Avaliação da actividade electroquímica em cogumelos silvestres comestíveis

(1)

Licenciada em Química, Ramo Científico

Avaliação da actividade electroquímica em cogumelos silvestres comestíveis

Departamento de Química

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Abril/2008

(2)

Á minha madrinha por todo o amor, carinho e apoio pelo exemplo de coragem, força e alegria de viver Estarás sempre comigo…

(3)

Agradecimentos

À minha orientadora, a Professora Ana Cristina Freire, por ter aceite orientar o meu trabalho, pela dedicação na orientação deste trabalho, estando sempre disponível para me ajudar.

Ao Doutor Miguel Vilas Boas, meu Co-orientador, que foi incansável na orientação deste trabalho, sempre presente na resolução dos problemas. Um muito obrigado pela sua dedicação na orientação e pela sua amizade.

À Doutora Isabel Ferreira por ter acolhido o meu trabalho no seu projecto de investigação, por toda a amizade, simpatia e apoio demonstrado.

Aos meus colegas de Laboratório, pelos bons momentos passados tanto a trabalhar como nas pausas para o cafezinho, que tornaram estes meses inesquecíveis. À Lillian, pelos extractos de cogumelos, pelo apoio, conselhos e explicações acerca do mundo dos cogumelos, pela sua boa disposição e amizade. À Daniela, por todo apoio e amizade, sempre disponível a ajudar e a resolver qualquer problema, pelos bons momentos passados nos almoços. Ao João, pelo sentido de humor e pela banda sonora do trabalho.

Aos restantes membros do Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada da Escola Superior Agrária de Bragança, pelo bom acolhimento, pelo apoio e pelos bons conselhos ao longo destes meses.

Aos meus amigos fora do mundo da química, presentes em todos os momentos, que ouviram os meus problemas, ansiedades, alegrias e me apoiaram, ao longo destes dois anos.

Por fim, os últimos são os primeiros, aos meus pais, ao Miguel, aos meus avós e ao meu tio pelo constante apoio, amor e carinho dado durante esta fase. Se cheguei aqui a vós o devo.

(4)

Resumo

Este trabalho teve como objectivo a avaliação da capacidade antioxidante e a quantificação da composição electroactiva em doze espécies de cogumelos silvestres comestíveis provenientes da região de Trás-os-Montes, através de técnicas electroquímicas. As diferentes amostras de cogumelos, sofreram um processo de extracção com metanol, analisando-se posteriormente o extracto por voltametria cíclica e por voltametria de impulso diferencial.

Numa primeira fase do trabalho procedeu-se à optimização das condições experimentais a utilizar nos estudos voltamétricos: solução MeOH/tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), sistema de três eléctrodos constituído por um eléctrodo de referência de Ag/AgCl saturado com KCl 3 mol dm^-3, eléctrodo auxiliar de platina e eléctrodo de trabalho de carbono vítreo; como electrólito de suporte seleccionou-se uma solução de perclorato de sódio a 0,1 mol dm^-3. Os voltamogramas foram traçados num intervalo de potencial de 0 V a um máximo de 1,8 V.

A voltametria cíclica permitiu a avaliação do perfil redox dos extractos metanólicos de cogumelos, enquanto que a voltametria de impulso diferencial permitiu a quantificação das espécies electroactivas totais existentes nos diferentes extractos metanólicos de cogumelos. Ambas as técnicas permitiram verificar a existência de uma onda anódica irreversível a 0,9 V comum a todos os extractos. Atendendo aos valores de Ep/2, verificou-se que o extracto com maior poder redutor foi o de Sarcodon imbricatus seguido do Macrolepiota procera> Leucopaxillus giganteus> Agaricus silvaticus = Coprinus comatus = Lactarius deliciosus.

No estudo de diferentes espécies do mesmo género, verificou-se que para os Agaricus, os extractos de Agaricus silvaticus e Agaricus silvicola são os que apresentam maior capacidade antioxidante, enquanto que o maior poder redutor foi apresentado pelo Agaricus arvensis. Em relação aos Macrolepiota, o maior poder redutor é apresentado pelo procera, enquanto que a maior capacidade antioxidante corresponde ao mastoideia.

Nos Lactarius, tanto o deliciosus como o piperatus, nas diferentes fases de maturação, apresentam somente a onda comum a 0,9 V, embora o Lactarius deliciosus apresenta uma maior densidade de corrente, logo maior capacidade antioxidante.

A avaliação da existência de outros processos de oxidação correspondentes a

(5)

imbricatus, Macrolepiota procera e Leucopaxillus giganteus surgem ondas de oxidação adicionais, a potenciais menos positivos, que foram atribuídos a existência de flavonóides.

A quantificação de espécies electroactivas foi obtida em termos de equivalentes de ácido gálico e ácido ascórbico. Verificou-se que os extractos Agaricus silvaticus, Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus são os que apresentam maiores destas espécies, seguidos dos Macrolepiota mastoidea~Agaricus arvensis>

Agaricus romagnesii> Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus giganteus~Lactarius deliciosus> Lactarius piperatus.

Foi também optimizado um método de quantificação de tocoferóis por DPV; no entanto, não foi possível detectar estas espécies antioxidantes nos extractos de cogumelos utilizados.

(6)

Abstract

The aim of this work was the evaluation of the antioxidant capacity and the quantification of the electroactive composition in twelve species of edible wild mushrooms from the region of Trás-os-Montes, through electrochemical techniques.

The different samples of mushrooms were extracted with methanol, analyzing later the extract by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry.

In the first stage the experimental conditions used in the voltammetric studies were optimized: MeOH / acetate buffer 0.1 mol dm^-3 (pH 4) / NaClO4 (70:28:2) solutions, a three-electrode cell incorporating Ag/AgCl (3 mol dm^-3 KCl) as the reference electrode, a Pt foil as counter electrode and a platinum or glassy carbon disk as working electrode; sodium perchlorate 0.1 mol dm^-3 was used as supporting electrolyte. The voltammograms were acquired between 0 V and 1.8 V.

