TriCat TM ELISA
Ensaio imunoenzimático manual e automático para diagnóstico
in vitro para a determinação quantitativa de adrenalina, noradrenalina e
dopamina em plasma e urina humanos.
RE59395
3x96
2-8°C
I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com
1. APLICAÇÕES
Ensaio imunoenzimático manual e automático para diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de adrenalina (epinefrina), noradrenalina (norepinefrina) e dopamina em plasma e urina humanos.
2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
As catecolaminas adrenalina, noradrenalina e dopamina são sintetizadas na medula supra-renal, no sistema nervoso simpático e no cérebro. Influenciam praticamente todos os tecidos e estão envolvidas, juntamente com outros sistemas hormonais e neuronais, na regulação de uma grande variedade de processos fisiológicos.
Como as catecolaminas e os seus metabolitos, metanefrina e normetanefrina, são segregadas em quantidades superiores às normais numa série de doenças, podendo ser usadas para efeitos de diagnóstico.
Neste contexto, o diagnóstico assim como o follow-up de doenças tumorais do sistema nervoso revestem-se de especial importância. Isto aplica-revestem-se esrevestem-sencialmente ao feocromocitoma, mas também ao neuroblastoma e ao ganglioneuroma.
Devido ao passo de extracção no início do teste, o utilizador pode utilizar materiais de todas as espécies animais. Funciona com ratazanas, ratos e outros. A estrutura química das catecolaminas é idêntica em todos os animais.
3. PRINCÍPIO DO TESTE
Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica de sandwich. Os poços estão revestidos com anticorpos de cabra anti-coelho. O anticorpo líquido adicionado, direccionado contra o epitopo de uma molécula de antigénio liga-se às paredes da placa durante o tempo de incubação. O antigénio da amostra é incubado no poço revestido, juntamente com anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab) dirigido para uma região diferente da molécula de antigénio. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de antigénio. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente usando a curva padrão.
4. AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais.
9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.
5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes.
A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 °C.
6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
A libertação in-vivo de catecolaminas e metanefrinas é influenciada por diversas comidas e medicamentos. Vitamina B, café e bananas, alfa-metildopa, inibidores MAO e COMT assim como medicações relativas à hipertensão não devem ser ingeridas pelo menos durante as 72 h anteriores à recolha de amostras.
Plasma (EDTA)
A amostra de sangue deve ser armazenada a 2-8°C até ser centrifugada para separar o plasma, o que deve ser feito nas 2 h que seguem à recolha do sangue.
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento: 2-8°C ≤ -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente. Para envio, as amostras devem ser congeladas. Estabilidade: 6 horas 1 mês
Urina
É possível usar tanto a primeira urina do dia como urina de 24 h. O volume total de urina excretada durante o período de 24 h deve ser recolhido e misturado num único frasco contendo como conservante 10-15 mL de HCl 6 N. Determinar o volume total para cálculo de resultados. Misture e centrifugue as amostras antes de iniciar o ensaio.
Armazenamento: ≤ -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente. Estabilidade: 6 meses
7. MATERIAIS FORNECIDOS
Os reagentes fornecidos neste kit são suficientes para 96 extracções em determinações simples na preparação da amostra (extracção): 88 amostras de pacientes, 6 padrões e 2 controlos. Cada extracto é suficiente para uma única determinação para o teste da adrenalina, noradrenalina e dopamina.
A microplaca pode ser utilizada para os três analitos: Adrenalina, Noradrenalina e Dopamina.
Quantidade Símbolo Componente
3 x 12x8 MTP Microplaca Tiras separáveis. Revestida com anti-coelho IgG (cabra, policlonal). 1 x 6 x 2.5 mL CAL A-F Padrão A-F Adrenalina: 0; 1.5; 5.0; 15; 50; 150 ng/mL (0; 8; 27; 82; 273; 819 nmol/L) Noradrenalina: 0; 5.0; 15; 50; 150; 500 ng/mL (0; 30; 89; 296; 887; 2955 nmol/L) Dopamina: 0; 60; 180; 585; 2300; 11470 ng/mL (0; 392; 1175; 3819; 15014; 74876 nmol/L)
Pronto a usar. Contêm: [-] Adrenalina, [-] Noradrenalina, [-] Dopamina (biologicamente activas), e 0.1 M HCl.
