UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS
JOSÉ EDNÉSIO DA CRUZ FREIRE
ANÁLISE IN SILICO DA SEQUÊNCIA DEDUZIDA DE PROTEÍNA LIGANTE À QUITINA DE
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
JOSÉ EDNÉSIO DA CRUZ FREIRE
DA SEQUÊNCIA DEDUZIDA DE Mo-CBP3, UMA PROTEÍNA LIGANTE À QUITINA DE Moringa oleifera LAM.
FORTALEZA 2013
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
JOSÉ EDNÉSIO DA CRUZ FREIRE
ANÁLISE IN SILICO DA SEQUÊNCIA DEDUZIDA DE Mo-CBP3, UMA PROTEÍNA LIGANTE À QUITINA DE Moringa oleifera LAM.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal
Orientadora: Profª. Drª. Ilka Maria Vasconcelos
JOSÉ EDNÉSIO DA CRUZ FREIRE
ANÁLISE IN SILICO DA SEQUÊNCIA DEDUZIDA DE Mo-CBP3, UMA PROTEÍNA LIGANTE À QUITINA DE Moringa oleifera LAM.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
APROVADA EM: _____ / _____ / _____
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Ilka Maria Vasconcelos (Orientadora) Universidade Federal do Ceará (UFC)
Prof. Dr. Thalles Barbosa Grangeiro (Co-Orientador) Universidade Federal do Ceará (UFC)
A Deus pela ciência necessária para desenvolver este trabalho.
A minha queria e compreensiva esposa, Cindy;
Aos saudosos, Genésio e Edite (meus pais);
A minha Madrasta, Maria por ter ajudado sempre que necessário;
Aos meus Irmãos, Benedito, Genedito, Evandito, Genedier, Efigênia e Lidiene,
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos, por me acolher em seu laboratório e dedicar uma valiosa orientação. Pelos questionamentos, explicações, soluções e exemplo, o qual tentarei seguir na minha caminhada científica.
Ao Prof. Dr. Thalles Barbosa Grangeiro, por sua grande contribuição para a realização deste trabalho, por meio de sugestões e explicações e co-orientação.
Ao Prof. Dr. João Paulo Matos Santos Lima, por aceitar o convite para participar desta banca.
À Dra Juliana Menezes Gifoni, por sua grande contribuição para a execução desta dissertação.
A todos os professores do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular que, de alguma forma, colaboraram para a realização deste trabalho.
A todos os integrantes dos Laboratórios de Toxinas Vegetais e Genética Molecular e Citogenética.
A Deus, pela ciência necessária para a execução deste trabalho.
Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes Instituições:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) através do Programa Reuni de Orientação e Operacionalização da Pós-Graduação Articulada à Graduação (PROPAG), pela concessão de bolsa de pós-graduação ao autor deste trabalho.
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP)
RESUMO
A Moringa oleifera é uma planta pertencente à família Moringaceae. Esta planta é nativa da Índia, sendo lá conhecida como drumstick (baqueta ou bastão de tambor). No Brasil, a M. oleifera foi introduzida na década de 1950, e é conhecida como moringa. Aproximadamente 40% do peso fresco das sementes é composto por proteínas, das quais algumas foram isoladas e caracterizadas como sendo floculantes e proteínas antinutricionais. Em adição, proteínas ligantes à quitina têm sido identificadas e isoladas, destacando-se dentre estas a Mo-CBP3, uma glicoproteína termoestável de massa molecular aparente em torno de 14,3 kDa, com potente atividade inibitória contra fungos fitopatogênicos. A fim caracterizar a sequência deduzida da Mo-CBP3, frutos de moringa foram coletados após 65 dias da antese e suas sementes submetidas à extração de RNA total. A síntese de cDNA foi dirigida por meio da técnica PCR-RACE 5'. Os produtos de PCR foram subclonados em vetores apropriados (pGEM-T Easy) e, em seguida, introduzido em hospedeiro de clonagem Escherichia coli TOP10F'. Os plasmídeos recombinantes foram purificados de células bacterianas transformadas e submetidos ao sequenciamento de DNA. A análise computacional da sequência deduzida da proteína Mo-CBP3 mostrou que esta é uma proteína de massa molecular aparente em torno de 12,85 kDa e, em condições citoplasmáticas apresenta-se instável. Possui sequências sinais deduzidas, sendo uma para peptídeo sinal, com 30 aminoácidos, e uma sequência na região C-terminal relacionada à ancoragem desta proteína à membrana plasmática, bem como ao retículo endoplasmático. Ademais, prováveis sítios de O-glicosilação e de fosforilação foram identificados. Um domínio relacionado às funções de transferência de lipídeos, de reserva e de inibidores de tripsina e de alfa-amilase foi identificado na sequência de Mo-CBP3, contribuindo, desse modo, para o entendimento de sua potente ação contra fungos fitopatogênicos.
ABSTRACT
Moringa oleifera is a tree belonging to the Moringaceae family. This plant is native from India where it is named as drumstick tree. In Brazil M. oleifera was introduced in the 1950’s decade and it is known as moringa. Approximately 40% of the fresh weight of these seeds is formed by proteins, some of which were isolated and characterized as flocculants and antinutritional proteins. In addition, the chitin binding proteins have been identified and isolated, especially among which is the Mo-CBP3, a thermostable glycoprotein of apparent molecular mass of around 14.3 kDa, with potent inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In order to characterize the deduced sequence of Mo-CBP3, moringa fruits were collected 65 days after anthesis and their seeds subjected to extraction of total RNA. cDNA synthesis was directed by ‘5’ RACE’-PCR. The PCR products were subcloned into appropriate vectors (pGEM-T Easy) and then introduced into Escherichia coli cloning host TOP10F'. The recombinant plasmids were purified from transformed bacterial cell and subjected to DNA sequencing. The computational analysis of the deduced protein sequence of Mo-CBP3 showed that this protein has an apparent molecular mass of 12.85 kDa and it is unstable in cytoplasmic conditions. It has derived signal sequences, one for the signal peptide with 30 amino acids, and a sequence at the C-terminus of this protein, related to the anchorage to the plasma membrane as well as the endoplasmic reticulum. Moreover, probable sites of O-glycosylation and phosphorylation were identified. One domain related to the lipid transfer functions, reserve and trypsin inhibitors and alpha-amylase was identified following Mo-CBP3, thereby contributing to the understanding of its potent action against phytopathogenic fungi.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Classificação taxonômica e características morfológicas da Moringa oleifera 21
Figura 2 - Fruto de Moringa oleifera coletado após 65 dias da antese 39
Figura 3 - Esquema geral de purificação do DNA genômico de sementes de Moringa oleifera 40
Figura 4 -
Mapa do vetor de clonagem pGEM T-Easy, destacando os diversos sítios de restrição de diferentes enzimas, a região do gene que confere resistência à ampicilina e o gene lacZ
51
Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose (1%) de DNA genômico de Moringa oleifera 59
Figura 6 - DNA amplificado a partir do DNA genômico extraído de sementes de Moringa oleifera 61
Figura 7 - Eletroforese em gel de agarose (1,5%) dos produtos de PCR-RACE para Mo-CBP3 65
Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose (1,5%) do DNA plasmidial extraído dos clones recombinantes 66
Figura 9 - Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos deduzidas para Mo-CBP3 68
Figura 10 -
Dendograma obtido a partir da análise filogenética por parcimônia com base nas sequências completa de aminoácidos relacionados às sequências de aminoácidos deduzidos para Mo-CBP3
69
Figura 11 -
Análise com o software SignalP 4.0 da Mo-CBP3, mostrando o ponto de clivagem do peptídeo sinal em todas as sequências de aminoácidos deduzidos para a Mo-CBP3
71
Figura 12 - Gráfico de hidropaticidade obtido das sequências de aminoácidos para Mo-CBP3 72
Figura 13 - Gráfico das regiões hidrofóbicas obtido das sequências de aminoácidos para Mo-CBP3 74
aminoácidos deduzidos para Mo-CBP3 76
Figura 16 - Predição para sítios de fosforilação nas sequências de aminoácidos deduzidas para Mo-CBP3 78
Figura 17 - Esquema representativo da disposição da região obtida do gene que codifica a Mo-CBP3 80
Figura 18 - Esquema da estrutura secundária deduzida para Mo-CBP3 (RevA7) 81
Figura 19 - Esquema da estrutura secundária deduzida para (RevA10) Mo-CBP3 82
Figura 20 - Esquema da estrutura secundária deduzida para (RevA17) Mo-CBP3 83
Figura 21 - Esquema da estrutura secundária deduzida para (RevA19) Mo-CBP3 84
