UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
EFEITO DE SELANTES DE SULCOS E FISSURAS NA PREVENÇÃO DA DESMINERALIZAÇÃO DO ESMALTE APÓS EXPOSIÇÃO AO BIOFILME DE Streptococcus mutans. ESTUDO IN VITRO.
Niterói 2020
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
EFEITO DE SELANTES DE SULCOS E FISSURAS NA PREVENÇÃO DA DESMINERALIZAÇÃO DO ESMALTE APÓS EXPOSIÇÃO AO BIOFILME DE Streptococcus mutans. ESTUDO IN VITRO.
PATRÍCIA DA SILVA LOPES PEREIRA DA SILVA Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Clínica odontológica Orientadora: Profa. Dra. Mônica Almeida Tostes
Co-Orientadora: Profa. Dra. Maristela Barbosa Portela
Niterói 2020
Ficha caLalogrâfica automâtica - SOC.’BNO Gerada com informagoes fornecidas pelo autor
Bibftolec0rto r esponsñvel: Sandra Lopes Coelho CRB7.’3389
BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Mônica Almeida Tostes
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: Assinatura:
Profa. Dra. Renata Nunes Jardim Reis
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: Assinatura:
Profa. Dra. Andréa Vaz Braga Pintor
Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro
Decisão: Assinatura:
Niterói 2020
DEDICATÓRIA
Dedico ao meu marido Cristiano e meus filhos Cristiano Junior, Victor Hugo e Maria Carolina por todo incentivo, carinho e motivação.
AGRADECIMENTOS
À Deus por seu imenso amor;
À minha orientadora Profa Dra Mônica Almeida Tostes, pela dedicação e paciência, guiando me ao longo desta jornada;
À Profa Dra Maristela Barbosa Portela por sua disponibilidade e apoio;
Ao Prof. Dr. Antonio Ferreira-Pereira do Laboratório de Bioquímica Microbiana do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes / UFRJ e aos técnicos do LABA / UFF pela ajuda em todas as etapas laboratoriais;
Aos meus colegas do mestrado em clínica odontológica e dentística da UFF, em especial a Juliane Cucciniello, pela amizade, parceria e conhecimento compartilhado Muito obrigada!
RESUMO
Pereira da Silva PSL. Efeito de selantes de sulcos e fissuras na prevenção da desmineralização do esmalte após exposição ao biofilme de Streptococcus mutans. Estudo in vitro. Niterói: Universidade Federal Fluminense. Faculdade de Odontologia. 2020.
Esta pesquisa laboratorial investigou a desmineralização do esmalte adjacente a materiais usados como selantes de sulcos e fissuras sendo um cimento de ionômero de vidro modificado por resina, um selante resinoso com liberação de fluoreto e uma resina de baixa viscosidade. Para tal foram realizados preparos cavitários padronizados em 45 blocos de dentes bovinos (4 x 4 x 4 mm) lixados e polidos previamente. Estes foram aleatoriamente distribuídos em 3 grupos (n = 15): RI - Riva Light Cure®/ SDI; EM - Embrace™ WetBond™ Pulpdent corp.® e CO - Resina Natural Flow / DFL, como controle negativo. Os materiais foram inseridos em preparos cavitários padronizados e selados seguindo as orientações dos fabricantes. Os blocos selados foram novamente lixados com lixas 3000 e polidos com Alumina 1 µm em feltro para acabamento da margem dente / selante e foram submetidos a termociclagem (500 ciclos / 30 seg). Após verificar que não tinha excesso do material selador na margem do preparo (Microscópio Óptico 10X), a metade dos blocos, incluindo esmalte e selante, foram cobertos com verniz ácido resistente para criar uma área controle (RI, EM e CO) e uma experimental (RI - EX, EM - EX e CO - EX). Posteriormente, foram expostos ao biofilme formado por Streptococcus mutans e seguiram para avaliação da desmineralização pelo teste de microdureza Knoop (50 g / 15 seg) nas duas superfícies, controle e experimental, considerando as distâncias de 25, 50, 100, 150 e 200 µm frente a interface esmalte / selante. Em outro ensaio, os selantes sob a forma de cilindros (4 mm de diâmetro x 3 mm de espessura) foram testados acerca da sua capacidade inibitória frente a atividade metabólica do biofilme cariogênico de Streptococcus mutans por 48 h, através do teste colorimétrico de redução enzimática do Tetrazolio Tiazolil Azul (MTT). Após a exposição ao biofilme ocorreu desmineralização em todos os grupos quando comparado ao seu controle. O grupo RI - EX apresentou valores maiores de microdureza quando comparado a CO - EX (p <
0,05), mas não diferiu do EM - EX. A maior desmineralização ocorreu no grupo CO - EX, com diferença estatística em todas as distâncias, quando comparado ao seu controle (CO). RI - EX apresentou desmineralização menor quando comparado ao seu controle em todas as distâncias e o EM - EX em relação ao seu controle nas distâncias de 50 - 200 µm. A atividade microbiana foi menor no EM comparada ao CO, porém sem diferença estatística com relação ao RI. Conclui - se que ambos materiais testados possuem potencial para inibir a desmineralização no esmalte na interface dente/material quando submetido a biofilme de S. mutans.