The cyclic voltammetry allowed the evaluation of the redox profile of the methanolic extracts of mushrooms, while the differential pulse voltammetry, allowed the quantification of total electroactive species present in the different methanolic extracts of mushrooms. Both techniques showed the existence of an irreversible anodic wave at 0.9 V, similar to all extracts. Based on the values of Ep / 2, it was found that the extract with higher reducing power was Sarcodon imbricatus followed by Macrolepiota procera> Leucopaxillus giganteus> = Agaricus silvaticus = Coprinus comatus = Lactarius deliciosus.

In the study of different species of the same gender, for Agaricus it was found that the extracts of Agaricus silvaticus and Agaricus silvicola are those with higher antioxidant capacity, while Agaricus arvensis present higher reducing power. For Macrolepiota the higher reducing power is shown in procera, while highest antioxidant capacity corresponds to mastoideia. In Lactarius, both deliciosus and piperatus, in different stages of maturation, have only a common wave at 0.9 V, although the Lactarius deliciosus presents a greater current density, therefore greater antioxidant capacity.

The evaluation of oxidation processes due to flavonoids present in extracts, carried at pH 7, revealed that in Sarcodon imbricatus, Macrolepiota procera and Leucopaxillus giganteus, at less positive potentials, there are additional oxidation waves, which

(7)

The quantification of electroactive species was obtained in terms of the equivalent of gallic and ascorbic acids. It was found that the extracts of Agaricus silvaticus, Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus are those with higher content, followed by Macrolepiota mastoidea ~ Agaricus arvensis> Agaricus romagnesii>

Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus giganteus ~ Lactarius deliciosus> Lactarius piperatus.

Finally, the presence of tocopherols in the extracts was evaluated using DPV, however, under the experimental conditions it was not possible to detect these antioxidants species in the analysed mushrooms extracts.

(8)

Résumé

Ce travail a comme objectif l’évaluation de la capacité antioxydante et la quantification de la composition électroactive sur douze espèces de champignons champêtres comestibles qui proviennent de la région de Trás-os-Montes, à travers des techniques électrochimiques. Les différents exemplaires de champignons ont subi un processus d’extraction avec du méthanol, s’étant postérieurement analysé l’extrait par voltamètre cyclique et para voltamètre d’impulsion différentiel.

Dans une première étape du travail, nous avons procédé à une optimisation des conditions expérimentales a utiliser dans les études voltamétriques: solution MeOH/tampon acétate 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), système de trois électrodes constitués par un électrode de référence de Ag/AgCl saturé avec KCl 3 mol dm^-3, électrode auxiliaire de platine et électrode de travail de carbone vitré; comme électrolyte de support nous avons sélectionné une solution de perchlorate de sodium a 0,1 mol dm^-3. Les voltamogrames ont été tracé dans un intervalle de potentiel de 0 V à un maximum de 1,8 V.

La voltamètrie cyclique a permis l’évaluation du profil du redox des extraits méthanoïques des champignons, alors que la voltamètrie d’impulsion différentiel a permis la quantification des espèces électroactives totales existantes dans les différents extraits méthanoïques des champignons. Les deux techniques ont permis de vérifier l’existence d’une onde anodique irréversible a 0,9 V commun a tout les extraits. Si nous observons les valeurs de Ep/2, nous pouvons vérifier que l’extrait avec la plus grande force réductrice a été le Sarcodon imbricatus suivi du Macrolepiota procera>

Leucopaxillus giganteus> Agaricus silvaticus = Coprinus comatus = Lactarius deliciosus.

Dans l’étude de différentes espèces du même genre, nous avons vérifié que pour les Agaricus, les extraits de Agaricus silvaticus et de Agaricus silvicola sont ceux qui représentent la plus grande capacité antioxydante, alors que la plus grande force réductrice a été présentée par le Agaricus arvensis. En ce qui concerne les Macrolepiota, la plus grande force réductrice a été présentée par le procera, alors que la plus grande capacité antioxydante correspond au mastoideia. Dans les Lactarius, aussi bien le deliciosus que le piperatus, dans les différentes phases de maturation,

(9)

représente une plus grande densité de courrant, donc une plus grande capacité antioxydante.

L’évaluation de la présence d’autres processus d’oxydation correspondants a des flavonoïdes présents dans les extraits, réalisé pH 7, a démontré que dans le Sarcodon imbricatus, Macrolepiota procera e Leucopaxillus giganteus ont surgi des vagues d’oxydation additionnelle, à des potentiels moins positifs, qui ont été attribués à la présence de flavonoïdes.

La quantification des espèces électroactives a été obtenue avec des équivalents d’acide gallique et d’acide ascorbique. Nous avons vérifié que les extraits d’Agaricus silvaticus, Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus sont ceux qui représentent les plus grandes valeurs de ces espèces, suivies des Macrolepiota mastoidea~Agaricus arvensis> Agaricus romagnesii> Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus giganteus~Lactarius deliciosus> Lactarius piperatus.

Nous avons aussi optimisé une méthode de quantification de tocoferoïdes par DPV; néanmoins, il nous a été impossible de détecter ces espèces antioxydantes dans les extraits de champignons utilisés.

(10)

Índice geral

Agradecimentos ii

Resumo iii

Abstract v

Résumé vii

Índice geral ix

Índice de figuras xi

Índice de tabelas xiv

Lista de abreviaturas e símbolos xv

Capítulo I – Introdução 1

1.1 – Cogumelos 2

1.1.1 – Valor nutricional e medicinal dos cogumelos 4

1.3 – Processos de stress oxidativo 6

1.3 – Compostos fenólicos 8

1.3.1 – Propriedades electroquímicas de compostos fenólicos 10 1.3.2 – Metodologias de avaliação da capacidade antioxidante 12 1.3.3 – Avaliação da capacidade antioxidante por técnicas electroquímicas 13

Capítulo II – Descrição das técnicas usadas 15

2.1 – Técnicas voltamétricas 16

2.1.1 – Voltametria cíclica 16

2.1.1.1 – Sistemas reversíveis 18

2.1.1.2 – Sistemas irreversíveis 19

2.1.2 – Voltametria de impulso diferencial 21

Capítulo III – Execução experimental 24

3.1 – Solventes e reagentes 25

3.2 – Instrumentação 26

3.2.1 – Instrumentação geral 26

3.2.2 – Electroquímica 26

3.3 – Procedimento 27

3.3.1 – Acondicionamento do eléctrodo 27

3.3.2 – Preparação dos extractos metanólicos 27

3.3.2.1 – Amostragem 27

3.3.2.2 – Extracção dos cogumelos 29

3.3.3 – Avaliação e quantificação da capacidade antioxidante 29 3.3.4 – Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos 30

Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão 31

4.1 – Optimização das condições experimentais 32

4.1.1 – Eléctrodo de trabalho 32

4.1.2 – Solução tampão 33

4.1.3 – Condições electroquímicas 35

4.2 – Caracterização electroquímica por voltametria cíclica 37 4.2.1 – Comportamento electroquímico das substâncias padrão 38

4.2.2 – Extractos de cogumelos 39

4.2.2.1 – Agaricus 42

4.2.2.2 – Macrolepiotas 43

4.2.2.3 – Lactarius 44

4.2.3 – Estudo a pH 7 46

4.3 – Avaliação da capacidade antioxidante por voltametria de impulso diferencial 48

4.3.1 – Substâncias padrão 48

4.3.2 – Estudo do efeito da concentração da amostra 49

(11)

4.3.3.3 – Lactarius 53

4.3.4 – Estudo a pH 7 56

4.4 – Quantificação dos antioxidantes totais presentes nos extractos de cogumelos 58

4.5 – Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos 62

4.5.1 – Substâncias padrão 62

Capítulo 5 – Conclusões e perspectivas futuras 66

5.1 – Conclusões 67

5.2 – Perspectivas futuras 69

Bibliografia 70

(12)

Índice de figuras

Figura 1.1 Constituição do cogumelo.^[3]

Figura 1.2 Estrutura de um Basidiomycota.^[1]

Figura 1.3 Esquema da formação de espécies reactivas de oxigénio.^[32]

Figura 1.4 Estruturas químicas para os ácidos fenólicos derivados do: (a) - ácido cinâmico e (b) - ácido benzóico.

Figura 1.5 Estrutura base para os flavonóides.

Figura 1.6 Esquema reaccional da oxidação de compostos fenólicos, na presença de radicais livres, com a formação do radical fenoxilo.

Figura 2.1 Variação do potencial aplicado com o tempo, em voltametria cíclica.

Figura 2.2 Voltamograma típico para um processo reversível O + ne^–→ R.^[74]

Figura 2.3 Voltamograma cíclico para um sistema irreversível.^[75]

Figura 2.4 Voltamogramas cíclicos de um sistema reversível (___) e quasi-reversível (- - -).^[75]

Figura 2.5 Voltametria de impulso diferencial: (a) - esquema de aplicação de potenciais; (b) - Perfil de um voltamograma.^[74,75]

Figura 3.1 Montagem experimental.

Figura 3.2 Cogumelos estudados neste trabalho: (a) Agaricus silvicola; (b) Agaricus silvaticus; (c) Agaricus romagnesii; (d) Agaricus bisporus; (e) Agaricus arvensis; (f) Coprinus comatus;

(g) Leucopaxillus giganteus; (h) Lactarius deliciosus; (i) Lactarius piperatus; (j) Macrolepiota procera; (k) Sarcodom imbricatus; (l) Macrolepiota mastoidea.

Figura 4.1 Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1mmol dm^-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s^-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.2 Voltamograma relativo a um extracto metanólico de Agaricus arvensis 10 mg cm^-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s^-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.3 Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1 mmol dm^-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm^-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm^-3 (10:2), (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm^-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm^-3). (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s^-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.4 Voltamograma obtido por DPV de uma solução do extracto de Leucopaxillus giganteus 1 mg cm^-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm^-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm^-3 (10:2), (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) / NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V, (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm^-3 Na2

HPO4/ 35% 50 mmol dm^-3).

Figura 4.5 Voltamogramas cíclicos consecutivos, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 V s^-1. (a) ácido ascórbico 1 mmol dm^-3; (b) extracto de Agaricus arvensis a 10 mg cm^-3.

Figura 4.6 Voltamograma cíclico do extracto metanólico de Leucopaxillus giganteus 1mg cm^-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 V s^-1, (i) eléctrodo após acondicionamento/limpeza e (ii) eléctrodo sem acondicionamento/limpeza.

Figura 4.7 Voltamograma por DPV de uma solução de ácido ascórbico 1 mmol dm^-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com uma amplitude de impulso de (i) 0,05 V, (ii) 0,06 V e de (iii) 0,07 V.

Figura 4.8 Estrutura química do (a) ácido ascórbico, (b) ácido gálico e (c) rutina

Figura 4.9 Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3(pH 4) /NaClO4

(70:28:2), com ν = 0,1 V s^-1. (a) ácido ascórbico 0,5 mmol dm^-3; (b) ácido gálico 0,5 mmol dm^-3.

Figura 4.10 Voltamograma cíclico da rutina a 0,5 mmol dm^-3, ν = 0,1V s^-1, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3(pH 4) /NaClO4 (70:28:2), até (i) 0,6 V e (ii) 1,2 V.

(13)

V s^-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus (fase III).

Figura 4.12 Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm^-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 Vs^-1: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. romagnesii; (v) A. arvensis.

Figura 4.13 Voltamograma cíclico relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm^-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s^-1.

Figura 4.14 Voltamograma cíclico para os extractos de (i) L. deliciosus, fase III e (ii) L. piperatus, fase III, com uma concentração de 10 mg/cm^-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s^-1.

Figura 4.15 Voltamograma cíclico para os extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm^-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 Vs^-1.

Figura 4.16 Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s^-1. (a) ácido gálico, 1 mmol dm^-3; (b) rutina, 0,5 mmol dm^-3.

Figura 4.17 Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm^-3, em (i) tampão pH 7 e (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s^-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus.

Figura 4.18 DPV dos padrões a 0,5 mmol dm^-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3(pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. (a) ácido ascórbico; (b) ácido gálico; (c) rutina.

Figura 4.19 Representação gráfica da densidade de corrente em função da concentração de extracto de Agaricus silvaticus, para um Ep=0,9 V.A voltametria de impulso diferencial foi realizada com ν=0,03 vs^-1 e uma amplitude de modulação de 006 V.

Figura 4.20 DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm^-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus.

Figura 4.21 DPV dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm^-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. arvensis; (v) A. romagnesii.