Figura 22 - Esquema da estrutura secundária deduzida para Mo-CBP3 (RevB6) 85
Figura 23 - Esquema da estrutura secundária deduzida para Mo-CBP3 (RevC4) 86
Figura 24 - Modelos das estruturas tridimensionais obtidos para as sequências deduzidas de Mo-CBP3 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição química das sementes de Moringa oleifera 24
Tabela 2 - Famílias de proteínas relacionadas à patogênese (PR-Proteínas) em
vegetais 27
Tabela 3 - Reagentes e volumes utilizados na reação de PCR 42
Tabela 4 - Condições utilizadas para a amplificação da região codificante da
proteína ligante à quitina Mo-CBP3 de sementes de Moringa oleifera 43 Tabela 5 - Reagentes e volumes utilizados na reação de RT-PCR 47 Tabela 6 - Reagentes e volumes utilizados na reação de PCR 49
Tabela 7 - Comparação das absorbâncias em diferentes comprimentos de onda
entre os dois métodos utilizados para extração de DNA genômico 60
Tabela 8 - Rendimento de RNA total de sementes de Moringa oleifera em
diferentes amostras 62
LISTA DE ABREVIATURAS
BLAST Ferramenta Básica de Alinhamento Localizado CIP Fosfatase Alcalina do Intestino de Bezerro DEPC Dietil-pirocarbonato
DNA Ácido desoxirribonucleico
Dnase Enzima endonuclease não específica que degrada moléculas de DNA dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
EcoRI Enzima de restrição
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ETI Efetores desencadeadores de respostas imunes GlcNac N-acetil-D-glucosamina
IPTG Isopropil-β-galactosídeo
kb Quilobase
LB Meio de cultura Luria Bertani
min Minuto
mM Milimolar
M-MLV Vírus da Leucemia de Murinos NPAAs Aminoácidos não proteicos OD600 Densidade óptica a 600nm
PAMPs Padrões Moleculares Associados a Patógenos pb Pares de bases
pGEM-T Easy Sistema de vetor plasmidial destinado à clonagem de produtos de PCR PR-Proteínas Proteínas relacionadas a patogêneses
PTI PAMPs desencadeadores de respostas imunes PVP Polivinilpirrolidona
RACE-PCR Rápida amplificação de finais de cDNA acoplado a Reação em cadeia da Polimerase
SOB Meio de cultura para bactérias suplementados com 2% triptona, 05% extrato de levedura e 0,5% NaCl, pH 7,0
SOC Meio super ótimo com repressão de catabólitos TAP Pirofosfatase Ácida do Tabaco
Tris 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol UDA Lectina de Urtica dioica
µg Micrograma
µL Microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 16
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 20
2.1 Moringa oleifera Lamarck 20
2.1.1 Considerações gerais 20
2.1.2 Relação Filotaxonômica 21
2.1.3 Usos e aplicações de Moringa oleifera 22
2.2 Mecanismos de Defesa Vegetal 25
2.3 Proteínas Vegetais de Defesa 28
2.3.1 Proteínas ligantes à quitina de origem vegetal 28
3 OBJETIVOS 33
3.1 Geral 33
3.2 Específicos 33
4 MATERIAIS 35
4.1 Sementes 35
4.2 Bactérias 35
4.3 Plasmídeos 35
4.4 Enzimas 35
4.5 Oligonucleotídeos 35
4.6 Reagentes e Kits 36
5 METODOLOGIA 38
5.1 Coleta dos frutos de Moringa oleifera 38
5.2 Extração do DNA genômico 38
5.2.1 Quantificação do DNA genômico 38
5.2.2 Amplificação do DNA genômico baseado na técnica da PCR 41
5.3 Extração de RNA total 41
5.3.1 Análise da integridade do RNA total 44
5.3.2 Tratamento do RNA total com DNase 44
5.3.3 Purificação do RNA total 45
5.4 Síntese da primeira fita de cDNA 45
5.4.1 Tratamento do RNA total com a enzima CIP (Calf Intestine Alkaline
5.4.2 Tratamento do RNA total com TAP (Tobacco Acid Pyrophosphatase) 46 5.4.3 Reação de Ligação (5’ RACE Adapter Ligation) 46
5.4.4 Transcriptase Reversa – RT-PCR 46
5.5 Amplificação da região codificadora da proteína Mo-CBP3 48
5.5.1 Reação PCR-RACE 48
5.5.2 Purificação dos produtos de PCR-RACE 48
5.5.3 Subclonagem em vetor plasmidial 50
5.5.4 Transformação 52
5.5.5 Seleção dos clones e purificação dos plasmídeos 53
5.6 Sequenciamento de nucleotídeos 53
5.7 Análise das sequências 54
5.7.1 Alinhamento múltiplo e análise filogenética 55
5.7.2 Modelagem computacional 55
6 RESULTADOS 58
6.1 Extração do DNA genômico de sementes de Moringa oleifera 58 6.2 Extração do RNA total de sementes de Moringa oleifera 58 6.3 Caracterização in silico da região codificadora da proteína Mo-CBP3 63
7 DISCUSSÃO 90
8 CONCLUSÃO 99
1 – INTRODUÇÃO
Nos anos vindouros, a agricultura deve tornar-se mais produtiva a fim de alimentar uma população mundial que excedeu 7,0 bilhões de habitantes em 2012 e cujas projeções para 2050 são de, aproximadamente, 9,1 bilhões (FAO, 2012). Além disso, a escassez de recursos naturais como a água (PFISTER et al., 2011; HOEKSTRA et al., 2012) e o ataque pestes agrícolas têm potencializado as perdas de grãos economicamente importantes em todo o mundo (BRIMNER; BOLAND, 2003).
Há décadas, o controle químico de fungos tem sido amplamente utilizado na agricultura mundial (PRAPAGDEE; KUEKULVONG; MONGKOLSUK, 2008). No entanto, o controle baseado em agentes bióticos tem sido muito eficiente, além de não prejudicar a saúde humana, não poluir o ambiente e nem provocar resistência de patógenos (PRAPAGDEE; KUEKULVONG; MONGKOLSUK, 2008; ROMEIS et al., 2012). Em um contexto mundial, muito se tem feito a fim de amenizar as perdas agronômicas geradas por fungos fitopatogênicos, no entanto, os esforços não têm sido muito efetivos. Segundo Carlomagno e colaboradores (2010), são necessários projetos visando a diminuição do uso de agrotóxicos e a melhoria das condições ambientais, além de otimização da produtividade. Assim, dentre as alternativas que possam minimizar os efeitos de pragas como os fungos, tem se destacado a bioprospecção de moléculas bioativas (RIZZELLO et al., 2009).
patógenos sem, contudo, recorrer ao uso de agentes químicos (ONGENA et al., 2007; JELÍNKOVÁ; TREMBLAY; DESROCHERS, 2012; ZHANG et al., 2012).
Moringa oleifera Lam. é uma planta bastante utilizada no mundo inteiro devido a uma diversidade de características vantajosas ao homem, além da elevada resistência que apresenta frente aos ataques de pragas (RAMACHANDRAN; PETER; GOPALAKRISHNAN, 1980). Sabe-se que as sementes de moringa apresentam um potencial biotecnológico muito rico e que ainda precisa ser bastante explorado, especialmente no que se refere às suas proteínas. Nesse contexto, as proteínas de sementes de moringa chamaram a atenção de nosso grupo de pesquisa, que buscou investigar a relação entre a elevada resistência a pragas observada para a planta e o conteúdo proteico de suas sementes. Dessa forma, Gomes (2002) detectou um elevado teor de proteínas ligantes à quitina em extratos aquosos e que apresentavam atividade antifúngica contra algumas espécies de fungos fitopatogênicos. Com o decorrer dos estudos, Gifoni et al. (2012) isolaram e caracterizaram uma proteína ligante à quitina, à qual chamaram de Mo-CPB3. Dentre as características desta proteína, destacam-se a massa molecular de 14,3 kDa, potencial isoelétrico no pH 10,8, glicosilação (2,5% de carboidratos), capacidade de coagular partículas em suspensão na água de forma similar ao sulfato de alumínio e potássio [KAl(SO4)2], utilizado comercialmente e, por fim, a atividade inibitória contra fungos fitopatogênicos, que é mantida mesmo depois de aquecida a 100 ºC durante 1 h. Estudos posteriores revelaram que Mo-CBP3 é formada por duas cadeias de tamanhos diferentes unidas por pontes dissulfeto. Para uma das cadeias foi obido o cDNA e deduzida a sequência, com base na sequência aminoterminal reportada por Gifoni et al. (2012). No entanto, até o presente estudo, não se conhecia a sequência da outra cadeia.
Diante do que foi exposto, Mo-CBP3 foi selecionada para ser objeto de estudo do presente trabalho. Mo-CBP3 possui um potencial de aproveitamento biotecnológico como uma proteína antifúngica, além de possuir o cDNA clonado para uma de suas subunidades. Ademais, essa proteína apresenta-se como um heterodímero termoestável com apreciável atividade coagulante. A capacidade de Mo-CBP3 inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos alimenta a ideia da participação desta como uma proteína de defesa, podendo ser utilizada como controle de fitopatógenos.
plantas de interesse econômico, muitos estudos acerca de sua caracterização e de seu(s) gene(s) precisam ser realizados. Com esse intuito, o presente estudo foi desenvolvido cujas atividades propostas têm como eixo os seguintes questionamentos:
O isolamento, clonagem e caracterização da região codificadora da Mo-CBP3 permitiriam um entendimento mais aprofundado sobre a função biológica dessa proteína em plantas de moringa?
