UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Faculdade de Medicina Veterinária
Dissertação
Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de
anticorpos contra o vírus da leucose bovina (BLV)
Clarissa Caetano de Castro
CLARISSA CAETANO DE CASTRO
Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de anticorpos contra o vírus da leucose bovina (BLV)
Orientadora: Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner Co-Orientador: Prof. Dr. Geferson Fischer
Pelotas, 2011
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área de conhecimento: Veterinária Preventiva).
Dados de catalogação na fonte:
( Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)
C355a Castro, Clarissa Caetano de
Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de anticorpos contra o vírus da leucose bovina(BLV) / Clarissa Caetano de Castro ; orientador Silvia de Oliveira Hübner ; co-orientador Geferson Fischer - Pelotas,2011.-48f. ; il..- Dissertação ( Mestrado ) –Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Faculdade de Veterinária . Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2011.
1.Leucose enzoótica bovina 2.Imunoperoxidase 3.Vírus da
leucose bovina 4.Infecção persistente 5.Diagnóstico
6.Anticorpos I.Hübner, Geferson Fischer(orientador) II .Título.
CDD 636.2089
Banca examinadora:
Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner – Universidade Federal de Pelotas (Orientadora)
Prof. Dr. Gilberto D’Ávila Vargas – Universidade Federal de Pelotas
Prof. PhD. Fábio Pereira Leivas Leite – Universidade Federal de Pelotas
Profa. Dra. Ana Cláudia Franco – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Agradecimentos
Ao meu marido Eugênio pelo amor, companheirismo e compreensão.
Aos meus queridos pais, Aldair e Paulo, e meus irmãos Luciane e Paulo pelo apoio, incentivo e carinho.
À minha orientadora Sílvia de Oliveira Hübner pela disposição, sugestões, paciência e pela grandiosa relação de amizade cultivada durante cinco anos durante as orientações de iniciação científica (CNPq) e de mestrado.
Ao meu co-orientador Geferson Fischer pelo apoio, ajuda, incentivo constante e aprendizado.
Aos professores e funcionários do Centro de Pesquisa em Virologia e Imunologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária - UFPel: Telmo Vidor, Gilberto D’Avila Vargas, José Carlos Rösler Sandrini, Eliete Sandrini, Enilda Souza de Oliveira e Márcia Rodrigues, pela estrutura e atenção a mim destinada.
Aos colegas e amigos do Centro de Pesquisa em Virologia e Imunologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária - UFPel: Cristina, Paula, Bianca, Fábio, Patrícia, Gustavo, Daiana, Cacciane, Fernanda e Débora pelo auxílio nas horas de dificuldade, pelos incentivos e otimismo e, principalmente, pela amizade.
Aos amigos do Centro de Desenvolvimento Tecnológico - Núcleo Biotecnologia - Laboratório de Bacteriologia - UFPel: Michele, Paula, Liana, Fernanda Valiati e Fernanda Rodrigues. Ao Prof. Fábio Leivas Leite por ter colocado o seu laboratório a disposição e, especialmente, a doutoranda Luana Dummer pelo ensinamento, ajuda e disposição.
À Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realização do curso de Pós-Graduação em Veterinária.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.
A todos que colaboraram de alguma forma na execução deste trabalho.
“Há homens que lutam um dia e são bons, há outros que lutam um ano e são melhores, há os que lutam muitos anos e são muito bons. Mas há os que lutam toda a vida e estes são imprescindíveis”. Bertold Brecht
RESUMO
CASTRO, Clarissa Caetano de. Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de anticorpos contra o vírus da leucose bovina (BLV). 2011. 48f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A leucose enzoótica dos bovinos (EBL) é uma enfermidade causada pelo vírus da leucose bovina (BLV), que ocasiona uma infecção persistente em bovinos, e é responsável por perdas econômicas significativas à pecuária, principalmente a leiteira. Amplamente disseminada no rebanho brasileiro, pode ser manifestada de três formas: aleucêmica, linfocitose persistente e linfossarcoma. Os animais com anticorpos contra o BLV deverão ser eliminados ou separados do restante do rebanho, pois significa que são portadores e disseminadores do vírus por toda a vida. O diagnóstico desta doença é essencial para estratégias de controle e erradicação baseadas na segregação de animais infectados no intuito de evitar ou amenizar a transmissão do vírus e, consequentemente, minimizar as perdas econômicas causadas pela doença. Durante a infecção pelo BLV são produzidos anticorpos contra as principais proteínas virais, gp51, gp30 (glicoproteínas do envelope) e p24 (proteína do capsídeo). O teste de imunodifusão em gel de ágar (agar gel immunodiffusion – AGID) e o ensaio imunoenzimático (enzyme-linked
immunosorbent assay – ELISA) são os mais utilizados para diagnóstico. No presente
trabalho foi avaliada a técnica de imunoperoxidase (peroxidase linked assay – PLA) na detecção de anticorpos contra o BLV. Os resultados obtidos na PLA foram comparados com o teste de AGID e a especificidade dos positivos confirmada pela técnica de Western blotting (WB). Foram testadas 201 amostras de soro de bovinos provenientes de propriedades localizadas no município de Pelotas: 59% (119) foram positivos por PLA e 26% (53) positivos por AGID. Todas as amostras positivas na AGID foram também positivas na PLA. Dos 32,8% (66) dos soros com resultados conflitantes apenas oito foram confirmados como positivos no WB, indicando serem falso-positivos os demais resultados e constatando que a AGID falhou em identificar 4% de animais positivos para EBL. A técnica de PLA para diagnóstico de infecção pelo BLV se mostrou muito útil para uso em programas de controle devido à maior sensibilidade da técnica quando comparada com o teste de AGID. Contudo, a ocorrência de resultados falso-positivos pela PLA inviabiliza o seu uso em programas de erradicação que envolva o sacrifício do animal soropositivo.
Palavras chave: Leucose enzoótica bovina. Imunoperoxidase. Vírus da leucose bovina. Infecção persistente. Diagnóstico. Anticorpos.
