UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Estudo da reatividade vascular e atividade oscilatória em aortas
isoladas de ratos após desnervação sino-aórtica
Matheus Lavorenti Rocha
Ribeirão Preto
2008
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.Matheus Lavorenti Rocha
Estudo da reatividade vascular e atividade oscilatória em aortas
isoladas de ratos após desnervação sino-aórtica
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Univerdade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Farmacologia Orientadora: Profª. Drª. Lusiane Maria Bendhack
Ribeirão Preto
2008
Pelos valores que me ensinaram, todas as
conquistas da minha vida sempre serão
dedicadas aos meus pais, Luiz Carlos e Regina.
AGRADECIMENTOS
A Profa. e amiga Dra. Lusiane M. Bendhack, pela conduta profissional exemplar, pela dedicação, orientação experiente e acima de tudo, pela sua confiança.
Aos membros da banca examinadora, por terem aceitado o convite, pela análise do trabalho e grande colaboração.
Aos Profs. do ICB/USP Dr. Roberto Britto e Dra. Luciana Rossoni que possibilitaram realizar algumas técnicas experimentais que enriqueceram este trabalho.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto por ter fornecido todas as condições para que este trabalho pudesse ter sido realizado.
Ao corpo docente e funcionários do Laboratório de Farmacologia da FCFRP, pela amizade, apoio e carinho.
A todos os colegas do laboratório de Farmacologia, pelo apoio, auxílio e por tornarem os dias de experimentos menos cansativos.
Às minhas irmãs, Rachel, Marina e Maíra, pelo carinho, apoio e incentivo, sem os quais este trabalho não teria real valor.
Aos amigos Fábio, Homer, Sandro e Gugui, pela importante fase em que passamos juntos, pela amizade, convivência e por tornarem meus dias mais agradáveis.
A todos aqueles que apesar de não citados, tiveram muita importância e ajudaram de alguma forma a realizar este trabalho.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Registro representativo da pressão arterial média e da freqüência
cardíaca em ratos DSA e SO...40
Figura 2. Efeito contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO...42
Figura 3. Efeito contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO...43
Figura 4. Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO...44
Figura 5. Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO...45
Figura 6. Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO...46
Figura 7. Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. ...47
Figura 8. Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. ...48
Figura 9. Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. ...49
Figura 10. Efeito contrátil da serotonina em aortas de ratos DSA e SO...50
Figura 11. Efeito contrátil da serotonina em aortas de ratos DSA e SO...51
Figura 12. Efeito de incrementos na concentração de CaCl2 sobre a resposta contrátil de aortas de ratos DSA e SO. ...52
Figura 13. Efeito de incrementos de CaCl2 sobre a resposta contrátil à fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. ...53
Figura 14. Efeito contrátil do KCl em aortas de ratos DSA e SO...54
Figura 15. Efeito contrátil do KCl em aortas de ratos DSA e SO...55
Figura 16. Efeito contrátil do TEA em aortas de ratos DSA e SO...56
Figura 17. Efeito contrátil do TEA em aortas de ratos DSA e SO...57
Figura 18. Efeito contrátil do BaCl2 em aortas de ratos DSA e SO...58
Figura 19. Efeito relaxante do pinacidil em aortas sem endotélio de ratos DSA e SO...59
Figura 20. Efeito relaxante da isoprenalina em aortas de ratos DSA e SO..60
Figura 22. Efeito relaxante da forscolina em aortas com e sem endotélio de ratos DSA e SO...62 Figura 23. Efeito relaxante da forscolina em aortas de ratos DSA e SO...63 Figura 24. Efeito relaxante do nitroprussiato de sódio em aortas sem
endotélio de ratos DSA e SO...64 Figura 25. Efeito relaxante da acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO....65 Figura 26. Efeito do heptanol sobre o relaxamento estimulado pela
acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO. ...66 Figura 27. Efeito do heptanol sobre a resposta relaxante da acetilcolina em
aortas de ratos DSA e SO...67 Figura 28. Efeito do 18β-GA sobre o relaxamente estimulado pela
acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO...68 Figura 29: Efeito do 18β-GA sobre a resposta relaxante da acetilcolina em
