BIOLISA RUBÉOLA IgG K 125 INSTRUÇÕES DE USO

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FINALIDADE

Teste para determinação quantitativa e qualitativa de anticorpos IgG para Rubéola em soro ou plasma humano por enzimaimunoensaio em microplaca. Somente para uso diagnóstico in vitro.

PRINCÍPIO DE AÇÃO

Metodologia: Enzimaimunoensaio ou imunoenzimétrica.

O Kit BIOLISA Rubéola IgG é um ensaio imunoenzimático em fase sólida baseada no princípio de detecção qualitativa e quantitativa indireta de anticorpos IgG para Rubéola no soro ou plasma humano. Anticorpos IgG anti - Rubéola presentes na amostra ligam-se aos antígenos revestidos na microplaca formando complexos antígeno-anticorpos IgG. Após a incubação inicial, a microplaca é lavada para remover os materiais não ligados. A Enzima Conjugada anti-Anticorpos IgG humanos é adicionada à microplaca e então incubada.

Os anticorpos enzima - conjugado anti-IgG humano se ligam aos anticorpos IgG imobilizados pelos antígenos presentes.

É realizada nova Lavagem para remover os excedentes.

Após esta etapa, os Substratos A e B são adicionados e incubados produzindo uma cor azul que indica a quantidade de anticorpos IgG presentes nas amostras. A Solução de Parada é adicionada para interromper a reação havendo uma mudança de cor para amarelo, medida em um leitor de microplacas.

REAGENTES

1- Padrões Referência ( A - D ) - Conservar entre 2 e 8°C. Quatro (4) frascos ( A - D ) de Padrões Referência contendo anticorpos IgG anti-rubéola em diferentes concentrações em solução de tampão e conservante. A- 0,0 UI/mL

B- 5,0 UI/mL C- 10,0 UI/mL D- 200,0 UI/mL

2- Conjugado - Conservar entre 2 e 8°C. Anticorpo anti- IgG humano ligado à peroxidase e conservante.

3- Placa Sensibilizada - Conservar entre 2 e 8º C

4- Lavagem Concentrada - Conservar entre 2 e 8ºC. Solução tampão, surfactante e conservante.

5- Diluente de Amostra - Conservar entre 2 e 8°C. Solução tampão e conservante.

6- Substrato A - Conservar entre 2 e 8°C. Solução tampão contendo peróxido de hidrogênio e conservante.

7- Substrato B - Conservar entre 2 e 8°C. Tampão contendo tetrametilbenzidina (TMB) e conservante.

8- Solução de Parada - Conservar entre 2 e 8°C. Ácido clorídrico 1M. 9- Seladores de Placa

APRESENTAÇÃO

REAGENTES 1 2 3

96 CAVIDADES 192 CAVIDADES 480 CAVIDADES

1- Padrões

Referência (A - D) 1 Frasco A-D x 1 mL 2 Frascos A-D x 1 mL 4 Frascos A-D x 1 mL 2- Conjugado 1 Frasco x 12 mL 2 Frascos x 12 mL 5 Frascos x 12 mL 3- Placa sensibilizada _{(96 cavidades)}1 Unidade _{(96 cavidades)}2 Unidades _{(96 cavidades)}5 Unidades

4- Lavagem

Concentrada 1 Frasco x 20 mL 2 Frascos x 20 mL 4 Frascos x 20 mL 5- Diluente de Amostra 1 Frasco x 12 mL 2 Frascos x 12 mL 5 Frascos x 12 mL

6- Substrato A 1 Frasco x 8 mL 2 Frascos x 8 mL 5 Frascos x 8 mL 7- Substrato B 1 Frasco x 8 mL 2 Frascos x 8 mL 5 Frascos x 8 mL

EQUIPAMENTOS E INSUMOS OPERACIONAIS Materiais contidos no kit:

- Reagentes descritos no quadro anterior - Instruções de uso (manual)

Materiais necessários não contidos no Kit:

1- Pipetas capazes de dispensar volumes de 5, 50 e 100 mL com precisão maior que 1,5%.

2- Repipetador para pipetagens repetitivas de volumes de 100 mL e 300 mL com precisão maior que 1,5% (opcional) ou pipeta multicanal.

3- Lavadora de microplaca (opcional).

4- Leitora de ELISA com capacidade de absorbância em 450 e 630 nm de comprimento de onda.

5- Pipetas com volumes reguláveis (200 mL a 1000 mL) para preparação do Substrato.

6- Tubos de ensaio para a preparação dos substratos A e B. 7- Papel absorvente para secar as microcavidades. 8- Cronômetro ou relógio.

9- Frasco para estocar a Solução de Lavagem após diluída. 10- Água destilada ou deionizada.

11- Ferramentas de Controle de Qualidade. 12- Incubadora de 37°C ± 2°C.

CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE

A temperatura de armazenamento deverá ser de 2 a 8°C. O transporte em temperaturas entre 15 e 30°C não deverá exceder a 72 (setenta e duas) horas. Não congelar. Manter ao abrigo da luz e evitar umidade. CUIDADOS ESPECIAIS

1- Somente para uso diagnóstico in vitro.

2- Seguir com rigor a metodologia proposta para a obtenção de resultados exatos.

3- O envelope contendo as tiras deve ser aberto somente após atingir a temperatura ambiente. Recolocar as tiras de microcavidades não utilizadas no invólucro de alumínio, vedar e estocar a 2-8°C.

4- A água utilizada na limpeza do material deve ser coletada recentemente e isenta de contaminantes.

5- Colunas deionizadoras saturadas liberam água alcalina, íons diversos, agentes oxidantes e redutores. que podem alterar de forma significativa os resultados.

6- Toda matéria-prima do produto é testada e deve ser não reagente para HBsAg, Anti-HIV 1&2 e Anti HCV. Entretanto, esses testes não oferecem total segurança da ausência de agentes infecciosos. A manipulação manual de todo produto que contém soro é potencialmente capaz de transmitir doenças. Portanto, é preciso tomar os devidos cuidados de biossegurança na manipulação desses produtos.

7- Pipetar os reagentes sempre na mesma ordem para minimizar a diferença de tempo de reação entre as microcavidades.

8- Por medida de proteção, pode-se cobrir a placa durante a reação. Caso opte por este procedimento, é necessário que seja estabelecido como rotina.

9- Deve-se assegurar que o fundo da cavidade esteja limpo e seco e que não haja bolhas na superfície do líquido antes de ler a placa. Não permitir que as cavidades sequem durante o ensaio.

10- Não exponha os reagentes, especialmente o Substrato, à luz forte ou vapores de hipoclorito durante o armazenamento ou as etapas de incubação.

11- A Solução de Parada contém ácido clorídrico que é um ácido forte. Portanto, manuseá-lo com o devido cuidado.

12- Recomendamos aplicar as normas locais, estaduais e federais de proteção ambiental para que o descarte dos reagentes e do material biológico seja feito de acordo com a legislação vigente.

13- Para obtenção de informações relacionadas à biossegurança ou em caso de acidentes com o produto, consultar as FISPQ (Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos) disponibilizadas no

AMOSTRAS

Utilizar soro ou plasma (EDTA ou Heparina).

Amostras hemolisadas ou altamente lipêmicas não devem ser usadas. As amostras podem ser conservadas sob refrigeração, entre 2 e 8ºC , pelo período máximo de 7 dias. Se as amostras não puderem ser analisadas dentro de 7 dias, podem ser estocadas por até 30 dias à temperatura de -20ºC (freezer).