Descritores: selante, desmineralização, Streptococcus mutans
ABSTRACT
Pereira da Silva PSL. Effect of pit and fissure sealants in preventing enamel demineralization after exposure to the Streptococcus mutans biofilm. In vitro study. Niterói: Universidade Federal Fluminense. Faculdade de Odontologia.
2020.
This laboratory research investigated the enamel demineralization adjacent to materials used as pit and fissure sealants, being a resin-modified glass ionomer cement, a resinous sealant with fluoride release and a low viscosity resin. For this purpose, standard cavity preparations were performed on 45 blocks of bovine teeth (4 x 4 x 4 mm) sanded and polished previously. These were randomly assigned to 3 groups (n = 15): RI - Riva Light Cure® / SDI; EM - Embrace™ WetBond™ Pulpdent corp.® and CO - Natural Flow resin / DFL, as a negative control. The sealants were inserted in standardized cavity preparations and sealed following the manufacturers' instructions.
The sealed blocks were again sanded with 3000 sandpaper and polished with 1 µm Alumina felt to finish the tooth / sealant margin and were subjected to thermocycling (500 cycles / 30 sec). After verifying that there was no excess of the sealing material in the preparation margin (10 X Optical Microscope), half of the blocks, including enamel and sealant, were covered with resistant acid varnish to create a control area (RI, EM and CO) and an experimental one (RI - EX, EM - EX and CO - EX). Subsequently, they were exposed to the biofilm formed by Streptococcus mutans and proceeded to assess demineralization by the Knoop microhardness test (50 g / 15 sec) on both surfaces, control and experimental, considering the distances of 25, 50, 100, 150 and 200 µm in relation to the interface. In another test, the sealants cylinders (4 mm in diameter x 3 mm in thickness) were tested for their inhibitory capacity against the metabolic activity of the cariogenic biofilm of Streptococcus mutans for 48 hours, using the colorimetric enzyme reduction test Tetrazolium Tiazolil Blue (MTT). About to the microhardness test, after exposure to the biofilm, demineralization occurred in all groups when compared to their control. The RI - EX group showed higher values of microhardness when compared to CO - EX (p < 0.05), but it did not differ from EM - EX. The greatest demineralization occurred in the CO - EX group, with statistical difference in all distances, when compared to its control (CO). RI - EX showed less demineralization when compared to its control over all distances and the EM - EX in relation to its control over distances of 50 - 200 µm. Microbial activity was lower in EM compared to CO, but without statistical difference in relation to RI. It is concluded that both tested sealants have the potential to inhibit enamel demineralization at the tooth / sealant interface when submitted to S. mutans biofilm.
Keywords: sealant, demineralization, Streptococcus mutans
SUMÁRIO
Pág.
1- INTRODUÇÃO 06
2- PROPOSIÇÃO E HIPÓTESE 08
3- MATERIAL E MÉTODOS 09
4- RESULTADOS 17
5- DISCUSSÃO 19
6- CONCLUSÃO 23
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 24
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1 - INTRODUÇÃO
O atendimento odontológico em odontopediatria busca, dentre outros fins, a implementação de medidas preventivas para impedir o estabelecimento de cárie, bem como a sua progressão [1,2]. A cárie dentária tem alta prevalência em crianças e ainda constitui um problema de saúde pública [3]. Apesar dos esforços para prevenir a doença, muitas crianças ainda apresentam lesões de cárie não tratadas, sendo a cárie em superfície oclusal uma das mais prevalentes [4]. O desenvolvimento da lesão de cárie nesta superfície ocorre pelo desequilíbrio entre os fatores etiológicos e protetores. Neste contexto os fatores determinantes para que ocorra a doença seriam a presença de bactérias associada ao consumo de carboidratos fermentáveis, enquanto os fatores protetivos incluem fluxo salivar normal, controle do biofilme, exposição de fluoretos e aplicação de selantes de fóssulas, sulcos e fissuras [2,4,5].
Em função do risco elevado de cárie na região oclusal, materiais capazes de atuar como barreira física contra o acúmulo de substrato cariogênico e biofilme têm sido indicados. Dentre estes materiais, os selantes de fóssulas, sulcos e fissuras vem sendo recomendados por décadas. O selamento é indicado quando há o risco iminente de cárie ou quando ocorre lesões de mancha branca ativa (MBA) [3,4].