1 x
2 x 2.5 mL CONTROL 1+2
Controlo 1+2
Pronto a usar. Contêm: [-] Adrenalina, [-] Noradrenalina, [-] Dopamina
(biologicamente activas), 0.1 M HCl. Para concentrações exactas consultar etiquetas dos frascos ou o certificado CQ.
2 x 400 µL ENZCONJ CONC Conjugado Enzimático Concentrado (50x) Contêm: Streptavidin fosfatasa alcalina, Tampão Tris, estabilizantes. 4 x EXTRPLATE Placa de Extracção (Macroplaca)
24 poços cada. Revestida com gel de afinidade de borato.
2 x 60 mL EXTRBUF Tampão de Extracção
Quantidade Símbolo Componente
6 x 1.25 mL COMT LYO COMT liofilizado Contêm: Catecol-O-metiltransferase (fígado de porco), NaN
3.
6 x 1.25 mL COENZ Solução de Coenzima Pronto a usar. Contêm: S-Adenosil-L-Metionina, estabilizantes.
3 x 3 mL ENZBUF Tampão Enzimático
Pronto a usar. Contêm: Tampão Tris, HCl, estabilizantes.
1 x 100 mL RELEASEBUF Tampão de Libertação
Colorido Amarelo. Pronto a usar. Contêm: 0.1 M HCl, Indicador.
2 x 3.0 mL ACYLREAG Reagente de Acilação Pronto a usar. Contêm: dimetilformamida, Ethanol.Cuidado! Tóxico. Altamente inflamável.
2 x 100 mL WASHBUF CONC Tampão de Lavagem Concentrado (10x)
Contêm: Tampão Tris, HCl, Tween, 0.2 % NaN3.
2 x 2 mL COMT ADD COMT Aditivo
Contêm: plasma humano, estabilizantes, 0.01 % Timerosal.
1 x 8.0 mL ANTISERUM AD Adrenalina Antisoro Colorido verde. Pronto a usar. Contêm: anticorpos contra Adrenalina (coelho), Tampão, estabilizantes.
1 x 8.0 mL ANTISERUM NAD Noradrenalina Antisoro Cor azul. Pronto a usar. Contêm: anticorpos contra Noradrenalina (coelho), Tampão, estabilizantes.
1 x 8.0 mL ANTISERUM DO Dopamina Antisoro cor-de-violeta Pronto a usar. Contêm: anticorpos contra Dopamina (coelho), Tampão, estabilizantes.
3 x 25 mL PNPP SUBS Solução de Substrato PNPP
Pronto a usar. Contêm: p-nitrofenil fosfato (PNPP).
3 x 15 mL PNPP STOP Solução de Paragem PNPP
Pronto a usar. Contêm: 1 M NaOH, 0.25 M EDTA.
9 x FOIL Película Aderente
8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 10; 10-100; 100-1000 µL 2. Agitador orbital (200-900 rpm) (p.ex. EAS 2/4, SLT)
3. Vortex
4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 405 nm
(comprimento de onda de referência 600-650 nm) 7. Água bidestilada ou bi-destilada
8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro 9. Tubos de ensaio descartáveis para diluição de amostras 10. 0.1 M HCl, para diluição de amostras (Urina)
9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem.
5. Usar um esquema de pipetagem para verificar a distribuição adequada pelos poços da placa. Um esquema de pipetagem tanto para pré-tratamento de amostras como para o ensaio está disponível no site da IBL.
6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados na mesma sequência de ordem e tempo. Recomenda-se o uso de uma pipeta de 8 canais para pipetagem das soluções em todos os poços.
7. A lavagem das microplacas é importante. Poços lavados incorrectamente levarão a resultados errados. Recomenda-se o uso de uma pipeta multicanal ou de um sistema de lavagem de microplacas automático. Não permitir que os poços sequem entre incubações. Não arranhar os poços revestidos durante a lavagem e a aspiração. Lavar e adicionar todos os reagentes com cuidado. Ao lavar, verificar que todos os poços contêm o mesmo volume de Tampão de Lavagem e que não existem resíduos nos poços.
8. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10. PROCEDIMENTO MANUAL
10.1. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
Os conteúdos do kit para 3 x 96 determinações podem ser divididos em 2 experiências separadas. Pode ocorrer a separação de quantidades visíveis de gel da superfície da placa de extracção durante a extracção. Este facto não influencia os resultados do teste.