ABSTRACT
CASTRO, Clarissa Caetano de. Evaluation of immunoperoxidase test for the detection of antibodies against the bovine leukosis virus (BLV). 2011. 48f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
The enzootic bovine leukosis is an illness caused by the bovine leukosis virus (BLV) which provokes a persistent infection in cattle and is responsible for significant economical losses to the bovines, mainly dairy cattle. It is widely spread in Brazilian cattle and it can come up in three forms: asymptomatic infection, persistent lymphocytosis and lymphosarcoma. The animals that have antibodies against the BLV must be eliminated or separated from the rest of the cattle, because they are carriers and disseminators of the virus during all their lifetimes. The diagnosis of this disease is essential for control and eradication strategies based on the segregation of infected animals in order to avoid or attenuate the transmission of the virus, and consequently, minimize the economical losses caused by the disease. During the BLV infection antibodies are produced against the main viral proteins, gp 51, gp 30 (envelope glicoproteins) and p24 (capsid protein). The agar gel immunodiffusion (AGID) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tests are the most used for diagnosis. In this report the immunoperoxidase technique (peroxidase linked assay - PLA) was evaluated in order to detect antibodies against the BLV. The results obtained in the PLA were compared with the AGID test and the specificity of the positive ones was confirmed by the Western blotting (WB) technique. Two hundred and one bovine serum samples of cattle coming from the city of Pelotas were tested: 59% (119) were positive in PLA and 26% (53) were positive in AGID. All the AGID positive samples were also PLA positive. From the 32,8% (66) of the conflicting serum results just eight were confirmed as positive in WB, indicating that the rest of the results were false-positive and showing that AGID failed in identifying 4% of the BLV positive animals. The PLA technique for the diagnosis of the BLV infection demonstrated to be very useful to use in control programs because it was more sensitive when compared to the AGID technique. However, the occurrence of false-positive results by the PLA makes its use unviable in eradication programs that involve the sacrifice of seropositive animals.
Key-words: Enzootic bovine leukosis. Immunoperoxidase. Bovine leukosis virus. Persistent infection. Diagnosis. Antibodies.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ... 10 2. ARTIGO ... 15 2.2 INTRODUÇÃO ... 17 2.3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 18 2.3.1 Testes sorológicos ... 18
2.3.1.1 Imunodifusão em Gel de Ágar (Agar Gel Immunodiffusion - AGID) ... 18
2.3.1.2 Imunoperoxidase (Peroxidase Linked Assay - PLA)... 19
2.3.1.3 SDS-PAGE ... 19
2.3.1.4 Western blotting (WB) ... 20
2.4 RESULTADOS ... 20
2.4.1 Imunodifusão em gel de ágar (Agar Gel Immunodiffusion - AGID)... 20
2.4.2 Imunoperoxidase (Peroxidase Linked Assay - PLA)... 20
2.4.3 SDS-PAGE ... 21 2.4.4 Western Blotting (WB) ... 21 2.5 DISCUSSÃO ... 21 2.6 AGRADECIMENTO ... 23 2.7 REFERÊNCIAS... 23 2.8 FIGURAS ... 27 3. CONCLUSÃO GERAL ... 31 4. REFERÊNCIAS GERAIS ... 32 5. ANEXO ... 38
1. INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil possui o segundo maior rebanho de bovinos do mundo. Com um consumo per capita em torno de 34,7 quilos por habitante/ano é o segundo maior produtor de carne bovina e o maior exportador mundial deste produto. No ano de 2009, para a produção de carne e de leite, destinou-se 205,292 milhões de animais, sendo a criação de gado de corte, seguida da criação de gado de leite, a principal fonte de geração de renda para produtores. Em 2009 foram produzidos 6,661 milhões de toneladas de carne, deste total 13,9% foram exportados para outros países. A produção brasileira de leite ocupa a sexta posição no ranking mundial. A produção em 2009 foi de 29,112 bilhões de litros, com consumo per capita em torno de 152 litros por habitante (IBGE, 2009). As regiões Centro-Oeste (34,4%) e Norte (19,7%) são as principais detentoras do rebanho bovino brasileiro. Os Estados que produzem mais leite são Minas Gerais (27,2%), Rio Grande do Sul (11,7%) e Paraná (11,5%) (COLLA et al., 2009).
Os resultados apresentados pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) são satisfatórios à economia brasileira, porém o Brasil ainda possui grandes prejuízos financeiros relacionados a doenças que afetam os rebanhos. Animais doentes podem ter redução no ganho de peso, nos índices produtivos e reprodutivos, além de estarem sujeitos à mortalidade. Outra preocupação são as exigências sanitárias que estão cada vez mais rigorosas por parte dos países europeus e Estados Unidos, que para importar produtos de origem animal impõe que os animais sejam livres de determinadas infecções.
Dentre as diversas enfermidades que acometem bovinos destacam-se as de etiologia viral, principalmente aquelas que geram portadores assintomáticos, responsáveis por disseminar o vírus para os animais suscetíveis. Com estas características destaca-se a Leucose Enzoótica Bovina (Enzootic Bovine Leukemia -
EBL).
A EBL é causada por um vírus pertencente à família Retroviridae, subfamília
Oncovirinae e gênero Deltaretrovirus. O vírion é esférico, com genoma RNA fita
capsídeo de simetria icosaédrica, envolvido pelo envelope derivado da membrana celular do hospedeiro, onde se observam projeções de glicoproteínas (MURPHY et al., 1999). Animais infectados pelo vírus da leucose bovina (bovine leukosis vírus - BLV) desenvolvem anticorpos contra as glicoproteínas do envelope viral gp51 e gp30 e contra as proteínas do capsídeo p24, da matriz viral p15 e do nucleocapsídeo p12 (KETTMANN et al., 1994).
No Brasil, a doença foi descrita pela primeira vez por Rangel e Machado (1943). No entanto, um relato publicado por Merkt et al., (1959) no Paraná, parece ter sido o primeiro registro oficial do diagnóstico da doença em rebanhos brasileiros. Atualmente a leucose está presente em praticamente todos os estados do Brasil e do mundo, com exceção de alguns países europeus que possuem rebanhos pouco numerosos e decidiram erradicar a doença há alguns anos (D’ ANGELINO, 1991; BIRGEL JUNIOR et al., 2006).