Dentre os materiais propostos, os que possuem liberação de fluoretos são os mais indicados [6] por possuírem dois mecanismos de ação, a criação de uma barreira física entre o biofilme e o sistema de fóssulas, sulcos e fissuras e a barreira química pela liberação de fluoretos [6,7,8,9]. Além de uma dieta cariogênica, outros fatores de risco devem ser avaliados para indicar a aplicação do selante, dentre eles a dificuldade na higienização, dentes em infra oclusão, hipomaturação do esmalte, capuz gengival, ou seja, fatores que possam contribuir para o acúmulo de biofilme [6].
A Academia Americana de Odontopediatria considera que os materiais indicados para selantes tenham baixa viscosidade e propriedades hidrofílicas, características estas que aumentam a capacidade de adesão e consequentemente a capacidade seladora [10], ambas presentes nos dois selantes com liberação de fluoreto testados.
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Os selante resinosos são tradicionalmente considerados eficazes, devido a maiores taxas de retenção e um efeito cariostático comprovado, porém exibem desvantagem relacionada a uma técnica de aplicação exigente no controle de umidade [7,11,13]. Entretanto, o selante Embrace™ WetBond™ Pulpdent corp.® (Watertown, Massachusetts, EUA), por ser um selante hidrofílico, apresenta esta vantagem por ser tolerante a contaminação e não requer adicional agente de união.
O Embrace™ WetBond™ Pulpdent corp.® para fóssulas e fissuras, é descrito por sua alta liberação de fluoreto, alta atividade antimicrobiana, ausência de bisfenol A, resistência ao cisalhamento perto do valor mínimo aceitável e a propriedade hidrofílica muito importante, principalmente, nos casos em que a manutenção do isolamento é difícil [14,15]. O Embrace incorpora monômeros metacrilatos di, tri e multi - funcionais em uma rede ácida integrada que é ativada pela umidade e permite menor contração de polimerização pela ausência de bisfenol A [14].
Da mesma forma os selantes ionoméricos possuem propriedades hidrofílicas e liberam fluoreto, isto confere ao material afinidade `a umidade e propriedade anticariogênica, respectivamente [16,17,18,19]. Além disso, a reconhecida biocompatibilidade, adesão química a dentina e esmalte, e o coeficiente de expansão térmica semelhante ao das estruturas dentárias, ratifica a indicação dos cimentos de ionômeros de vidro em odontopediatria a mais de duas décadas [20]. Dessa maneira, há dentre os selantes, materiais resinosos com propriedade ligada à liberação fluoreto e ionoméricos com componentes resinosos (6). No entanto, apesar de, muitos estudos comprovarem a eficácia dos selantes, poucos estudos avaliaram o Riva Light Cure® / SDI (Bayswater, Victoria, Austrália) e o Embrace™ Wetbond™ Pulpdent corp.® em estudos com biofilme mensurando sua atividade antimicrobiana.
Baseado nos aspectos citados acima, o presente trabalho avaliou estes dois materiais na prevenção da desmineralização após formação de biofilme de S.
mutans, na margem do esmalte ao redor do material. Desse modo, foram testados o Riva Light Cure® / SDI, o Embrace™ Wetbond™ Pulpdent corp.® e como controle negativo a Resina Natural Flow / DFL® (Rio de Janeiro, RJ, Brasil).
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2 - PROPOSIÇÃO
Objetivo geral
Avaliar o efeito de materiais indicados para o selamento de fóssulas, sulcos e fissuras sendo um ionomérico modificado por resina, um resinoso com liberação de fluoreto e uma resina flow, na prevenção da desmineralização do esmalte adjacente aos materiais submetidos ao biofilme de Streptococcus mutans por 48 horas.
Objetivos específicos
• Investigar a desmineralização ao redor da margem esmalte / selante após a formação do biofilme de Streptococcus mutans por 48 horas mediante análise de microdureza Knoop;
• Verificar a atividade metabólica do biofilme formado sobre os diferentes selantes testados;
A hipótese nula testada considerou ausência de diferença estatisticamente significativa na prevenção da desmineralização do esmalte ao redor dos selantes avaliados, em função da distância da interface esmalte / selante e na capacidade inibitória avaliada frente ao teste de atividade metabólica do biofilme de S. mutans.
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3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Desenho do estudo
O estudo foi laboratorial analisando materiais odontológicos indicados para o selamento de fóssulas, sulcos e fissuras, tendo como substrato o dente bovino. Os materiais odontológicos foram: cimento a base de ionômero de vidro modificado por resina encapsulado e fotopolimerizável, Riva Light Cure®/ SDI; um composto resinoso com liberação de fluoreto, Embrace™ WetBond™ Pulpdent corp.® e a resina Natural Flow / DFL®, como controle negativo. Para tanto, segue a descrição do critério de seleção de dentes; o preparo das cavidades; técnicas de inserção dos selantes (Quadro 1), o processo de termociclagem; formação do biofilme cariogênico; o teste de microdureza Knoop (KHN) e a avaliação de atividade metabólica do biofilme. O desenho do estudo está demonstrado na Figura 1.