Figura 4.22 DPV relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm^-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.23 DPV relativo aos extractos de (i) Lactarius deliciosus e (ii) Lactarius piperatus, na fase de maturação III, com uma concentração de 10 mg cm^-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.24 DPV relativo aos extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm^-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.25 DPV relativo aos extractos Lactarius piperatus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm^-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s^-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.26 DPV dos padrões a 0,5 mmol dm^-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3/NaClO4

(70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4. (a) ácido gálico; (b) rutina. ν = 0,03 V s^-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.27 DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm^-3, em tampão (i) pH 7 e (ii) pH 4: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus. ν

= 0,03 V s^-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.28 DPV para o ácido gálico em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3(pH 4) /NaClO4

(70:28:2), a várias concentrações: (i) 0,20 mg cm^-3; (ii) 0,15 mg cm^-3; (iii) 0,1 mg cm^-3 (iv) 0,05 mg cm^-3; (v) 0,02 mg cm^-3. ν = 0,03 V s^-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

(14)

Figura 4.29 DPV do extracto S. imbricatus em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm^-3 (pH 4) /NaClO4

(70:28:2) a várias concentrações: (i) 15 mg cm^-3; (ii) 10 mg cm^-3; (iii) 5 mg cm^-3; (iv) 1 mg cm^-3; (v) 0,5 mg cm^-3. ν = 0,03 V s^-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.30 Variação da densidade de corrente em função da concentração, de 0,002 a 0,2 mg cm^-3 obtida por DPV para o (a) e ácido gálico (b). ν = 0,03 V s^-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.31 Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos, por voltametria de impulso diferencial. (a) A. silvicola, (b) A. bisporus, (c) A. silvaticus, (d) A. arvensis, (e) A. romagnesii, (f) C. comatus, (g) M. mastoidea, (h) M. procera, (i) S.

imbricatus, (j) L. giganteus, (k) L. deliciosus, (l) L. piperatus. ν = 0,03 V s^-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.32 Estruturas químicas dos diferentes tocoferóis.

Figura 4.33 Voltamograma cíclico dos padrões numa solução contendo 0,2 cm^-3 de H2SO4 0,1 mol dm^-3, 1,2 cm^-3 de TBAP 0,06 mol dm^-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal

= 10 cm^-3), com concentração de 0,01 mg cm^-3. ν = 0,1V s^-1.

Figura 4.34 DPV para diferentes concentrações de padrões, solução contendo 0,2 cm^-3 de H2SO4 0,1 mol dm^-3, 1,2 cm^-3 de TBAP 0,06 mol dm^-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm^-3) . (i) 0,02 mg cm^-3 (ii) 0,01 mg cm^-3 (iii) 0,004 mg cm^-3. ν = 0,03 V s^-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

Figura 4.35 Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos para os padrões. (i) α-tocoferol; (ii) β- e γ-tocoferol; (iii) δ-tocoferol.

Figura 4.36 DPV dos diferentes extractos de Agaricus, com uma concentração de 10 mg cm^-3, numa solução contendo 0,2 cm³ de H2SO4 0,1 mol dm^-3, 1,2 cm³ de TBAP 0,06 mol dm^-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm³), s. (a) A. silvicola; (b) A.

silvaticus; (c) A. romagnesii; (d) A. arvensis; (e) A. bisporus. ν = 0,03 V s^-1, amplitude de modulação de 0,06 V.

(15)

Índice de tabelas

Tabela 4.1 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos numa concentração de 5 mg cm^-3.

Tabela 4.2 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos de Agaricus com uma concentração de 10 mg cm^-3.

Tabela 4.3 Valores de Ep/2 para os Lactarius em diferentes fases de maturação, com uma concentração de 10 mg cm^-3.

Tabela 4.4 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm^-3. Tabela 4.5 Valores de Ep para os diferentes extractos com uma concentração de 5 mg cm^-3.

Tabela 4.6 Valores de Ep para os extractos de Lactarius nas diferentes fases de maturação, com uma concentração de 10 mg cm^-3.

Tabela 4.7 Valores de Ep para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm^-3. Tabela 4.8 Resultados obtidos para os diferentes extractos por voltametria de impulso diferencial.

(16)

Abreviaturas e símbolos

AA Ácido ascórbico

AAPH Diidrocloreto de 2,2^’-azobis (2-amino propano) ABTS Ácido 2’-azino-bis(3- etilbenzotiazoline-6-sulfónico

AG Ácido gálico

AMNV 2,2^’-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo)

DAD Detector diode-array

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo DPV Voltametria de impulso diferencial

C.A. Capacidade antioxidante

CV Voltametria cíclica

ECD Detector electroquímico

ESR Ressonância de spin electrónico EtOH Etanol

GC-FID Cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização de chama HPLC Cromatografia líquida de alta pressão

LC-MS Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa MeOH Metanol

MS-MS Espectrometria de massa acoplada a espectrometria de massa ORAC Capacidade de absorção do oxigénio radicalar

PS Perclorato de sódio mono-hidratado RMN Ressonância magnética nuclear

rpm Rotações por ,minuto

TBAP Perclorato de tetrabutilamónio

UV-Vis Ultravioleta-visível

A Área do eléctrodo

α Coeficiente de transferência C Concentração

D Coeficiente de difusão

∆Ep

Eº Potencial formal

Ep/2 Potencial de onda a meia altura E1/2 Potencial de meia onda

Ep Potencial de onda

Epa Potencial de onda anódico Epc Potencial de onda catódico

F Constante de Faraday

kº Constante de velocidade padrão heterogénea ip Intensidade de corrente de pico

ipa Intensidade de pico anódico ipc Intensidade de pico catódico

j Densidade de corrente

n número de electrões

na número de electrões envolvidos no processo de transferência electrónica T Temperatura

ν Velocidade de varrimento

W1/2 Largura do pico a meia-altura

(17)

Capítulo I

Introdução

(18)

Neste capítulo apresenta-se a descrição das características dos cogumelos, no que se refere aos aspectos constitucionais, nutricionais e as suas propriedades medicinais, como o seu valor nutricional e medicinal, já que são uma fonte alimentar rica em antioxidantes, moléculas bloqueadoras de radicais livres.