A doença pode vir a se manifestar de três formas: aleucêmica, linfocitose persistente e linfossarcoma. Entre 1% a 5% dos bovinos soropositivos desenvolvem linfossarcoma e 30% desenvolvem linfocitose persistente (FERRER, 1979). O linfossarcoma multicêntrico dos animais adultos é a neoplasia maligna mais comum dos bovinos. É uma enfermidade altamente fatal, observada principalmente em gado leiteiro e, sobretudo, em animais entre seis e nove anos de idade (SORENSEN, 1979). A maior ocorrência de EBL em gado leiteiro comparada ao gado de corte é devido ao constante manejo, uma vez que a principal forma de transmissão é a horizontal, em especial a iatrogênica pelo uso de fômites contaminados, agulhas, instrumentos cirúrgicos e até mesmo pela palpação retal (JOHNSON; KANEENE, 1992).
A EBL gera prejuízos econômicos devido às restrições no mercado internacional, gastos com tratamento e diagnóstico, mortes de animais ocasionadas pela doença, condenação da carcaça, custo com reposição de animais e perdas na produção, devido à baixa na produtividade dos animais infectados (PELZER; SPRECHER, 1997). O estudo desenvolvido por Rajão (2008) demonstrou uma perda na produção de leite no período de 2005 a 2007 de R$ 332,95 por lactação de cada animal infectado com EBL, levando em consideração o valor médio pago ao produtor pelo litro de leite de R$ 0,53.
Em rebanhos infectados com o BLV, quando comparados com rebanhos livres, a produção de leite é menor e a taxa de descarte é maior (TRAININ, 1996; SARGEANT et al., 1997; OTT et al., 2003). Estudo realizado por Thurmond et al. (1983) demonstraram que animais soronegativos apresentavam uma maior sobrevida nos rebanhos em comparação aos animais soropositvos, após a idade de três anos e meio, caracterizando desta forma uma maior taxa de descarte para os animais sororeagentes. Fetrow e Ferrer (1982) salientam que há a possibilidade do vírus atuar como agente imunossupressor, podendo assim agir como fator predisponente a outras doenças. Outro fato de baixa produtividade está relacionado a intervalos de partos mais longos em relação a animais infectados do que animais não infectados (HEALD et al., 1992; JACOBS et al.,1995).
Embora estudos de impacto econômico ocasionados pela infecção pelo BLV não são frequentemente realizados no Brasil, revelam altas prevalências em algumas regiões. No Rio Grande do Sul há relatos de prevalência de 12,0% (MORAES et al., 1996) e 23,5% no município de Passo Fundo, RS (POLLETO et al., 2004). Sponchiado (2008) relatou a prevalência de 49,04% de EBL em bovinos da raça Holandesa criados em diversas regiões do Estado do Paraná. Em São Paulo a prevalência relatada foi de 54% (MEGID et al., 2003). Já no Estado de Santa Catarina a prevalência em bovinos leiteiros em 2001 estava em 7,6% (LUDERS, 2001).
Para solucionar as perdas econômicas causadas por essa enfermidade é necessário inicialmente a identificação dos animais soropositivos no rebanho. Os animais soropositivos para o BLV deverão ser eliminados, pois a presença de anticorpos significa que estão infectados pelo BLV e animais infectados permanecem portadores do vírus por toda a vida, disseminando a doença para o restante dos animais suscetíveis (EVERMANN, 1992). Quando o descarte do animal é economicamente inviável, a separação dos soropositivos em grupos de manejo representa uma alternativa para reduzir a difusão da infecção (FLORES et al., 1990; DIGIACOMO, 1992). A identificação desses animais é realizada através de diagnóstico laboratorial.
As técnicas mais utilizadas para diagnosticar a infecção pelo BLV são imunodifusão em gel de ágar (agar gel immunodiffusion - AGID) e o ensaio imunoenzimático (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA). AGID e ELISA são
testes aprovados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e pela Organização Mundial da Saúde Animal (OIE) e são baseados na detecção de anticorpos contra a gp51 e p24 (KNAPEN et al., 1994; REICHEL et al., 1998;
GUTIÉRREZ et al., 2009). Anticorpos contra a p24 são produzidos entre a segunda e quarta semanas após inoculação com BLV e anticorpos anti-gp51 são identificados mais tardiamente (GONZALEZ et al., 1999).
O teste de AGID apresenta como problemática um longo tempo para a leitura do resultado (48-72 horas), a presença de reações inespecíficas e sensibilidade relativamente baixa. Quando um animal tem níveis baixos de anticorpos estes podem não ser detectados, o que pode ocorrer em infecções recentes e em períodos em que os anticorpos estão sendo mobilizados, como o período pré-parto e colostral (JOHNSON; KANEENE, 1991; AGRESTI et al., 1993). O teste ELISA apresenta boa sensibilidade e rapidez na sua execução, contudo possui um custo relativamente alto em virtude da importação dos reagentes para sua realização, além disso, é mais propenso a apresentar reações inespecíficas (JOHNSON; KANEENE, 1992).
A literatura cita a utilização de outros testes para diagnóstico da enfermidade, como radioimunoensaio (RIA), reação da polimerase em cadeia (PCR) e Western blotting (WB). O RIA é pouco usado por ser radioativo, gerando risco operacional, além de possuir elevado custo para biossegurança e problemas com o descarte de material. O PCR é uma técnica molecular apresenta alto custo de equipamentos, exigência de treinamento e necessidade de cuidados extremos para evitar contaminação com as amostras.
O WB é um teste muito sensível e específico, embora pouco prático (KITTELBERGER et al., 1996). Segundo Gonzalez et al. (1999) a reação contra a proteína p24 deve ser utilizada como referência em testes de WB, por aparecer em todas as amostras positivas, enquanto que a gp51 pode desnaturar durante a eletroforese. Além disso, a gp51 pode ser confundida com muitas proteínas diferentes de mesmo peso molecular (KITTELBERGER et al., 1996; LLAMES et al., 2000).
