CIÊNCIA EQUATORIAL
ISSN 2179-9563Artigo Original Volume 3 - Número 1 - 1º Semestre 2013
ASPECTOS GERAIS SOBRE A MODELAGEM COMPARATIVA DE PROTEÍNAS
Paulo Henrique Matayoshi Calixto
RESUMO
A caracterização funcional de uma sequência proteica é um dos principais problemas da biologia. Esse problema é facilmente minimizado com o estudo da estrutura tridimensional da proteína em questão. Na ausência de uma estrutura determinada experimentalmente, a modelagem comparativa ou por homologia pode, na maioria das vezes, construir uma estrutura tridimensional. Contudo, a modelagem comparativa implica na existência de uma proteína-molde anteriormente determinada. Por construir a estrutura tridimensional de uma proteína baseado em um molde, a modelagem comparativa é considerada a técnica mais acurada na determinação de estruturas in silico. A modelagem comparativa envolve os seguintes passos: alinhamento e seleção da estrutura molde, construção do modelo, refinamento, modelagem das alças, modelagem das cadeias laterais e validação. Além das características funcionais, a modelagem comparativa pode fornecer subsídios para o estudo de inibidores proteicos a partir da estrutura gerada. Por fim, esta revisão focou o uso da modelagem comparativa e seus principais passos envolvidos na determinação de estruturas proteicas.
Palavras-chaves: modelagem comparativa; modelagem por homologia; estrutura terciária.
GENERAL ASPECTS OF THE COMPARATIVE MODELING OF PROTEINS
ABSTRACT
Functional characterization of a protein sequence is one of the major problems of biology. This problem is easily minimized by studying the three-dimensional structure of the protein in question. In the absence of an experimentally determined structure, the comparative modeling or homology modeling can, in most cases, build three-dimensional structure. However, the comparative modeling needs the existence of a protein-template previously determined. By constructing the three dimensional structure of a protein based on a template, the comparative modeling technique is considered more accurate in the determination of structures in silico. The comparative modeling involves the following steps: alignment and selection of template structure, model building, refinement, loops modeling, side-chain modeling, and validation. In addition to the functional characteristics, comparative modeling can provide information for the study of protein inhibitors from the structure generated. Finally, this review focused on the use of comparative modeling and its main steps involved in the determination of protein structures.
INTRODUÇÃO
Até o início dos anos 2.000, o sequenciamento de genomas complexos demandava longos períodos de tempo e altos investimentos. Por exemplo, Projeto Genoma Humano mobilizou por 10 anos, uma série de centros de pesquisas em todo o mundo, a custos próximos à ordem de 3 bilhões de dólares (PICARDI; PESOLE, 2012). Após uma década, esse mesmo genoma, através do desenvolvimento de novas técnicas de sequenciamento, pode ser sequenciado em um único laboratório, no período de uma semana e a custos operacionais inferiores a 5 mil dólares (EDWARDS et al., 2013).
Diante desse cenário, um grande número de genomas foram depositados na base mundial de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Atualmente, o GenBank compreende 6.869 e 20.331 genomas completos e incompletos, respectivamente (GENOME ONLINE DATABASE, 2013). No entanto, as informações presentes na sequência de DNA são limitadas do ponto de vista proteico-estrutural e das características funcionais. Tais informações podem ser obtidas através da resolução das estruturas proteicas codificadas pelos seus respectivos gene (PETERS et al., 2012).
Experimentalmente, a determinação de estruturas proteicas pode ser alcançada através da difração de raios-X, considerada a técnica padrão ouro. Essa técnica envolve os seguintes passos: 1) purificação da proteína, usualmente alcançada via clonagem molecular; 2) cristalização proteica, um cristal da proteína é obtido em condições controladas; 3) difração dos raios-X, onde os raios-X incidem sobre o cristal e a difração gerada é captada por uma membrana; 4) obtenção das coordenadas cartesianas (x, y e z), realizada através da construção de um mapa de densidade eletrônica baseado no perfil de difração captado pela membrana (NAKANO et al., 2012). Além da difração de raios-X, a estrutura proteica pode ser determinada por ensaios de ressonância nuclear magnética (RNM). Contudo, essa técnica se aplica, quase que exclusivamente, à polipeptídios, tais como receptores celulares (KAY, 2005).