DESCRIÇÃO DO PROCESSO

PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO Solução de Lavagem

Diluir o conteúdo do frasco Nº4 (Lavagem Concentrada) em 1000 mL de água destilada ou deionizada. Estocar entre 2 e 8ºC até a data de validade impressa no frasco original. Pode ser armazenada em temperatura ambiente. Caso ocorra cristalização, aquecer a 37°C até dissolução. Substrato – Solução de Trabalho

Determinar a quantidade de cavidades a serem utilizadas para preparo de um volume adequado. Preparar a solução misturando partes iguais do Substrato A e Substrato B 15 minutos antes de sua utilização. Mantenha-o protegido da luz até ser utilizado.

Para cada microcavidade (teste), utilizar: 50 mL de Substrato A + 50 mL de Substrato B

Por exemplo: misture 1 mL de Substrato A e 1 mL de Substrato B para duas tiras de 8 microcavidades (16 testes). Ocorre sobra de reagente. Usar no máximo até uma (1) hora após preparo.

TÉCNICA

Antes de iniciar o ensaio, colocar todos os reagentes, amostras, Padrões Referência e controles para estabilizarem em temperatura ambiente (15 – 30ºC) por no mínimo 40 minutos.

Retornar as tiras da microplaca que não serão utilizadas para a embalagem original selada.

1- Separar as cavidades a serem utilizadas considerando: Padrões, controles e amostras podendo ser testados em duplicata;

2- Separar a primeira cavidade para Branco (OPCIONAL);

3- Pipetar 100 mL dos Padrões Referência (A-D) nas cavidades determinadas;

4- Pipetar 100 mL de Diluente de Amostra nas cavidades determinadas para as amostras e, em seguida, pipetar 5µL de amostra sobre o Diluente de Amostra;

5- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos;

Ocorre mudança de cor de verde para azul nas cavidades das amostras. Cobrir as cavidades com o selador de placa;

6- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos a 37°C ± 2°C em uma incubadora; 7- Retirar o selador de placas das cavidades;

8- Descartar o conteúdo das cavidades por aspiração (Lavadora) ou por decantação (manual).

Usar 300 mL aproximadamente de Solução de Lavagem, previamente preparada,* para efetuar um total de cinco (5) ciclos de lavagem; Para a garantia da secagem da placa, ao final da lavagem, bater a placa por alguns segundos em papel absorvente.

Nota: Lavagem/ secagem deficiente pode causar resultados inadequados. 9- Pipetar 100 mL de Conjugado em cada cavidade exceto na cavidade Branco (caso tenha feito a opção);

10- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cobrir as cavidades com o selador de placa;

11- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos em uma incubadora a 37°C ± 2°C; 12- Retirar o selador de placa das cavidades;

13- Repetir o item 8;

14- ATENÇÃO Siga um dos seguintes procedimentos:

A) Pipetar 100 mL de Substrato previamente preparado* - Solução de Trabalho ( A + B ) em cada cavidade.

*Vide PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO

16- Incubar por 10 minutos ± 1 minuto em uma incubadora a 37°C ± 2°C; 17- Retirar o selador de placa das cavidades;

18- Pipetar 50 mL de Solução de Parada em cada cavidade; 19- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos;

20- Ler: 450 nm (filtro primário)/630 nm (filtro secundário) em até 30 minutos (no máximo).

VERIFICAÇÃO DA TÉCNICA

Verifique se os resultados obtidos para leitura dos Padrões Referência estão compatíveis com os valores apresentados abaixo:

ITEM ABSORBÂNCIA

Branco < 0,050 Padrão Referência A < 0,100 Padrão Referência B > 0,200 e < 0,700 Padrão Referência C > Abs B e < Abs D Padrão Referência D > 1,500

As absorbâncias para os Padrões Referência foram obtidas após a diminuição da absorbância do branco. Para a leitura em filtro único (450 nm) considerar limite de branco < 0,100 .

Caso os valores se encontrem fora dos valores esperados, deve-se repetir a técnica.

CÁLCULOS QUALITATIVO

Considerar como Cut-Off a absorbância média obtida com o Padrão Referência C.

Padrão Referência C A1 = 1,012 A2 = 1,102 Absorbância média ( 1,012 + 1,102 ) / 2 = 1,057

Calcular o Índice dividindo a absorbância da amostra pelo valor de cut-Off. Exemplo:

Amostra 1,779 Valor de Cut-Off 1,057 Índice: Amostra/ Valor de Cut-Off 1,779 / 1,057 = 1,683

QUANTITATIVO

Uma curva de calibração é usada para determinar a concentração de anticorpos anti-rubéola em amostras desconhecidas.

Preparo da Curva de Calibração

Registrar as absorbâncias obtidas na Leitora de microplaca, como apresentado no exemplo 1. Calcular as médias das duplicatas, (caso sejam realizadas duplicatas).

Plotar as absorbâncias médias de cada Padrão Referência versus a concentração correspondente em UI/mL em papel milimetrado (antes de plotá-las no gráfico).Traçar a curva.

Nota: Os dados apresentados no exemplo 1 são apenas para ilustração e não podem ser usados em substituição à curva de calibração, que deve ser construída no laboratório.

BIOLISA RUBÉOLA IgG

K 125

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Exemplo 1

PADRÕES ABSORBÂNCIA ABSORBÂNCIA_MÉDIA CONCENTRAÇÃO A 0,04 0,035 0 UI / mL 0,03 B 0,22 0,235 5,0 UI / mL 0,25 C 0,84 0,85 10,0 UI / mL 0,86 D 2,38 2,275 200,0 UI / mL 2,17

As amostras que tenham absorbância acima do Padrão Referência D, devem ser pré-diluídas utilizando o Diluente de Amostra e devem ser testadas novamente. A concentração deve ser multiplicada pelo fator de diluição. Leitura automática e cálculo podem ser realizados através da função de regressão linear em programas adequados de computador. RESULTADOS

RESULTADOS QUALITATIVO QUANTITATIVO ÍNDICE CONCENTRAÇÃO

Negativo < 0,5 < 5,0 UI/mL Positivo > 1,1 ≥ 10,0 UI/mL Indeterminado ≥ 0,5 e ≤ 1,1 5,0 - 10,0 UI/mL

Observação: No caso de resultado indeterminado, a amostra deve ser reanalisada. As amostras que obtiverem resultados repetidamente indeterminados devem ser retestadas utilizando um método alternativo. Se os resultados permanecerem indeterminados, deve-se coletar uma nova amostra em duas semanas. Se a nova amostra for positiva, a amostra deve ser considerada positiva.

LIMITAÇÕES DO PROCESSO

A interpretação de um teste diagnóstico, não deve ser estabelecido com base em um único ensaio. Deve-se incluir outros testes de confirmação, antes que uma amostra seja considerada positiva. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição. Enfim, todos os resultados devem ser interpretados em conjunto com outras informações clínicas disponíveis. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE

O Laboratório Clínico deve possuir um programa interno de controle da qualidade, onde procedimentos, normas, limites e tolerância para variações sejam claramente estabelecidos. É importante ressaltar que todos os sistemas de medição apresentam uma variabilidade analítica característica, que deve ser monitorada pelos próprios laboratórios. Para tanto, é recomendável a utilização de controles, que permitem avaliar a precisão e a exatidão das dosagens.