Os organismos estão expostos a vários tipos de ameaças, entre elas o stress oxidativo, causador de um conjunto variado de patologias. Considerando os cogumelos como uma fonte de compostos com propriedades farmacológicas com potencialidades para a prevenção destas ameaças, efectua-se uma caracterização sucinta dos processos de stress oxidativo, da importância dos compostos fenólicos na sua prevenção e descrevem-se os métodos analíticos utilizados para a avaliação destes compostos em matrizes alimentares.

1.1 – Cogumelos

Das 75 000 espécies classificadas como fungos, os cogumelos são os mais conhecidos, constituindo um grupo de organismos bastante importante que durante muito tempo foi considerado como plantas, mas que devido ás suas características tão peculiares constituem agora um reino próprio – Reino Fungi.

Os fungos apresentam um conjunto de características próprias que permitem sua diferenciação das plantas: não sintetizam clorofila, não possuem celulose na sua parede celular, sendo esta constituída, na maioria das vezes, por quitina (polímero da N-acetil-D-glicosamina) e também não armazenam amido como substância de reserva, mas sim glicogénio.^[1,2]São seres heterotróficos, obtendo o seu alimento por absorção.

Alguns, os saprófitas, produzem enzimas que hidrolisam a matéria orgânica morta que os rodeia. Porém, podem também ser parasitas recebendo o alimento do corpo dos hospedeiros, prejudicando-os, ou em simbiose com benefício para ambos.

Com excepção de algumas formas unicelulares, como as leveduras, os fungos são constituídos por uma rede de filamentos ramificados chamados hifas, Figura 1.1.

Estas contêm citoplasma e núcleos, e podem apresentar diferentes formas. As hifas, iniciam-se como formações tubulares a partir de esporos, ramificando-se repetidamente. Constituem assim uma rede mais ou menos densa que forma o micélio.

O crescimento total do micélio pode exceder um quilómetro por dia e ficar organizado

(19)

Figura 1.1 – Constituição do cogumelo, retirado de [1].

A reprodução dos fungos é variada e por vezes complexa, envolvendo processos sexuados e assexuados (por gemiparidade ou por formação de vários esporos). O tipo de reprodução que apresentam é utilizado na sua classificação, considerando-se quatro divisões: Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota.

Os cogumelos são frutificações de alguns fungos e pertencem à divisão Basidiomycota. São em grande parte saprófitas existindo também alguns parasitas. A constituição de um cogumelo encontra-se representada na Figura 1.1 e 1.2.

Figura 1.2 – Estrutura de um Basidiomycota, retirado de [3].

(20)

A parte visível do fungo é constituída por um conjunto compacto de hifas que formam uma estrutura reprodutora complexa, denominada basidiocarpo. Nas lâminas radiais existentes na face interior do chapéu, formam-se hifas especializadas chamadas basídios que originam esporos sexuados designados basidiósporos, Figura 1.2. A parte subterrânea do micélio não visível, é constituída por hifas septadas, monocarióticas e é a partir dela que se forma a região aérea, na altura da reprodução. Uma vez maduros estes esporos, caem ao solo e germinam produzindo hifas que darão origem aos micélios primários. Estas hifas têm sexos diferentes (+, -). Quando se encontram duas hifas compatíveis juntam-se célula a célula e dão lugar aos micélios secundários (com células binucleadas). Estes micélios são os que irão produzir novos cogumelos.^[1,2]

1.1.1 - Valor nutricional e medicinal dos cogumelos

Os cogumelos estão presentes em áreas tão diversas como a alimentação, a medicina, na obtenção de alguns medicamentos (o Leucopaxillus giganteus é usado na indústria farmacêutica para extracção do antibiótico clitocibina^[4]), na luta biológica de pragas (Cordyceps militaris contra a processionária do pinheiro^[2]) e até no artesanato e ornamentação.

Existem mais de 45 mil espécies descritas de cogumelos, com cerca de duas mil conhecidas como comestíveis, mas apenas 25 são cultivadas e aceites como alimento, e somente 10 têm-se tornado populares entre os países consumidores destes fungos.^[1]

Na alimentação, apresentam um valor gastronómico elevado já que possuem um sabor, aroma e textura inegualáveis. Desde os tempos antigos que os cogumelos são consumidos por humanos, fazendo parte da sua dieta alimentar.^[2,5-9]

São um alimento de alto valor nutritivo, com uma quantidade de proteínas quase equivalente à carne, ovos, leite e acima de alguns vegetais e frutas (19-35% em seco, incluindo todos os aminoácidos essenciais),^[9,10,] apresentando um teor de 80 a 90 % de água relativamente ao peso total.^[2] Contêm vitaminas como a tiamina, riboflavina, ácido ascórbico, vitamina D2, uma percentagem elevada de minerais (cálcio, iodo, fósforo) e também valores apreciáveis de fibras.^[5,7-9,11]

Alguns estudos recentes^[12] indicam que os cogumelos silvestres do nordeste de

(21)

com baixo teor de gorduras, encontrando-se em maior quantidade os ácidos gordos insaturados, como os ácidos oleico e linoleico. Este aspecto faz deste alimento um excelente componente para uma dieta alimentar pobre em calorias, já que uma porção de 100g de cogumelo contém aproximadamente 28 Kcal (118KJ).

Ao longo da história da humanidade, os primeiros efeitos da acção dos cogumelos na saúde humana foram as intoxicações, como os casos do ergotismo na idade média e alucinogénios em rituais religiosos. Só mais tarde, no séc. XIX e XX se descobriu uma acção benéfica para o ser humano.^[2,13]

Hoje em dia os cogumelos são um alimento terapêutico útil na prevenção de várias doenças, servindo como fonte para o desenvolvimento de fármacos e nutricêuticos (alimentos com propriedades farmacêuticas).^[14] Na literatura está descrito a actividade de cogumelos em várias terapêuticas anti-tumorais, anti- microbianas, anti-víricas, anti-alérgicas, anti-inflamatórias, tratamentos hematológicos e imunomoduladores, em tratamento de diabetes, hipertensão e hipercolestrolemia.^[2,15,16]Em alguns países, como a China, o Japão, os EUA e o Canadá, os cogumelos são utilizados no tratamento de casos de cancro gastrointestinais, dos pulmões e da mama.^[17,18] A importância do cogumelo chinês Shiitake (Lentinus edodes), é bem conhecida,^[16,19] além de possuir compostos com actividade anti-tumoral, é utilizado para preparar antibióticos e anti-víricos.