A técnica de imunoperoxidade (peroxidase linked assay – PLA) é empregada para diagnosticar diversas enfermidades virais, como peste suína clássica (HOUBEN et al., 1995), arbovirus (SOLIMAN et al., 1997) e, principalmente, para a identificação de animais persistentemente infectados com o vírus da diarréia viral bovina (BVDV)
(DUBOVI, 1996; ELAHI, 1997; DEREGT; PRINS, 1998). A PLA é uma técnica rápida, de fácil execução, de baixo custo em laboratórios que possuem rotina em trabalhar com cultivo celular e permite o teste de grande número de amostras simultaneamente.
Recentemente, foi descrita a possibilidade do uso da PLA para diagnosticar EBL, sendo relatada alta sensibilidade e especificidade (BUZALA; DEREN; RULKA et al., 2003).
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a técnica de PLA para detecção de anticorpos contra o BLV comparando-a com o teste de AGID, e os resultados divergentes entre as técnicas foram comprovados usando o método de WB.
2. ARTIGO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de anticorpos contra o 14
vírus da leucose enzoótica bovina (BLV) 15
16
(Artigo científico a ser submetido ao periódico Archivos de Medicina Veterinaria – 17 Anexo) 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
AVALIAÇÃO DO TESTE DE IMUNOPEROXIDASE PARA DETECÇÃO DE 1
ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA LEUCOSE BOVINA (BLV) 2
3 4
C C de Castro1*, C F Nunes1, P F Finger1, B S Siddler1, L Dummer2, G Fischer1, G D Vargas1, 5 S O Hübner1. 6 7 8 1
Centro de Pesquisa em Virologia e Imunologia Animal, Faculdade de Veterinária,
9
Universidade Federal de Pelotas – UFPel – CP 354 – 96010-900 – Pelotas – RS – Brasil;
10
2
Centro de Desenvolvimento Tecnológico - Núcleo Biotecnologia - Laboratório de
11
Bacteriologia – UFPel – CP 354 – 96010-900 – Pelotas – RS – Brasil.
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
32 *Autor para correspondência. Tel 53 32757498; FAX 32757498
2.1 RESUMO 1
2
O vírus da leucose bovina (bovine leukosis virus - BLV) é um retrovírus que causa uma 3
infecção crônica, manifestada por três formas: aleucêmica, linfocitose persistente e 4
linfossarcoma. Uma vez infectados, os bovinos permanecem portadores pelo resto da vida. 5
Anticorpos são detectados poucas semanas após a infecção e sua detecção é importante para 6
identificação de animais infectados. Os teste de imunodifusão em gel de ágar (agar gel 7
immunodiffusion – AGID) e o ensaio imunoenzimático (enzyme-linked immunosorbent assay
8
– ELISA) são os mais utilizados para diagnóstico. Neste trabalho se avaliou a técnica de
9
imunoperoxidase (peroxidase linked assay – PLA) para detectar anticorpos contra o BLV. Os 10
resultados obtidos na PLA foram comparados com o teste de AGID e a especificidade dos 11
positivos confirmada pela técnica de Western blotting (WB). De 201 amostras de soro de 12
bovinos 59% (119) foram positivas por PLA e 26% (53) positivas por AGID. Todas as 13
amostras positivas na AGID foram também positivas na PLA. Dos 66 (32,8%) soros com 14
resultados conflitantes oito foram confirmados por WB. A técnica de PLA apresentou um 15
desempenho superior ao AGID, na detecção de animais soropositivos. A sua maior 16
sensibilidade a torna muito útil em programas de controle da enfermidade. 17
Palavras chave: imunoperoxidase, vírus da leucose bovina; sorologia; ensaio. 18
19
2.2 INTRODUÇÃO 20
21
A leucose enzoótica bovina (enzootic bovine leukemia - EBL) é uma enfermidade 22
causada pelo vírus da leucose bovina (bovine leukosis virus - BLV), pertencente à família 23
Retroviridae e subfamília Oncovirinae (Fauquet et al 2005). O BLV induz uma infecção
24
crônica em bovinos caracterizada pelo desenvolvimento de três formas: assintomática, 25
linfocitose persistente e linfossarcoma. A infecção está relacionada a prejuízos econômicos 26
devido a gastos com diagnóstico e tratamento, condenação de carcaças, mortes, perdas na 27
produtividade e custo com reposição de animais, além de poder comprometer o sistema 28
imunológico, tornando os animais mais suscetíveis a outras enfermidades (Fetrow e Ferrer 29
1982, Pelzer 1997). 30
O BLV está disseminado nos rebanhos bovinos de todo o mundo (Johnson e Kaneene 31
1992). A transmissão ocorre pela transferência de linfócitos B infectados para animais 32
suscetíveis, o que pode ocorrer verticalmente ou, principalmente, pela via horizontal, através 33
do uso de fômites contaminados, agulhas, instrumento cirúrgicos e até mesmo pela palpação 1
retal (Hopkins e DiGiacomo 1997). A determinação acurada do diagnóstico é essencial para 2
estratégias de controle e erradicação baseadas na segregação de animais infectados. 3
Durante a infecção pelo BLV são produzidos anticorpos persistentes contra as 4
principais proteínas virais, gp51, gp30 (glicoproteínas do envelope) e p24 (proteína do 5
capsídeo) (Evermann 1992, Kettmann et al 1994). Testes como a imunodifusão em gel de 6
ágar (agar gel immunodiffusion – AGID) e o ensaio imunoenzimático (enzyme-linked 7
immunosorbent assay – ELISA )apesar de não identificar todos os animais infectados (Eaves
8
et al 1994, Choi et al 2002) tem sido utilizados para detectar anticorpos contra essas proteínas 9
virais (Reichel et al 1998, Llames et al 2000, González et al 2007, Gutiérrez et al 2009). Mais 10
recentemente, foi descrita a possibilidade do uso de uma técnica de imunoperoxidase 11
(peroxidase linked assay – PLA) para diagnosticar EBL, sendo relatada uma alta sensibilidade
12
e especificidade, quando comparada a AGID e ELISA (Buzala e Deren 2003, Rulka et al 13