Contaminação aérea por desinfectantes contendo peroxigénio para limpeza de superfícies ou equipamentos utilizados em pó ou em solução, p.e. VIRKON deve ser evitado em qualquer caso.Estes compostos alteram fortemente o desempenho do ensaio.
VIRKON é marca registada da DuPont.
10.1.1. Diluição de Amostras
As amostras que se suspeite conterem concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser diluídas como segue:
Amostra diluir com Observações
Plasma > padrão mais elevado agua bidest. antes do passo de extracção
Urina > padrão mais elevado 0.1 N HCl antes do passo de extracção
10.1.2. Extracção de Amostras, Padrões e Controlos (Placa de Extracção) (versão manual)
1. Pipetar 20 µL de cada Padrão, Controlo e amostra de urina e 500 µL de cada amostra de plasma para os respectivos poços da placa de extracção. Adicionar 500 µL de água bidest. a todos os poços excepto aos com amostras de plasma para corrigir diferenças de volumes.
2. Pipetar 1000 µL de Tampão de Extracção para cada poço.
3. Tapar a placa com película adesiva. Extrair 30 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (600–900 rpm).
Durante a extracção, a superfície do líquido deve humedecer a película aderente mas o nível de líquido não deve exceder 2/3 do poço. Salpicos não afectam os resultados.
4. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. 5. Pipetar 2 mL de água bidest. para cada poço.
6. Tapar a placa com nova película adesiva. Agitar 5 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (600–900 rpm). Salpicos não afectam os resultados.
7. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. Remover completamente o líquido.
8. Pipetar 150 µL de Tampão de Extracção para cada poço. Adicionar 50 µL de Reagente de Acilação a cada poço. Misturar imediatamente após pipetagem.
9. Extrair 20 min à TA (18-25°C) (sem película aderente) num agitador orbital (400–600 rpm).
10. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. Remover completamente o líquido.
11. Pipetar 2 mL de água bidest. para cada poço.
12. Tapar a placa com nova película adesiva. Agitar 5 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (600–900 rpm). Salpicos não afectam os resultados.
13. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. Remover completamente o líquido.
14. Pipetar 300 µL de Tampão de Libertação para cada poço.
15. Agitar 30 min à TA (18-25°C) (sem película aderente) num agitador orbital (400–600 rpm).
As amostras preparadas devem ser testadas no próprio dia. Caso não seja possível, pode armazenar a placa de extracção coberta com folha adesiva durante a noite a 2-8ºC.
Importante para a medição da Dopamina.
Deve ser efectuada em tubos separados a diluição de padrões e controlos extraídos antes de
serem pipetados nos poços da Microplaca. Deve diluir também as amostras de urina previamente. Assim, dilua todos os Padrões, Controlos e amostras de urina extraídos a 1:51 com Tampão de Libertação em tubos descartáveis. (i.e. 10 µL de amostras extraídas + 500 µL de Tampão de Libertação).
Amostras de plasma extraídas não necessitam de diluição prévia. 10.1.3. Preparação de componentes concentrados
Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 3 x 6 tiras (3 x 48 determinações) Diluir /
dissolver Componente com Diluente Relação Observações Armazena-mento Estabilidade
75 mL WASHBUF CONC 675 mL agua bidest. 1:10 Misturar energicamente. 2-8°C 4 semanas 300 µL ENZCONJ CONC 15 mL WASHBUF (diluído) 1:51 Preparar mesmo antes de usar e utilizar apenas uma vez.
Misturar sem fazer espuma. 18-25°C 5 horas
10.2. PROCEDIMENTO DO ENSAIO (versão manual) 10.2.1. Preparação de Solução Enzimática COMT
A Solução Enzimática COMT deve ser preparada imediatamente antes da sua utilização. Dissolva cada componente do COMT liofilizado em 1.25 mL de água bidestilada e misture o COMT* dissolvido.
Em seguida pipete 1.25 mL de Solução de Coenzima, depois mais 1.25 mL de Tampão Enzimático e 0.40 mL de Aditivo COMT aos frascos de COMT misturado para dar um volume final de 4.5 mL de Solução Enzimática COMT por frasco.
Prepare três (3) frascos para 48 determinações de adrenalina, 48 determinações de noradrenalina e 48 determinações de dopamina. A solução pode aparecer turva. Misturar sem fazer espuma. A solução COMT é estável à temperatura ambiente durante 1 hora.