DESEMPENHO DO PRODUTO CONTROLE DE QUALIDADE Exatidão

COMPARAÇÃO DE MÉTODOS E ESPECIFICIDADE METODOLÓGICA O kit BIOLISA Rubéola IgG foi comparado com outro kit de ELISA disponível comercialmente. Foram utilizadas 07 amostras de soro humano. A equação da reta de regressão linear obtida foi Y = 1,0051X + 0,2739 e o coeficiente de correlação 0,9999. Com estes resultados pode-se concluir que os kits apresentam boa especificidade metodológica.

Precisão REPETIBILIDADE

Foram realizadas 20 dosagens sucessivas com três amostras, utilizando o mesmo lote, obtendo-se os seguintes resultados:

REPETIBILIDADE AMOSTRA

1 2 3

Média (UI/mL) 2,546 18,478 112,744 Desvio padrão (UI/mL) 0,039 0,486 0,271 Coeficiente de variação (%) 1,532 2,630 0,240

REPRODUTIBILIDADE

Foram realizadas 20 dosagens durante 3 dias consecutivos com três amostras, utilizando o mesmo lote, obtendo-se os seguintes resultados:

REPRODUTIBILIDADE AMOSTRA

1 2 3

Média (UI/mL) 2,545 18,615 112,645 Desvio padrão (UI/mL) 0,002 0,120 0,093 Coeficiente de variação (%) 0,091 0,642 0,083

Sensibilidade Analítica

A sensibilidade indica o limite de detecção do método. Foi calculada a partir de vinte (20) determinações de Rubéola IgG, em uma amostra isenta desses analitos. Foi encontrado um valor médio igual a 0,98 UI/mL, com desvio padrão de 0,01 UI/mL. A sensibilidade, que corresponde à soma da média encontrada com 3 vezes o desvio padrão, para este método, é igual a 1,01 UI/mL.

Sensibilidade e Especificidade Clínica

O Kit BIOLISA Rubéola IgG foi utilizado para análise de amostras clínicas em comparação com outro kit de EIA. Os resultados mostram que a sensibilidade clínica do Kit BIOLISA Rubéola IgG é > 96,4%, e a especificidade clínica é 99,9%.

BIOLISA Rubéola IgG X EIA Referência

MÉTODO EIA REFERÊNCIA

TOTAL BIOLISA RUBÉOLA IgG POSITIVO NEGATIVO POSITIVO 54 0 54 NEGATIVO 2 37 39 RESULTADO TOTAL 56 37 93 Sensibilidade Clínica: >96,4% (87,7 - 99,6%) * Concordância global: 97,9% (92,4 - 99,7) * Especificidade Clínica: 99,9% (90,5 - 100,0%) * *95% Intervalo de confiança Linearidade

A reação é capaz de detectar concentrações até a concentração do ponto mais alto da curva de calibração. Para amostras com valores superiores, diluir a mesma com Diluente de Amostra, repetir a dosagem e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.

SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO

A Rubéola é um vírus de RNA, esférico, envelope pequeno, pertencente à família Togaviridae. É vulgarmente conhecido como alemão ou sarampo de 3 dias. A infecção pelo vírus de Rubéola é transmitida através de gotículas de saliva, resultando em erupção contagiosa leve em crianças ou jovens adultos.

Na infância, a infecção é uma doença auto-limitante, benigna, caracterizada por febre baixa, dor de cabeça, linfadenopatia, artralgia e conjuntivite. No entanto, a infecção durante a gravidez, especialmente no primeiro trimestre, pode levar ao aborto espontâneo, infecção intra-uterina causando a morte fetal, ou anomalias congênitas.

A Rubéola Congênita depende do período em que a infecção ocorre e pode resultar em complicações graves, incluindo a surdez, problemas oculares, incluindo cataratas e glaucoma, cardiopatia congênita e retardo mental. Os anticorpos IgM contra a rubéola são produzidos inicialmente, podendo atingir níveis detectáveis dentro de 2-3 dias e pico de 14-21 dias após o início dos sintomas que permanecem detectáveis durante as próximas 4-8 semanas. O diagnóstico de infecção ativa ou recente pode ser obtido pela presença de anticorpos IgM em amostra inicial. Depois de vários dias, os anticorpos IgG aparecem depois da IgM, com pico de 14-21 dias, persistindo níveis variados para toda a vida. A presença de

anticorpos IgG anti-rubéola é indicativo de infecção prévia e/ou imunidade.

NÚMERO DE TESTES Apresentação 1 – 96 testes Apresentação 2 – 192 testes Apresentação 3 – 480 testes REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Herrmann, KL. Rubella Virus. In: Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology 4th Edition (1985) 779-784.

2. Turgeon, ML. Rubella Infection. In: Immunology and Serology in Laboratory Medicine. 2nd Edition (1996). 275-286.

3. Chernesky, MA, Mahony JB. Rubella Virus. In: Manual of Clinical Microbiology. 6th Edition (1995) 968-973.

4. Voller, A, Bidwell, DE, A simple Method for Detecting Antibodies to Rubella. Brit. J. Exp. Pathol. (1975) 56:338-339.

5. Rawls WE, Chernesky MA. Rubella Virus. Manual Clinical Immunology (1976) 452-455.

6. Millian, SJ, Wegman D. Rubella Serology: Applications, Limitations, and Interpretations. Amer. J. Pub. Health (1972) 170-176.

7. Bioclin – Dados de arquivos GARANTIA DE QUALIDADE

Antes de serem liberados para consumo, todos os reagentes Bioclin são testados pelo Departamento de Controle de Qualidade. A qualidade dos reagentes é assegurada até a data de validade mencionada na embalagem de apresentação, desde que armazenados e transportados nas condições adequadas.

DADOS DO FABRICANTE QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP 31565-130 - Belo Horizonte - MG - Brasil Tel.: ( 31 ) 3439.5454 - Fax: ( 31 ) 3439.5455 E-mail bioclin@bioclin.com.br

CNPJ: 19.400.787/0001-07 - Indústria Brasileira ATENDIMENTO AO CONSUMIDOR Serviço de Assessoria ao Cliente Tel.: 0800 0315454.

E-mail: sac@bioclin.com.br

Número de Registro do Kit BIOLISA Rubéola IgG na ANVISA: 10269360191 Revisão: Maio/12

PANTONE 5435

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FINALIDAD

Test para determinación cuantitativa y cualitativa de anticuerpos IgG para rubéola en suero o plasma humano, por enzimainmunoensayo en microplaca. Solamente para uso diagnóstico in vitro.

PRINCIPIO DE ACCIÓN

Metodología: Enzimainmunoensayo o inmunoenzimétrica.

El Kit BIOLISA Rubéola IgG es un ensayo inmunoenzimático en fase sólida basado en el principio de detección cualitativa y cuantitativa indirecta de anticuerpos IgG para rubéola en suero o plasma humano.

Anticuerpos IgG anti-rubéola presentes en la muestra, se ligan a los antígenos revestidos en la microplaca formando complejos antígenos anticuerpos IgG. Después de la incubación inicial, la microplaca es lavada para remover los materiales no ligados. La Enzima-Conjugada anti-Anticuerpos IgG humanos es adicionada a la microplaca y entonces incubada.

Los anticuerpos enzima - conjugado anti-IgG humano se ligan a los anticuerpos IgG inmobilizados por los antígenos presentes.