Sendo Mo-CBP3 uma proteína dimérica, seria possível, através de ferramentas de bioinformática, modelar a estrutura terciária dessa proteína, bem como predizer sua estrutura secundária e informações referentes ao peptídeo sinal, aos sítios de glicosilação, fosforilação e acetilação, além de características como índice de hidropaticidade?
Diante desses questionamentos é que foi formulada a seguinte hipótese:
2 – FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 – Moringa oleifera Lamarck
2.1.1 – Considerações gerais
A Moringa oleifera é uma planta que pertence à família Moringaceae, originária da região sub-himalaiana, a noroeste da Índia, onde é conhecida como drumstick tree, ou bastão de tambor (RAMACHANDRAN; PETER; GOPALAKRISHNAN, 1980; GANGULY; GUHA, 2008), devido à morfologia de seus frutos. Existem ainda muitos outros nomes populares, de acordo com a região. Dentre eles, os mais comuns são horseradish tree, (embora haja outras espécies de plantas também conhecidas como horseradish incluindo, a Armoracia rusticana) ou raiz forte, devido ao sabor de suas raízes (SHIH et al., 2011) e árvore milagrosa, pelas inúmeras propriedades benéficas que apresenta, inclusive nutritiva (SREELATHA; JEYACHITRA; PADMA, 2011). No Nordeste brasileiro, onde foi introduzida na década de 1950, pode ainda ser referida como lírio-branco, quiabo de quina ou, simplesmente, moringa (LORENZI; MATOS, 2002; GIFONI, 2009). Trata-se de uma espécie perene, de uso diversificado, com especial destaque na ornamentação de parques e jardins, na alimentação animal, na complementação alimentar humana e na medicina (VIEIRA; CHAVES; VIÉGAS, 2008). Por essa razão, a M. oleifera é amplamente cultivada em regiões desde as subtropicais secas e úmidas, até florestas úmidas (GALLÃO; DAMASCENO; BRITO, 2006; SREELATHA; JEYACHITRA; PADMA, 2011).
copa aberta com crescimento bastante rápido (CÁCERES BECKER, 1997; CHUANG
permanece entre 250-1.500 mm/a
encontra-se sempre florida quando o índice é superior a 600 mm/ano PRASAD, 2009).
O gênero Moringa é constituído por quatorze espécies bastante estudadas, em razão, principalmente das
apresentarem propriedades floculantes diversos países como um método natura Esta água pode ser destinada à
canais de irrigação (NDABIGENGESERE; NARASIAH, 1998 FAGBENRO; ADEBAYO, 2011)
BENANG, 2009; FIRTH et al. espécies deste grupo, em particular a
resistência a pragas, facilidade de cultivo e rapidez no crescimento (RAMACHANDRAN; PETER; GOPALAKRISHNAN, 1980)
2.1.2 –Relação Filotaxonômica
Figura 1 – Classificação taxonômica
Reino: Plantae Sub-reino: Tracheobionta Superdivisão: Spermatophyta Divisão: Magnoliophyta (Angiosperma)
Classe: Magnoliopsida (Dicotoledônea) Ordem: Brassicales
Família: Moringaceae Gênero: Moringa
Epíteto Específico: oleifera Espécie: Moringa oleifera
copa aberta com crescimento bastante rápido (CÁCERES et al., 1991; MAKKAR; ; CHUANG et al., 2007). Em regiões onde o índice pluviométrico
mm/ano, a M. oleifera está bem adaptada, no entanto, quando o índice é superior a 600 mm/ano (CYSNE, 2006;
é constituído por quatorze espécies (RAMOS et al.
azão, principalmente das sementes de algumas destas ntarem propriedades floculantes e, consequentemente, serem utilizadas em diversos países como um método natural eficiente e econômico de purificação de água Esta água pode ser destinada à piscicultura, incluindo viveiros, barragens em fazenda e
(NDABIGENGESERE; NARASIAH, 1998; AYOTUNDE , 2011), bem como para o consumo humano (AMAGLO et al., 2010; RODRÍGUEZ-NÚÑEZ et al., 2012)
espécies deste grupo, em particular a M. oleifera, caracterizam-se, também, por sua resistência a pragas, facilidade de cultivo e rapidez no crescimento (RAMACHANDRAN; PETER; GOPALAKRISHNAN, 1980).
Relação Filotaxonômica
Classificação taxonômica e características morfológicas da Moringa oleifera
Superdivisão: Spermatophyta
Classe: Magnoliopsida (Dicotoledônea)
., 1991; MAKKAR; regiões onde o índice pluviométrico bem adaptada, no entanto, (CYSNE, 2006;
et al., 2010) sementes de algumas destas utilizadas em de purificação de água. piscicultura, incluindo viveiros, barragens em fazenda e AYOTUNDE; (AMAGLOH; , 2012). Muitas se, também, por sua resistência a pragas, facilidade de cultivo e rapidez no crescimento
2.1.3 – Usos e aplicações de Moringa oleifera
Devido à propriedade floculante apresentada pelas sementes de M. oleifera, esta espécie tem sido de grande importância, sobretudo, em países subdesenvolvidos, onde é comum o uso de suas sementes para purificar a água de uso doméstico (YARAHMADI et al., 2009; LÜRLING; BEEKMAN, 2010). Segundo Gallão, Damasceno e Brito (2006), o tratamento de água à base de sementes trituradas de M. oleifera não altera de forma significativa suas propriedades físico-químicas. As propriedades coagulantes presentes em sementes de M. oleifera foram atribuídas, pelo menos em parte, a polieletrólitos de 3,0 kDa (OKUDA et al., 2001). Outros estudos relacionaram essa propriedade a proteínas catiônicas com massa molecular entre 6,5 e 13,0 kDa (GASSENSCHMIDT et al., 1995; NDABIGENGESERE; NARASIAH; TALBOT, 1995; GHEBREMICHAEL et al., 2005; GOYAL et al., 2007), ou a polipeptídeos, incluindo o peptídeo Flo que ao mesmo tempo em que flocula age como biocida para várias espécies de bactérias (CHEN, 2009; MANGALE; CHONDE; RAUT, 2012).
As sementes de M. oleifera possuem grande importância industrial, já que apresentam um elevado teor de óleo de boa qualidade. O principal constituinte do óleo da M. oleifera é o ácido oleico (78,6%), o que lhe confere características semelhantes à do azeite de oliva (ANWAR; BHANGER, 2003).
Além dos atributos citados acima, a M. oleifera é empregada na medicina popular, em todo o mundo. Devido a isso, muitos estudos têm sido desenvolvidos na tentativa de isolar compostos bioativos das mais diversas partes da planta. (GANGULY; GUHA, 2008; SANTANA et al., 2010; MANAHEJI et al., 2011; MUANGNOI et al., 2011; PEREIRA et al., 2011; ROLIM et al., 2011; SREELATHA; JEYACHITRA; PADMA, 2011). Além disso, foi verificado que o extrato etanólico de folhas de M. oleifera apresentou atividade antiviral contra o HSV-1 (vírus Herpes simplex tipo 1), inibindo o desenvolvimento do vírus in vitro, em ensaio de formação de placas, prolongando o tempo médio de sobrevivência e reduzindo a mortalidade de camundongos infectados com o HSV-1 (LIPIPUN et al., 2003).
2008; VIERA; CHAVES; VIÉGAS, 2010). Foram também demonstrados efeitos antifúngicos contra as espécies Basidiobolus haptosporus, B. ranarum, Candida albicans, Colletotrichum gloeosporioides, C. musae, Fusarium solani, F. oxysporum, Microsporum canis, Rhizopus solani, Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes (NWOSU; OKAFOR, 1995; JABEEN et al., 2008; ROCHA et al., 2011; GIFONI et al., 2012). Além dos efeitos antimicrobianos, efeitos larvicida contra o mosquito Aedes aegypti (FERREIRA et al., 2009) e nematicida contra o Meloidogyne incognita (ONYEKE; AKUESHI, 2012) foram observados.
Muitas das propriedades citadas acima da M. oleifera têm sido relacionadas às suas sementes e estas, naturalmente, estão encerradas em um tegumento trialado que, por sua vez, está envolto por um fruto comprido em forma de vagem (RAMOS et al., 2010; RICO et al., 2010). Segundo Gallão, Damasceno e Brito (2006), na composição química das sementes de M. oleifera, para cada 100 g de farinha há o equivalente a 39,3 g de proteínas (TABELA 1).