* Si solamente se necesita una aliquota de COMT, retire el volumen necesario del frasco de COMT. El resto de la solución de COMT debe ser congelada en forma inmediata a -20°C en aliquotas. En estas condiciones la solución COMT es estable por 1-2 meses.
10.2.2. Derivatização Enzimática de Amostras, Padrões e Controlos (Microplaca)
Se pipetar com deslocamento positivo, devolva o líquido residual da ponta da pipeta para os poços correspondentes da placa de extracção, de outra forma os extractos podem não ser suficientes para a determinação dos outros analitos.
É útil segurar a placa de extracção em posição inclinada.
Antes de utilizar as microplacas, defina e marque os poços para Adrenalina, Noradrenalina e Dopamina.
10.2.3. Para uso na pesquisa de homogeneizados de tecidos e sobrenadantes de culturas celulares recomenda-se o seguinte:
O trabalho com sobrenadantes de culturas celulares depende da matriz bem como das concentrações esperadas:
De acordo com o protocolo para a urina (extracção de pelo menos 20 µL de sobrenadante) pode ser esperada uma sensibilidade para a adrenalina de 0.3 ng/mL, para a noradrenalina de 0.6 ng/mL e para a dopamina de 5 ng/mL para a amostra diluída. No caso de uma matriz com adição de soro (FCS), o protocolo do plasma (extracção de 500 µL de sobrenadante) pode ser utilizado com as sensibilidades correspondentes ao protocolo do plasma (ver 16. DESEMPENHO).
Para homogeneizados de tecidos não deve ser utilizado ácido perclórico para a homogeneização. Para informação adicional contacte a IBL.
10.2.4. Adrenalina em urina e plasma
1. Pipetar 75 µL de Solução Enzimática COMT acabada de preparar para cada poço da Microplaca. Agitar rapidamente a placa.
2. Pipetar 100 µL de cada extraído Padrão, Controlo e amostra para os respectivos poços. Durante este passo segure a ponta da pipeta directamente na solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar rapidamente a placa.
3. Pipetar 50 µL de Antisoro para Adrenalina (cor verde) para cada poço.
4. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 120 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm).
10.2.5. Noradrenalina em urina e plasma
1. Pipetar 25 µL de Solução Enzimática COMT acabada de preparar para cada poço da Microplaca. Agitar rapidamente a placa.
2. Pipetar 25 µL de cada extraído Padrão, Controlo e amostra para os respectivos poços. Durante este passo segure a ponta da pipeta directamente na solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar rapidamente a placa.
3. Pipetar 50 µL de Antisoro para Noradrenalina (cor azul) para cada poço.
4. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 120 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm).
10.2.6. Dopamina em urina e plasma
1. Pipetar 75 µL de Solução Enzimática COMT acabada de preparar para cada poço da Microplaca. Agitar rapidamente a placa.
2. Em urina: Pipetar 100 µL de 1:51 Padrão, Controlos e amostra de urina previamente diluídos e extraídos nos respectivos poços.
Durante este passo segure a ponta da pipeta directamente na solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar rapidamente a placa.
Em plasma: Pipetar 100 µL de extracto de Padrão e Controlo previamente diluídos a 1:51, e extracto da amostra de palsma não dilúido para os respectivos poços.
Durante este passo segure a ponta da pipeta directamente na solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar rapidamente a placa.
3. Pipetar 50 µL de Antisoro para Dopamina (cor-de-violeta) para cada poço.
4. Tapar a placa com película aderente. Incubar 120 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm).
10.2.7. ELISA
O procedimento seguinte deve ser realizado para Adrenalina, Noradrenalina e Dopamina.
1. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 6 x com 250 - 300 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
2. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço. 3. Tapar a placa com nova película adesiva.
Incubar 60 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm).
4. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 6 x com 250 - 300 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
5. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
6. Pipetar 200 µL da Solução de Substrato PNPP para cada poço.
7. Incubare 40 min à TA (18-25°C) (sem película adesival) num agitator orbital (400–600 rpm).
8. Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução Stop PNPP para cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
9. Medir densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (comprimento de onda de referência: 620-650 nm)
nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução Stop. Não deve haver bolhas de ar visíveis.