Es realizado nuevo lavado para remover los excedentes. Después de esta etapa, los Sustratos A y B son adicionados e incubados, produciendo un color azul, que indica la cantidad de anticuerpos IgG presentes en las muestras. La solución de parada es adicionada para interrumpir la reacción ocurriendo un cambio de color para amarillo, medido en un lector de microplacas.

REACTIVOS

1- Patrones Referencia ( A - D ) - Almacenar entre 2 y 8°C. Cuatro (4) frascos (A - D) de Patrones referencia conteniendo anticuerpos anti-Rubéola en diferentes concentraciones en solución de tapón y conservante. A- 0,0 UI/mL

B- 5,0 UI/mL C- 10,0 UI/mL D- 200,0 UI/mL

2- Conjugado - Almacenar entre 2 y 8°C. Anticuerpo anti- IgG humano ligado a peroxidasa, y conservante.

3- Placa Sensibilizada - Almacenar entre 2 y 8ºC.

4- Solución de Lavado Concentrado - Almacenar entre 2 y 8ºC. Solución Tapón, surfactante y conservante.

5- Diluyente de Muestra - Almacenar entre 2 y 8°C. Solución Tapón y conservante.

6- Sustrato A - Almacenar entre 2 y 8°C. Solución Tapón conteniendo peróxido de hidrógeno y conservante.

7- Sustrato B - Almacenar entre 2 y 8°C. Tapón conteniendo tetrametilbenzidina (TMB) y conservante.

8- Solución de Parada - Almacenar entre 2 y 8°C. Ácido Clorídrico 1M. 9- Selladores de Placa

PRESENTACIÓN

REACTIVOS 1 2 3

96 CAVIDADES 192 CAVIDADES 480 CAVIDADES

1- Patrones

referencia (A-D) 1 Frasco A - D x 1 mL 2 Frascos A - D x 1 mL 4 Frascos A - D x 1 mL 2- Conjugado 1 Frasco x _{12 mL} 2 Frascos x _{12 mL} 5 Frascos x _{12 mL}

3- Placa sensibilizada _{(96 cavidades)}1 Unidad _{(96 cavidades)}2 Unidades _{(96 cavidades)}5 Unidades 4- Solución de Lavado

Concentrado 1 Frasco x 20 mL 2 Frascos x 20 mL 4 Frascos x 20 mL 5- Diluyente de

Muestra 1 Frasco x 12 mL 2 Frascos x 12 mL 5 Frascos x 12 mL

EQUIPOS E INSUMOS OPERACIONALES Materiales contenidos en el kit: - Reactivos descritos en el cuadro anterior. - Instrucciones de uso (manual).

Materiales necesarios, no contenidos en los Kit:

1- Pipetas capaces de dispensar volúmenes de 5, 50 y 100 mL con precisión mayor que 1,5%.

2- Repipetador para pipetajes repetitivas de volúmenes de 100 mL y 300 mL, con precisión mayor que 1,5% (opcional) o pipeta multicanal.

3- Lavadora de microplaca (opcional).

4- Lectora de ELISA con capacidad de absorbancia en 450 y 630 nm de longitud de onda.

5- Pipetas con volúmenes regulables (200 mL a 1000 mL) para preparación de Sustrato.

6- Tubos de ensayo para la preparación del Sustrato A y B. 7- Papel absorbente para secar las microcavidades. 8- Cronómetro o reloj.

9- Frasco para almacenar la Solución de Lavado después de diluida; 10- Agua destilada o deionizada.

11- Herramientas de Control de Calidad. 12- Incubadora de 37°C ± 2°C.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE

La temperatura de almacenamiento deberá ser de 2 a 8°C. El transporte a temperaturas entre 15 y 30°C no deberá exceder a 72 (setenta y dos) horas. No congelar. Mantener al abrigo de la luz y evitar la humedad.

CUIDADOS ESPECIALES

1- Solamente para uso diagnóstico in vitro.

2- Seguir con rigor la metodologÍa propuesta para la obtención de resultados exactos.

3- El sobre conteniendo las tiras debe ser abierto solamente después de alcanzar la temperatura ambiente Recolocar las tiras de microcavidades no utilizadas en la envoltura de aluminio, sellar y almacenar a 2-8°C. 4- El agua utilizada en la limpieza del material debe ser reciente e exenta de contaminantes.

5- Columnas deionizadoras saturadas liberan agua alcalina, iones diversos y agentes oxidantes y reductores, que pueden alterar de forma significativa los resultados.

6- Toda matéria prima del producto es probado y debe ser no reactivo para HBsAg, Anti-HIV 1&2 y Anti-HCV. Sin embargo , esos tests no ofrecen total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos. La manipulación manual de todo producto que contiene suero es potencialmente capaz de transmitir dolencias. Por lo tanto, es necesario tomar los debidos cuidados de bioseguridad en la manipulación de esos productos.

7- Pipetear los reactivos siempre en el mismo orden para minimizar la diferencia de tiempo de reacción entre las microcavidades.

8- Por medida de protección, se puede cubrir la placa durante la reacción. Caso opte por este procedimiento, es necesario que sea establecido como rutina.

9- Se debe asegurar que el fondo de la cavidad este limpio y seco y que no haya burbujas en la superficie del líquido antes de leer la placa. No permitir que las cavidades sequem durante el ensayo.

10- No exponga los reactivos, especialmente el sustrato, a la luz fuerte o vapores de hipoclorito durante el almacenamiento o etapas de incubación. 11- La Solución de Parada contiene ácido clorídrico, que es un ácido fuerte. Por lo tanto, manosearlo con el debido cuidado.

12- Se recomienda la aplicación de la ley local, estatal y federal de protección ambiental para la eliminación de reactivos y material biológico se hace de acuerdo con la legislación vigente.

13- Para obtener información relacionada con la seguridad biológica o en caso de accidentes con el producto, consultar la FISPQ (Ficha de Informaciones de la Seguridad de Productos Químicos) disponibles en el site www.bioclin.com.br o solicitando a través del SAC (Servicio de Asesoría

Las muestras pueden ser conservadas bajo refrigeración, entre 2 y 8ºC , por el período máximo de 7 días. Si las muestras no pudieran ser analizadas dentro de 7 días, pueden ser almacenadas por hasta 30 días a temperatura de -20ºC (freezer).

DESCRIPCIÓN DEL PROCESO

PREPARO DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO Solución de Lavado

Diluir el contenido del frasco Nº4 (Solución de Lavado Concentrado) en 1000 mL de agua destilada o deionizada. Almacenar entre 2 y 8ºC hasta la fecha de validad impresa en el frasco original. Puede ser almacenada a temperatura ambiente. Caso ocurra cristalización, calentar a 37ºC hasta su disolución.

Sustrato – Solución de Trabajo

Determinar la cantidad de cavidades a ser utilizadas para preparo de un volúmen adecuado. Preparar la solución mezclando partes iguales de Sustrato A y Sustrato B, 15 minutos antes de su utilización. Manténgalo protegido de la luz hasta ser utilizado.

Para cada microcavidad (test), utilizar: 50 mL de Sustrato A + 50 mL de Sustrato B

Por ejemplo: mezcle 1mL de Sustrato A y 1mL de Sustrato B para dos tiras de 8 microcavidades (16 tests). Ocurre sobra de reactivo.