Estas propriedades a nível medicinal, estão associadas com a sua composição química rica em 1,3-β-D-glucanas, ergosterol, lecitina, crestina, importantes na resposta imunitária e hematológica no cancro, em quitina, um polissacárido existente nas paredes celulares, o quitosano, derivado di-acetilado, responsáveis pela diminuição do colesterol fisiológico.^[13,20] São, também uma importante fonte de compostos bioactivos com valor medicinal, apresentando uma grande variedade de metabolitos secundários, tais como compostos fenólicos, policetídeos, terpenos e esteróides, reconhecidos como excelentes antioxidantes, destacando-se os compostos fenólicos, que se apresentam em maior quantidade.^[21,22]

Entre estes compostos com propriedades antioxidantes foi identificado e quantificado, em vários géneros de cogumelos comestíveis, a ergotionina (2-mercapto- N^α-trimetil-L-histidina),^[23] que é um bloqueador de radicais livres não enzimático, com capacidade de proteger as células do stress oxidativo. A biosíntese deste composto efectua-se exclusivamente nos fungos e micobactérias, sendo capturado

(22)

pelas plantas através das raízes e chegando às nossas células através da cadeia alimentar.^[24]

Estudos recentes[9,25,26,27] descrevem, por técnicas cromatográficas, a presença de nove ácidos orgânicos, em maior quantidade, os ácidos cítrico, cetoglucárico, málico, succínico, fumárico e os ácidos oxálico, ascórbico, quínico e ácido xiquímico, em menores proporções. Adicionalmente, também foram identificados ácidos fenólicos como os ácido cafeoilquinico, nas posições 3-, 4- e 5-, cafeíco, p-cumárico, p- hidroxibenzóico, rutina e quercetina. Estes compostos além de influenciarem as propriedades organolépticas, também apresentam uma importante actividade biológica, como se verifica pelos resultados obtidos sobre a capacidade antioxidante dos cogumelos, que mostraram a existência de uma correlação entre a actividade e o conteúdo em polifenóis: maior actividade antioxidante indica maior quantidade de fenóis totais. [4,14,15,17,21,22,28,29]

1.2. – Processos de stress oxidativo

As células vivas estão continuamente expostas a uma grande variedade de ameaças, como o stress oxidativo que é causado por um número de factores internos e externos, como os processos fisiológicos de respiração mitocondrial ou a exposição a poluentes e radiação ionizante. O stress oxidativo surge nos sistemas biológicos como resultado de exposição significativa a oxidantes, da diminuição da capacidade antioxidante do sistema ou de ambos. Está muitas vezes associado com a formação de espécies reactivas de oxigénio, incluindo os radicais livres, implicados nas patofisiologias das doenças.^[30]

O oxigénio, é um componente vital para a sobrevivência da espécie humana, estando presente na atmosfera, no estado fundamental e na forma de um biradical tripleto, ³O2. Após a entrada no corpo humano, pode ser transformado através de um processo de redução envolvendo 4 electrões, formando-se água, Figura 1.3. Desta transformação resulta a formação de espécies reactivas de oxigénio, como o radical superóxido (O2.-), o radical hidroxilo (OH^.), o peróxido de hidrogénio (H2O2) e outras espécies reactivas. Alguns componentes celulares, entre os quais, as proteínas, enzimas, DNA e RNA, reagem prontamente com estas espécies reactivas de oxigénio.^[31]

(23)

O₂ O

HO₂ H

HO₂

H₂O₂

HO

H H

H₂O

3O₂ e

hν

1O₂

e

O₂²

e e

Figura 1.3 – Esquema da formação de espécies reactivas de oxigénio.^[31]

A oxidação dos lípidos existentes nas membranas celulares é um processo muito frequente no corpo humano. Esta reacção é iniciada rapidamente pelo excesso de espécies reactivas de oxigénio, em particular os radicais hidroxilos, através de um mecanismo radicalar em cadeia, formando-se compostos tóxicos como os peróxidos lipídicos, o malonaldéido, monohidiroxperóxidos ou 4-hidroxinonenal.^[32] Tanto as espécies envolvidas como as formadas estão relacionadas em muitos causas de doenças, incluindo o cancro e o envelhecimento.

A peroxidação lipídica, além de causar sérios danos no corpo humano, é a principal causa da deterioração dos alimentos afectando a cor, aroma (formação de moléculas nocivas à saúde, voláteis e não voláteis), textura e valor nutricional.^[32]

A natureza equipou os organismos contra os danos provocados pelos radicais livres com vários mecanismos de defesa que actuam de diferentes formas. Os antioxidantes são moléculas naturais que previnem a formação descontrolada de radicais livres e espécies reactivas de oxigénio ou que inibem a sua reacção com as estruturas biológicas, interrompendo a reacção em cadeia e formando radicais com baixa reactividade que são facilmente removidos do organismo.

Podem ser classificados em dois grandes grupos: as enzimas antioxidantes e os antioxidantes de baixo peso molecular, aos quais pertencem uma grande variedade de compostos.^[33]As enzimas são em menor número e incluem a superóxido dismutase, a catalase e a peroxidase. O grupo dos compostos com baixo peso molecular é vasto,^[30,34]

actuando directamente como bloqueadores neutralizando as espécies reactivas de oxigénio, ou indirectamente, como agentes quelantes de metais de transição.^[30,35] Nos tecidos humanos, estes compostos, têm origens diferentes, por exemplo, a glutationa, a nicotinamida adenina dinucleótido (na forma reduzida) e a carnosina são sintetizadas

(24)

pelas células. O ácido úrico e a bilirubina são produtos do metabolismo celular, enquanto que o ácido ascórbico, α-tocoferol, β-caroteno e outros carotenóides, como o licopeno e compostos fenólicos, são obtidos da alimentação.^[31,36,37] Todavia, em certas situações, como a toma de alguns fármacos ou radiação UV, ocorre uma maior formação de espécies reactivas de oxigénio, excedendo as capacidades normais de defesa do organismo, o que provoca danos nos tecidos.