aortas de ratos DSA e SO...69 Figura 30. Expressão do RNA mensageiro (mRNA) para conexina 43 em
aortas de ratos DSA e SO...71 Figura 31. Imagem representativa dos experimentos de western blot (topo) e analise quantitativa (gráfico) para conexina 43 em aortas isoladas de ratos DSA e SO...72 Figura 32. (a) Traçado representativo mostrando as contrações oscilatórias
em aortas de ratos DSA...74 Figura 33. Contrações oscilatórias em anéis de aortas isoladas de ratos DSA e os parâmetros avaliados. ...75 Figura 34. Efeito contrátil da Fenilefrina em aortas de ratos DSA...77 Figura 35. Traçado representativo mostrando o registro de contrações
oscilatórias em aorta isoladas de ratos DSA...78 Figura 36. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA em 3 diferentes condições...80 Figura 37. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas (E+) isoladas de ratos DSA...81 Figura 38. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas E+
isoladas de ratos DSA...82 Figura 39. Traçado das contrações oscilatórias em aorta de rato DSA...85
Figura 40. Efeitos de 4-AP sobre as contrações oscilatórias em anéis de aortas isoladas de ratos DSA. ...86 Figura 41. Efeitos do cloreto de bário sobre as contrações oscilatórias em
aortas isoladas de ratos DSA. ...87 Figura 42. Efeitos da glibenclamida sobre as contrações oscilatórias em
aortas isoladas de ratos DSA. ...89 Figura 43. Efeitos dos moduladores de canais para K+ ativados por Ca2+
sobre as contrações oscilatórias em anéis de aortas isoladas de ratos DSA. ...91 Figura 44. Efeitos do 2-APB sobre as contrações oscilatórias induzidas por
fenilefrina em aortas isoladas de ratos DSA...94 Figura 45. Traçado representativo mostrando os efeitos da rianodina sobre
as contrações oscilatórias em aorta E- isoladas de ratos DSA...96 Figura 46. Traçado representativo mostrando o efeito da tapsigagina sobre
as contrações oscilatórias em aortas isoladas de rato DSA...98 Figura 47. Efeito do Bay K 8644 sobre as contrações oscilatórias induzidas
por fenilefrina em aortas de ratos DSA...100 Figura 48. Traçado representativo mostrando o registro de contrações
oscilatórias em aortas isoladas de rato DSA...101 Figura 49. Traçado representativo mostrando os efeitos do heptanol sobre
as contrações oscilatórias em aorta isoladas de rato DSA...103 Figura 50. Traçado representativo mostrando o efeito do 18β-GA sobre as
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores de freqüência e amplitude das contrações oscilatórias em aortas isoladas de ratos DSA em situações controles e após incubação com drogas...83 Tabela 2. Efeitos dos bloqueadores de canais para K+ sobre as contrações
LISTA DE ABREVIATURAS
[Ca2+]c - Concentração Citoplasmática de Ca2+18β-GA - Ácido 18β-Glicirretínico
2-APB – 2-Aminoetil Ester Difenil-borato 4-AP – 4-Aminopiridina
Cx - Conexina DAG – Diacilglicerol
DMB – Dimetil-benzil Amilorida DSA – Desnervação Sino-aórtica
EC50 – Concentração que promove 50% da resposta máxima
Emax - Efeito Máximo
GMPc – Guanosina Monofosfato Cíclico IP3 – Inositol 1,4,5 trifosfato
KATP - Canais para Potássio dependentes de ATP
Kca – Canais para Potássio Ativados por Ca2+
KCl – Cloreto de Potássio
Kir - Canais para Potássio do Tipo Retificador
Kv - Canais para Potássio dependentes de Voltagem
L-NAME – NG-nitro-L-arginina Metil Ester
LPA – Labilidade da Pressão Arterial MLV – Músculo Liso Vascular
NO – Óxido Nítrico
NPPB - 5-nitro-2-(3-phenilpropilamino) ácido benzóico NPS – Nitroprussiato de Sódio
ODQ – 1H-[1,2,4]oxidazol[4,3-a]quinoxaline1-one PAM – Pressão Arterial Média
pD2 – Potência (-log EC50)
PGF2α – Prostaglandina F2α
RS – Retículo Sarcoplasmático SO – Sham-Operados
RESUMO
ROCHA ML. Estudo da reatividade vascular e atividade oscilatória em aortas isoladas de ratos após desnervação sino-aórtica. 2008. 170p. Tese (doutorado) – Faculdade de Madicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