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Figura 1 – Esquema representativo do desenho experimental.
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3.2 - Seleção dos dentes
Primeiramente, o cálculo amostral foi realizado estabelecendo o poder do teste estatístico de 0,95 e significância de 0,05 com 1 de efeito de tamanho. O número mínimo requerido foi de 13 espécimes para cada grupo.
Foram selecionados dentes bovinos mantidos em solução de formol a 10% até a sua utilização, cerca de 30 dias. Os dentes foram analisados em Lupa estereoscópica (CGA 6745, Tecnival, Buenos Aires, Argentina) após o polimento com escova de Robinson e mistura de pedra pomes com água destilada em baixa rotação (Kavo Dental GmbH, Biberach, Alemanha). Foram lavados em água e escolhidos obedecendo os seguintes critérios: ausência de trincas ou defeitos macroscópicos ou qualquer outra alteração de esmalte.
Inicialmente, coroas dentárias foram seccionadas, separando-as da raiz com um disco diamantado dupla face (Diamond Wafering Blades 1/2’’, diâmetro 4’’ x 0,012’’ 7 – ref. 11 - 4244, Buehler Ltda, Lake Bluff, IL, EUA) em máquina de corte Isomet 1000 (Buehler Ltda, Lake Bluff, IL, EUA). Em seguida, as coroas foram fixadas na sua face distal com cera em placas de acrílico cristal de 4 mm x 4 mm x 5 mm e seccionadas no sentido mesio - distal, separando a face vestibular da lingual, com disco diamantado dupla face. As faces vestibulares foram fixadas com cera nas mesmas placas de acrílico. Do centro da face vestibular foram obtidos dois blocos de esmalte com dimensões de 4 x 4 x 4 mm (N = 45), através do uso de dois discos diamantados dupla face, no aparelho de corte, com um espaçador de 4 mm entre eles. Estes blocos foram removidos e seguiram para a planificação, sendo o restante descartado.
Cada espécime foi planificado e polido antes do preparo das cavidades. Para tal, os blocos de esmalte, foram fixados com cera no centro de uma base de acrílico cristal de 30 mm de diâmetro por 8 mm de espessura, com a maior área plana do esmalte voltada para baixo. Foi utilizada uma lixa 320 (Carbimet Paper Discs, Buehler, Lake Buff, IL, EUA), com refrigeração a água, para planificação da dentina.
Os blocos foram reafixados com as superfícies de esmalte incluídas de forma que ficassem visíveis, quais foram planificadas em Politriz (Arotec, Cotia, SP, Brasil) com
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lixas 600, 1000, 1200 (Extec Corp. Enfield, CT, EUA), durante 1 minuto em velocidade baixa e com a lixa 2500 (Extec Corp. Enfield, CT, EUA) por 2 min. Todo o processo de lixação foi realizado manualmente e as amostras foram condicionadas sob pressão mínima para mantê-las sobre o prato da lixadeira.
3.3 - Preparo das cavidades
Foram realizados preparos cavitários nos blocos de dente bovino, determinando um tratamento biomecânico em tecidos duros do dente, simulando condições semelhantes a potenciais fóssulas. Para tanto, os blocos foram fixados em bases de acrílico e em cada espécime, na região central vestibular, foi confeccionada uma cavidade. Os preparos foram realizados em alta velocidade sob intensa refrigeração ar / água, utilizando uma broca diamantada 2292 KG Sorensen (Barueri, SP, Brasil), com um mecanismo de ‘‘stop’’, para que um padrão de preparo fosse mantido para cada 10 dentes. Após o preparo foi realizada profilaxia com pedra pomes e água com o auxílio da escova Robinson e lavado com seringa tríplice até a completa remoção dos resíduos de material. Todos procedimentos seladores foram realizados segundo as orientações dos fabricantes (Quadro 1). Após o selamento, os blocos foram submetidos a lixa 3000 (3M, Maplewood, Minnesota, EUA) e Alumina 1 µm (Buehler, Lake Bluff, IL, EUA) e polidos com disco de feltro (TEXMET C, ref.
401108, Buehler Ltda, Lake Bluff, IL, EUA) durante 3 minutos em velocidade alta até obter - se uma superfície de aspecto vítreo. Ao final foram observados ao microscópio óptico (Stemi 2000C, Zeiss, Jena, Alemanha) na objetiva de 10 x até que nenhum material estivesse cobrindo a margem do dente.
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Quadro 1. Composição, indicação e técnica de inserção dos materiais testados.
Produto Composição Indicação Técnica do procedimento Fabricante
Riva Light Cure®
Ionômero de vidro reforçado por
resina (tecnologia Ionglass), Compartimento 1:
ácido poliacrílico, ácido tartárico, 2-hidroximetil metacrilato (HEMA), etilenoglicol dimetacrilato (EDGMA), monômeros ácidos;
Compartimento 2:
Flúor e aluminossilicato de vidro.