Usar máximo hasta una (1) hora luego del preparo. TÉCNICA

Antes de iniciar el ensayo, colocar todos los reactivos, muestras y Patrones Referencia y controles para que se estabilicen a temperatura ambiente (15 - 30ºC) mínimo por 40 minutos.

Retornar las tiras de la microplaca que no serán utilizadas para el embalaje original sellado.

1- Separar las cavidades a ser utilizadas considerando: Patrones, controles y muestras pudiendo ser probados en duplicado.

2- Separar la primera cavidad para Blanco (OPCIONAL).

3- Pipetear 100 mL de los Patrones Referencia (A-D) en las cavidades determinadas.

4- Pipetear 100 mL de Diluyente de Muestra en las cavidades determinadas para las muestras y en seguida, pipetear 5 mL de muestra sobre el Diluyente de Muestra.

5- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos.

Ocurre cambio de color de verde para azul en las cavidades de las muestras. Cubrir las cavidades con el sellador de placa.

6- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos a 37°C ± 2°C. en una incubadora. 7- Retirar el sellador de placa de las cavidades.

8- Desechar el contenido de las cavidades por aspiración (Lavadora) o por decantación (manual);

Usar 300 mL aproximadamente de Solución de Lavado, previamente preparada*, para efectuar un total de cinco (5) ciclos de lavado. Para la garantia del secado de la placa, al final del lavado, batir la placa por algunos segundos en papel absorbente.

Nota: Lavado / secado deficiente puede causar resultados inadecuados. 9- Pipetear 100 mL de Conjugado en cada cavidad excepto en la cavidad Blanco (easo haya hecho la opción).

10- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cobrir las cavidades con el sellador de placa.

11- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos en una incubadora 37°C ± 2°C. 12- Retirar el sellador de placa de las cavidades.

13- Repetir el item 8.

14- ATENCIÓN Siga uno de los siguientes procedimientos:

A) Pipetear 100 mL de Sustrato previamente preparado* – Solución de Trabajo (A + B) en cada cavidad.

*Ved PREPARO DE REACTIVOS DE TRABAJO O

B) Pipetear 50 mL de Sustrato A en cada cavidad. Pipetar 50 mL de Sustrato

18- Pipetear 50 mL de Solución de Parada en cada cavidad. 19- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos.

20- Leer a 450 nm (filtro primario) / 630 nm (filtro secundario) máximo hasta en 30 minutos(máximo).

VERIFICACIÓN DE LA TÉCNICA

Verifique si los resultados obtenidos para lectura de los Patrones son compatibles con los valores presentados abajo:

ITEM ABSORBANCIAS

Blanco < 0,050 Patrón Referencia A < 0,100 Patrón Referencia B > 0,200 y < 0,700 Patrón Referencia C > Abs B y < Abs D Patrón Referencia D > 1,500

Las absorbancias para los Patrones Referencia fueron obtenidos después de la disminución de la absorbancia del blanco. Para la lectura en filtro único (450 nm) considerar el límite de blanco < 0,100 .

Caso los valores se encuentren fuera de los valores esperados, se debe repetir la técnica.

CÁLCULOS CUALITATIVO

Considerar como Cut-Off la absorbancia promedio obtenida con el Patrón referencia C.

ITEM ABSORBANCIA

Patrón Referencia C A1= 1,012 A2= 1,102 Absorbancia promedio (1,012 + 1,102) / 2 = 1,057

Calcular el Índice dividiendo la absorbancia de la muestra por el valor de Cut-Off.

Ejemplo:

ITEM ABSORBANCIA

Muestra 1,779 Valor de Cut-Off 1,057 Índice: Muestra/ Valor de Cut-Off 1,779/1,057 = 1,683

CUANTITATIVO

Una curva de calibración es usada para determinar la concentración de anticuerpos anti-rubéola en muestras desconocidas.

Preparo de la Curva de Calibración

Registrar las absorbancias obtenidas en la Lectora de microplaca, como presentado en el ejemplo 1. Calcular los promedios de los duplicados, caso sean realizados duplicados.

Plotear las absorbancias promedios de cada Patrón Referencia frente a la concentración correspondiente en UI/mL en papel milimetrado (antes de plotearlas en el gráfico).Trazar la curva.

Nota: Los datos presentados en el ejemplo 1 son apenas para ilustración y no pueden ser usados en sustitución a la curva de calibración, que debe ser construida en el laboratorio.

BIOLISA RUBÉOLA IgG

K 125

(4)

Ejemplo 1

PATRONES ABSORBANCIA ABSORBANCIA_PROMEDIO CONCENTRACIÓN

A 0,04 0,035 0 UI/mL 0,03 B 0,22 0,235 5,0 UI/mL 0,25 C 0,84 0,85 10,0 UI/mL 0,86 D 2,38 2,275 200,0 UI/mL 2,17

Las muestras que tengan absorbancia encima del Patrón Referencia D deben ser previamente diluidas utilizando Diluyente de muestra y deben ser probadas nuevamente. La concentración debe ser multiplicada por el factor de dilución. Lectura automática y cálculo pueden ser realizados a través de la función de regresión linear en programas adecuados de computador. RESULTADOS

RESULTADOS CUALITATIVO CUANTITATIVO

ÍNDICE CONCENTRACIÓN

Negativo <0,5 <5,0 UI/mL Positivo >1,1 ≥10,0 UI/mL Indeterminado ≥ 0,5 y ≤ 1,1 5,0 – 10,0 UI/mL

Observación: En el caso de resultado indeterminado, la muestra debe ser reanalizada. Las muestras que obtuvieran resultados repetidamente indeterminados deben ser reanalizados utilizando un método alternativo. Si los resultados permanecieran indeterminados, se debe colectar una nueva muestra en dos semanas. Si la nueva muestra fuera positiva, la muestra debe ser considerada positiva.

LIMITACIONES DEL PROCESO

La interpretación de un test diagnóstico, no debe ser establecida con base en un único ensayo. Se deben incluir otros tests de confirmación, antes que una muestra sea considerada positiva. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposición. Por último , todos los resultados deben ser interpretados en conjunto con otras informaciones clínicas disponibles. CONTROL INTERNO DE CALIDAD

El Laboratorio Clínico debe poseer un programa interno de control de calidad, donde procedimientos, normas, límites y tolerancia para variaciones sean claramente establecidos. Es importante resaltar que todos los sistemas de medición presentan una variabilidad analítica característica, que debe ser vigilada por los propios laboratorios. Por lo tanto, es recomendable la utilización de controles, que permiten la evaluación, la precisión y la exactitud de las dosificaciones.

DESEMPEÑO DEL PRODUCTO CONTROL DE CALIDAD Exactitud

COMPARACIÓN DE MÉTODOS Y ESPECIFICIDAD METODOLÓGICA O kit BIOLISA Rubéola IgG fue comparado con otro kit de ELISA disponible comercialmente. Fueron utilizadas 07 muestras de suero humano. La ecuación de la recta de regresión linear obtenida fue Y = 1,0051X + 0,2739 y el coeficiente de correlación 0,9999. Con estos resultados se puede concluir que los kits presentan buena especificidad metodológica.