Alternativamente, a estrutura de uma proteína pode ser determinada por meios não experimentais, como é o caso da modelagem molecular. Entre as técnicas de modelagem molecular se destacam o ab initio, threading e modelagem comparativa. A resolução de estruturas proteicas pela técnica de ab initio consiste em construir a proteína “do zero”, ou seja, baseado apenas em princípios físicos, sem a influência de estruturas proteicas homólogas ou correlatas, sendo sua principal vantagem (KLEPEIS et al., 2005). Por outro lado, a principal desvantagem é que essa técnica requer grande aporte computacional e dessa forma é utilizada, quase que exclusivamente, para a determinação de estruturas de proteínas menores (HUANG et al., 2000). Outra técnica para a geração de estruturas proteicas é o threading, que consiste na modelagem de proteínas baseado no padrão de enovelamento de outras estruturas proteicas previamente determinadas. Dessa forma, sua principal vantagem é a possibilidade de modelar proteínas de médio e grande porte sem que exista a estrutura de uma proteína homóloga determinada. Contudo, por se basear em padrões de enovelamento, o threading nem sempre apresenta resultados satisfatórios (MA et al., 2013). Por fim, a estrutura de uma proteína pode ser determinada pela técnica de modelagem comparativa, também conhecida como modelagem por homologia. Essa técnica se baseia no alinhamento dos aminoácidos idênticos entre proteína-alvo e proteína-molde e no compartilhamento da conformação espacial entre esses resíduos. A modelagem comparativa é a técnica computacional que apresenta maior acurácia na determinação in
silico de estruturas proteicas. Sua principal
desvantagem se limita à dependência de uma estrutura-molde previamente determinada (GORDON; KHANNA, 2010). Nesse contexto, o objetivo deste trabalho é revisar, de forma crítica e concisa, os principais aspectos sobre as etapas necessárias para a geração estruturas proteicas por modelagem comparativa.
MODELAGEM COMPARATIVA
A modelagem comparativa se fundamenta no fato de que sequências
evolutivamente relacionadas compartilham o mesmo padrão de enovelamento da estrutura terciária. Baseado nessa premissa, a modelagem comparativa consiste de cinco estágios principais: 1) alinhamento e seleção do molde; 2) construção do modelo; 3) refinamento; 4) modelagem das alças; 5) modelagem das cadeias laterais; 6) validação (CALIXTO et al., 2013).
A acurácia da estrutura gerada por modelagem comparativa é diretamente proporcional ao grau de identidade com a proteína-molde. Caso o percentual de identidade seja superior a 50%, o modelo gerado apresentará de boa a ótima qualidade e com resultados tão precisos quanto estruturas resolvidas por raios-X de baixa resolução (KOPP; SCHWEDE, 2004). Quando o percentual de identidade oscila entre 30 e 50%, o modelo obtido apresenta boa qualidade. No entanto, para esse caso são esperados desvios de até 3,5Å em mais de 80% dos átomos de carbono-alfa (Cα) das posições reais. Por outro lado, quando o percentual de identidade é inferior a 30%, a estrutura gerada provavelmente apresentará baixa qualidade e de difícil correção no processo de refinamento. Ademais, nesses casos a estrutura, usualmente apresenta inúmeros erros estruturais e de enovelamento que não condizem com a proteína in natura (FRENKEL; TRIFONOV, 2007).
Existe grande preocupação por parte dos pesquisadores em avaliar a confiabilidade dos métodos de obtenção de estruturas in
silico. Diante disso, foi criado o CASP
(Critical Assessment of Protein Structure
Prediction), um evento global e que ocorre a
cada biênio, para avaliar os diversos métodos de predição de estruturas. O último CASP, realizado em 2011, por mais uma vez, elegeu a modelagem comparativa como o método mais acurado para a determinação in silico de proteínas (MOULT et al., 2011).
ALINHAMENTO E SELEÇÃO DO MOLDE
O grau de dificuldade em identificar uma proteína-molde pode variar de “fácil” para proteínas de famílias bem caracterizadas, a até “impossível”, para proteínas com padrão
de enovelamento desconhecido. Ademais, a proteína-molde deve satisfazer alguns requisitos, tais como: 1) identidade com a proteína-alvo superior 25-30%; 2) valor de “e” (e-value) do alinhamento próximo de zero; 3) alta taxa de cobertura do alinhamento (TUCCINARDI et al., 2010).
Nesse estágio o programa ou o servidor compara a sequência da proteína-alvo com a sequência da proteína-molde previamente depositada no PDB (Figura 1). A maneira mais comum de comparação entre sequências é o alinhamento local, sendo o BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) (WONG et al., 2011). Uma busca via BLAST contra o PDB usando como entrada a proteína-alvo, gera uma lista com as proteínas de estruturas conhecidas que poderão ser usadas como molde. Contudo, o BLAST não pode encontrar uma proteína-molde quando o percentual de identidade é inferior a 30%, nesses casos a relação de homologia entre as sequências não é confiável. O alinhamento entre sequências é mais sensível quando há relação evolutiva entre proteínas ou genes (PARK et al., 1998; LINDAHL; ELOFSSON, 2000; MAHMOOD et al., 2012). Quando o percentual de identidade entre duas sequências oscila entre 10 e 40%, apenas 42 a 47% dos resíduos estão alinhados adequadamente. Os erros de alinhamento são as principais causas de desvios na modelagem comparativa, mesmo quando a proteína-molde correta é escolhida (SKOLNICK; FETROW, 2000).