Restaurações pequenas de classe I, II, III e V, dentes decíduos, geriátricos, construções de núcleo, restaurações na superfície da raiz, preenchimento ou forramento, restaurações provisórias, selante de cicatrículas e fissuras.
Profilaxia com pedra pomes e água;
condicionamento com ácido fosfórico a 37%/10 seg; lavagem e secagem com leve jato de ar; ativação da cápsula e agitação por 10 seg na Ultramat S; adaptação da cápsula ao aplicador Riva; aplicação do material na cavidade; fotoativação por 20 seg.
SDI (Victoria, Australia)
Embrace™
Wetbond™
Monômeros di-, tri,multifuncionais, Fluoreto, Sílica amorfa e 36,6%
de carga.
Selante de fóssulas e Fissuras.
Profilaxia com pedra pomes e água;
condicionamento com ácido fosfórico a 37% / 15 seg; lavagem e secagem com leve jato de ar; aplicação da resina; fotoativacao 20 seg.
Pulpdent corp. ® (MA, EUA)
Resina Natural Flow
BisGMA, dimetacrilatos, Boro Alumínio, silicatos de vidro, sílica
sintética e 43% de carga.
Restaurações classe III / V, preenchimento de regiões socavadas, cimentação de facetas de porcelana, colagem de fragmentos, selamento de orifício do parafuso do implante, reparo em restaurações em resina e porcelana, hipoplasia, fluorose, erosão, abrasão ou pigmentação, selamento de fóssulas e fissuras.
Profilaxia com pedra pomes e água;
condicionamento com ácido fosfórico a 37%/30 seg; lavagem e secagem com leve jato de ar; aplicação da resina em incremento único; fotoativação 30 seg.
DFL®
(RJ, Brasil)
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3.4 - Ciclagem térmica ou Termociclagem
Os blocos dente / selante foram mantidos por 24 horas em água destilada após a realização das restaurações e em seguida submetidos a ciclagem térmica, realizada em um termociclador (Marconi, MA 470 / 3C, Piracicaba, SP, Brasil), nas temperaturas de 5ºC, 37 ºC e 55 ºC em 500 ciclos de 30 segundos cada banho.
3.5 - Formação do biofilme com Streptococcus mutans
Os blocos foram cobertos com duas camadas de esmalte ácido resistente (Colorama®), exceto a metade da superfície vestibular restaurada (Figura 1).
Anteriormente, verificou-se que não tinha excesso do material selador na margem do preparo (Microscópio Óptico, 10 X). Desse modo, a metade dos blocos, incluindo esmalte e material foi coberta com verniz ácido resistente para criar uma área controle (RI, EM e CO) e uma experimental (RI – EX, EM – EX e CO - EX), exposta ao biofilme.
Nesta fase, os espécimes foram fixados em 45 poços (subdivididos em 15 por grupo), em placas de acrílico, (TPP 24 Zellkultur Testplatte F, Trasadingen, Suíça) e esterilizado por óxido de etileno. O biofilme maduro foi então formado por uma bactéria cariogênica, o Streptococcus mutans ATCC 25175 (American Type Culture Collection, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) que foi crescida previamente por 24 horas em meio de cultura de infusão de cérebro e coração (BHI, Difco, Sparks, MD, EUA) a 37º C sob condições microaerófilas. O inóculo bacteriano foi ajustado no ponto 0.5 da escala de McFarland. Posteriormente, essa suspensão bacteriana foi diluída 1 : 100 e 10 µl foram inoculados em cada poço com BHI suplementado com 2 % de sacarose. As placas foram então incubadas a 37º C sob condições microaerófilas por 48 h. O meio de crescimento foi renovado a cada 24 h.
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3.6 - Teste de microdureza Knoop
Com os espécimes posicionados de forma paralela à mesa coordenada e ajustados para se obter o foco, foram realizadas duas fileiras de 5 indentações, sendo localizadas em esmalte e na interface esmalte / selante (Figura 1). As indentações foram realizadas em esmalte na porção central próximas aos selamentos. A primeira indentação foi realizada a 25 µm da margem esmalte / selante, a segunda a 50 µm. As demais guardaram uma distância de 50 µm entre elas. O teste foi realizado com indentador Knoop (Microdurômetro HMV-G 21ST Shimadzu® corp., Japão) utilizando força de 0.05 HK (50 g ou 490.3 mN) e o tempo de indentação de 15 segundos. Da mesma forma, o mesmo procedimento foi repetido na área controle após a remoção do verniz ácido resistente.