Tabela 1 - Composição química das sementes de Moringa oleifera
Constituintes Semente
Umidade (%) 6,3
Açúcares solúveis (g/100g) 3,14
Oligossacarídeos (g/100g) 3,31
Amido (g/100g) 6,02
Proteínas (g/100g) 39,3
Lipídeos (g/100g) 18,8
Fonte: GALLÃO; DAMASCENO; BRITO (2006).
2.2 – Mecanismos de Defesa Vegetal
As plantas, em seus ambientes naturais, estão constantemente cercadas por inúmeros inimigos potenciais, incluindo insetos, nematoides e fungos fitopatogênicos. Em consequência de sua imobilidade, as plantas precisam, constantemente, estar preparadas para impedir infecções ou mesmo sua morte. Nesse contexto, para se proteger dos impactos negativos causados por estirpes de fungos causadores de doenças, as plantas utilizam meios capazes de deter tais agentes nocivos (MARCHIVE et al., 2013), incluindo as estruturas físicas protetoras (BUENO; AMBRÓSIO; SOUZA, 2007; TON; FLORS; MAUCH-MANI, 2009). A presença de material lipídico, como cutina, ceras e suberina, além de outras funções, impede, num primeiro momento, a penetração de diversas espécies de fungos e outros fitopatógenos em tecidos vegetais (TON; FLORS; MAUCH-MANI, 2009; MÉNDEZ-BRAVO et al., 2011).
Immunity), baseado na proteção mediada por proteínas de defesa (DONG et al., 2011). Atualmente a classificação das proteínas relacionadas à patogênese (PR-Proteínas) inclui 17 classes, como pode ser visto na Tabela 2 (SELS et al., 2008; LAM; NG, 2010; BONARDI et al., 2011). Estas proteínas estão organizadas com base na semelhança de suas atividades biológicas, bem como das propriedades físico-químicas e na similaridade de sequência (FERNANDES et al., 2013). A rigor, tais proteínas não constituem uma superfamília, mas sim um conjunto de proteínas não relacionadas, geralmente envolvidas nos mecanismos de defesa (BREITENEDER, 2004). Quando uma planta sobrevive a lesões causadas por fungos e outros patógenos, muitas vezes, esta mostra um aumento na sua resistência a ataques subsequentes em qualquer outro tecido contra uma grande variedade de espécies nocivas, sendo este fenômeno chamado de Resistência Sistêmica Adquirida, SAR (FU; DONG, 2013).
Tabela 2 - Famílias de proteínas relacionadas à patogênese (PR-Proteínas) em vegetais
Família Propriedades Gene
PR-1 Antifúngica Ypr1
PR-2 β-1,3-glucanase Ypr2, [Gns2 ('Glb')]
PR-3 Quitinase tipo I, II, IV, V, VI, VII Ypr3, Chia
PR-4 Quitinase tipo I, II Ypr4, Chid
PR-5 Tipo taumatina; Osmotina Ypr5
PR-6 Inibidor de protease Ypr6, Pis ('Pin')
PR-7 Endoproteinase Ypr7
PR-8 Quitinase tipo III Ypr8, Chib
PR-9 Peroxidase Ypr9, Prx
PR-10 Proteínas semelhantes à ribonuclease Ypr10
PR-11 Quitinase tipo I, V Ypr11, Chic
PR-12 Defensina Ypr12
PR-13 Tionina Ypr13, Thi
PR-14 Proteínas relacionadas ao transporte de lipídeos Ypr14, Ltp
PR-15 Oxalato oxidases Ypr15
PR-16 Proteínas relacionadas a oxalato oxidase Ypr16
PR-17 Não conhecida Ypr17
2.3 – Proteínas Vegetais de Defesa
Apesar de muitas moléculas participarem do processo de resistência vegetal à predação ou infecção, as proteínas têm recebido atenção especial em virtude da potencialidade de aplicações na agricultura.
Nos últimos anos, sequências de DNA codificando diferentes proteínas antifúngicas como quitinases e glucanases têm sido isoladas, caracterizadas e incorporadas no genoma de importantes espécies cultivadas como arroz, ervilha, trigo, nas quais têm se mostrado protetoras contra fungos (EMANI et al., 2003; KUMAR et al., 2004; AMIAN et al., 2011; LIU et al., 2012a). Adicionalmente às quitinases e glucanases, outras PR-proteínas também têm sido utilizadas, como por exemplo, as defensinas. Trabalhos recentes têm demonstrado que a superexpressão de uma defensina de rabanete, denominada RS-AFP2, em plantas de tomate tem resultado numa redução de 90% dos sintomas de doenças causadas por vários fungos de importância agronômica (KOSTOV et al., 2009). Outra classe de proteínas que merece destaque são as proteínas transferidoras de lípideos (LTP); a superexpressão de duas LTPs de pimentão em plantas de tabaco resultou na expressão constitutiva de genes para PR-Proteínas tanto de forma local como sistêmica, causando resistência aos fungos Phytophthora nicotianae e Pseudomonas syringae pv. Tabaci (SAROWAR et al., 2009). Entretanto, a superexpressão de LTP pode ser problemática, uma vez que a ativação de SAR pode resultar em crescimento atrofiado, hipersensibilidade à luz e desenvolvimento de lesões espontâneas (WALTERS et al., 2007). Boa parte dos trabalhos publicados também relata uma maior proteção das plantas a doenças fúngicas, quando essas expressam a combinação de dois genes relacionados à defesa, resultando em sinergismo e reduzindo, desta maneira, a probabilidade de resistência. Sendo assim, a busca de novas proteínas antifúngicas e a caracterização dos genes que as codificam permitem explorar de maneira mais eficiente as estratégias de defesa, levando à produção de organismos mais resistentes a doenças.
2.3.1 - Proteínas ligantes à quitina de origem vegetal
natureza, estando presente em estruturas biológicas de vários organismos como fungos, insetos e nematoides (PURUSHOTHAM et al., 2012), além de, existir como um dos principais constituintes da parede celular de algumas espécies de bactérias (ECKERT et al., 2013). Acredita-se que, devido às plantas estarem constantemente sujeitas a ataques de fitopatógenos contendo quitina em sua constituição, muitas delas desenvolveram, ao longo de sua evolução, a capacidade de sintetizar proteínas ligantes à quitina e, consequentemente, a habilidade de neutralizar a proliferação destes patógenos em tecidos vegetais (ASENSIO et al., 2000). Desse modo, estudos têm sugerido que a síntese de proteínas ligantes à quitina em plantas tenha um papel muito importante nas infecções causadas por patógenos, especialmente por fungos (COLOMBO et al., 2005; KAKU et al., 2006).
Segundo Trindade e colaboradores (2006), muitas das proteínas que se ligam à quitina, cujas sequências polipeptídicas são conhecidas, contêm um motivo estrutural comum de 30 a 43 resíduos de aminoácidos, com muitas cisteínas e glicinas em posições conservadas, sendo este domínio mais conhecido como heveínico. Há, ainda a família CBM 50 (Carbohydrate-Binding Modules), que possui um motivo chamado LysM (SEIDL-SEIBOTH et al., 2013), capaz de reconhecer e se ligar a resíduos de GlcNAc.
De acordo com Huang, Xie e Gong (2000), as proteínas ligantes à quitina podem ser genericamente classificadas nos grupos de peptídeos do tipo heveína, lectinas, quitinases e peptídeos do tipo Ac-AMP (peptídeos antimicrobianos de Amaranthus caudatus). Muitas lectinas ligantes à quitina foram caracterizadas nos últimos anos, no entanto, a lectina do gérmen de trigo (WGA) foi à melhor estudada (BECKMANN; MÖLLER; WITTMANN, 2012). No entanto, o maior grupo de lectinas ligante a quitina já determinado foi aquelas pertencentes à família das heveínas, assim conhecida por possuírem em comum o domínio heveínico como sítio de interação com resíduos de quitina. A proteína heveína trata-se de uma merolectina monomérica termoestável de 5,0 kDa isolada do látex da Hevea brasiliensis, capaz de inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos (COLOMBO et al., 2005).
dioica (UDA) (PEUMANS et al., 1985; ISELI et al., 1993), a PL-B, uma lectina de Phytolacca americana que além de aglutinar eritrócitos estimula mitoses em linfócitos periféricos (YAMAGUCHI et al., 1997), podendo estas lectinas estar envolvidas com o papel de defesa do vegetal contra herbívoros. Outras lectinas, no entanto, parecem estar envolvidas com a defesa da planta contra o ataque de insetos, como a lectinas do Solanum tuberosum (STA) e a lectina do Lycopersicon esculentum (LEL) (RAIKHEL; LEE, 1993; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; TRINDADE et al., 2006).
Um grupo de pequenas proteínas catiônicas com propriedade de ligação a quitina chamadas genericamente de defensinas, ricas em cisteínas incluindo, a avesina A, Ee-CBP, MsDef1 e MtDef4, PhDef1, PhDef2, Pn-AMP1 e Pn-AMP2 com 37, 36, 45, 54, 31, 27, 41 e 40 resíduos de aminoácidos, respectivamente, apresentaram potentes atividades inibitórias de crescimento contra vários fungos (VAN DEN BERGH et al., 2002; LEE et al., 2003; LI; CLAESON, 2003; SAGARAM et al., 2011; GHAG et al., 2012).