2003). O objetivo do presente trabalho foi avaliar o desempenho da PLA para detecção de 14
anticorpos contra o BLV, comparando-a com AGID e a técnica de Western blotting (WB). 15
16
2.3 MATERIAIS E MÉTODOS 17
18
O presente trabalho foi desenvolvido no Centro de Pesquisa em Virologia e 19
Imunologia Animal (CPVIA), em colaboração com Centro de Desenvolvimento Tecnológico 20
- Núcleo Biotecnologia (Laboratório de Bacteriologia), ambos da Universidade Federal de 21
Pelotas – UFPel. O estudo foi conduzido com 201 amostras de soros bovinos pertencentes a 22
seis propriedades localizadas no município de Pelotas, sul do estado do Rio Grande do Sul. Os 23
históricos dos animais e das propriedades eram desconhecidos. As amostras foram enviadas 24
ao CPVIA para realizar o diagnóstico de EBL. Amostras de sangue total foram centrifugadas 25
para separação do soro e após foram armazenadas a -20º C. 26
27
2.3.1 Testes sorológicos 28
2.3.1.1 Imunodifusão em Gel de Ágar (Agar Gel Immunodiffusion - AGID) 29
30
Para a AGID foi utilizado o Kit comercial para diagnóstico de EBL produzido pelo 31
Instituto de Tecnologia do Paraná (Tecpar) contendo antígeno elaborado a partir do meio de 32
cultivo das células Fetal Lamb Kidney (FLK) BLV. O teste foi realizado de acordo com o 33
protocolo recomendado pelo fabricante. Utilizou-se gel de ágar a 1% sobre placas de Petri de 1
vidro (90 x 15 mm) em que foram perfuradas sete rosetas, permitindo que 28 amostras fossem 2
testadas simultaneamente. Após 72 horas foi realizada a leitura do teste em ambiente escuro 3
com o auxílio de um foco de luz forte. Foram consideradas como positivas as amostras que 4
apresentaram linha de identidade com o soro controle positivo. 5
2.3.1.2 Imunoperoxidase (Peroxidase Linked Assay - PLA) 6
7
Células FLK permanentemente infectadas pelo BLV foram cultivadas em placas de 8
poliestireno (TPP) de 96 cavidades, contendo meio F 10 e 199 (Interlab) com adição de 10% 9
de soro fetal bovino (SFB - Invitrogen) por 72 horas (37º C, 5% CO2). As células foram 10
negativas para o vírus da diarréia viral dos bovinos (BVDV) quando analisadas por 11
imunofluorescência, usando anticorpo policlonal e anticorpo monoclonal anti BVDV 12
(gentilmente cedido pelo laboratório de virologia da UFSM). As células foram fixadas em 13
solução de paraformaldeído a 3% em PBS (NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 Mm, pH 14
7,3). Todas as lavagens foram realizadas com PBS contendo 5% de Tween 80 (PBST-80). Em 15
ensaios preliminares foram avaliadas diferentes diluições de soro a serem utilizadas na prova, 16
utilizando-se soros controles como parâmetros. Após a remoção do excesso do fixador foram 17
adicionadas as amostras de soro a serem testadas, diluídas a 1:80 em PBST-80 (100 18
µl/cavidade) e incubadas a 37º C por 1 hora. As amostras foram sempre testadas em 19
duplicatas, e em cada placa foram incluídos controles positivo (soro do kit de AGID e soro 20
fornecido pelo Instituto Pasteur de Montevideo - Uruguai) e negativo (SBF). As placas foram 21
lavadas quatro vezes e, após adição do conjugado a peroxidase anti-IgG bovina (Sigma-22
Aldrich) na diluição 1:600, foram incubadas por 1 hora a 37º C. Após quatro lavagens 23
adicionou-se a solução reveladora (5 ml de tampão acetato pH 5.0, 200 µl de solução de 24
carbazol e 10 µl de H2O2 30%). Após 15 minutos à temperatura ambiente foi realizada a 25
leitura das placas em microscópio ótico invertido, visando observação da formação de 26
coloração carmim nos locais onde ocorreram as reações imunes. 27
28
2.3.1.3 SDS-PAGE 29
30
Para a realização do SDS-PAGE foi utilizado o antígeno do kit de AGID (Tecpar). O 31
antígeno foi diluido a 1:50 em PBS (pH 7,4) contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e separado 32
por eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% a 100 V por 90 minutos conforme protocolo 1
de Sambrook e Russel (2001). O gel foi corado com azul de Coomassie R250 durante 120 2
minutos para a visualização das proteínas do BLV. 3
4
2.3.1.4 Western blotting (WB) 5
6
O WB foi realizado para confirmar a sensibilidade e especificidade de algumas 7
amostras reagentes na PLA e não reagentes na AGID. A técnica foi padronizada utilizando-se 8
amostras controles utilizadas no PLA e amostras de soro testadas que apresentaram 9
resultados positivos e negativos tanto por AGID quanto por PLA. Após a separação das 10
proteínas virais no SDS-PAGE, foi realizada a transferencia para a membrana de nitrocelulose 11
(Hybond/ ECL- GE Healthcare) conforme descrito (Sambrook e Russel 2001). Foi realizado o 12
bloqueio com leite desnatado a 5% em PBST durante 1 hora. Em seguida, foram adicionadas 13
as amostras de soro a serem testadas na diluição 1:200 em PBST e incubados durante 1 hora a 14
temperatura ambiente sob agitação constante. Depois de lavadas com PBST, foram incubadas 15
com anti-IgG bovino conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich) diluido a 1:1000 em PBST. 16
A revelação foi realizada com SIGMA FAST 3,3’-Diaminobenzidine tablets (Sigma-Aldrich) 17
até o surgimento da coloração. A reação foi parada com lavagens em água destilada. 18
19
2.4 RESULTADOS 20
21
2.4.1 Imunodifusão em gel de ágar (Agar Gel Immunodiffusion - AGID) 22
23
As amostras testadas foram consideradas positivas na presença de linha de identidade. 24
Do total de 201 animais avaliados, 26% (53) apresentaram resultado positivo, enquanto que 25
74% (148) apresentaram resultado negativo. Na figura 1 está a demonstração de algumas 26
reações observadas. 27
28