3.7 - Mensuração da atividade metabólica do biofilme de Streptococcus mutans
A mensuração da atividade metabólica foi realizada através de um ensaio colorimétrico que verificou a reação de redução enzimática do Tetrazólio Tiazolil Azul Brometo (MTT, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) pelas células viáveis de S.
mutans do biofilme formado. Os espécimes cilíndricos (medindo 4 mm de diâmetro e 3 mm de espessura) foram preparados cuidadosamente dispensando o material em uma matriz de acrílico padronizada. A inserção do material e fotopolimerização seguiu as recomendações dos fabricantes como descrito no Quadro 1. Uma matriz de acetato foi colocada sobre os espécimes antes de serem fotopolimerizados. Estes espécimes (N = 5) foram transferidos para os poços de placas de cultura celular (placas de 24 poços) para a indução do biofilme de S. mutans.
O biofilme de S. mutans foi induzido de acordo com a metodologia descrita no item 3.5. Após 48 h de formação de biofilme, os espécimes foram cuidadosamente transferidos para outras placas estéreis e 500 µL de MTT (1mg / ml em PBS) foram adicionados em cada poço e as placas foram incubadas a 37° C sob condições microaerófilas por 1 h na ausência de luz. Posteriormente, 500 µL de dimetilsulfóxido
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(DMSO) foram adicionados em cada poço e as placas permaneceram em incubação por mais 20 minutos sob agitação suave e na ausência de luz. As soluções foram então transferidas para placas de 96 poços e colocadas em um leitor de microplaca com comprimento de onda de 540 nm. Uma maior absorbância (valor absoluto de D.O. – densidade óptica) está relacionada a uma maior atividade metabólica das células formadoras do biofilme, o que pode ser considerado como uma maior quantidade de formação do biofilme.
3.8 - Análise estatística
Os dados foram analisados por GraphPad Prism, versão 8,0 (GraphPad Software, Inc., EUA). Inicialmente, todos os dados foram verificados pelo teste de ShapiroWilk. Com base nessas análises preliminares, os dados foram submetidos aos testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney.
O controle da KHN após a exposição ao biofilme nos mesmos grupos foram analisados usando o teste de Wilcoxon.
Todas as análises foram realizadas no nível de significância α = 0,05. O Gráfico 1, preparado pelo GraphPad Prism versão 8,0 apresenta os resultados pelas médias de dureza e coeficiente de variação nos grupos em suas diferentes distâncias avaliadas. O cálculo amostral foi realizado baseado em estudos anteriores com a mesma metodologia com o programa estatístico G*Power 3.1.
Os dados relativos às medianas, valores mínimo - máximo e coeficiente de variação dos resultados do teste de atividade metabólica do biofilme de S. mutans formado sobre os materiais após 48 h apresentam – se na Tabela 1.
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4 - RESULTADOS
4.1 – Teste de Microdureza Knoop
A média dos valores de microdureza Knoop e intervalo de confiança ao redor da margem do selamento, nas diferentes distâncias, está apresentada no gráfico 1.
Observa - se valores menores ao redor das margens de esmalte submetido ao biofilme quando comparado ao seu controle correspondente (não submetido ao biofilme). Em todos os grupos ocorreram perda de dureza quando submetido ao biofilme cariogênico, entretanto, no RI - EX esta diferença não foi significativa quando comparado ao lado controle RI (Teste Wilcoxon pareado; p > 0.05). Com relação a extensão da desmineralização, apenas na distância de 25 μm da margem esmalte / selante foi observado diferença estatisticamente significativa nas áreas expostas ao biofilme de S. mutans em todos os grupos. Nesta distância, o RI - EX apresentou o maior valor de microdureza Knoop comparado ao CO - EX e EM - EX (Kruskal Wallis, Mann Whitney; p < 0,05).
Gráfico 1. Representa as médias de dureza e coeficiente de variação nos grupos nas diferentes distâncias avaliadas. (*) significa diferença estatística no grupo considerando a área controle e experimental (exposta ao biofilme de S. mutans) nas referidas distâncias.
Distância da margem em µm
KHN
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4.2 - Teste da atividade metabólica do biofilme de Streptococcus mutans
Todos os materiais testados apresentaram acúmulo de biofilme de S. mutans após 48 h. O grupo EM apresentou diferença estatisticamente significativa quando comparado ao grupo CO, entretanto, não apresentou diferença estatisticamente significativa quando comparado ao grupo RI (Tabela 1).
Tabela 1- Tabela representativa da atividade metabólica do biofilme de S. mutans formado sobre os materiais após 48 h. Letras diferentes indicam diferença
significativa (p < 0.05).