Animais submetidos à desnervação sino-aórtica (DSA), secção das aferências dos pressorreceptores aórticos e carotídeos, caracterizam-se por apresentar intensa variabilidade da pressão arterial e ausência de hipertensão severa. No presente trabalho, verificamos o aparecimento de atividade oscilatória em aortas de ratos DSA e investigamos alguns mecanismos que poderiam influenciar a manutenção/gênese das oscilações. Também analisamos possíveis alterações na reatividade vascular em aortas de ratos DSA e SO. Para isto, analisamos a resposta contrátil e relaxante da aorta de ratos DSA e comparação com aortas de ratos Sham-operados (SO), utilizando agentes promotores de contração (fenilefrina, serotonina, KCl, tetraetilamônio e BaCl2) e relaxamento vascular (pinacidil, isoprenalina, forscolina, nitroprussiato
de sódio e acetilcolina). Analisamos a participação das junções do tipo gap utilizando os bloqueadores heptanol e ácido 18β-glicirretínico (18β-GA), sobre a reatividade vascular e sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA. Também foi verificada a participação dos diferentes tipos de canais para K+, a influência da fonte extra e intracelular de Ca2+ e a influência do endotélio sobre as contrações oscilatórias. Foram feitos ensaios de biologia molecular (PCR-RT e Western Blot) para detecção de conexina 43 em aortas de ratos DSA e SO. Como resultados, verificamos que aortas de ratos DSA possuem maior expressão protéica de conexina 43 do que aortas de ratos SO. Aortas de ratos DSA apresentaram maior resposta contrátil para fenilefrina e serotonina,
além de menor sensibilidade ao TEA e menor relaxamento para isoprenalina do que aortas de ratos SO. A resposta aumentada para fenilefrina em aortas de ratos DSA foi normalizada pelo bloqueio das junções do tipo Gap com 18β-GA. O 18β-GA diminuiu o relaxamento causado pela acetilcolina em aortas de ratos SO como maior magnitude do que em aortas de ratos DSA, enquanto o heptanol não afetou a resposta relaxante para acetilcolina em aortas de ratos DSA, mas diminuiu o relaxamento em aortas de ratos SO. Sobre as contrações oscilatórias que ocorrem em aortas de ratos DSA, o óxido nítrico (NO) endotelial tem efeito modulador negativo sobre as oscilações, e exerce este efeito através da ativação de guanilato ciclase. Os canais para K+ parecem ser importantes para as oscilações, principalmente os KATP e KCa, uma vez que as
oscilações foram afetadas por seus bloqueadores específicos. Além disto, as contrações oscilatórias mobilizam tanto Ca2+ externo como do retículo
sarcoplasmático. As junções do tipo gap parecem ser fundamentais para a manutenção das oscilações, uma vez que o heptanol e o 18β-GA aboliram este fenômeno. Como conclusão, demonstramos que aortas isoladas de ratos DSA apresentam maior resposta contrátil para agonistas contráteis, além prejuízo no relaxamento via ativação de β-adrenoreceptores. Parte destes resultados podem ser explicados pelo aumento no número de conexina 43 em aortas de ratos DSA. O estudo das contrações oscilatórias revelou que as oscilações são moduladas negativamente pelo endotélio, são dependentes do Ca2+ extra e intracelular e das junções gap. Ainda, os canais para K+ (KATP e KCa) são
ABSTRACT
ROCHA ML. Study of vascular reactivity and oscillatory contractions in sinoaortic denervated rat aortas. 2008. 170p. Tese (doutorado) – Faculdade de Madicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
The spontaneous variation of blood pressure is defined as arterial pressure lability. Sinoaortic denervation (SAD) is characterized by arterial pressure lability without sustained hypertension. In this work, we have investigated some of the mechanisms that could influence the maintenance/genesis of the oscillations observed in SAD rat aortas, as well as alterations in the vascular reactivity in isolated aortas of those animals. Therefore, we analyzed the contractile and relaxing responses of the SAD rat aortas as compared to Sham-operated (SO) rat aortas by using constrictor (phenylephrine, serotonin, KCl, tetraetylammonium (TEA) and BaCl2) and
relaxant substances (pinacidil, isoprenaline, forskolin, sodium nitroprusside and acetylcholine). We investigated the participation of the gap junctional communications using the gap junction blocker heptanol and 18β-acid glicirretinic (18β-GA), on the vascular reactivity and on the oscillatory contractions in SAD rat aortas. The contribution of the different types of K+ channels, the influence of the extra and intracellular Ca2+ sources and the influence of the endothelium on the oscillatory contractions were also verified. Additionally, we have used molecular biology techniques (PCR-RT and Western Blot) for detection of connexin 43 in isolated aortas of both animal groups. We have verified that SAD rat aortas possess larger connexin 43 expression than SO rat aortas. SAD rat aortas exhibited higher contractile responses for