Ademais, as quitinases, um grupo de proteínas ligantes à quitina tem atraído atenção de pesquisadores e indústrias de farmacêuticas e de biotecnologia devido em todo o mundo devido a sua capacidade de hidrolisar resíduos de quitina (CHEONG et al., 2000; SELITRENNIKOFF, 2001; YE; NG, 2005). Além disso, foi desmonstrado que estas proteínas possuem importantes funções de defesa em plantas contras uma grande variedade de fungos fitopatogênicos (HUANG; XIE; GONG, 2000; YANG; GONG, 2002).
Estruturas elucidadas de receptores de quitina existem apenas para Arabidopsis thaliana e Oryza sativa. Em A. thaliana, tanto os receptores RLK (Receptor-Like Protein Kinase) como os CERK1 (Chitin Elicitor Receptor Kinase) apresentam três domínios LysM, ambos voltados para a região extracelular (WAN et al., 2008; LIU et al., 2012b; KOUZAI et al., 2013). As proteínas LYP4 e LYP6 (Lysin Motif-Containing Proteins), além de outra proteína homóloga à CEBiP (Chitin Elicitor-Binding Protein) e a proteína OsCERK1 foram identificadas em arroz e todas elas desencadearam sinais adicionais em presença de fragmento de quitina (SHIMIZU et al., 2010; LIU et al., 2012a). A CEBiP é uma glicoproteína ancorada à membrana celular que contém dois domínios LysM de alta afinidade a fragmentos de quitina.
microrganismos incluindo bactérias e leveduras são consideradas “fábricas biológicas” de primeira escolha para essas biomoléculas. No entanto, para que isso seja viável, é necessário o conhecimento prévio detalhado sobre as propriedades moleculares, estruturais, biológicas e fisiológicas da proteína em questão no sistema de defesa vegetal.
3 – OBJETIVOS
3.1 – Geral
Amplificar a região codificadora da proteína ligante à quitina Mo-CBP3, expressa em sementes de Moringa oleifera, bem como clonar os fragmentos, determinar a sequência dos nucleotídeos, e predizer in silico características estruturais desta proteína por meio da utilização de ferramentas de bioinformática.
3.2 – Específicos
Otimizar as técnicas de isolamento e purificação do RNA total a partir de sementes de M. oleifera;
Amplificar a região codificadora da proteína Mo-CBP3 a partir do cDNA, obtido pela técnica baseada em PCR-RACE 5’;
Clonar e sequenciar a região codificadora da proteína Mo-CBP3;
Comparar e analisar as sequências de nucleotídeos obtidas e as sequências aminoácidos deduzidas para a Mo-CBP3 com sequências disponíveis em bancos de dados públicos;
4 – MATERIAIS
4.1 – Sementes
As sementes utilizadas, neste trabalho, foram obtidas a partir de frutos de Moringa oleifera, coletados após 65 dias da antese, de árvores geolocalizadas nas coordenadas -3º 44’ 27.28’’ S, -38º 34’ 34.60’’ W, no Campus do Pici, da Universidade Federal do Ceará (UFC), por ser de fácil acesso, além de haver sido registrada em Voucher sob o número EAC-54.112, sendo posteriormente depositadas no Herbário EAC (Prisco Bezerra) desta mesma Universidade.
4.2 – Bactérias
Escherichia coli TOP 10 F’ foi utilizada como hospedeiro de clonagem e nos experimentos de clonagem do gene da proteína ligante à quitina Mo-CBP3 de sementes de M. oleifera.
4.3 – Plasmídeo
O vetor de expressão pGEM-T Easy (3015 pb, Promega) foi utilizado como vetor de clonagem em células de E. coli.
4.4 – Enzimas
Fosfatase alcalina de intestino de bezerro, RT-MMLV, pirofosfatase ácida do tabaco e T4 RNA ligase foram adquiridas da Ambion, Life Tecnology. DNase, Taq DNA polimerase e T4 DNA ligase foram obtidas da Promega Corporation. EcoRI foi adquirida da Thermo Scientific.
4.5 – Oligonucleotídeos
GGTAC ATTTG AGCAA CTAG-3’; Mo-RevB 5’-AGCTT CGAGC TCTAC GAACA CACA-3’ e Mo-RevC 5’-GTTAC ACCGC TAGTG GCTCT CGTC-3’), todos da Eurofins MWG/Operon. Os oligonucleotídeos usados para o sequenciamento foram o M13 Upstream 5’-GTTTT CCCAG TCACG ACGTT GTA-3’ e o M13 Downstream 5’-GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG-3’, ambos da adquiridos da empresa Exxtend solução em Oligos. Além desses, foram utilizados os oligonucleotídeos presentes no kit FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Life Tecnology), sendo eles: 5' RACE Outer Primer 5’-GCTGA TGGCG ATGAA TGAAC ACTG-3’ e seu adaptador 5' RACE Adapter 5’-GCUGA UGGCG AUGAA UGAAC ACUGC GUUUG CUGGC UUUGA UGAAA-3’, bem como os Random decamers.
4.6 – Reagentes e kits
Kit Concert™ Plant RNA Reagent, meio de cultura LB ágar, carbenicilina, estreptomicina, indutor de crescimento isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo e os marcadores de massa molecular φX174 DNA/Hae III e λDNA/Hind III fragments foram adquiridos da Invitrogen. Os outros marcadores moleculares Gene Ruller Express DNA ladder e Ladder 1 kb foram provenientes da Fermentas e Ludwig Biotec, respectivamente. O kit FirstChoice® RLM-RACE e inibidor de RNAse foram
provenientes da Ambion, Life Technology, USA. O kit GFXTM PCR DNA and Band
5 – METODOLOGIA
5.1 – Coleta dos frutos de Moringa oleifera
Os frutos de M. oleifera foram coletados das árvores aos 65 dias após a antese (FIGURA 2), imediatamente postos em contato com nitrogênio líquido e estocados em ultrafreezer a – 80 ºC. Aproximadamente 10 sementes, ainda em contato com nitrogênio líquido, foram pulverizadas com auxílio de pistilo e almofariz. Amostras de 100 mg de sementes em pó foram armazenadas em microtubos do tipo eppendorf (1,5 mL) e estocadas a – 80 ºC, até o momento da extração do DNA genômico e do RNA total.
5.2 – Extração do DNA genômico
Para a extração do DNA, a 100 mg de sementes pulverizadas contidas no microtubo foi adicionado 1 mL de SDS 20%/PVP 1% e, em seguida, a mistura foi incubada a 65 ºC por 30 min, sendo homogeneizada a cada 5 min. A seguir, RNase A (20 µg/mL) foi acrescentada à mistura e a mesma incubada a 37 ºC sob agitação orbital (100 rpm), durante 20 min. À mistura foi adicionado 0,4 mL de clorofórmio. Após centrifugada (13.000 x g, 3 min), a fase aquosa foi transferida para um microtubo estéril e à mesma foi adicionado 0,4 mL de cloreto de lítio 7,5 M. A mistura foi incubada por 20 min em banho de gelo seguido de centrifugação (13.000 x g, 3 min). Ao sobrenadante foi adicionado 1 mL de isopropanol. Após homogeneização por inversão, o precipitado foi coletado por centrifugação (13.000 x g, 1 min), lavado com etanol 70% e seco ao ar. O DNA precipitado foi reidratado com 80 µL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Este protocolo está sumarizado na FIGURA 3.
5.2.1 – Quantificação do DNA genômico
Figura 2 – Fruto de Moringa oleifera
Moringa oleifera coletado após 65 dias da antese
Figura 3 – Esquema geral de purificação do DNA genômico de sementes de oleifera
Esquema geral de purificação do DNA genômico de sementes de
5.2.2 – Amplificação do DNA genômico baseado na técnica da PCR
A fim de amplificar a região codificadora da proteína Mo-CBP3, a 2.500 ng de DNA purificado foram adicionados 2,0 µL de tampão da enzima GoTaq DNA polimerase flexi (Promega®), 1,6 µL de MgCl2, 0,4 µL de dNTP, 0,8 µL de primer upstream ( Mo-For 5’-GCTGA TGGCG ATGAA TGAAC ACTG-3’), 0,8 µL de primer downstream (Mo-RevA 5’-CACGG GGTAC ATTTG AGCAA CTAG-3’; Mo-RevB 5’-AGCTT CGAGC TCTAC GAACA CACA-3’ e Mo-RevC 5’- GTTAC ACCGC TAGTG GCTCT CGTC -3’) na concentração de 5 mM, 0,15 µL de GoTaq DNA polimerase (Promega®) e água (q.s.p.) livre de RNAse, para um volume final de 20 µL (TABELA 3).