CO EM RI
Mediana 0.061b 0.049a 0.055a
Mínimo-Máximo 0.059-0.065 0.040-0.052 0.053-0.061 Coeficiente de Variação
4.95% 13.29% 7.39%
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5. Discussão
A presente pesquisa in vitro avaliou através dos ensaios de microdureza Knoop e atividade metabólica de biofilme de S. mutans a influência de dois materiais com liberação de fluoreto indicados para selantes de sulcos e fissuras na prevenção da desmineralização em esmalte. Diversos estudos têm comparado materiais ionoméricos e resinosos na prevenção da desmineralização em fóssulas, sulcos e fissuras com diferentes metodologias [21-25]. Para tanto, neste estudo laboratorial foi realizado preparo cavitário para simular as condições de fóssulas, sulcos e fissuras, e o teste de microdureza Knoop para avaliar a desmineralização ao redor das margens do preparo após formação do biofilme por 48 horas. A microdureza Knoop tem sido amplamente utilizada para este propósito [22,26,27] e o teste da atividade metabólica do biofilme de S. mutans, por sua capacidade de simular as condições bucais, vem sendo utilizado em substituição ao pH cíclico [25].
A retenção e penetração do selante nas fóssulas, sulcos e fissuras, o risco de cárie do indivíduo e as propriedades inerentes ao material são algumas das variáveis que podem afetar a eficácia de um selante [23,24]. A ação antimicrobiana e a remineralização associadas a presença de selantes com liberação de fluoreto é amplamente reconhecida por estudos laboratoriais e clínicos [4,22,28]. Contudo, a adesão bacteriana sobre o material é influenciada por muitos fatores e estudos sugerem que a redução na aderência bacteriana de S. mutans sobre os materiais com liberação de fluoreto contribui para prevenção de cárie [29]. Na presente pesquisa os materiais com liberação de fluoreto interferiram na atividade metabólica do biofilme, confirmando o papel do fluoreto na ação antimicrobiana. De outro modo, sabe-se, que a liberação de fluoreto dos materiais reage com o esmalte / dentina formando fluoreto de cálcio (CaF2), o qual é depositado no biofilme e na lesão de cárie inicial, numa concentração capaz de inibir a progressão da lesão [27]. O modelo da presente pesquisa foi de prevenção da desmineralização e estes dois aspectos podem ter contribuído para os resultados encontrados nos grupos de materiais que liberam fluoretos.
Embora ambos materiais com liberação de fluoreto tenham apresentado capacidade de prevenir a desmineralização, o RI apresentou melhores resultados
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interferindo no processo de desmineralização próximo a interface esmalte / selante frente aos outros materiais testados, sendo compatível com a performance de material ionomérico em outras pesquisas [22,26]. Estes resultados são justificados posto que, a liberação de fluoreto em materiais ionoméricos ocorre de forma acentuada nas primeiras horas, atuando inicialmente na interface dente / material, e posteriormente acontecendo de forma mais reduzida, mantendo-se constante e em níveis menores [30]. Além disso, vale ressaltar que no presente estudo a prevenção da desmineralização ocorreu após o envelhecimento do material. O envelhecimento em água ou com termociclagem, como a utilizada na presente pesquisa, pode ter contribuído para a menor aderência bacteriana. Segundo Bürgers et al o envelhecimento pode aumentar a rugosidade do material, porém diminui a energia superficial livre. A diminuição da energia superficial influência na adesão bacteriana [29]. Bürgers et al verificaram menor adesão bacteriana sobre diversos materiais resinosos e ionoméricos, mas não avaliaram as alterações em esmalte em função dessa diminuição.
Os resultados encontrados corroboram aos de Amaral et al, que em estudo in situ, verificaram maior eficácia na remineralização em esmalte de fissuras com selante ionomérico quando comparado ao resinoso sem liberação de fluoreto [22].
Contudo, Haricharan et al em estudos in vivo não observaram nenhuma diferença significativa comparando o EM com um CIV. Entretanto, a lesão de cárie em dentina ocorreu em 7,8% e 6,7% para o CIV e EM, respectivamente [31]. De forma que, mesmo sem diferença estatística, alta taxa de perda foi evidenciada em ambos os grupos [31]. Cabe salientar, ainda que, na presente pesquisa, a mensuração da dureza do esmalte ao redor dos materiais ocorreu após a exposição dos mesmos a um desafio cariogênico (biofilme de S. mutans com meio de cultura suplementado com sacarose) por apenas 48 h. Se essa condição cariogênica perdurasse por mais tempo, resultados semelhantes aos dos estudos in vivo, descritos anteriormente, poderiam ser encontrados.
Com relação a capacidade dos materiais testados em acumular biofilme de S.
mutans em sua superfície, o grupo CO demonstrou o maior acúmulo enquanto o grupo EM apresentou menor deposição do biofilme quando comparado ao RI, porém sem diferença estatística entre esses dois últimos. Provavelmente, este resultado pode ter ocorrido em virtude da liberação de fluoreto, podendo ter sido maior no
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grupo EM. Elevada liberação de fluoreto foi observada por Fiorati - Aguiar et al.
quando avaliaram o EM comparado a outros materiais seladores. O Embrace liberou grandes quantidades de fluoreto nas primeiras horas e foi declinando com o tempo, em virtude da sua malha polimérica. De outra forma o CIV em sua pesquisa manteve liberação constante por mais tempo [14]. Adicionalmente, o EM apresentou também valores de atividade antimicrobiana superiores a outro selante com menor liberação de fluoreto [14]. Mediante o exposto, podemos deduzir que a liberação de fluoreto pode ter sido um dos fatores responsáveis pelo resultado encontrado na presente pesquisa.