Precisión REPETIBILIDAD

Fueron realizadas 20 dosis sucesivas con tres muestras, utilizando el mismo lote, obteniéndose los siguientes resultados:

REPETIBILIDAD MUESTRA

1 2 3

Promedio (UI/mL) 2,546 18,478 112,744 Desvío patrón (UI/mL) 0,039 0,486 0,271 Coeficiente de variación (%) 1,532 2,630 0,240

REPRODUCTIBILIDAD

Fueron realizadas 20 dosis durante 3 días consecutivos con tres muestras, utilizando el mismo lote, obteniéndose los siguientes resultados:

REPRODUCTIBILIDAD MUESTRA

1 2 3

Promedio (UI/mL) 2,545 18,615 112,645 Desvío patrón (UI/mL) 0,002 0,120 0,093 Coeficiente de variación (%) 0,091 0,642 0,083

Sensibilidad Analítica

La sensibilidad indica el límite de detección del método. Fue calculada a partir de veinte (20) determinaciones de Rubéola IgG, en una muestra exenta de esos analitos. Fue encontrado un valor promedio igual a 0,98 UI/mL, con desvío patrón de 0,01 UI/mL. La sensibilidad, que corresponde a la suma del promedio encontrado con 3 veces el desvío patrón, para este método, es igual a 1,01 UI/mL.

Sensibilidad y Especificidad Clínica

El Kit BIOLISA Rubéola IgG fue utilizado para análisis de muestras clínicas en comparación con otro kit de EIA.

Los resultados muestran que la sensibilidad clínica del Kit BIOLISA Rubéola IgG es >96,4%, y la especificidad clínica es 99,9%.

BIOLISA Rubéola IgG X EIA REFERENCIA

MÉTODO EIA REFERENCIA

TOTAL BIOLISA RUBEÓLA IgG POSITIVO NEGATIVO POSITIVO 54 0 54 NEGATIVO 2 37 39 TOTAL 56 37 93 Sensibilidad Clínica: >96,4% (87,7 - 99,6%) * Concordancia global: 97,9% (92,4 - 99,7) * Especificidad Clínica: 99,9% (90,5 - 100,0%) * *95% Intervalo de confianza Linearidad

La reacción es capaz de detectar concentraciones hasta la concentración del punto más alto de la curva de calibración. Para muestras con valores superiores, diluir la misma con Diluyente de Muestra, repetir la dosificación y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.

SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO

La Rubéola es un vírus de RNA, esférico, sobre pequeño, perteneciente a la familia Togaviridae. Es vulgarmente conocido como alemán o sarampión de 3 días. La infección por el vírus de Rubéola es transmitida a través de gotículas de saliva, resultando en erupción contagiosa leve en crianças o jovenes adultos.

En La infancia, la infección es una dolencia auto-limitante, benigna, caracterizada por fiebre baja, dolor de cabeza, linfadenopatía, artralgia y conjuntivitis. Sin embargo, la infección durante el embarazo, especialmente en el primer trimestre, puede llevar al aborto espontáneo, infección intra-uterina causando la muerte fetal, o anomalias congénitas.

La Rubéola congénita depende del período en que la infección ocurre y puede resultar en complicaciones graves, incluyendo la sordez, problemas oculares, incluyendo cataratas y glaucoma, cardiopatía congénita y retardo mental. Los anticuerpos IgM contra la rubéola son producidos inicialmente, pudiendo alcanzar niveles detectables dentro de 2-3 días y pico de 14-21 días después el inicio de los síntomas que permanecen detectables durante las próximas 4-8 semanas. El diagnóstico de infección activa o reciente puede ser obtenido por la presencia de anticuerpos IgM en muestra inicial. Después de varios días, los anticuerpos IgG aparecen luego de la IgM, con pico de 14-21 días, persistiendo niveles variados para toda la vida. La presencia de anticuerpos IgG anti-rubéola es indicativo de infección previa y/o inmunidad. NÚMERO DE PRUEBAS Presentación 1 – 96 pruebas Presentación 2 – 192 pruebas Presentación 3 – 480 pruebas REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS

3. Chernesky, MA, Mahony JB. Rubella Virus. In: Manual of Clinical Microbiology. 6th Edition (1995) 968- 973.

6. Millian, SJ, Wegman D. Rubella Serology: Applications, Limitations, and Interpretations. Amer. J. Pub.Health (1972) 170-176.

7. Bioclin – Dados de arquivos GARANTÍA DE CALIDAD

Antes de ser liberado para el consumo, todos los reactivos Bioclin son testados por el Departamento de Control de Calidad. La calidad de los reactivos es asegurada hasta la fecha de validad mencionada en el embalaje de presentacion, desde que sean almacenados y transportados en las condiciones adecuadas.

DATOS DEL FABRICANTE QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP 31565-130 - Belo Horizonte - MG - Brasil Tel.: +55 ( 31 ) 3439.5454 - Fax: +55 ( 31 ) 3439.5455 E-mail: bioclin@bioclin.com.br

CNPJ: 19.400.787/0001-07 - Industria Brasileña ATENDIMIENTO AL CONSUMIDOR Servicio de Asesoría al Cliente Tel. : 0800 0315454 E-mail: sac@bioclin.com.br

Numero de registro del kit de BIOLISA Rubéola IgG en la ANVISA: 10269360191

Revisión: Mayo/12

PANTONE 5435

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FUNCTION

Test for quantitative and qualitative of Rubella IgG antibody in human serum or plasma by immunoassay in micro plates. For in vitro diagnostic use only. PRINCIPLE OF ACTION

Methodology: Enzyme immunoassay or immunoenzymetric.

The BIOLISA Rubella IgG Kit is a solid phase enzyme immunoassay based on the indirect quantitative and qualitative detection of IgG antibodies for rubella in human serum or plasma.

IgG antibodies - rubella present in the sample bind to the antigen coated on the micro plate forming antigen-antibodies IgG. After the initial incubation, the micro plate is washed to remove unbound materials. The human enzyme conjugate anti-IgG is added to micro plate and then incubated.

The human antibody - enzyme conjugate anti IgG antibodies bind to immobilized IgG by antigens present.

A new rinse is performed to remove the leftover.

After this step, the substrates A and B are added and incubated producing a blue color indicating that the amount of IgG in the samples. The Stop Solution is added to stop the reaction having a color change to yellow, measured in a micro plate reader.

REAGENTS

1- Reference Standards (A - D) - Store between 2 and 8°C. Four (4) bottles (A - D) of Reference Standards containing rubella anti-IgG antibodies in different concentrations in tampon solution and preservative.

A – 0,0 Ul/mL B – 5,0 Ul/mL C – 10,0 Ul/mL D – 200,0 Ul/mL

2- Conjugate - Store between 2 and 8ºC. Human anti-IgG antibody linked to peroxidase and preservative.

3- Sensitized Plate - Store between 2 and 8ºC

4- Concentrated Washing Solution - Store between 2 and 8ºC. Buffer solution, surfactant and preservative.

5- Sample Diluent - Store between 2 and 8ºC. Buffer solution and preservative.

6- Substrate A - Store between 2 and 8ºC. Buffer containing hydrogen peroxide and preservative.

7- Substrate B - Store between 2 and 8ºC. Buffer containing tetramethylbenzidine (TMB) and preservative.