phenylephrine and serotonin, besides smaller sensitivity to TEA and lower relaxation to isoprenaline than SO rat aortas. The increased phenylephrine-induced contractions in SAD rat aortas were normalized by the gap junction blockade with 18β-GA. This inhibitor also reduced the relaxation caused by acetylcholine in SO rat aortas with larger magnitude than in SAD rat aortas, while heptanol failed to affect the relaxant response to acetylcholine in SAD rat aortas, but it was reduced in SO rat aortas. In relation to the oscillatory contractions in SAD rat aortas, our results indicate that the endothelium-derived NO (and not prostanoids), through cGMP pathway, has inhibitory effect on the oscillations. The K+ channels KATP and BKCa play the predominant role
on the regulation of oscillatory contractions, although we did not discard the influence of Kir channels on these oscillations. Drugs that impaired intracellular
Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum interrupted the oscillations. The
oscillations also depend on the extracellular Ca2+ entry through L-type Ca2+ channel. Moreover, the oscillations seem to be dependent of the gap junctional communication, since heptanol and 18β-GA completely blocked them.
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO...16
2 - OBJETIVOS...27
3 - MATERIAL E MÉTODOS...28
3.1 - Animais experimentais e desnervação Sino-Aórtica...28
3.2 – Medida da pressão arterial média e labilidade da pressão arterial...29
3.3 - Montagem de preparações de aortas isoladas...29
3.4 - Análise Estatística...30
4. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS...32
4.1 - Curvas concentração-efeito cumulativas em anéis de aortas de ratos DSA e SO para agentes contráteis...32
4.2 – Curvas concentração-efeito cumulativas em anéis de aortas de ratos DSA e SO para agentes relaxantes...32
4.3 – Estudo da resposta contrátil estimulada com fenilefrina frente a concentrações crescentes de cálcio extracelular...32
4.4 – Influência do endotélio vascular sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA...33
4.5 – Efeitos dos moduladores de canais para K+ sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA...34
4.6 – Participação do Ca2+ intra e extracelular e junções gap sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA...34
4.7 - Quantificação da expressão gênica de conexina 43 por PCR Real-Time...35
4.8 - Expressão protéica (western-blot) para conexina 43...37
5 – RESULTADOS...38
5.1 - Pressão arterial média, freqüência cardíaca e labilidade da pressão arterial...39
5.2 – Reatividade vascular a agentes contráteis...41
5.4 - Expressão gênica da conexina 43...70
5.5 - Expressão protéica (western-blot) para conexina 43...72
5.6 - Características das contrações oscilatórias e sua análise...73
5.7 - Influência do endotélio sobre as contrações oscilatórias...76
5.8 - Efeitos dos moduladores de canais para K+ sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA...84
5.9 - Participação do Ca2+ intra e extracelular nas contrações oscilatórias....93
5.10 - Participação das junções intercelulares do tipo GAP sobre as contrações oscilatórias...102
6 – DISCUSSÃO...105
7 – SUMÁRIO E CONCLUSÕES...144
8 – REFERÊNCIAS BLIOGRÁFICAS...146
1. INTRODUÇÃO
Os barorreceptores arteriais localizados na região de bifurcação das artérias carótidas comuns e no arco aórtico, são estruturas nervosas sensíveis à variação na pressão arterial. Através da regulação reflexa, eles são responsáveis pela manutenção dos níveis de pressão arterial dentro de uma estreita faixa de variação (Jacob et al., 1988). Após estimulados por alterações da pressão arterial, esses barorreceptores conduzem informações por suas aferências até o sistema nervoso central, mais especificamente no núcleo do trato solitário, onde essas informações são integradas e reflexamente dirigidas ao coração e vasos sanguíneos por eferências que se encontram no tronco cerebral e medula espinhal (Palkovits & Zaborszky, 1977). Através desse mecanismo reflexo, os barorreceptores proporcionam um controle da pressão arterial momento-a-momento.