A amplificação foi realizada em termociclador (MJ Research PTC-200 Thermo Cycle), ocorrendo uma etapa de desnaturação inicial a 95 ºC por 5 min e 33 ciclos subsequentes de desnaturação a 95 ºC por 1 min, seguida de pareamento a 60 ºC por 1,5 min e extensão a 72 ºC por 1,5 min. Após completar os 33 ciclos, uma etapa de extensão final a 72 ºC, durante 15 min foi procedida (TABELA 4). Os produtos obtidos foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1,5% e visualizados com brometo de etídio (Sambrook et al., 1989). A captura da imagem foi realizada com auxílio de luz ultravioleta (302nm) em um transiluminador (MacrovueTM Transluminator, Pharmacia Biotec).
5.3 – Extração do RNA total
Tabela 3 - Reagentes e volumes utilizados na reação da PCR
Componentes Volume (µL)
RevA RevB RevC
10X Green GoTaq® Reaction Buffer 2 2 2
MgCl2 1,6 1,6 1,6
dNTP mix 0,4 0,4 0,4
Primer Upstream 5’-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3’ 0,8 0,8 0,8 Primer Downstream 5’-CACGGGGTACATTTGAGCAACTAG-3’ 0,8 - - Primer Downstream 5’- AGCTTCGAGCTCTACGAACACACA-3’ - 0,8 - Primer Downstream 5’-GTTACACCGCTAGTGGCTCTCGTC-3’ - - 0,8
GoTaq® DNA Polymerase 0,15 0,15 0,15
cDNA (3.000 ng) 2 2 2
Tabela 4 – Condições utilizadas para a amplificação da região codificante da proteína ligante à quitina Mo-CBP3 de sementes de Moringa oleifera
Estágio Repetição Temperatura Tempo
Desnaturação inicial 1 1 95 ºC 5 min
Amplificação 2 33
95 ºC 1 min
60 ºC 1:30 min
72 ºC 1:30 min
isopropanol na relação de 1:1 (v/v) e deixado incubando a temperatura ambiente durante 10 min. A amostra foi centrifugada nas mesmas condições e a fase aquosa descartada. O precipitado de RNA total foi submetido a uma lavagem utilizando solução de etanol a 75% (1 mL de etanol para cada 0,5 mL do reagente de extração) e centrifugado a 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. A fase aquosa foi descartada. O precipitado de RNA total foi seco ao ar e, em seguida, hidratado com 30 µL de água livre de RNAse. A quantificação da amostra de RNA total foi realizada conforme o item 5.2.1, sendo considerado uma unidade de DO260nm equivalente a 40 µg/mL. Para essa análise, foi empregado 1 µL da amostra de RNA total.
5.3.1 – Análise da integridade do RNA total
A integridade da amostra de RNA total foi constatada por eletroforese em condição desnaturante. Imediatamente antes da eletroforese foi preparada a reação, para um volume de 10 µL, adicionando-se 60% (v/v) de azul de bromofenol [0,25% (m/v), glicerol 30% (v/v), preparados com tampão TE (Tris-EDTA)], 1 µL de brometo de etídio (1 mg/mL) e 3 µL da amostra de RNA. Em seguida, a amostra foi aplicada em gel de agarose 1,2% preparado com tampão TBE (Tris-borato 0,04 M, EDTA 1 mM) 10%. As bandas correspondentes às subunidades 28 S e 18 S do RNA ribossomal foram visualizadas por meio de um transiluminador (Gel Transilluminator Bio-Rad) de UV e uma câmera acoplada ao microcomputador dotado de software de captura e análise de imagens. Após análise, a amostra foi armazenada a –80 °C.
5.3.2 – Tratamento do RNA total com DNase
5.3.3 – Purificação do RNA total
A purificação do RNA total foi realizada usando o RNAeasy Mini Kit (Quiagen), conforme descrito a seguir. Primeiramente, o volume das alíquotas foi ajustado para 100 µL com água livre de RNase. Em seguida, foram adicionados 350 µL de tampão RLT (composto com tiocianato de guanidina, um sal capaz de inativar RNAses) e 250 µL de etanol (100%), ambos homogeneizados, respectivamente. A mistura (700 µL) foi imediatamente transferida para uma coluna (RNAeasy Mini Spin Column) acoplada a um microtubo de 2 mL e centrifugados a 8.000 x g (Eppendorf® MiniSpin, Model 533), durante 15 seg, à temperatura ambiente. O filtrado foi descartado. A amostra foi concentrada pela adição de 500 µL do tampão RPE (composto com álcool) e centrifugada nas mesmas condições anteriores. O filtrado foi descartado. Em seguida, foi adicionado tampão RPE no mesmo volume anterior e centrifugado a 8.000 x g, à temperatura ambiente, por 2 min, e descartado o filtrado. Para a eluição do RNA total, a coluna foi imediatamente transferida para um novo microtubo (1,5 mL) estéril e a ela foram adicionados 30 µL de água livre de RNAse. O RNA purificado foi recuperado através de centrifugação de 8.000 x g, à temperatura ambiente, durante 1 min. O RNA purificado foi estocado a -80 ºC, até o momento da síntese da primeira fita de cDNA.
5.4 – Síntese da primeira fita de cDNA
5.4.1 – Tratamento do RNA total com a enzima CIP (Calf Intestine Alkaline Phosphatase)
em banho de gelo, durante 10 min. Depois de incubada, a amostra foi imediatamente centrifugada a 13.500 x g, por 20 min, à temperatura ambiente. Após o descarte do sobrenadante, o precipitado formado foi lavado com 500 µL de uma solução de etanol 70% e centrifugado nas mesmas condições citadas acima. O sobrenadante foi descartado. Finalmente, o RNA precipitado foi tratado com a enzima CIP e eluído em 10 µL de água livre de RNAse e estocado a –20 ºC, até o momento do tratamento com a enzima TAP.
5.4.2 – Tratamento do RNA total com TAP (Tobacco Acid Pyrophosphatase)
Após o tratamento do RNA total com a enzima CIP, sucedeu-se ao tratamento com a enzima TAP, de acordo com o protocolo descrito a seguir. Inicialmente, ao RNA total tratado com CIP (7.000 ng) foram adicionados 1 µL de tampão TAP 10x, 2 µL da enzima TAP e água livre de RNAse para um volume final de 10 µL. A mistura foi gentilmente homogeneizada e incubada a 37 ºC, durante 1 h. Em seguida, foi estocada a –20 ºC, até a realização da reação de ligação do adaptador (oligonucleotídeo adaptador de 45 pb) ao RNA tratado com as enzimas CIP e TAP.
5.4.3 – Reação de Ligação (5’ RACE Adapter Ligation)
Previamente, a 3.500 ng de RNA total tratado com as enzimas (CIP/TAP), foram adicionados 1 µL do adaptador 5’ RACE (5'-GCUGA UGGCG AUGAA UGAAC ACUGC GUUUG CUGGC UUUGA UGAAA-3'), 1 µL de tampão RNA ligase 10x, 2 µL da enzima T4 RNA ligase e água livre de RNAse para um volume final de 10 µL. A mistura foi gentilmente homogeneizada e incuba a 37 ºC, durante 1 h. Em seguida, foi estocada a –20 ºC, até o momento da reação com a transcriptase reversa (RT-PCR).
5.4.4 – Transcriptase Reversa – RT-PCR
Tabela 5 – Reagentes e volumes utilizados na reação de RT-PCR
Componentes Volume (µL)
RNA/adaptador 2
dNTP mix 4
Random decamers 2
Tampão da transcriptase reversa 10x 2
Inibidor de RNase 1
M-MLV RT (transcriptase reversa) 1
transcriptase reversa 10x, 2 µL de inibidor de RNAse, 1 µL de enzima M-MLV RT e água livre de RNAse para um volume final de 20 µL (TABELA 5). A mistura foi gentilmente homogeneizada e incubada a 50 ºC, durante 1 h. Em seguida, uma alíquota de cDNA sintetizado foi analisado através de eletroforese em gel de agarose a 1,2% em tampão TBE, seguida da visualização por meio de um transluminador de UV e uma câmera acoplada ao microcomputador dotado de software de captura e análise de imagens. Os cDNAs foram estocados a –20 ºC, até o momento da reação de PCR para 5’ RLM-RACE.
5.5 – Amplificação da região codificadora da proteína Mo-CBP3
5.5.1 – Reação de PCR-RACE
De antemão, a 3.000 ng de cDNA, foram adicionados 5 µL de tampão da enzima GoTaq DNA polimerase (Promega®), 4 µL de dNTP, 2 µL de primer upstream (5’-GCTGA TGGCG ATGAA TGAAC ACTG-3’), 4 µL de primer downstream (Mo-RevA 5’-CACGG GGTAC ATTTG AGCAA CTAG-3’, Mo-RevB 5’-AGCTT CGAGC TCTAC GAACA CACA-3’; Mo-RevC 5’-GTTAC ACCGC TAGTG GCTCT CGTC-3’) e 0,25 µL de GoTaq DNA polimerase (Promega®) e água livre de RNAse para um volume final de 50 µL (TABELA 6). A amplificação foi realizada nas mesmas condições apresentadas na Tabela 4. Os produtos obtidos foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1,2% e visualizados com brometo de etídio. A captura da imagem foi realizada com auxílio de luz UV (302nm) em um transiluminador (MacrovueTM Transluminator, Pharmacia Biotec).