As plantas constituem a maior fonte de antioxidantes para o homem. A uma dieta alimentar saudável, rica em fruta e vegetais está associada a uma menor incidência de mortes por cancro, doenças do coração, aterosclerose, doenças degenerativas e envelhecimento.^[30,31]

1.3 – Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são um grupo extenso e complexo de fitoquímicos e são encontrados em grandes quantidades nos vegetais e plantas. Além das suas propriedades antioxidantes, a sua presença contribui para a parte sensorial dos alimentos, como a cor, o sabor e o aroma.^[38]

De uma maneira geral, o termo “antioxidante” é usado para classificar moléculas que estão presentes em baixas quantidades relativamente ao substrato que é oxidável, que reagem rapidamente de maneira a suprimir ou a prevenir a sua oxidação.^[39]

Recentemente, devido ás restrições colocadas ao uso de antioxidantes sintéticos como o BHA (2- e 3-terc-butil-4-metoxifenol) e o BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol), cresceu o interesse por antioxidantes de origem natural. Muitas indústrias cosméticas, farmacêuticas e alimentares usam-nos na formulação dos seus produtos, porque além de possuírem valor medicinal, previnem o envelhecimento e degradação dos produtos.^[40-42]

Este conjunto de compostos tem na sua constituição básica um ou mais anéis benzénicos hidroxilados e as suas propriedades redox estão relacionadas com as suas características estruturais: o número e posições dos grupos hidroxilo e metoxilo no anel, a extensão da conjugação estrutural, a presença de grupos dadores ou aceitadores de densidade electrónica no anel aromático, que lhe conferem características antioxidantes.

Nas reacções em que estão envolvidos como antioxidantes actuam como dadores de densidade electrónica em meios aquosos e dadores de protões em meios não polares,

(25)

como no caso da peroxidação lipídica, na qual se vão ligar aos radicais alquilperoxilo (ROO^•), formando um radical estabilizado pela ressonância do anel aromático.^[32,43]

Os dois grupos principais que constituem os compostos fenólicos são os ácidos fenólicos e os flavonóides. Os ácidos fenólicos dividem-se em derivados do ácido benzóico (ex.: ácido gálico) e derivados do ácido cinâmico (ex.: ácido cafeico, ácido clorogénico), Figura 1.4.^[44,45] Os ácidos fenólicos encontram-se frequentemente esterificados, muitas das vezes com o ácido quínico, por exemplo o ácido caféico vai dar origem ao ácido clorogénico. Também se podem esterificar com outros componentes como os ácidos xiquímico, málico, tartárico, entre outros. Além de esterificados podem encontrar-se também na forma glicosídica.^[32,46]

HO R

CH CHCOOH HO R

R

COOH

(a) (b)

Figura 1.4 – Estruturas químicas para os ácidos fenólicos derivados do: (a) - ácido cinâmico e (b) - ácido benzóico.

A actividade antioxidante dos ácidos fenólicos e dos seus ésteres depende do número de grupos hidroxilo existentes na molécula. A presença do grupo carboxilato, um aceitador de densidade electrónica por efeito mesomérico, confere aos derivados hidroxilados do ácido benzóico uma menor tendência para se comportarem como dadores de protões, comparativamente aos derivados hidroxilados do ácido cinâmico.^[36]

Os flavonóides englobam uma classe muito importante de compostos encontrados com grande frequência na natureza, unicamente em vegetais, que além de possuírem propriedades antioxidantes são considerados pigmentos. Todos os flavonóides possuem uma estrutura base C6-C3-C6, em que dois dos anéis da molécula são anéis aromáticos.^[44,47] Estes compostos possuem como estrutura base a flavona, Figura 1.5, ou uma forma hidrogenada dessa estrutura.

(26)

O

1 2

3 5 4

6

7 8

2' 3' 4' 5'

A B

C

Figura 1.5 – Estrutura base para os flavonóides.

Podem ser agrupados em vários grupos como: flavonas (ex.: luteolina), flavonóis (ex.: quercetina), flavanonas (ex.: naringina) e isoflavonas. Os flavonóis são um grupo abundante e ocorrem geralmente esterificados com glicosídeos e/ou glicurónidos.

Normalmente, o glicosídeo encontra-se na posição 3, podendo também surgir na posição 7. A glicose é o glicosídeo mais comum, mas também ocorrem a rutinose, galactose, arabinose ou a xilose. A rutina (quercetina-3-o -rutinose) é um dos flavonóides mais bioactivos, também conhecida por vitamina P, e já descrito como um factor activador para a vitamina C.^[48]

1.3.1 - Propriedades electroquímicas de compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são electroactivos, facilmente sujeitos a reacções de transferência electrónica de oxidação e redução, podendo assim ser estudados por métodos electroquímicos. Estes compostos têm em comum um ou mais grupos hidroxilo ligados a um anel benzénico ou a uma estrutura cíclica.

A reacção inicial apresenta-se, muitas vezes, da seguinte forma:

R O + 2 H⁺+ 2e^- (eq.1)

onde R é o antioxidante (redutor) e o O é o produto formado, que também pode ser oxidante se o processo for reversível. Os grupos hidroxilo são oxidados pela transferência de 2 electrões levando à formação, depois da libertação de 2H⁺, da correspondente quinona. Está comprovado que, devido a efeitos de estabilização do anel, quanto maior for o número de substituintes hidroxilo no anel aromático, menor

(27)

De uma maneira geral, no passo inicial da oxidação dos compostos fenólicos há a formação de um radical fenoxilo, mas também surge descrito na literatura o ião fenoxónio como produto, Figura 1.6. Estes compostos intermédios podem participar em reacções de acoplamento, perda de protões ou ataque nucleófilo.[34,50-52]

R O R O

R OH

R O

ROO

O R

Figura 1.6 – Esquema reaccional da oxidação de compostos fenólicos, na presença de radicais livres, com a formação do radical fenoxilo.