A secção das aferências dos barorreceptores, através da desnervação sino-aórtica (DSA), realizada em várias espécies de animais e particularmente em ratos (Krieger, 1964), deu origem a um modelo de hipertensão experimental, considerado inicialmente como modelo de hipertensão neurogênica. Porém, a principal função dos barorreceptores é minimizar variações instantâneas na pressão arterial e não controlar cronicamente a mesma. Sendo assim, alguns estudos demostraram que a DSA caracterizava-se principalmente por induzir uma exagerada variabilidade nos valores de pressão arterial e não propriamente pelos altos níveis de pressão arterial (Norman et al., 1981; Saito et al., 1986; Alper et al., 1987; Eto et al., 2003).
A variabilidade aumentada nos valores de pressão arterial ou labilidade da pressão arterial (LPA), característica marcante deste modelo experimental tem sido observada em varias espécies animais (Norman et al., 1981; Saito et al., 1986; Shade et al., 1990) e inclusive no homem (Aksmit et al., 1987). Os mecanismos relacionados à LPA não estão totalmente esclarecidos. Jacob et al. (1989) apresentaram evidências para participação de dois mecanismos que poderiam contribuir para a LPA: um componente neurogênico, relacionado à descarga central mediada pelo sistema nervoso simpático e um componente periférico que envolve a ativação do músculo liso vascular (MLV) por vários agentes vasoconstritores endógenos, o que poderia causar alterações na concentração intracelular de Ca2+.
A pressão arterial é uma bem conhecida determinante para lesões a órgãos alvos (coração, rins, vasos) em pacientes e animais hipertensos e a redução da pressão arterial tem sido enfatizada por ser muito importante para proteção desses órgãos (Staessen et al., 2001). Porém, os altos níveis de pressão arterial certamente não são os únicos determinantes para os danos observados nos órgãos alvos do sistema circulatório. Algumas drogas anti-hipertensivas efetivamente reduzirem a pressão arterial, mas falham em prevenir estas lesões (Teisman et al., 1998), que vão desde hipertrofia das veias e artérias, lesões glomerulares e hipertrofia e dano do miocárdio. Vários estudos clínicos demonstraram a associação entre LPA e lesões no coração, rins e vasos, além de demonstrarem que tais prejuízos foram mais severos em pacientes hipertensos com elevados valores de LPA (Parati et al., 1987, Frattola et al., 1993; Mancia et al., 2001). Ainda mais, estudos em animais mostraram que a LPA é mais prejudicial que a própria hipertensão aos órgãos
alvos do sistema circulatório (Shan et al., 2001; Zhang et al., 2003; Miao et al., 2006). A DSA é um modelo exemplar para tratar do assunto, uma vez que causa intensa LPA, sem aumentar os níveis pressóricos.
O tônus do MLV é modulado por vários mecanismos. É influenciado por sistemas extrínsecos aos vasos sanguíneos como a inervação recebida por diferentes vasos, interação com vários hormônios ou peptídeos vasoativos, fatores locais gerados pelo metabolismo celular e o endotélio vascular. Também é modulado por fatores intrínsecos ao MLV como potencial de membrana e sistemas moleculares de regulação como canais iônicos, mensageiros secundários e proteínas contráteis.
Dentro do limitado número de sinais intracelulares, o íon Ca2+ constitui um segundo mensageiro muito importante que controla uma ampla variedade de processos celulares, em particular a modulação de vias metabólicas, síntese de hormônios e contração muscular (Carafoli, 1987). Em particular para contração muscular, as fontes de Ca2+ podem ser de origem intracelular, extracelular ou ambas. Dessa forma, os íons Ca2+ são encontrados em quatro diferentes estoques: extracelular, citoplasmático, mitocondrial e não mitocondrial (retículo sarcoplasmático). O retículo sarcoplasmático (RS) é considerado o principal estoque intracelular de Ca2+. Porém, além do retículo, a mitocôndria também participa no tamponamento destes íons (Thomas et al., 1996).