11. PROCEDIMENTO AUTOMÁTICO
11.1. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE (versão automático)
Os conteúdos do kit para 3 x 96 determinações podem ser divididos em 2 experiências separadas. Pode ocorrer a separação de quantidades visíveis de gel da superfície da placa de extracção durante a extracção. Este facto não influencia os resultados do teste.
Contaminação aérea por desinfectantes contendo peroxigénio para limpeza de superfícies ou equipamentos utilizados em pó ou em solução, p.e. VIRKON deve ser evitado em qualquer caso.Estes compostos alteram fortemente o desempenho do ensaio.
VIRKON é marca registada da DuPont.
11.1.1. Diluição de Amostras
As amostras que se suspeite conterem concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser diluídas como segue:
Amostra diluir com Observações
Plasma > padrão mais elevado agua bidest. antes do passo de extracção
11.1.2. Extracção de Amostras, Padrões e Controlos (Placa de Extracção) (versão automático)
1. Pipetar 30 µL de cada Padrão, Controlo e amostra de urina e 750 µL de cada amostra de plasma para os respectivos poços da placa de extracção. Adicionar 750 µL de água bidest. a todos os poços excepto aos com amostras de plasma para corrigir diferenças de volumes.
2. Pipetar 1000 µL de Tampão de Extracção para cada poço.
3. Tapar a placa com película adesiva. Extrair 30 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (600-900 rpm). Durante a extracção, a superfície do líquido deve humedecer a película aderente mas o nível de líquido não deve exceder 2/3 do poço. Salpicos não afectam os resultados.
4. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. 5. Pipetar 2 mL de água bidest. para cada poço.
6. Tapar a placa com nova película adesiva. Agitar 5 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (600-900 rpm). Salpicos não afectam os resultados.
7. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. Remover completamente o líquido.
8. Pipetar 150 µL de Tampão de Extracção para cada poço. Adicionar 50 µL de Reagente de Acilação a cada poço. Misturar imediatamente após pipetagem.
9. Extrair 20 min à TA (18-25°C) (sem película aderente) num agitador orbital (400–600 rpm).
10. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. Remover completamente o líquido.
11. Pipetar 2 mL de água bidest. para cada poço.
12. Tapar a placa com nova película adesiva. Agitar 5 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (600-900 rpm). Salpicos não afectam os resultados.
13. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. Remover completamente o líquido.
14. Pipetar 450 µL de Tampão de Libertação para cada poço.
15. Agitar 30 min à TA (18-25°C) (sem película aderente) num agitador orbital (400–600 rpm).
As amostras preparadas devem ser testadas no próprio dia. Caso não seja possível, pode armazenar a placa de extracção coberta com folha adesiva durante a noite a 2-8°C.
Importante para a medição da Dopamina.
Deve ser efectuada em tubos separados a diluição de padrões e controlos extraídos antes de
serem pipetados nos poços da Microplaca. Deve diluir também as amostras de urina previamente. Assim, dilua todos os Padrões, Controlos e amostras de urina extraídos a 1:51 com Tampão de Libertação em tubos descartáveis. (i.e. 10 µL de amostras extraídas + 500 µL de Tampão de Libertação).
Amostras de plasma extraídas não necessitam de diluição prévia. 11.1.3. Preparação de componentes concentrados
Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 3 x 6 tiras (3 x 48 determinações) Diluir /
dissolver Componente com Diluente Relação Observações Armazena-mento Estabilidade
75 mL WASHBUF CONC 675 mL agua bidest. 1:10 Misturar energicamente. 2-8°C 4 semanas 380 µL ENZCONJ CONC 19 mL WASHBUF (diluído) 1:51 Preparar mesmo antes de usar e utilizar apenas uma vez.
Misturar sem fazer espuma. 18-25°C 5 horas
11.2. PROCEDIMENTO DO ENSAIO (versão automático) 11.2.1. Preparação de Solução Enzimática COMT
Dissolva cada componente do COMT liofilizado em 1.25 mL de água bidestilada e misture o COMT* dissolvido.
Em seguida pipete 1.25 mL de Solução de Coenzima, depois mais 1.25 mL de Tampão Enzimático e 0.40 mL de Aditivo COMT aos frascos de COMT misturado para dar um volume final de 4.5 mL de Solução Enzimática COMT por frasco.
