o n d e r a g lu c o s a n in a o u à m a n o s a n in a , e a s f r a
ções B j e B j j à g a l a c t o s a n i n a ou t a l o s a n i n a .
b ) As f r a ç õ e s A j, A j j e B j , B j j a p r e s e n ta r a m m£
b i l i d a d e s crom at o g r á f i c a s s e m e lh a n te s ao s p a d r õ e s de D- / g lu c o s a n in a e de D—g a l a c t o s a n i n a , e d i s t i n t a s à de D— man£
8am in a, o que p e r m ite s u p o r que a s f r a ç õ e s A j e A j j devem se i d e n t i f i c a r com a g l u c o s a n i n a .
c ) Som ente a s f r a ç õ e s B j e B j j são v i s u a l i z a d a s p e l a g a l a c t o s e o x i d a s e , à se m e lh a n ç a do p a d rã o de D -g a la £ t o s a n i n a . Embora no t r a b a l h o da g a l a c t o s e o x i d a s e , a t a - lo s a m in a não te n h a s id o t e s t a d a como s u b s t r a t o , o f a t o de serem a s n o b i l i d a d e s c r o n a t o g r á f i c a s de g a l a c t o s a n i n a - e t a l o s a n i n a d i s t i n t a s co n o s o l v e n t e em pregado ( 3 2 ) , s u g e re q u ed a s f r a ç õ e s B j e B j j devem c o r r e s p o n d e r à g a l a £ t o s a n i n a .
d) CRUMPTON (3 1 ) com provou que a r e l a ç ã o e n t r e *
o volum e de e l u e n t e n e c e s s á r i o p a r a e l u i r a c o n c e n t r a ç ã o -
m áxina de u n a m in o a ç ú c a r e o p a r a e l u i r a da g l u c o s a n i n a /
da mosna c o lu n a é c o n s t a n t e , I n d e p e n d e n te d as d in e n s õ e s da c c lu n a dc r e s i n a em pregada e da n o r n a l i d a d e do e l u e n t e á c i
/ mmmdo n a f a i x a de 0 ,2 5 - 0 ,5 0 N. E s t a r a z ã o é cham ada de Rgluco, o a n in a , e cono pode s e r v i s t o n a t a b e l a I I , os r e s u l t a d o s / o b tid o s co n a s f r a ç õ e s e s t ã o de a c o rd o com os de CRUMPTON- (3 1 ) e de BMYTRACZENKQ ( 46) , p e r m itin d o i d e n t i f i c a r a s f r a çÕcs A^e A jj como g l u c o s a n i n a , e a s f r a ç õ e s e B ^ como g a la c to s a n i n a •
e ) Como to d a g lu c o s a n in a d as p a r e d e s c e l u l a r e s I 0 I I e s t á n a fo rm a de N - a c e t i l g l u c o s a n i n a ( t a b e l a s I e I I I )
co n c lu ím o s que a s f r a ç õ e s A^ e A ^ c o rre sp o n d e m r e a l m e n t e -
à g lu c o s a n in a . ' .
Cono pode s e r v i s t o p e l a t a b e l a I , e x i s t e u n i n t e r e s s a n t e b a la n ç o no t e o r de h e x o s a n in a s d a p a re d e c e l u - /
*
l a r de P . c i n n a b a r in u s c r e s c i d o em f o n t e de c a rb o n o v a r i á v e l . A ssim , e n q u a n to a p a re d e do fungo c r e s c i d o em g lu c o s e
t e n m ais que o dobro de g a la c t o s a n i n a que a p a re d e do cress e id o em a c e t a t o , o q u a l p o r s u a v e z a p r e s e n t a um c o n t e ú d o / m aio r de g lu c o s a n i n a , de t a l m a n e ira que a p o rc e n ta g e m to-*
4 1
t a l do h e x o sa n in a s é m a io r no c r e s c i d o em a c e t a t o .