O processo de contração do MLV se dá por uma cascata de eventos intracelulares. Os músculos lisos podem apresentar um padrão bifásico ou monofásico de contração, dependendo do estímulo recebido. No padrão bifásico, inicialmente observa-se um rápido e transitório aumento no tônus contrátil seguido pelo desenvolvimento lento e mantido da contração. Este
padrão de resposta geralmente acontece com a ativação de receptores, como por exemplo, pela fenilefrina ou serotonina. No padrão monofásico, a resposta contrátil desenvolve-se gradualmente até atingir o platô e este tipo de resposta é observada, por exemplo, com a despolarização de membrana com altas concentrações de KCl. Ambos os tipos de contração envolve aumento nos níveis citoplasmáticos de Ca2+ que ativam uma proteína citoplasmática chamada miosina quinase de cadeia leve. A ativação desta enzima promove a fosforilação da cadeia leve da miosina, que quando fosforilada, interage com os filamentos de actina causando a contração do MLV. Uma segunda enzima, a miosina fosfatase da cadeia leve, ativa em baixas concentrações de Ca2+, desfosforila a cadeia leve da miosina, retornando ao seu estado inativo, fazendo o MLV relaxar (Adelstein et al., 1982; Somlyo & Somlyo, 1986).
O MLV está constantemente em interação com vários hormônios e peptídeos que possuem receptores específicos na superfície da membrana plasmática, como vasopressina, adrenalina, angiotensina II, bradicinina e histamina (Murphy & Mras, 1983). Estes hormônios e peptídeos também podem alterar o tônus vascular indiretamente, por agirem em terminações nervosas e no endotélio vascular (Regoli et al., 1990).
O endotélio tem função essencial na regulação do tônus e das respostas contráteis do MLV pela liberação de fatores relaxantes e contráteis em condições basais e em resposta a estímulos agonistas ou alterações no fluxo sanguíneo (Furchgott, 1984; Bullock et al., 1986; Rees et al., 1989). O relaxamento dependente do endotélio vascular é resultado da liberação de substâncias vasodilatadoras que incluem o óxido nítrico (NO), fator
hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) e prostaciclinas (Furchgott & Zawadzki, 1980; Palmer et al., 1987; Félétou & Vanhoutte, 1988).
A participação do endotélio vascular também é observada na resposta relaxante induzida por agonistas vasodilatadores como a isoprenalina. Este agonista, interagindo com receptores β-adrenérgicos no MLV, ativa a adenilato-ciclase e aumenta os níveis de AMPc, induzindo relaxamento independente do endotélio (Kukovetz et al., 1981). Entretanto, receptores β-adrenérgicos também estão presentes em células endoteliais (Stephenson & Summers, 1987; Molenaar et al., 1988). A inibição da síntese de NO ou a remoção do endotélio diminuem o relaxamento induzido pelos agonistas de β-adrenoreceptores em aortas de ratos (White et al., 1986; Gray & Marshall, 1992). Além disto, esta resposta é inibida por oxihemoglobina, um seqüestrador de NO, ODQ, inibidor da guanilato ciclase e por inibidores da NO sintase. Neste sentido, a ativação de β-adrenereceptores nas células endoteliais com isoprenalina, induz formação de AMPc promovendo síntese de NO, e consequentemente relaxamento do MLV via GMPc (Grece et al., 1988; Iranami et al., 1996; Toyoshima et al., 1998; Ferro et al., 1999).
A partir da década de 80, quando Furchgott & Zawadzki (1980) descreveram o relaxamento dependente do endotélio, a participação do endotélio vascular passou a ser verificada em estudos da reatividade vascular a agentes vasocontrictores. A remoção do endotélio vascular promove aumento da sensibilidade vascular a agonistas α-adrenérgicos (Martin et al., 1986; Kaneko & Sunano, 1993). Portanto, a liberação de fatores endoteliais relaxantes e contráteis, modula o efeito de agentes vasoconstrictores.