5.5.2 – Purificação dos produtos de PCR-RACE
Para a purificação do material amplificado foi usado o kit de purificação Invitrogen PureLinkTM PCP, seguindo o procedimento descrito a seguir. Inicialmente,
400 µL de PureLinkTM Binding Buffer com isopropanol foram misturados a 100 µL do
Tabela 6 – Reagentes e volumes utilizados na reação de PCR-RACE
Componentes Volumes (µL)
Green GoTaq® Reaction Buffer 5x 2
dNTP mix 4
Primer upstream 5’-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3’ 2 Primer downstream 5’- CACGGGGTACATTTGAGCAACTAG-3’ 4
GoTaq® DNA Polymerase 0,25
cDNA (3.000 ng) 1
Wash Buffer, seguida de uma centrifugação nas mesmas condições anteriores. Após o filtrado ser descartado, o sistema foi novamente centrifugado a 13.000 x g, durante 3 min, a fim de remover todos os resíduos de Wash Buffer. Para a eluição de DNA, a coluna foi previamente transferida para um microtubo de 1,5 mL (PureLinkTM Elution
Tube) estéril, à qual foram adicionados 30 µL de Buffer Elution (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5), com incubação por 1 min, à temperatura ambiente. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 13.000 x g, durante 2 min, à temperatura ambiente. O DNA purificado foi quantificado conforme descrito no item 5.2.1. e armazenado a – 20 ºC para uso posterior.
5.5.3 – Subclonagem em vetor plasmidial
A subclonagem ds produto obtido foi realizada em vetor plasmidial, utilizando o sistema pGEM-T Easy (FIGURA 4). Primeiramente, as amostras (as siglas RevA, RevB e RevC foram adotadas em referência aos primers reverse usados neste trabalho, sendo estas adotadas para designar cada uma das amostras objeto deste estudo, e serão doravante empregadas neste manuscrito) foram ajustadas para uma concentração de 10 ng/µL, usando como agente eluente Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, fornecido pelo kit de purificação Invitrogen PureLinkTM PCP. Em seguida, foram adicionados 5 µL de
tampão de ligação 2x (Tris-HCl 60 mM, MgCl2 20 mM, ditiotreitol 20 mM, adenosina trifosfato 2 mM, polietilenoglicol 10%), 3 µL de amostra, 1 µL da enzima T4 DNA ligase, 1 µL (50 ng/µL) do plasmídeo pGEM-T Easy. O material foi incubado durante 16 h a 4 ºC. O produto de subclonagem foi utilizado para transformação de Escherichia coli.
frasco foram cultivadas a 37 ºC, durante 16 h, sob agitação orbital constante a 200 rpm (Certomat® IS, Sartorius). Após esse tempo, 5 mL do pré-inóculo foram transferidos para 500 mL de meio YT (peptona de caseína 1,6%, estrato de levedura 1,0%, NaCl 0,5%, pH 7,2), 2x, onde as células bacterianas foram novamente cultivadas sob agitação nas mesmas condições. Passado esse tempo, as células foram incubadas em banho de gelo durante 30 min, transferidas para tubos de centrífuga de 50 mL previamente resfriados e submetidos à centrifugação a 6.000 x g, a 4 C, por 10 min (Centrífuga Sorvall RC5B Plus, Rotor SS-34). O sobrenadante foi descartado e o precipitado celular lavado três vezes com glicerol 10% gelado, sendo os volumes de glicerol 40 mL, 40 mL e 30 mL, respectivamente. As culturas foram centrifugadas nas mesmas condições anteriores, após cada lavagem. Depois de lavadas, as células bacterianas foram resuspendidas gentilmente em 200 µL de meio líquido GYT (glicerol 10%, extrato de levedura 0,125%, triptona 0,25%, pH 7,0). Alíquotas de 50 L de células eletrocompetentes foram distribuídas em microtubos (gelados) estéreis de 1,5 mL e armazenadas a –80 C, até a etapa de eletroporação. O controle positivo do método foi obtido através de uma reação de transformação de bactérias competentes, utilizando uma solução contendo plasmídeos circulares (pGEM-T Easy) purificados e de concentração previamente estabelecida.
5.5.4 – Transformação
5.5.5 – Seleção dos clones e purificação dos plasmídeos
Alíquotas de 50 µL de bactérias transformadas foram plaqueadas em meio LB-ágar (peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, NaCl 5 g, q.s.p. 1 L), contendo estreptomicina (50 µL/mL), carbenicilina (100 µL/mL), isopropil-β-D-tiogalactosídeo (IPTG, 100 µL/mL) e 5-bromo-4-cloro-indoil-β-D-galactosídeo (X-GAL, 80 µL/mL) e incubadas a 37 ºC, durante 16 h. Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de agarose 1% e revelados com brometo de etídio. Somente as colônias contendo insertos de aproximadamente 700 pb foram cultivadas em 5 mL de caldo LB contendo estreptomicina (100 µg/mL) e carbenicilina (50 µg/mL) sob agitação a 180 rpm, por 12 h, a 37 ºC. Após essa etapa, os plasmídeos foram extraídos e purificados do cultivo bacteriano usando o kit MiniPrep para extração de DNA plasmidial.
De cada cultura selecionada, foram centrifugados 4 mL, durante 1 min, à temperatura ambiente (Eppendorf® MiniSpin, Model 533). O sobrenadante foi descartado, sendo o precipitado resuspenso com 250 µL de tampão S1 (contém RNase) e agitado (vórtex). Em seguida, foram adicionados 250 µL de tampão de lise S2 (contém SDS e NaOH) e 350 µL de tampão de neutralização S3 e misturados gentilmente (6 e 8 vezes) por inversão do microtubo. As amostras foram centrifugadas a 12.000 x g, durante 10 min, à temperatura ambiente. Imediatamente, as amostras foram transferidas para colunas (MiniPrep), previamente acopladas a microtubos de 2 mL, e centrifugadas a 12.000 x g, durante 1 min, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado. Logo após essa etapa, por duas vezes seguidas, 700 µL de tampão de dessalinização W2 (contém etanol 100%) foram adicionados às colunas contendo as amostras de plasmídeos e centrifugadas nas mesmas condições anteriores. Posteriormente, as colunas foram recolocadas em seus devidos microtubos e centrifugadas a 12.000 x g, por 1 min, à temperatura ambiente. Finalmente, as amostras foram eluídas com tampão TE (Tris-HCl 2,5 mM, pH 8,5, EDTA 1 mM), aquecido previamente a 60 ºC. As amostras foram armazenadas a –20 ºC para uso posterior.
5.6 – Sequenciamento de nucleotídeos
ACGTT GTA-3’ e M13 (- 45) downstream 5’-GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG-3’. O sequenciamento foi realizado baseado no método de terminação de cadeia (Dye Terminator Chemistry), utilizando o DYEnamic ET Dye Terminator Kit. Inicialmente, os produtos de PCR foram tratados pela adição de 0,5 µL de exonuclease I (20 U/µL) e 1 µL de fosfatase alcalina humana (10 U/µL), para cada 5 µL de reação de PCR. Essa reação foi incubada a 37 ºC por 15 min, seguindo-se de outra incubação a 80 ºC durante 15 min. Essas duas enzimas juntas eliminam os restos de dNTPs e oligonucleotídeos não incorporados durante a reação de PCR.
Para a reação de sequenciamento foram usados 3 µL de cada produto de PCR tratado, 2,5 µL de primers (M13 upstream e M13 downstream), 1 µL de reagente de sequenciamento premix, 2 µL de tampão save money e 2,5 µL de água (deionizada) estéril. Essa reação foi montada em placas contendo 96 poços e posteriormente selada, homogeneizada e colocada no termociclador, seguindo-se os parâmetros: 30 ciclos de 95 ºC por 20 seg, 50 ºC por 15 seg e 60 ºC por 1 min. Os amplicons oriundos dessa reação foram precipitados, através da adição de 2 µL de tampão acetato de sódio/EDTA e 40 µL de etanol 95%, havendo a homogeneização em vórtex e, em seguida, a placa foi centrifugada a 3700 rpm, 4 ºC, por 1 h. Os produtos precipitados foram lavados, através da adição de 100 µL de etanol 70%, e centrifugados a 3700 rpm, 4 ºC, por 15 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado secado a 25 ºC. O DNA foi ressuspenso em 20 µL de solução de formamida (loading solution) e, em seguida, submetido à eletroforese capilar no sequenciador de nucleotídeos MegaBASE DNA Analysis System (GE Healthcare, EUA).