No entanto, existem outros fatores, além da presença de fluoretos, que podem influenciar a formação de biofilme na superfície de um material como por exemplo, rugosidade superficial, composição química e tamanho das partículas desse material [32]. Fatores esses que não foram considerados nesta pesquisa.
A mensuração da formação do biofilme sobre os espécimes dos grupos foi realizada considerando a atividade metabólica de S. mutans através da adição de MTT, que ao sofrer uma reação enzimática proveniente das células bacterianas viáveis altera a coloração do meio, proporcionando uma medição indireta quantitativa de S. mutans vivos através da leitura espectrofotométrica. Apesar de não ser uma medição completa de todo o biofilme presente, já que esse é formado por células e matriz extracelular, trata-se de uma metodologia extensamente usada em várias pesquisas [33-35].
Anteriormente, o EM demostrou maior inibição de S. mutans comparado a outros produtos com liberação de fluoreto e ainda manteve por mais tempo a sua capacidade inibitória [36]. Entretanto, neste mesmo estudo a maior capacidade inibitória foi obtida nas amostras do material e não quando este estava associado ao esmalte [36]. Resultado semelhante ao da presente pesquisa. De forma que, a potencial associação da menor capacidade inibitória frente ao S. mutans no esmalte pode ser em decorrência da forma de liberação de fluoreto por compostos resinosos associadas a alterações do pH, interferindo no fluoreto disponível para o processo des/re. Adicionalmente, vale ressaltar que a avaliação da desmineralização foi realizada após o ciclagem e este fato pode ter também contribuindo para os resultados encontrados em função do envelhecimento do material, o que não ocorreu nos espécimes da atividade antimicrobiana. Desse modo o EM apresentou inibição
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microbiana quando o material foi testado imediatamente, mas pode não ter mantido esta liberação de fluoreto após o envelhecimento.
Dentro das limitações e considerações do estudo, vários aspectos podem ser avaliados. Primeiramente, considerar que o teste de atividade metabólica foi realizado somente com biofilme de S. mutans o que não representa o biofilme presente em fóssulas, sulcos e fissuras na cavidade bucal. Devido a este fato, nossos resultados não podem ser extrapolados para situações clínicas sem algumas restrições [29]. Além disso, a avaliação da desmineralização através de teste de microdureza Knoop é uma método indireto e amplamente utilizado, mas outros métodos podem ser utilizados com esta finalidade para avaliar a profundidade da desmineralização [22,37,38]. Avaliar a lesão de sub superfície formada podendo trazer um conhecimento maior sobre a influência desses materiais no processo de remineralização ou inibição da desmineralização.
Um outro dado interessante na presente pesquisa, foi que ambos materiais com liberação de fluoretos foram capazes de prevenir desmineralização mesmo depois do “envelhecimento” do material através do processo de termociclagem. A presente pesquisa não avaliou a desmineralização imediatamente após a inserção do material como em outros estudos [21,39]. Entretanto, apesar disso, verificamos que ocorre prevenção mesmo após o período inicial de maior liberação de fluoreto, embora de forma discreta. Este resultado enfatiza a importância do envelhecimento na interpretação dos resultados in vivo.
Outro aspecto a ser avaliado é que o CIV utilizado na presente pesquisa, RIVA Light Cure, é um ionômero modificado por resina e nenhum estudo comparou ou avaliou este material mediante sua capacidade preventiva, impossibilitando comparações entre resultados. Desde a introdução dos ionômeros de vidro como selante de fóssulas, sulcos e fissuras muitos estudos foram realizados e o ponto mais importante questionado a sua eficácia é a baixa retenção dos CIVs. Em estudos com ionômero de vidro reforçado com resina uma melhor retenção tem sido observada além da manutenção na liberação de fluoreto, mas ainda existem dúvidas com relação a sua eficácia. É de conhecimento de todos que os CIVs podem ser
“recargados” com fluoreto, que é uma vantagem clínica desse material. Este aspecto pode também ser investigado com os materiais avaliados em futuras pesquisas.
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6 - CONCLUSÃO
Analisando os resultados de microdureza Knoop, atividade metabólica do biofilme cariogênico, conclui-se que:
O grupo RI apresentou maior capacidade de prevenir desmineralização no esmalte adjacente ao material quando comparado ao grupo CO e o grupo EM. Esta prevenção ocorreu próxima à margem do material, cerca de 25 µm. Ambos materiais liberadores de fluoretos (RI e EM) apresentaram capacidade inibitória frente a atividade metabólica do biofilme cariogênico testado.
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7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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