Prepare três (3) frascos para 48 determinações de adrenalina, 48 determinações de noradrenalina e 48 determinações de dopamina. A solução pode aparecer turva. Misturar sem fazer espuma. A solução COMT é estável à temperatura ambiente durante 1 hora.
* Si solamente se necesita una aliquota de COMT, retire el volumen necesario del frasco de COMT. El resto de la solución de COMT debe ser congelada en forma inmediata a -20°C en aliquotas. En estas condiciones la solución COMT es estable por 1-2 meses.
11.2.2. Para uso na pesquisa de homogeneizados de tecidos e sobrenadantes de culturas celulares recomenda-se o seguinte:
O trabalho com sobrenadantes de culturas celulares depende da matriz bem como das concentrações esperadas: De acordo com o protocolo para a urina (extracção de pelo menos 20 µL de sobrenadante) pode ser esperada uma sensibilidade para a adrenalina de 0.3 ng/mL, para a noradrenalina de 0.6 ng/mL e para a dopamina de 5 ng/mL para a amostra diluída.
No caso de uma matriz com adição de soro (FCS), o protocolo do plasma (extracção de 500 µL de sobrenadante) pode ser utilizado com as sensibilidades correspondentes ao protocolo do plasma (ver 16. DESEMPENHO)
Para homogeneizados de tecidos não deve ser utilizado ácido perclórico para a homogeneização. Para informação adicional contacte a IBL-International.
11.2.3. Derivatização Enzimática de Amostras, Padrões e Controlos (Microplaca) 11.2.4. Adrenalina em urina e plasma
1. Pipetar 75 µL de Solução Enzimática COMT acabada de preparar para cada poço da Microplaca. Agite a placa por 1 min.
2. Pipetar 100 µL de cada extraído Padrão, Controlo e amostra para os respectivos poços. Durante este passo segure a ponta da pipeta directamente na solução COMT. A cor muda para rosa. Agite a placa por 1 min.
3. Pipetar 50 µL de Antisoro para Adrenalina (cor verde) para cada poço.
4. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 120 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400-600 rpm).
11.2.5. Noradrenalina em urina e plasma
1. Pipetar 25 µL de Solução Enzimática COMT acabada de preparar para cada poço da Microplaca. Agitar a placa por 1 min.
2. Pipetar 25 µL de cada extraído Padrão, Controlo e amostra para os respectivos poços. Durante este passo segure a ponta da pipeta directamente na solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar a placa por 1 min.
3. Pipetar 50 µL de Antisoro para Noradrenalina (cor azul) para cada poço.
4. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 120 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm).
11.2.6. Dopamina em urina e plasma
1. Pipetar 75 µL de Solução Enzimática COMT acabada de preparar para cada poço da Microplaca. Agitar rapidamente a placa.
2. Em urina: Pipetar 100 µL de 1:51 Padrão, Controlos e amostra de urina extraídos y previamente diluídos nos respectivos poços.
Durante este passo segure a ponta da pipeta directamente na solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar rapidamente a placa.
Em plasma: Pipetar 100 µL de extracto de Padrão e Controlo previamente diluídos a 1:51 , e extracto da amostra de plasma não dilúido para os respectivos poços.
Durante este passo segure a ponta da pipeta directamente na solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar rapidamente a placa.
3. Pipetar 50 µL de Antisoro para Dopamina (cor-de-violeta) para cada poço.
4. Tapar a placa com película aderente. Incubar 120 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm).
11.2.7. ELISA
O procedimento seguinte deve ser realizado para Adrenalina, Noradrenalina e Dopamina.
1. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 6 x com 250-300 µL de Tampão de Lavagem diluído. 2. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático para cada poço.
3. Tapar a placa. Incubar 60 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm).
4. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 6 x com 250-300 µL de Tampão de Lavagem diluído. 5. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e
de Paragem.
6. Pipetar 200 µL da Solução de Substrato PNPP para cada poço.
7. Incubar 40 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm). Se a temperatura no aparelho exceder os 25°C, deve ser encurtado o tempo de incubação para 30 minutos para evitar sobreposição de sinal.
8. Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução de Paragem PNPP para cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
9. Medir densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (comprimento de onda de referência: 620-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem.
12. CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser repetida.
Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.
Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e métodos de lavagem.
13. CÁLCULO DE RESULTADOS
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma boa curva é fornecida optando por por interpolação ”cubic spline”, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo “logit-log”.
Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões.