8- Stop Solution - Store between 2 and 8ºC. Chloridric Acid 1 M. 9- Plate Sealers

PRESENTATION

REAGENTS 1 2 3

96 CAVITIES 192 CAVITIES 480 CAVITIES

1 – Reference

Standards (A-D) A-D x 1 mL1 Flask A-D x 1 mL2 Flasks A-D x 1 mL4 Flasks 2 - Conjugate 1 Flask x 12 mL 2 Flasks x 12 mL 5 Flasks x 12 mL 3 - Sensitized Plate _{(96 cavities)}1 unit _{(96 cavities)}2 units _{(96 cavities)}5 units

4 - Concentrated

Washing Solution 1 Flask x 20 mL 2 Flasks x 20 mL 4 Flasks x 20 mL 5 - Sample Diluents 1 Flask x 12 mL 2 Flasks x 12 mL 5 Flasks x 12 mL 6 - Substrate A 1 Flask x 8 mL 2 Flasks x 8 mL 5 Flasks x 8 mL 7 - Substrate B 1 Flask x 8 mL 2 Flasks x 8 mL 5 Flasks x 8 mL 8 - Stop Solution 1 Flask x 8 mL 2 Flasks x 8 mL 4 Flasks x 8 mL

9 - Plate sealer 3 5 10

Required materials not contained in the Kit:

1- Pipette capable of dispensing volumes of 5, 50 and 100 mL with a precision greater than 1,5%.

2- Re-pipettor for repetitive pipetting volumes of 100 mL and 300 mL, with precision greater than 1,5% (optional) or multichannel pipette.

3- Micro plate washer (optional).

4- ELISA reader capable of absorbance at 450 and 630 nm wavelength. 5- Adjustable volume pipettes (200 mL to 1000 mL) for preparation of the substrate.

6- Test tubes for preparation of the substrates A and B. 7- Paper towel to dry cavities

8- Watch or stopwatches.

9- Flask to store the washing solution after diluted. 10- Distilled water.

11- Tools of Quality Control. 12- Incubator 37°C ± 2°C.

TRANSPORTATION AND STORAGE CONDITIONS

The storage temperature should be 2 to 8°C. The transport at temperatures between 15 and 30°C must not exceed 72 (seventy two) hours. Do not freeze. Keep away from light and avoid moisture.

SPECIAL CARE

1- For in vitro diagnostic use only.

2- Strictly follow the methodology proposed to obtain accurate results. 3- The envelope containing the strips should be opened only after it reaches room temperature. Place the strip with unused cavities in the aluminum bag, seal and store at 2-8°C.

4- The water used in material cleaning must to be recent and free of contaminants.

5- Deionized and saturated columns release alkaline water, several ions and oxidizing and reducing agents that can significantly alter the results. 6- All the raw material of product is tested and should be nonreactive for HBs Antigen, HIV 1 & 2 and Anti HCV. However, these tests do not provide total assurance of the absence of infectious agents. The manual manipulation of any product containing human serum is potentially capable of transmitting diseases. Therefore, we must take due care in handling the bio safety of these products.

7- Always add reagents in the same order to minimize the difference in reaction time between the cavities.

8- As a safety measure, you can cover the plate during the reaction. If you opt for this procedure it must be established as routine.

9- You must ensure that the bottom of the cavity is clean and dry and there are no bubbles on the surface fluid before reading the plate. Do not let the cavities run dry during the test.

10- Do not expose reagents, especially the substrate, to strong light or hypochlorite fumes during storage or incubation steps.

11- Stop Solution contains hydrochloric acid, which is a strong acid. Handle it with care.

12- We recommend applying the local, state and federal rules for environmental protection, so that disposal of reagents and biological material can be made in accordance with current legislation.

13- To obtain information related to biosafety or in case of accidents with the product, consult the MSDS (Material Safety Data Sheet) available on the website www.bioclin.com.br or upon request by the SAC (Advisory Service Customer) of Quibasa.

SAMPLES

Use serum or plasma (EDTA or Heparin).

Hemolyzed or highly lipemic samples should not be used.

Samples may be refrigerated at between 2 and 8°C for a maximum of 5 days. If samples can not be analyzed within 5 days, they can be stored for up to 30 days at -20ºC (freezer).

PROCESS DESCRIPTION

until expiration date printed on the original bottle. Can be stored at room temperature. In case of crystallization, heat it at 37ºC until dissolution. Substrate - Working Solution

Determine the amount of cavities to be used for preparation of an appropriate volume. Prepare the solution by mixing equal parts of Substrate A and Substrate B, 15 minutes before use. Keep it protected from light until used. To each cavity (test), use:

50 mL of substrate A + 50 mL of substrate B

For example: mix 1 mL of Substrate A and 1 mL of Substrate B to two strips with 8 cavities (16 tests). Leftover reagent occurs.

Use no later than one (1) hour after preparation. TECHNIQUE

Before starting the assay, bring all reagents, samples, Standard References and controls to stabilize at room temperature (15-30°C) for at least 40 minutes.

Return the strips of the plate will not be used for the original sealed packaging.

1- Select the wells to be used considering: Standards, controls and samples (either tested in duplicate);

2- Select the first cavity for Blank (OPTIONAL);

3- Pipette 100 mL of Standard Reference (A - D) in the determined cavities; 4- Pipette 100 mL of Sample Diluents in certain cavities for samples and then pipette 5 mL of sample on sample diluent.

5- Mix gently for ± 30 seconds;

Change occurs in color from green to blue in the cavities of the samples. Cover wells with plate sealer;

6- Incubate for 30 minutes ± 2 minutes in an incubator at 37°C ± 2°C; 7- Remove the sealing of wells;

8- Discard the contents of the wells by aspiration (Washer) or by decanting (manual); Use approximately 300 mL of Washing Solution, previously prepared* to perform a total of five (5) washing cycles. To ensure drying of the plate at the end of the wash, hit the board for a few seconds on absorbent paper.

Note: Poor washing and drying can cause inadequate results.

9- Pipette 100 mL of Conjugate into each well except in the Blank cavity (if you made this option);

10- Mix gently for ± 30 seconds. Cover cavities with plate sealer;

11- Incubate for 30 minutes ± 2 minutes in an incubator at 37°C ± 2°C; 12- Remove the sealer from plate cavities;

13- Repeat item 8;

14- WARNING Do one of the following:

A) Pipette 100 mL of previously substrate* - Working Solution (A+B) in each cavity.

*See PREPARATION OF WORKING REAGENTS Or

B) Pipette 50 mL of Substrate A to each cavity. Pipette 50 mL of Substrate B into each cavity;

15- Shake gently for ± 30 seconds. Cover wells with plate sealer; 16- Incubate for 10 minutes ± 1 minute. In an incubator at 37°C ± 2°C; 17- Remove the sealer from plate cavities;

18- Pipette 50 mL of Stop Solution to each cavity; 19- Mix gently for ± 30 seconds;

20- Perform Reading: 450 nm (primary filter)/630 nm (secondary filter) within 30 minutes (maximum).

TECHNIQUE VERIFICATION

Verify if the results obtained by the reading of the Reference Standards are compatible to the values below:

ITEM ABSORBANCE

Blank < 0,050 Standard Reference A < 0,100 Standard Reference B > 0,200 and < 0,700 Standard Reference C > Abs B and < Abs D Standard Reference D > 1,500

The absorbancies for the Reference Standards were obtained after the reduction of the blank absorbance. For a single filter reading (450 nm) consider a blank limit of < 0,100.

If the values fall out from the expected values, you must repeat the technique. CALCULATIONS

QUALITATIVE

Cut-Off regarded as the mean absorbance obtained with the Standard Reference C.

Standard Reference C A1 = 1,012 A2 = 1,102 Average Absorbance (1,012 + 1,102) / 2 = 1,057

Calculate the index by dividing the sample absorbance by the value of the Cut-Off.