Nos últimos 10 anos, grandes progressos têm sido feito no desenvolvimento de métodos de alinhamentos mais sensíveis baseados na busca iterativa, tais como Hidden
Markov Models (HMM) (TSIGELNY et al.,
2002), Position-Specif Iterated BLAST (PSI-BLAST) (ALTSCHUL et al., 1997) e alinhamento perfil-perfil (JAROSZEWSKI et al., 2005). Ademais, ainda existem os alinhamentos múltiplos ou progressivos, que são tipicamente heurísticos. Os alinhamentos progressivos são de fácil execução e permitem a construção de alinhamentos empregando várias sequências, além de permitir o uso de sequências pouco relacionadas. O alinhamento de sequências proteicas divergentes pode ser realizado com alta acurácia através do
Figura 1: Alinhamento entre aminoácidos da proteína-alvo (Lbgp63) e da proteína-molde (Lmgp63). As sequências alinhadas correspondem à proteína madura. Os aminoácidos foram coloridos de acordo com o esquema de cores Zappo, para facilitar a visualização da conservação entre as sequências. As cores a seguir representam as características de cada aminoácido, são elas: rosa (aminoácidos alifáticos/hidrofóbicos), amarelo escuro (aromáticos), azul (de carga positiva), vermelho (carga negativa), verde (hidrofílicos), magenta (conformacionalmente especiais) e amarelo claro (cisteína). programa ClustalW2. O ClustalW2 inclui uma
série de características, tais como: 1) atribuição de diferentes pesos cada sequência em um alinhamento parcial; 2) as matrizes de substituições são variáveis em diferentes estágios do alinhamento, de acordo com a divergência das sequências a serem alinhadas (THOMPSON et al., 2002).
CONSTRUÇÃO DO MODELO
O próximo passo após o alinhamento entre as sequências da proteína-alvo e a proteína-molde é a construção do modelo por modelagem comparativa. Diferentes métodos podem ser usados para gerar o modelo estrutural, tais como montagem de corpo rígido (SCHOONMAN et al., 1998), segmento correspondente (Levitt, 1992), restrição espacial (ROST, 1999). A construção do modelo pelo método de montagem de corpo rígido se baseia na dissecção da proteína-alvo em regiões conservadas e variáveis comparadas à proteína-molde. A acurácia do modelo depende diretamente da escolha da proteína-molde e do percentual de identidade
do alinhamento. Ademais, a montagem de corpo rígido permite um grau de flexibilidade e automação, proporcionando a construção de modelos de boa qualidade de maneira fácil e rápida (SCHOONMAN et al., 1998). O segundo método de geração de estruturas, o segmento correspondente, se baseia na construção de estruturas pelo uso de conjuntos de posições atômicas da proteína-molde como guia de posição. Todos os segmentos atômicos que atuam como guias de posição podem ser obtidos pelo escaneamento de proteínas com estrutura conhecida (Levitt, 1992).
Em adição aos métodos anteriores, uma estrutura proteica pode ser gerada pela busca de restrição conformacional baseado na função de energia. A modelagem por satisfação de restrição espacial se baseia na formação de várias delimitações na estrutura-alvo em construção, usando um alinhamento entre a proteína-alvo e proteínas-molde relacionadas como referência (Figura 2). A geração de estruturas por restrição espacial tem como alicerce o fato de que as distâncias entre os resíduos alinhados na alvo e proteína-molde são similares (ROST, 1999).
Figura 2. A) Estrutura da adenosina quinase de Anopheles darlingi construída por modelagem comparativa. B) Estrutura-molde da adenosina quinase de Anopheles gambiae (PDB: 3LOO). C) Sobreposição das estruturas A e B.
REFINAMENTO
O refinamento do modelo é uma questão extremamente importante, pois nessa etapa a proteína recém-modelada será tratada a fim de deixa-la mais próxima da forma nativa. Geralmente, a geração de estruturas por modelagem comparativa envolve uma série de substituições, inserções e deleções de aminoácidos. O refinamento do modelo é baseado na edição do alinhamento, modelagem das alças e das cadeias laterais. O processo de refinamento normalmente se inicia com um passo de minimização de energia usando campos de força da mecânica molecular, tais como OPLS, GROMOS, Amber, etc (ZHU et al., 2008). Contudo, em alguns casos, onde um refinamento mais aprofundado é demandado, outras técnicas podem ser usadas, como a dinâmica molecular, Monte Carlo e algoritmo baseado em genética (DAS et al., 2007). O refinamento por Monte Carlo é um dos métodos mais empregados e foca em regiões que provavelmente contêm erros, enquanto o restante da proteína se mantém relaxada em um campo de força fisicamente realista. Essa abordagem permite uma melhora significativa da conformação das cadeias principais e laterais dos aminoácidos. Ademais, vale ressaltar que a acurácia do alinhamento é diretamente proporcional ao percentual de identidade/similaridade entre as sequências das proteínas alvo e molde. A geração de modelos baseado em alinhamentos mal realizados resultam em erros que podem ser de difícil remoção durante o refinamento (MISURA; BAKER, 2005).