Atualmente se sabe que o endotélio vascular tem função essencial na regulação do tônus do MLV. Dentre os fatores relaxantes derivados do endotélio destaca-se o NO (Ignarro et al., 1987; Palmer et al.,1987) e sua liberação das células endoteliais é observada em condições basais, como também após a estimulação com várias substâncias (acetilcolina, hormônios como catecolaminas e vasopressina, autacóides como bradicinina e histamina e mediadores derivados das plaquetas como serotonina e adenosina, via ativação mediada por receptores ligados à proteína G) (Boulanger & Vanhoutte, 1997).
Uma vez sintetizado pelas células endoteliais, o NO migra facilmente para células do MLV subjacente promovendo relaxamento. O NO é considerado o ativador endógeno da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) e ativando-a, promove aumento da síntese e conseqüente acúmulo de guanosina monofostado cíclico (GMPc), formado a partir da degradação de guanosina trifosfato (GTP). O GMPc promove relaxamento por ativar uma cascata de eventos intracelulares, que envolvem a ativação de proteína quinase dependente do GMPc, a PKG, a qual atuará levando à redução da concentração citoplasmática de íons Ca2+ (MacDaniel et al., 1992),
desfosforilação da cadeia leve de miosina (Murad, 1986) e interação com o aparato contrátil, desativando o complexo Ca2+-calmodulina (Karaki et al., 1988), além da ativação dos canais para K+, levando à hiperpolarização e inibição de canais para Ca2+ dependentes de voltagem (Miyoshi et al., 1994).
Junções do tipo Gap são expressos em quase todos os tecidos de mamíferos. Nos vasos, estas junções facilitam a comunicação química e elétrica entre o endotélio e o músculo liso, e entre as células adjacentes do
MLV, ligando diretamente a região citoplasmática de duas células vizinhas. Metabólitos, íons, segundos mensageiros (incluindo IP3, AMPc, GMPc, etc.),
Ca2+ entre outras moléculas ≤ 1kDa são capazes de passar através das
junções gap de uma célula para outra (Kumar & Gilula, 1996), dessa forma, habilitando a produção coordenada de múltiplas respostas celulares. A coordenação da resposta entre todas as células do MLV é fundamental para a modulação do tônus vascular. Vários estudos indicam que nem a inervação perivascular, nem a propagação do potencial de ação são suficientes para garantir a ativação uniforme da camada muscular em muitos tipos de vasos sanguíneos (Hirst & Edwards, 1989; Christ et al., 1993). Estudos demonstraram que é improvável que a difusão de substâncias como neurotransmissores e outras moléculas vasoativas ocorra através da camada média dos vasos de forma suficiente para ativar todas as células (Burnstock et al., 1970). Nessa direção, recentes estudos destacam a importância das junções do tipo Gap na modulação da resposta contrátil e relaxante, tornando possível que um maior número de células sejam recrutadas uniformemente para participar da contração e do relaxamento (Christ et al., 1993; Hill et al., 2002)
A atividade contrátil espontânea foi demonstrada em vasos de ratos com hipertensão experimental (Holloway & Bohr, 1973). Lamb e colaboredores (1985), demonstraram a presença de oscilações na fase tônica da contração estimulada pela noradrenalina em vasos isolados de ratos hipertensos. Poucos estudos foram realizados em vasos isolados de ratos submetidos à DSA para verificar a presença de atividade oscilatória espontânea ou outras alterações que pudessem explicar a LPA observada nesses animais.
Contrações oscilatórias em vasos sanguíneos sob condições fisiológicas ou patológicas têm sido descritas em inúmeros tipos de MLV e não vascular como traquéia de cobaia (Yagi et al., 2002), veia porta de rato (Burt, 2005), bexiga de rato (Imai et al., 2001), ducto torácico de porco (Moffatt et al., 2004), brônquios (Perez & Sanderson, 2005), artéria subcutânea de cão (Johanson & Bohr, 1966), artéria mesentérica bovina (Roddie & Scott, 1969), entre outros. Segundo Hayashida e colaboradores (1986), estas contrações oscilatórias ocorrem devido à sincronia entre a atividade elétrica e mecânica na parede celular de muitas células d o MLV. Porém, em grandes artérias as contrações oscilatórias ocorrem ocasionalmente ou são induzidas por aplicações de algum estímulo químico como altas concenrações de ínos potássio, catecolaminas, baixa concentração de magnésio, serotonina, bloqueadores de canais iônicos, etc. (Biamino & Kruckenberg, 1969; Altura & Altura, 1974; Yagi et al., 2003).