Example:

Sample 1,779 Cut-off Value 1,057 Index: Sample / Cut-off Value 1,779 / 1,057 = 1,683

QUANTITATIVE

A calibration curve is used to determine the concentration of anti-rubella virus in unknown samples.

Preparation of Calibration Curve

Record the absorbance obtained in the micro plate reader as outlined in Example 1. Calculate the averages of duplicates (if they are carried duplicates).

Plot the absorbances of each Reference Standard versus the corresponding concentration in Ul/mL on graph paper (before you plot them on the graph.) Plot the curve.

Note: Data presented in example 1 are for illustration only and may not be used in replacement to the calibration curve, which should be constructed in the laboratory.

BIOLISA RUBELLA IgG

K125

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Example 1

STANDARDS ABSORBANCE _ABSORBANCEAVERAGE CONCENTRATION A 0,04 0,035 0 Ul / mL 0,03 B 0,22 0,235 5,0 Ul/ mL 0,25 C 0,84 0,85 10,0 Ul/ mL 0,86 D 2,38 2,275 200,0 Ul/ mL 2,17

Samples that have absorbance above the Reference Standard D, must be pre-diluted using Sample Diluents and should be retested. Concentration must be multiplied by the dilution factor. Automatic reading and calculation can be performed on the linear regression function in appropriate computer programs.

RESULTS

RESULTS QUALITATIVE QUANTITATIVE

INDEX CONCENTRATION

Negative < 0,5 < 5,0 Ul/mL Positive > 1,1 ≥ 10,0 Ul/mL Undetermined ≥ 0,5 and ≤ 1,1 5,0 – 10,0 Ul/mL

Note: In case of undetermined results, the sample must be retested. Samples that results have been obtained repeatedly undetermined should be retested using an alternative method.

If the results remain uncertain, a new sample must be collected in two weeks. If the new sample is positive, the sample should be considered positive. PROCEDURE LIMITATIONS

The interpretation of a diagnostic test, there should not be based on a single run. This should include confirmation of other tests before a sample is considered positive. A negative result does not exclude the possibility of exposure. Finally, all results should be interpreted in conjunction with other clinical information available.

INTERNAL QUALITY CONTROL

The Clinical Laboratory must have an internal quality control, where all procedures, rules, limits and tolerance to variations be clearly established. It is important to mention that all measurement systems present a analytical variety, and it must be monitor by the laboratory. Therefore, it is recommendable the use of controls, allowing the precision and accuracy of the dosages.

PRODUCT PERFORMANCE QUALITY CONTROL Accuracy

COMPARISON OF METHODS AND SPECIFICITY METHODOLOGY The BIOLISA-Rubella IgG kit was compared with another commercially available ELISA kit. Seven (07) human serum samples were used. The equation of linear regression line obtained was Y = 1,0051 x + 0,2739 and correlation coefficient of 0,9999. With these results we can conclude that the kit shows good methodological specificity.

Accuracy REPEATABILITY

20 successive measurements were performed with three samples, using the same lot, resulting in the following results:

REPEATABILITY SAMPLE

1 2 3

Average (UI/mL) 2,546 18,478 112,744 Standard Deviation (UI/mL) 0,039 0,486 0,271 Coefficient of Variation (%) 1,532 2,630 0,240

REPRODUCIBILITY

20 measurements were performed for 3 consecutive days with three samples, using the same lot, obtaining the following results:

REPRODUCIBILITY SAMPLE

1 2 3

Average (UI/mL) 2,545 18,615 112,645 Standard Deviation (UI/mL) 0,002 0,120 0,093 Coefficient of Variation (%) 0,091 0,642 0,083

Analytical Sensitivity

The sensitivity indicates the limit of detection. Was calculated from twenty (20) determinations of Rubella IgG in a sample from these analytes. An average value equal to 0,98 Ul/mL with a standard deviation of 0,01 Ul/mL. The sensitivity, which is the sum of the average found with three times the standard deviation for this method is equal to 1,01 Ul/mL.

Clinical sensitivity and specificity

BIOLISA Rubella IgG Kit analyzed clinical samples in comparison with other kit of EIA.

The results show that the clinical sensitivity of the BIOLISA Rubella IgG kit is > 96,4% and clinical specificity is 99,9%.

BIOLISA Rubella IgG X Reference EIA

METHOD REFERENCE EIA

TOTAL BIOLISA RUBELLA IgG POSITIVE NEGATIVE POSITIVE 54 0 54 NEGATIVE 2 37 39 TOTAL RESULTS 56 37 93 Clinical Sensitivity: > 96,4% (87,7 - 99,6%)* Overall Agreement: 97,9% (92,4 - 99,7)* Clinical Specificity: 99,9% (90,5 - 100,0%)* * 95% Confidence Interval Linearity

The reaction is able to detect concentrations until the concentration of the highest point on the curve. For samples with higher values, dilute the same with Sample Diluents, repeat the dosage and multiply the results by the dilution factor.

DIAGNOSTIC SIGNIFICANCE

Rubella is a RNA virus, spherical, small envelope, which belongs to the Togaviridae family. It is commonly known as German or 3 days measles. The rubella virus infection is transmitted through droplets of saliva, resulting in mild contagious rash in children or young adults.

In childhood, infection is a self-limiting, benign condition characterized by fever, sore head, lymphadenopathy, arthralgia, and conjunctivitis. However, infection during pregnancy, especially in the first quarter, can lead to miscarriage, intrauterine infection causes fetal death, or congenital anomalies.

Congenital rubella depends on the period in which infection occurs and can result in complications disorders, including deafness, eye problems, including cataracts and glaucoma, congenital heart disease and mental retardation. IgM antibodies against rubella are produced initially, reaching detectable levels within 2-3 days and peak within 14-21 days after onset of symptoms that remain detectable during the next 4-8 weeks. The diagnosis of recent infection or can be obtained by the presence of IgM antibodies in the initial sample. After several days, IgG antibodies appear after IgM, with a peak of 14-21 days, varying levels persist for a lifetime. The presence of anti-rubella IgG antibodies is indicative of infection and / or immunity. NUMBER OF TESTS

Presentation 1 - 96 tests Presentation 2 - 192 tests Presentation 3 - 480 tests BIBLIOGRAPHIC REFERENCES

3. Chernesky, MA, Mahony JB. Rubella Virus. In: Manual of Clinical Microbiology. 6th Edition (1995) 968-973.

6. Millian, SJ, Wegman D. Rubella Serology: Applications, Limitations, and Interpretations. Amer. J. Pub. Health (1972) 170-176.

7. Bioclin – Dados de arquivos QUALITY ASSURANCE

Before being released for consumption, all Bioclin reagents are tested by the Department of Quality Control. The quality of reagents is assured until expiration date stated on the presentation packaging, when stored and transported under appropriate conditions.

MANUFACTURER’S DATA QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP 31565-130 - Belo Horizonte - MG - Brasil Phone.: +55 (31) 3439.5454 - Fax: +55 (31) 3439.5455 E-mail: bioclin@bioclin.com.br

CNPJ: 19.400.787/0001-07 - Indústria Brasileira CUSTOMER SERVICE

Customer Advisory Service Phone.: 0800 0315454. E-mail: sac@bioclin.com.br

ANVISA registration for BIOLISA Rubella IgG Kit: 10269360191. Review: May/12