MODELAGEM DAS ALÇAS
O alinhamento entre duas proteínas homólogas, usualmente conta com a presença de inserções e/ou deleções, que na estrutura modelada corresponde às alças. As alças são regiões variáveis, ou seja, não são conservadas evolutivamente e frequentemente determinam a especificidade funcional da proteína e contribuem para a formação dos sítios ativos ou de ligação. Dessa forma, a modelagem das alças é de extrema importância, especialmente se a estrutura modelada for usada em simulações de interação proteína/proteína,
proteína/substrato ou proteína/inibidor (LEE et al., 2010).
As alças são estruturas mais difíceis de determinar do que fitas e hélices, que são geometricamente regulares, pois exibem grande variabilidade estrutural. O comprimento da alça geralmente é muito curto, fato que permite sua modelagem. A modelagem de alças apresenta um grande desafio, já que a mesma pode não estar presente na estrutura proteica in natura. Uma regra básica é que a estrutura da alça modelada tem consistência geométrica com o restante da proteína (MICHALSKY et al., 2003).
MODELAGEM DAS CADEIAS LATERAIS
A modelagem da cadeia lateral dos aminoácidos é um passo importante na predição da estrutura por modelagem comparativa. A predição das cadeias laterais usualmente envolve a colocação dos mesmos em coordenadas fixas em relação à cadeia principal. Essas coordenadas podem ser geradas a partir da estrutura-molde, de simulações de modelagem por ab initio ou a combinação de ambas. As cadeias laterais dos aminoácidos tendem a existir em um número limitado de conformações de baixa energia, chamados rotâmeros. A qualidade da predição das cadeias laterais pode ser analisada pelo valor do desvio médio da raiz quadrada (RMSD, do inglês root mean square
deviation) para todos os átomos (MENDES et
al., 1999).
VALIDAÇÃO DO MODELO
Cada passo da modelagem comparativa pode influenciar no processo de validação da estrutura. Assim, erros podem ser acidentalmente introduzidos e propagados nos processos anteriores e, consequentemente, impedir a validação do modelo. O modelo estrutural pode ser avaliado como um todo ou por regiões individuais. Inicialmente, o enovelamento do modelo pode ser avaliado pela similaridade com a proteína-molde. Uma necessidade básica para um modelo construído é que o mesmo apresente bons parâmetros estereoquímicos (MARTI-RENOM et al.,
2000). Consideramos como válido, a estrutura que apresenta poucas distorções nos contatos atômicos. O gráfico de Ramachandran (Figura 3) é provavelmente a ferramenta mais importante na determinação da qualidade da proteína, pois aponta a existência de impedimentos estereoquímicos na cadeia principal dos aminoácidos (LASKOWSKI et al., 1996). Ademais, a validação de uma estrutura depende da análise de outras ferramentas, tais como: 1) ERRATv2 (COLOVOS; YEATES, 1993), é um algoritmo usado para avaliar o progresso do refinamento proteico e funciona através da interação entre átomos não-ligados; 2) ProSa (WIEDERSTEIN; SIPPL, 2007), realiza a avaliação da qualidade geral da estrutura gerada, através da comparação com estruturas experimentalmente determinadas e depositadas no PDB.; 3) Verify3D (BOWIE et al., 1991), verifica a compatibilidade entre a sequência de aminoácidos e a estrutura terciária.
Figura 3. Gráfico de Ramachandran.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A modelagem comparativa é uma poderosa ferramenta da biologia computacional na elucidação de estruturas proteicas. Trata-se de uma técnica extremamente acurada, de rápida execução e ocupa uma posição de destaque na genômica estrutural, devido sua fácil automação. A geração de estruturas possibilita um melhor entendimento da função proteica. Ademais, as informações geradas pela modelagem
comparativa podem ser úteis no desenho racional de fármacos, visando o tratamento curativo e/ou profilático de diversas doenças ou infecções.
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1 - Paulo Henrique Matayoshi Calixto, Universidade Federal do Triângulo Mineiro. ph_calixto@yahoo.com