2.4.2 Imunoperoxidase (Peroxidase Linked Assay - PLA) 29
30
As amostras de soro positivas foram caracterizadas pela visualização de intensa 31
coloração carmim no citoplasma de células FLK (Figura 2). Por esta técnica foi observado 32
que dos 201 soros analisados 59% (119) eram soropositivos e 41% (82) soronegativos para 1
EBL. Todas as amostras positivas por AGID foram consideradas positivas por PLA. 2
3
2.4.3 SDS-PAGE 4
5
Após a coloração do gel com azul de Coomassie foram visualizadas as seguintes 6
proteínas do BLV: proteases 145, 72, 66 e 44 nas posições com peso molecular aproximado 7
de 141, 88, 74 e 44 KDa, respectivamente. Também as glicoproteínas 51 e 30, nas posições 8
com peso molecular aproximado de 68 e 32 KDa, e a proteína 24 na posição de 28 KDa 9 (Figura 3). 10 11 2.4.4 Western Blotting (WB) 12 13
O resultado foi considerado positivo para a presença de anticorpos contra o BLV 14
quando o soro foi reagente com a proteína do BLV de peso molecular de 24 KDa, que pode 15
ser representada com o aparecimento de uma a três bandas próximas (Mager et al 1994, 16
Jimenez et al 1995, Gonzalez et al 1999). 17
Das 201 amostras de soro analisadas 32,8% (66)apresentaram resultados divergentes, 18
ou seja, foram positivos por PLA e negativos por AGID. Para comprovar a especificidade dos 19
resultados conflitantes foi realizada a técnica de WB. Das 66 amostras, somente 8 (12,1%) 20
confirmaram a positividade (Figura 4). 21
22
2.5 DISCUSSÃO 23
24
A técnica de PLA é descrita por diversos pesquisadores como sendo de alta 25
especificidade e sensibilidade na identificação de animais sorologicamente positivos contra 26
diversas enfermidades (Houben et al 1995, Soliman et al 1997, Elahi 1997, Deregt e Prins 27
1998, Buzala e Deren 2003 e Rulka et al 2003). Além disso, é considerada uma técnica de 28
fácil execução e permite testar muitas amostras ao mesmo tempo. Em laboratórios com rotina 29
em cultivo celular a técnica de PLA, uma vez implementada, possui um baixo custo. Tais 30
características fazem com que possa ser de grande utilidade em programas de controle e 31
erradicação. Nesse sentido, esse trabalho teve como objetivo verificar se a PLA poderia ser 32
utilizada para diagnosticar bovinos infectados pelo BLV, e, dessa forma, proporcionar aos 1
produtores uma alternativa na busca de animais portadores. 2
Foram analisadas 201 amostras de soros por PLA e os resultados foram comparados 3
com o teste AGID (Tabela 1). Houve concordância de resultados em 67,2% das amostras 4
(135/201), sendo que todas as amostras positivas na AGID foram positivas na PLA, 26% 5
(53/201) e 41% (82/201) apresentaram resultados positivos e negativos, respectivamente, em 6
ambos os testes. Para confirmar se as amostras consideradas positivas na PLA e negativas na 7
AGID eram realmente positivas foi realizado o teste de WB, visto que é uma técnica de 8
grande sensibilidade e especificidade, embora de pouca praticidade para uso como teste de 9
triagem (González et al 1999, Choi et al 2002). Dos 66 soros positivos por PLA e negativos 10
por AGID, 8 (12,1%) foram sororeagentes por WB (Tabela 2), indicando serem falso-11
positivos os demais resultados e constatando que a AGID falhou em identificar 4% (8/201) de 12
animais positivos para ELB. De fato, trabalhos anteriores descrevem uma menor sensibilidade 13
do AGID comparada ao WB (Kittelberger et al 1996, Gonzalez et al 1999, Choi et al 2002). 14
Os resultados encontrados no PLA contrariam os descritos por Buzala e Deren (2003) 15
e Rulka et al (2003) que não detectaram problemas de especificidade, embora confirmem a 16
sensibilidade da técnica um pouco superior ao AGID na detecção de anticorpos contra o BLV. 17
Podem ser elaboradas diversas hipóteses para tentar explicar os resultados falso-positivos 18
encontrados no presente estudo. As reações observadas podem ter ocorrido devido a reações 19
inespecíficas contra antígenos celulares e não virais. Pode ter havido reações dos anticorpos 20
dos bovinos devido a presença de epitopos nas células muito semelhantes aos de antígenos 21
aos quais os animais tenham sido expostos. Existe ainda uma possibilidade de que as células 22
FLK utilizadas na técnica estivessem contaminadas com outro agente, como enterovirus, 23
rotavirus, coronavirus, vírus sincicial respiratório dos bovinos ou micoplasma (Beier et al 24
2004), os quais não foram testados. A linha celular FLK é muito utilizada para a produção de 25
antígeno para ser utilizado em kits comerciais de diagnóstico de BLV. Considerando a 26
possibilidade de freqüente contaminação dessas células (Bolin et al 1994, Dees et al 1994), 27
cabe ressaltar a importância da utilização de células livres de agentes estranhos para evitar 28
interpretações equivocadas no diagnóstico de BLV. Recentemente foi estabelecida uma nova 29
linhagem celular (PO714) permanentemente infectada pelo BLV e livre de contaminantes 30
(Beier et al 2004). Talvez a utilização dessa linhagem celular possa eliminar os resultados 31
falso-positivos e viabilizar a implementação da técnica de PLA para diagnóstico de EBL. 32
A prevalência de infecção pelo BLV é alta em várias regiões do Brasil, e recomenda-1
se que o controle seja feito pelas provas sorológicas, buscando identificar os animais 2
portadores da enfermidade. Os testes de AGID e ELISA são os aprovados pela Organização 3
Mundial da Saúde Animal (OIE), porém há relatos que estes métodos não identificam todos 4
os animais infectados (Eaves et al 1994). Em virtude disto, na implantação de um programa 5