A concentração dos Controlos e das amostras de Urina em ng/mL pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.
Os resultados para a Adrenalina e Noradrenalina nas amostras de plasma em ng/mL têm que ser divididos por 25. Este factor de correcção corresponde à diferença entre o volume necessário durante o passo de extracção (20 µL de padrões vs 500 µL de plasma para a versão manual e 30 µL de padrões vs 750 µL de plasma para a versão automática).
Os resultados para a Dopamina nas amostras de plasma têm que ser divididos por 1275. Esse fator de correcção responde à diferença acima mencionada durante o passo de extração e para a prediluição dos padrões. Para fazer a conversão de ng/mL para pg/mL multiplique por 1000.
No caso de amostras diluídas os valores têm que ser multiplicados pelo factor de diluição correspondente. Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.
Conversão:
1000 pg/mL = 1 ng/mL
Adrenalina (µg/L) x 5.458 = nmol/L Noradrenalina (µg/L) x 5.911 = nmol/L Dopamina (µg/L) x 6.528 = nmol/L Curva de Calibração Típica
(Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão Adrenalina (ng/mL) DOMédia DO/DO(%) max
A 0.0 0.088 3.1 B 1.5 0.167 5.8 C 5.0 0.368 12.8 D 15 0.796 27.6 E 50 1.579 54.8 F 150 2.881 100
Padrão Noradrenalina (ng/mL) DOMédia DO/DO(%) max
A 0 0.223 0.0 B 5 0.322 6.7 C 15 0.539 21.3 D 50 0.984 51.2 E 150 1.438 81.8 F 500 1.708 100
Padrão Dopamina (ng/mL) DOMédia DO/DO(%) max
A 0 0.135 0 B 60 0.287 6.4 C 180 0.500 15.3 D 585 1.113 41.0 E 2300 2.105 82.5 F 11470 2.522 100 14. VALORES ESPERADOS
Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.
Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores: (5 % - 95 % percentil) Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade.
Urina Plasma µg/dias nmol/dias pg/mL nmol/L Adrenalina < 20 < 110 < 125 < 0.68 Noradrenalina < 90 < 535 < 600 < 3.55 Dopamina < 600 < 3917 < 100 < 0.65
15. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/-20%) nos resultados do teste se estiverem em concentrações inferiores às indicadas:
Hemoglobina 2.0 mg/mL Bilirrubina 1.0 mg/mL Triglicéridos 91 mg/mL
16. DESEMPENHO
Especificidade Analítica (Reactividade Cruzada)
Substância Adrenalina Noradrenalina Dopamina
Reactividade cruzada de outras substâncias testadas < 0.5 % Adrenalina 100 < 0.02 < 0.05 Noradrenalina < 0.4 100 < 0.05 Dopamina < 0.1 < 0.02 100 Metanefrina < 0.1 < 0.002 < 0.05 Normetanefrina < 0.1 < 0.005 < 0.05 3-MT < 0.1 < 0.002 < 0.05 L-DOPA < 0.1 < 0.001 < 0.05 Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção) Adrenalina Urina 0.2 ng/mL
Média do Sinal (Padrão Zero) + 2SD Plasma 8 pg/mL
Noradrenalina Urina Plasma 0.6 ng/mL 20 pg/mL Dopamina Urina Plasma 5 ng/mL 4 pg/mL
Precisão Intervalo (ng/mL) (%) CV
Intra-Ensaio
Adrenalina Urina Plasma 0.046 – 1.060 5.0 - 64.3 8.7 6.8 Noradrenalina Urina Plasma 0.560 - 12.38 16.0 – 256 7.3 7.4 Dopamina Urina Plasma 0.046 - 1.402 37 – 1549 10.9 7.0
Inter-Ensaio
Adrenalina Urina Plasma 0.051 – 0.979 5.2 - 74.5 12.1 15.2 Noradrenalina Urina Plasma 0.569 - 1.945 15.4 - 391.5 12.1 12.5 Dopamina Urina Plasma 0.213 - 1.055 47 – 990 10.8 16.3
Linearidade
Intervalo
(ng/mL) Diluição em Série até Intervalo (%) Adrenalina Urina Plasma 0.002 – 0.837 2.7 – 114.6 1:32 1:32 85 - 105 76 - 120 Noradrenalina Urina Plasma 0.02 - 8.2 5.1 – 423 1:32 1:32 85 - 115 89 - 111 Dopamina Urina Plasma 141 – 5732 0.04 – 1.3 1:32 1:16 100 - 135 87 - 114 Sem inibição da formação do complexo anticorpo-antigénio detectada.