No caso particular dos flavonóides, as reacções de oxidação dependem da sua estrutura já que têm vários grupos fenoxilo livres, em particular o-fenoxilo. São estes grupos hidroxilo presentes no anel C, Figura 1.5, que são os principais responsáveis pelas propriedades antioxidantes, já que são os primeiros grupos a serem oxidados.[43,48,53,54] A presença de diferentes substituintes nas estruturas vai alterar a sua capacidade antioxidante, aumentando quando os substituintes são dadores de densidade electrónica, já que estabilizam o anel aromático.^[52]

O pH do meio reaccional é também um factor importante neste tipo de reacções, pois o pH altera a fórmula de estrutura das espécies e por conseguinte terão valores de potencias diferentes. Este factor permite diferenciar entre os ácidos fenólicos e flavonóides. Estes últimos compostos vão apresentar reacções de oxidação susceptíveis ao pH, tendo mais tendência a ocorrerem a pH neutro, isto é, são dadores de electrões mais efectivos a este pH, enquanto que os ácidos fenólicos são mais activos a pH ácidos.^[43,53,55] Estudos efectuados por radioquímica revelam que a maioria dos flavonóides ingeridos se encontram nos intestinos, antes de serem excretados na bílis, onde a sua acção antioxidante será maior. Em contrapartida, os ácidos fenólicos são

(28)

mais electroactivos no estômago, estando de acordo com o pH em que são mais electroactivos.^[53,56]

1.3.2 - Metodologias de avaliação da capacidade antioxidante

Na literatura, estão descritas várias metodologias para determinar a composição fenólica e a capacidade antioxidante de compostos orgânicos. Estes métodos foram desenvolvidos de acordo com as propriedades e os modos de acção apresentados pelos compostos fenólicos.^[33]

Genericamente, a avaliação da capacidade antioxidante de um composto ou de uma amostra, independentemente da sua constituição, baseiam-se em estratégias de inibição por competição, isto é, vão-se gerar/bloquear radicais, através de diversos mecanismos, medindo-se a sua concentração em intervalo de tempo definidos.^[33,57]A maioria destes métodos avaliam a capacidade de bloquear radicais livres, alguns com cor como os formados pelo DPPH(2,2-difenil-1-picril-hidrazilo)^[57,58], o ABTS^•+ (ácido 2’-azino-bis(3- etilbenzotiazoline-6-sulfónico), o AAPH (diidrocloreto de 2,2^’-azobis (2-aminopropano)) e o AMNV (2,2^’-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo)). Nestes casos é possível a sua detecção e quantificação por UV-Vis. ^[33,57]

Outro método utilizado para descrever a capacidade bloqueadora e quelante de radicais é através da avaliação da capacidade de absorção do oxigénio radicalar (ORAC) com diferentes espécies reactivas (com um gerador de radicais peroxilo, hidroxilo, superóxido ou um metal de transição), usando trolox como padrão.[23,39,59,60]

A actividade antioxidante pode também ser determinada directamente, avaliando o poder redutor de uma amostra; estas metodologias baseiam-se na tendência que os antioxidantes apresentam para reduzir o catião Fe³⁺ a Fe²⁺.^[15,60]

A capacidade dos compostos fenólicos para promover ou inibir processos de oxidação em lípidos levou ao desenvolvimento de uma série de metodologias, enzimáticas e não enzimáticas, de inibição da peroxidação lipídica, usando o ácido linolénico como sistema modelo.^[52,61]

Para identificar e quantificar os vários compostos fenólicos, que apresentam estruturas e polaridades muito semelhantes, utilizam-se técnicas espectrofotométricas de UV-Vis, cromatográficos, HPLC (detectores de UV, fluorescência, DAD, ECD) ou GC- FID, por espectroscopia de massa, por técnicas de ressonância magnética (RMN, ESR)

(29)

Grande parte destas metodologias apresenta a desvantagem de usarem reagentes específicos, dispendiosos e procedimentos elaborados, pelo que é recorrente a utilização do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu para avaliar a quantidade de fenóis totais. Este método é baseado na reacção dos compostos fenólicos com um reagente colorimétrico, seguido de medição na região visível do espectro. A desvantagem deste procedimento é que pode sobrestimar-se o conteúdo em fenóis totais, já que várias substâncias como, o dióxido de enxofre, ácido ascórbico ou açucares redutores, podem interferir na medição.^[45]

1.3.3 - Avaliação da capacidade antioxidante por técnicas electroquímicas

A procura de metodologias alternativas para caracterizar e avaliar o perfil e capacidade antioxidante de substâncias orgânicas, levou ao interesse pelas técnicas electroquímicas, entre elas a voltametria cíclica, a voltametria de impulso diferencial e a voltametria de onda quadrada.^[33] Estas técnicas foram já aplicadas na caracterização de uma variedade de antioxidantes incluindo ácidos fenólicos,^[49,52,56] flavonóides,[45,55,67]

ácido ascórbico,^[49,68] tocoferóis,^[69] carotenóides^[70] e antioxidantes sintéticos^[71], tanto em amostras biológicas como em extractos de plantas.^[30,72]

A maioria dos compostos fenólicos é electroactiva, pelo que podem ser estudados por métodos electroquímicos. Estes compostos, como foi referido anteriormente, vão actuar como agentes redutores e, em solução, tendem a ser facilmente oxidados em eléctrodos inertes. Foi já estabelecida uma importante relação entre comportamento electroquímico e o poder antioxidante: um baixo potencial de oxidação está associado a um elevado poder antioxidante.^[39]

As técnicas voltamétricas oferecem vantagens em relação a outros métodos, devido a rapidez e simplicidade da análise. O estudo electroquímico dos compostos fenólicos oferece a possibilidade de investigar as suas características funcionais sem usar reagentes específicos.^[54]

Comparativamente com os métodos espectrofotométricos que são usados habitualmente na avaliação dos diferentes compostos fenólicos, os electroquímicos permitem uma maior selectividade.[30,39,45,72] Adicionalmente, as técnicas voltamétricas, não requerem a caracterização intensiva de cada componente em relação a uma

[30]

(30)

A maior desvantagem da determinação electroquímica é a possível desactivação da superfície do eléctrodo, associada com a adsorção de substâncias orgânicas, o que poderá limitar a reprodutibilidade do método.^[37]

Sendo as técnicas voltamétricas rápidas e simples na avaliação da composição fenólica e capacidade antioxidante, há uma janela de oportunidades para a sua utilização de forma mais sistemática.

Desta maneira, estas técnicas apresentam-se como uma boa ferramenta tanto na avaliação da capacidade antioxidante como na quantificação da composição electroactiva de cogumelos silvestres comestíveis, encontrando-se alguns destes resultados relativos aos extractos de Agaricus sp. já em publicação.^[73]

(31)