de erradicação da EBL o ideal seria o uso de uma prova de grande acurácia e que detecte 6
precocemente os animais infectados. Nossos resultados sugerem, da mesma forma que os 7
obtidos por outros grupos, a necessidade de testes mais sensíveis para identificar bovinos 8
positivos para o BLV (Klintevall et al 1991, Kittelberger et al 1996, Gonzalez et al 1999, 9
Martin et al 2001). Técnicas como o WB, que detecta anticorpos contra p24, os quais são 10
produzidos precocemente (González et al 1999), ou técnicas moleculares, podem ser 11
alternativas a serem futuramente implementadas (Klintevall et al 1991, Martin et al 2001, 12
Kuckleburg et al 2003). 13
No presente estudo a técnica de PLA, quando comparada à técnica de AGID, 14
apresentou baixa especificidade, porém, a utilização da técnica em programas de controle da 15
doença através da identificação dos animais sororeagentes é satisfatória, pois propicia a 16
identificação de maior número de animais soropositivos do que o teste de AGID. 17
18
2.6 AGRADECIMENTO 19
20
Nós somos gratos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 21
(Capes) – pelo suporte financeiro concedido através da bolsa de mestrado. 22
23
2.7 REFERÊNCIAS 24
25
Beier D, R Riebe, P Blankenstein, E Starick, A Bondzio, O Marquardt. 2004. Establishment 26
of a new bovine leukosis virus producing cell line. J Virol Meth 121, 239–246. 27
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10 11
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15
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bovine viral diarrhea virus (VDBV) strains an the role of different cell fixation methods in 17
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19
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22
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20 21
Soliman A K, D M Watts, A W Salib, A E D Shehata, R R Arthur, B A M Botros. 1997. 22
Application of an immunoperoxidase monolayer assay for the detection of arboviral 23
antibodies. J Vir Method 65, 147-151. 24 25 26 27 28 29 30 31 32
2.8 FIGURAS 1
2
Castro et al, Figura 1 3
4
Teste de AGID para detecção de anticorpos anti-BLV. 1: soro controle positivo; 2: amostra 5
de soro positiva; 3: amostra de soro positiva; 4: soro controle positivo; 5: amostra de soro 6
positiva; 6: amostra de soro negativa; 7: antígeno do BLV. 7
8
Castro et al, Figura 2 9
10
Reações observadas pela técnica de PLA em células FLK. (A) Amostra positiva para 11
anticorpos contra o BLV; → presença da coloração Carmin marcando o antígeno no 12
citoplasma da célula. (B) Amostra negativa para anticorpos contra o BLV. Observação em 13
microscópio óptico invertido 40x. 14
15 16 17
Castro et al, Figura 3 1
2
Perfil de proteínas do BLV obtido a partir do kit utilizado (Tecpar) obsevado por SDS-PAGE 3
(gel de acrilamida 12 %) corado com azul de Coomassie. (M) marcador de peso molecular 4
(Prestained SDS-PAGE Standards Low Range – Bio Rad). 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Castro et al, Figura 4 1
2
3
Imunodetecção por WB de anticorpos específicos contra o BLV. M: marcador de peso 4
molecular (Prestained SDS-PAGE Standards Low Range – Bio Rad); ++: amostra positiva 5
nos testes de AGID e PLA; --: amostra negativa nos teses de AGID e PLA; SFB: amostra 6
controle negativo; SH1: amostra controle positivo cedido pelo Instituto Pasteur-Montevideo; 7
SH2: amostra controle positivo do kit comercial (Tecpar); A+: amostra de soro positivo e A-: 8
amostra de soro negativo; *: presença de reação contra a proteína p24. 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Tabela 1 – Análise dos resultados entre as técnicas de Imunoperoxidase e Imunodifusão em 1 Gel de Ágar. 2 Testes sorológicos
Resultados PLA AGID
Positivos 119 (59%) 53 (26%)
Negativos 82 (41%) 148 (74%)
Total 201 (100%) 201 (100%)
3 4
Tabela 2 – Comparação dos resultados divergentes dos testes de Imunoperoxidase e 5
Imunodifusão em Gel de Ágar com a técnica de Western blotting. 6
7
Testes Sorológicos
Resultados PLA AGID WB
Positivos 66 (100%) 0 8 (12,1%) Negativos 0 66 (100%) 58 (87,9%) Total 66 (100%) 66 (100%) 66 (100%) 8 9 10 11 12
3. CONCLUSÃO GERAL
- A técnica de imunoperoxidase apresentou maior sensibilidade para detectar anticorpos contra o BLV, quando comparada ao teste de AGID;
- A técnica de imunoperoxidade para a detecção de anticorpos contra o BLV apresentou baixa especificidade, quando comparada com o teste de AGID e confirmada pelo WB;
- A utilização da técnica de Imunoperoxidase em programas de controle da doença através da identificação dos animais sororeagentes é satisfatória, pois propicia a identificação de maior número de animais soropositivos do que o teste de AGID;
- A técnica de Imunoperoxidase não é recomendada para eliminar a enfermidade através da erradicação, pois demonstrou resultados elevados na identificação de animais falso-positivos.
4. REFERÊNCIAS GERAIS
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ANEXO A - Formato de acordo com as normas da revista Archivos de Medicina Veterinaria. www.veterinaria.uach.cl ISSN 0717-6201 versão online ISSN 0301-732X versão impressa
INSTRUÇÕES PARA OS AUTORES Instruções para os autores
Envio da publicação
Forma e preparação do artigo Provas de impressão
Instruções para os autores
Archivos de Medicina Veterinária publica, em espanhol ou inglês, contribuições científicas originais na forma de artigos científicos, revisões bibliográficas e comunicações curtas que possam incluir observações clínicas, descrições de técnicas ou métodos, e avanços em todos os aspectos das Ciências Veterinárias e bem-estar animal.