Recuperação
Média
(%) Intervalo (%)
% Recuperação após adição de “reforço” Adrenalina Urina Plasma 100 95 85 - 106 85 - 120
Noradrenalina Urina Plasma 100.9 97.5 81 - 116 83 - 111 Dopamina Urina Plasma 101.5 91 89 - 113 70 - 113
Comparação Método Usado versus HPLC
Adrenalina IBL= 0.91 x HPLC + 14.0; r = 0.969; n = 120 Noradrenalina IBL = 0.75 x HPLC + 4.8; r = 0.945; n = 134 Dopamina IBL = 1.06 x HPLC - 0.154; r = 0.985; n = 90
17.
PROTOCOLO CURTO TRICAT (Adrenalina, Noradrenalina and Dopamina) ELISATempo Total do Ensaio ~ 7 horas
Amostras EDTA Plasma, Urina
Extracção e Acilação
Padrão, Controlo e amostra de urina 20 µL (Versão automática 30 µL)
Amostras de plasma 500 µL (Versão automática 750 µL)
Adicione de água bi-destilada a Padrões,
Controlos, amostra de urina 500 µL (Versão automática 750 µL)
Tampão de Extracção 1 mL
Incubação 30 min; TA; num agitador orbital (600-900 rpm)
Lavagem com água bi-destilada 2 mL
Incubação 5 min; TA; num agitador orbital (600-900 rpm)
Tampão de Extracção 150 µL
Reagente de Acilação 50 µL
Incubação 20 min; TA; num agitador orbital (400-600 rpm)
Lavagem com água bi-destilada 2 mL
Incubação 5 min; TA; num agitador orbital (600-900 rpm)
Tampão de Libertação 300 µL (Versão automática: 450 µL)
Incubação 30 min; TA; num agitador orbital (400-600 rpm)
Apenas para Dopamina:
Dilua todos os padrões extraídos, controlos e amostras de urina com Tampão de Libertação em tubos descartáveis
10 µL + 500 µL
As Amostras são preparadas agora para o ELISA Procedimento da Microplaca
Adrenalina Noradrenalina Dopamina
Solução Enzimática COMT 75 µL 25 µL 75 µL
Padrões de Dopmanina, Controllos e
Amostras de Urina prediluídos e extraídos - - 100 µL
Amostras de Plasma de Dopmaina
extraídas (sem pre-dilução) - - 100 µL
Padrão extraído, Controlo e amostra (urina
e plasma) 100 µL 25 µL -
Antisoro 50 µL (verde) 50 µL (azul) 50 µL (violeta)
Incubação 120 min; TA; num agitador orbital (400-600 rpm)
Lavagem 6 x 300 µL
Conjugado Enzimático 100 µL
Incubação 60 min;TA; num agitador orbital (400-600 rpm)
Lavagem 6 x 300 µL
Substrato 200 µL
Incubação 40 min (30 min Versão automática) ; TA; num agitador orbital (400-600 rpm)
Solução de Paragem 50 µL
Medir Densidade Optica nos 60 min. a 405 nm / 620-650 nm
18. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO
1. Rust MB, Faulhaber J et. al. Neurogenic Mechanisms Contribute to Hypertension in Mice with Disruption of the K-CL Cotransporter KCC3. Circulation Research, January (2006)
2. Creces J., Appleton Ch.: Catecholamines and their Metabolites: Evaluation of a commercial ELISA. Clin. Biochem., QML Pathology, Brisbane QLD (2004)
3. Adams, J. M. et al. Effects of 17β-Estradiol on hypoglycemia-induced increases in plasma catecholamines in the rat. Poster Society for Neuroscience, Annual Meeting, New Orleans (2003)
4. Westermann J, Hubl W, Kaiser N, Salewski L, Simple, rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by non-competitive enzyme immunoassay, compared with HPLC method. Clin. Lab., 48: 61-71 (2002)
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
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Tel.: + 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.IBL-International.com
IBL International Corp.
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Tel.: +1 (416) 645 -1703 Fax: -1704 E-MAIL: Sales@IBL-International.com WEB: http://www.IBL-International.com
LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