A lte r a ç ã o no t e o r de g l u c o s a n in a da p a re d e celu**
l a r e s t á também r e la c i o n a d o c o n o d in o r f is m o de B l a s t o n y - / cos d e r n a t i t i d i s ( 6 ) e P a r a c o c c i d i o i d e s b r a s i l i e n s i s ( 7 ) . A p a re d e das c é l u l a s l e v e d u r i f o r n e s d e s t e s m ic r o r g a n is m o s / possuem u n a c o n c e n tr a ç ã o m a io r d e s t a h e x o s a n in a que a pare_
do das f i l a m e n t o s a s . E n t r e t a n t o , em C o rd y cep s n i i i t a r i s (~
( 8 ) é e n c o n tr a d a uma p o rc e n ta g e m m a io r de h e x o s a n in a s n a p a re d e das f i l a m e n t o s a s . Mesmo n o s c a s o s de m o d if ic a ç õ e s / menos p ro n u n c ia d a s da m o r f o lo g ia e x i s t e u n a a l t e r a ç ã o do
. ê
t e o r dc a n in o a ç ú c a r e s d as p a r e d e s . I s t o o c o r r e t a n t o no c a
Qo de le v e d u r a s do g ê n e ro R h o d o to ru la ( 1 4 ) , cono no c a so /
do c r e s c im e n to t i p o c o l o n i a l de N e u ro s p o ra ( 9 ) . A ssim , a
p a re d e c e l u l a r de N e u ro sp o ra c r a s s a « t i p o c o l o n i a l , t e n u -
- 23 -
na c o n c e n tra ç ã o m a io r de g lu c o s a n in a que a do t i p o s e l v a - / * - * g e n . Con r e l a ç ã o à a l t e r a ç ã o no t e o r de g a l a c t o s a n i n a da p a re d e c e l u l a r de P ic n o p o r u s , r e s s a l t a - s e que r e s u l t a d o s / o cD C lhantes f o r a n o b tid o s só n o s c a s o s de n u ta ç ã o e n N e u -/
r o s p o r a c r a s s a ( 1 2 , 4 7 ) . L ogo, os dados o b t i d o s no p r e s e n te c a so lev am a s u p o r que a s a l t e r a ç õ e s no t e o r de h e x o s a - p-fn as da p a re d e c e l u l a r de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s d ev en ta n b ó n e s t a r r e l a c i o n a d a s c o n a s n o d i f i c a ç õ e s n o r f o l ó g i c a s
o c o r r i d a s . •
0 f a t o de j á t e r s id o d e n o n s tra d o e n N e u r o s p o r a / c r a s s a ( 3 9 ) que os p o lím e ro s de g a l a c t o s a n i n a da p a re d e fu n cio n am cono r e c e p t o r e s de p o l i f o s f a t o , p e r m i t i r i a c o r r e l a c i o n a r a p o r c e n ta g e n n a i o r de f ó s f o r o t o t a l c o n a de g a
l a c t o s a n i n a n a p a re d e c e l u l a r de P ic n o p o ru s c i n n a b a r in u s / c r e s c id o en g lu c o s e ( t a b e l a I ) , s u g e rin d o que a g a l a c t o s a -
4
m ina e s t a r i a n a p a r e d e n a f o r n a de p o l í n e r o .
A i d e n t i f i c a ç ã o de g a l a c t o s a n i n a n a s p a r e d e s c e l u l a r e s de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s c o n t r a r i a a r e g r a de que e s t a h e x o s a n in a ó a ç ú c a r c a r a c t e r í s t i c o a p e n a s da p a re de dos A s c o n ic e to s ( l ) .
30» Ação E n z i n á t i c a do Suco D ig e s tiv o de M e g a lo b o lin u s p a r a n a - Suco d i g e s t i v o de H e lix p o n a t i a ( f o n t e c o n e rc ia ll) ó a n p la n e n te u t i l i z a d o p a r a o e s tu d o e s t r u t u r a l e c a r a c t e r i z a ç ã o de q u i t i n a e n p a r e d e s c e l u l a r e s de fu n g o s ( 8 , 3 8 , 4 4 , 40 ) .
0 su co d i g e s t i v o de M e g a lo b o lin u s p a ra n a g u e n s o s
c a t a l i s a a h i d r ó l i s e de q u i t i n a l i b e r a n d o cono p ro d u to IT-
a c e t i l g l u c o s a m i n a , in d ic a n d o que e l e c o n tó n e n t r e o u t r a s /
e n z im a s , u n a q u i t i n a s e . As p a r e d e s c e l u l a r e s I e I I e n s a i
a d a s c o n o suco d e s te ca ra m u jo ( f i g u r a 1 5 ) f o r a n d e g ra d a — /
d a s , n o s tr a n d o e x i s t i r n a s p a r e d e s de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i
nus u n p o lím e ro t i p o q u i t i n a , e que os g lu c a n o s p r e s e n t e s /
nos d o is t i p o s de p a r e d e s e s tu d a d a s d ev e n d i f e p i r , j á que
a s p o r c e n ta g e n s de g lu c o s e l i b e r a d a s f o r a n d i f e r e n t e s ( t a -
b e la I I I ) .