5.7 – Análises das sequências
A análise das sequências foi realizada com auxílio do programa PSI-BLAST (ALTSCHUL et al., 1997), além de outras ferramentas de bioinformática disponíveis on line, nos sites do National Center for Biotechnology Information, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools), Swiss Institute of Bioinformatics, SIB (http://www.expasy.ch/tools) e outros. Os alinhamentos múltiplos das sequências de aminoácidos e de DNA foram realizados com o programa ClustalW2 (LARKIN et al., 2007), posteriormente, corrigidos manualmente.
plasmídeo foi eliminada. Para obtenção da sequência deduzida de aminoácidos, foram utilizadas as ferramentas de tradução disponíveis no banco de dados público BLASTX.
As sequências deduzidas de aminoácidos, no formato FASTA, foram comparadas com proteínas já depositadas no Banco de Dados Genômicos do NCBI (GenBank), através do programa pBLAST, que alinha sequências de proteínas fornecidas em relação as sequências de proteínas já catalogadas pelo GenBank.
5.7.1 – Alinhamento Múltiplo e Análise Filogenética
Usando o programa ClustalW2 (LARKIN et al., 2007), as sequências deduzidas de aminoácidos obtidas da proteína Mo-CBP3 foram comparadas com outras albuminas 2S de vegetais. A árvore filogenética foi construída usando o método de neighbor-joining, baseado no alinhamento da sequência de aminoácidos (ClustralW2) de proteínas albuminas 2S. As sequências utilizadas foram as de albuminas 2S (AAL91665.1) de Anacardium occidentale, (NP_194445.1) de Arabidopsis thaliana, (CAA52813.1) de Brassica carinata, (CAA46785.1) de B. juncea, (CAA46784.1) de B. nigra, (CAA46782.1) de B. rapa, (AFQ32285.1) de Camelina sativa, (AAA33049.1) de Gossypium hirsutum, (ACI41245.1) de Sesamum indicum e (AFJ04524.1) de Vernicia fordii; dos precursores de albuminas 2S (ACI70207.1) de Bertholletia excelsa, (AAB41308.1) de Juglans regia e (EOY12555.1) de Theobroma cacao; da albumina 2S alergênica (ABG73108.1) de Pistacia vera, do precursor da subunidade maior da proteína albumina 2S rica em enxofre de sementes (EEF39554.1) de Ricinus communis, da albumina-like 2S (XP_004245641.1) de Solanum lycope, do inibidor de protease/reserva energética de semente/LTP (EFH42316.1) de Arabidopsis lyrata, dos precusores de napins (AAA33006.1) de B. napus e (CAD32938.1) de Momordica charantia, da mabinlin (BAA12204.1) de Capparis masaikai, da proteínas hipotética (EOA18741.1) de Capsella rubella, do alergênico I1 putativo (AAO32314.1) de Carya illinoinensis, da proteína putativa (EEE98189.1) de Populus trichocarpa.
5.7.2 – Modelam Computacional
6 – RESULTADOS
6.1 – Extração do DNA genômico de sementes de Moringa oleifera
A fim de comprovar a presença do gene que codifica a proteína Mo-CBP3 no genoma de M. oleifera, foi inicialmente realizada uma extração e purificação do DNA genômico a partir das sementes. As duas técnicas de extração de DNA genômico utilizadas foram SDS 20% associado à PVP 1% e CTAB (FIGURA 5). Os resultados revelam razões de A260/A280 de 1,93 para o método SDS 20% associado à PVP 1% e 1,91 para o método CTAB. A extração pelo primeiro método se mostrou mais eficiente, não sendo visualizadas contaminações no gel de agarose. Quando analisada a extração pelo método CTAB, é nítida a presença de contaminações na amostra (TABELA 7), configurando-se num método inapropriado para a extração de DNA genômico de sementes de moringa.
A amostra de DNA extraída pelo método SDS 20% associado à PVP 1% foi quantificada (1.145,5 ng/µL) e submetida à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE, tendo sido visualizada uma única banda com tamanho maior que 23 kb, sem aparente degradação e/ou contaminações. Dessa forma, o referido método foi utilizado para obtenção de DNA genômico neste trabalho. As reações de PCR foram obtidas através de uma reação em cadeia da polimerase (PCR), sendo dirigida pelos primers Mo-For (Upstream) e primers Mo-RevA: 5’-CACGG GGTAC ATTTG AGCAA CTAG-3’ (Downstream). Os resultados obtidos mostram bandas únicas de aproximadamente 400 pares de bases, indicando que o gene de interesse está presente em cópia única no genoma de M. oleifera (FIGURA 6).
6.2 – Extração do RNA total de sementes de Moringa oleifera
Figura 5 – Eletroforese em gel de agarose (1%) de DNA genômico de Moringa oleifera
Tabela 7 – Comparação das absorbâncias em diferentes comprimentos de onda entre os dois métodos utilizados para extração de DNA genômico
Método de extração de DNA genômico Absorbância (nm) 230 260 280 260/280 SDS 20% associado à PVP 1% 0,473 0,572 0,296 1,93
Figura 6 – DNA amplificado a partir do DNA genômico extraído de sementes de Moringa oleifera.
Tabela 8 – Rendimento de RNA total de sementes de Moringa oleifera em diferentes amostras.
Amostras Concentração (ng/µL) A260 A260/A280 Fator
1 2404.04 60.101 2.08 40
2 7807.48 195.187 2.13 40
3 809.92 20.248 2 40
4 5385.44 134.636 2.09 40
5 2206.48 55.162 2.05 40
6 2134.80 53.370 2.1 40
7 1731.44 43.286 2.16 40
enzima DNase e purificação como descrita nos itens 5.3.3 e 5.3.4, o RNA apresentou concentração média de 1218.69 ng/µL (TABELA 9).
A fim de se entender as características do gene da Mo-CBP3 foi inicialmente usada a técnica de PCR-RACE 5’ (Rapid Amplification of cDNA Ends), descrita sucintamente no item 5.4 em “Métodos”. O resultado obtido nessa análise corresponde a três bandas únicas, RevA, RevB e RevC, com fragmentos em torno de 700 pb (FIGURA 7A). Este resultado foi confirmado através do recurso Interactive 3D Surface Plot do software ImageJ (FIGURA 7B).
Os produtos de amplificação obtidos através da técnica PCR-RACE foram purificados e concentrados usando o kit PureLinkTM PCR Purification. Cada amostra em concentração de 10 ng/µL foi preparada para utilização nas reações de subclonados em vetores plasmidiais (pGEM-T Easy) e, após a obtenção do DNA plasmidial recombinante, foi realizada a transformação de células de E. coli TOP 10 F’ eletrocompetentes. O resultado mostrou que as transformações ocorreram de forma eficiente, sendo em maior grau RevA, RevC e RevB, respectivamente; dado já esperado, devido à concentração de amostra obtida na PCR-RACE. Da placa de Petri contendo os clones RevA foram selecionadas 12 colônias, enquanto da placa RevC foi possível selecionar 3 colônias e da placa RevB apenas 1 colônia. Um total de 52 clones (colônias brancas) resistentes aos antibióticos carbenicilina (50 µg/mL) e estreptomicina (100 µg/mL) foram selecionados, de forma randômica, 36 (69,2%) clones recombinantes, sendo 12 clones de cada grupo eleitos de forma randômica e, submetidos à digestão do DNA plasmidial com EcoRI. Todas as colônias isoladas foram colocadas em caldo LB, contendo os antibióticos carbenicilina e estreptomicina. Após 16 h a 37 ºC, sob agitação de 180 rpm, parte das células foi estocada na presença de glicerol em ultrafreezer para etapas posteriores de subclonagem. As células de E. coli recombinantes remanescentes foram submetidas à extração plasmidial e os resultados da extração dos plasmídeos já digeridos podem ser visto na Figura 8.
6.3 – Caracterização in silico da região codificadora da proteína Mo-CBP3
Tabela 9 – Rendimento e pureza das amostras de RNA purificado
Amostras (100 g) Concentração (ng/µL) A260 A260/A280 Fator
1 719.32 18 2.03 40
2 3234.92 80.873 2.02 40
3 352.68 8.817 2 40
4 2166.48 54.162 1.8 40
5 693.88 17.347 2.04 40
6 879.28 21.982 2.1 40
7 710.32 17.758 1.9 40
Figura 7 – Eletroforese em gel de agarose (1,5%) dos produtos de PCR-RACE para Mo-CBP3.
(A) À esquerda: Raias 1, 2 e 3: amostras RevA, RevB e RevC, respectivamente; Raia 4: Marcador e Raia 5: controle (negativo). (B) À direta: Intensidade em pixels das bandas referentes às amostras RevA, RevB e RevC e do Marcador. As siglas RevA, RevB e RevC foram adotadas em referência aos primers reverse usados.