Envio da publicação
Os artigos devem ser enviados ao Editor e incluir:
Três exemplares impressos em papel, incluindo os quadros, figuras e fotografias. Uma versão eletrônica do texto, quadros (preferentemente em formato MS Word) e figuras (de preferência em formato Excel), deverá vir em anexo em disco de 3,5” ou CD,
devidamente rotulado com o Sobrenome do primeiro autor e as primeiras palavras do título do artigo.
Os trabalhos devem ser originais e, não devem estar em processo de revisão em outra revista.
Os artigos apresentados sem considerar as normas de estilo, serão devolvidos sem passar pela revisão.
Para experiências com animais ou humanos, o Comitê Editor poderá solicitar que se anexe à autorização de um Comitê de Bio-ética ou instância similar.
Deverá incluir uma carta dirigida ao Editor solicitando a publicação do seu trabalho e indicando um dos autores como responsável pela revisão das provas de impressão e da correspondência.
A propriedade intelectual dos trabalhos publicados pertence aos autores.
Os revisores de Archivos de Medicina Veterinária assessoram ao Comitê Editor para decidir se o trabalho pode ser publicado. Os autores poderão sugerir revisores. Todos os artigos enviados para publicação serão enviados a dois revisores selecionados pelo Comitê Editor e podem incluir, ou não, os sugeridos pelos autores. Em caso de existir controvérsia nos informes, se recorrerá a um terceiro em caráter de árbitro, que assessorará ao Comitê Editor para decidir o destino do trabalho. Os revisores estão obrigados a manter o caráter confidencial de toda a informação dos trabalhos, mesmo quando não sejam publicados.
Antes da publicação deverá ser pago um valor o qual esta indicado na Web www.veterinaria.uach.cl
Forma e preparação do artigo
Tipos de artigos
Artigos de revisão: são realizados por especialistas que resumem e projetam o conhecimento atualizado num campo particular das Ciências Veterinárias, e não necessariamente se ajustam a um formato definido de apresentação. Os autores deverão previamente consultar aos editores antes de iniciar o trabalho de revisão. O Comitê Editor poderá solicitar os especialistas o envio de artigos de revisão, que também serão
submetidos ao processo de arbitragem e edição. Não devendo exceder 35 páginas.
Artigos científicos: estes informam um novo avanço em Ciências Veterinárias baseados numa investigação original. O formato dos mesmos deverá incluir, sumário, introdução, material e métodos, resultados, discussão, resumo, agradecimentos (quando corresponda) e referências. Não devem exceder de 25 páginas.
Comunicações curtas: informam de maneia breve, um avanço, resultado de um experimento, observações clínicas ou nova metodologia, justando-se ao seguinte formato: sumário, introdução, material e métodos, resultados e discussão (seção conjunta), resumo, agradecimentos (quando corresponda) e referências. Não devem exceder de 15 páginas.
Estilo e formato da revista
Apresentação geral: a revista publica artigos em espanhol ou inglês.
Os artigos deverão ser escritos com letras Times New Roman tamanho 12, por um só lado das folhas, o espaçamento entre linhas e médio, em tamanho carta (21,5 x 27,9 cm), deixando 2 cm em cada margem da folha.
Todas as páginas devem ser numeradas de maneira consecutiva no ângulo superior direito, e as línhas deverão ser numeradas em cada página, iniciando-se com o número 1, junto à
margem esquerda, em todo o trabalho.
Os títulos de capítulos devem ser escritos em minúscula e negrito, justificada do lado esquerdo, em línhas separadas e sem ponto final. Ex. “Materiais e Métodos”. Nos subtítulos só a primeira letra é maiúscula. Subtítulo primário Ex “Desenho experimental” deverá ser justificado ao lado esquerdo e em negrito; subtítulo secundário deve ser justificado do lado esquerdo e em letra itálica. Não deverão usar-se sublinhados nem numeração de subtítulos ou lista de itens.
a clareza do texto o requeira, devem ser expressas em palavras. Um decimal deverá ser precedido de um numeral usando ponto quando o artigo é em inglês ou vírgula quando o artigo é em espanhol Ex. “0,5” não “,5”. As medidas de quantidade deverão ajustar se ao Sistema Internacional de Unidades, a menos que a prática numa disciplina use derivados deles (Ex. a unidade internacional de Curie). As datas devem ser expressas como “07 de setembro de 1954” no texto, mas podem apresentar-se abreviadas nos quadros e figuras. O tempo diário deve expressar se segundo as 24 horas cronológicas.
Para a nomenclatura química deve-se utilizar as normas da Sociedade de Bioquímica (Biochem J 209, 1-27, 1983), os fármacos ou drogas devem ser mencionados por seus nomes genéricos (em minúsculas), se for necessário colocar marcas e suas fontes deverão ir ao pé de página. As enzimas devem ser identificadas, quando se mencionam por primeira vez, segundo a Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry.
Os termos em latim e suas abreviações que são de uso comum na literatura científica, tais como: in vitro, in vivo, ad libitum deverão ser italizadas. Os valores de probabilidade devem ser dados na forma de P<0,05 o P<0,01. Desvio padrão, erro padrão da media e intervalos de confiança, se abreviarão da seguinte forma: DE, EE e IC, respectivamente.
Pé de página
Serão usados para indicar o endereço do autor responsável da correspondência e seu endereço eletrônico na página do título, para elaborar abreviações citadas em o título de quadros, marcas comerciais, nome e endereço de empresas ou quando deva-se sinalar a fonte de financiamento.
Título
O título do trabalho deve ser conciso, específico e informativo. Só a primeira letra será maiúscula, em negrito, centrado, iniciando se na línea 10, sem usar marcas comerciais ou abreviações. Dever-se-á sinalar, com índice # a fonte de financiamento, se houver, será detalhada ao pé da página. Separado por espaço de uma línha onde deverá escrever o título
em inglês, em igual estilo e formato.
Autores e endereços