A n a lisa n d o os dados da t a b e l a I I I , o b s e rv a —s e / que en q u a n to 70$ d as g lu c o s e s c o n t i d a s n a p a r e d e c e l u l a r - de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s c r e s c i d o em g lu c o s e sã o l i b e r a das p e l a s enzim as do su co d i g e s t i v o de Me g a lo bo l i n u s p a r a r a «mens e s , som ente 45$ o são l i b e r a d a s da p a r e d e do c r e s c i do cm a c e t a t o . 0 f a t o de g lu c a n o OC 1 ,3 s e r com ponente da p a re d e c e l u l a r de fu n g o s ( l ) e g lu c a n a s e ^ 1 , 1 e s t a r a u s e n te em suco d i g e s t i v o de H e lix p o m a tia (3 8 )» s u g e re a / p o s s i b i l i d a d e da e x i s t ê n c i a de um g lu c a n o d e s t e t i p o , d if j3 rc n c ia n d o q u a n t i t a t i v a m e n t e a p a r e d e c e l u l a r de P ic n o p o ru s c in n a b a r in u s n a s c o n d iç õ e s em e s t u d o . Em bora e s t a s s u p o s i ções n e c e s s ite m de c o n firm a ç ã o e x p e r i m e n t a l , r e s u l t a d o s s £ n e l h a n t e s a e s t e s fo ra m r e l a t a d o s no d in o r fis m o de P a ra c o c • / . . . " ' 1 c i d i o i d e s b r a s i l i e n s i s ( 7 ) . A lte r a ç ã o n a co m p o sição de g l u canos p a r e c e e s t a r tam bón r e l a c i o n a d o com o c r e s c im e n to t i po c o l o n i a l de N e u r o s p o r a , p o is o f r a c i o n a n e n t o da p a r e c e / c e l u l a r m o stro u que e x t r a t o a l c a l i s o l ú v e l e s t á s e n s i v e l — / mente aum entado com r e l a ç ã o ao t i p o s e lv a g e m ( 1 0 ) .
0 f a t o de e n c o n t r a r q u i t i n a como p r i n c i p a l compo n e n te da p a re d e e g lu c a n o s como s e g u n d o , co n firm am os c r i t é r i o s m o r fo ló g ic o s que c l a s s i f i c a r a m P ic n o p o r u s c i n n a b a r i nus como um B a s i s i o m i c e t o , s it u a n d o - o d e n tr o do grupo V da c l a s s i f i c a ç ã o ta x o n o n ic a de BARTNICKI-GARCIA ( l ) .
0 is o la m e n to e a d e te rm in a ç ã o da e s t r u t u r a dos /
p o lím e ro s de g l u c o s e , n a n o se e g a l a c t o s a m i n a , sã o a n á l i s e s
co m p lem en tare s n e c e s s á r i a s e x p l ic a ç ã o g l o b a l d as a l t e r a
ções m o r f o ló g ic a s o b s e r v a d a s .
Tig u r a 1* P ic n o p o ru s c i n n a b a r in u s c r e s c i d o ein S a b o u ra u d D—
g lu c o s e p o r 72 h o r a s a 28°C .
F ig u ra 2 . P ic n o n o ru s c i n n a b a r in u s c r e s c i d o e n S a b o u ra u d a c e
t a t q p o r 72 h o r a s a 28 C»
&
V,
>MÍ-
.‘v •«?. n Ví’ V- Mi v b 1 \U, „
v -■» \v . l,‘.i ; '-VJ' '
i 2 f . '
F ig u ra 3* M icro f o t o g r a f i a (x 1200) de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s c r e s c id o en S ab o u rau d D - g lu c o s e . C u l t u r a de 7 2 h o ra s a 28°C .
F ig u ra 4» M i c r o f o t o g r a f i a (x 12 0 0 ) de P ic n o p o ru s c i n n a b a r i n u s . c r e s c id o e n S a b o u ra u d a c e t a t o . C u l t u r a de 72 h o r a s
*