Os efeitos das contrações oscilatórias presentes em leitos vasculares e não vasculares são correntemente controversas e por isto, sua significância fisiológica ainda não está corretamente definida. Na tentativa de explicar estes mecanismos, muitos estudos têm descrito um crítico papel dos canais para cálcio dependentes de voltagem (Hayashida et al., 1986; Omote & Mizusawa, 1996) e também mostram que as oscilações no tônus vascular são precedidas por oscilações no potencial de membrana (Hashitani et al., 1996; Gokina et al., 1996; Oishi et al., 2002). Porém, estudos recentes têm mostrado que oscilações na concentração intracelular de cálcio envolvendo principalmente o RS também precedem as contrações oscilatórias (Mauban et al., 2001; Haddock & Hill, 2002; Takenaka et al., 2003; Burt, 2003).
Estas flutuações na tensão vascular podem estar relacionadas às oscilações na concentração citoplasmática de Ca2+ ([Ca2+]c), descritas por
Berridge (1990). De acordo com este autor, as flutuações na [Ca2+]
c poderiam
ser causadas tanto pelo influxo de Ca2+ extracelular quanto pela liberação de Ca2+ de estoques intracelulares. Nelson et al. (1995), demonstraram que drogas que depletam o Ca2+ do RS, como a tapsigargina, abolem as flutuações da [Ca2+]c.
Em células musculares de mamíferos, o influxo transarcolemal de cálcio, através da troca Na+/Ca2+ e de canais voltagem-dependentes do tipo L (Bers, 2002), dispara a liberação de uma quantidade ainda maior deste íon do RS, através de canais para cálcio denominados canais de rianodina, mecanismo denominado liberação de cálcio cálcio-induzida. Estudos sobre oscilações na concentração intracelular de cálcio também destacam a função dos canais de rianodina do RS na manutenção das oscilações (Kiyoshi et al., 2003; MacMillan et al., 2005).
O endotélio pode modular respostas nas células do MLV subjacente para uma variedade de estímulos (Toda, 1980; Furchgott, 1983; Blanco-Rivero et al., 2005). Neste sentido, tem sido demonstrado que contrações oscilatórias em artérias de algumas espécies são dependentes do endotélio, assim como aortas de hamsters (Jackson, 1988) e artéria auricular de coelhos (Omote & Mizusawa, 1993). Além disso, contrações oscilatórias são mediadas por contínua liberação de NO do endotélio e elevação de GMPc no MLV dessas espécies (Jackson et al., 1991). Por outro lado, o endotélio exerce efeito inibitório sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos SHR (Sunano et al., 1994). Em artéria basilar canina, a remoção do endotélio reduz, mas não
abole completamente as oscilações (Katusic et al., 1988). Portanto, a influência do endotélio sobre as contrações oscilatórias pode variar dependendo do leito e do animal estudado.
Canais para K+ presentes na membrana do MLV regulam o potencial de membrana. Neste sentido, ativação de canais para K+ leva ao efluxo de K+ e hiperpolarização da membrana do MLV promovendo a inativação dos canais para Ca2+ sensíveis à voltagem e consequentemente vasodilatação. No sistema vascular, diferentes substâncias endógenas interferem com a função dos canais para K+, entre elas os fatores endoteliais e segundos mensageiros intracelulares como GMPc e AMPc. A inibição dos canais para K+ determina despolarização de membrana promovendo vasoconstricção e favorecendo a despolarização induzida por agentes contráteis (Nelson & Quayle, 1995).
Vários tipos de canais para K+ têm sido identificados na membrana do
MLV. Estes canais têm um papel crucial na manutenção dos potenciais elétricos através da superfície da membrana do músculo liso (Nelson & Quayle, 1995; Standen & Quayle, 1998). O potencial de membrana da célula é um importante regulador da força de contração, controlando a entrada de íons Ca2+ e também, em certas ocasiões, a liberação de Ca2+ intracelular (Standen &
Quayle, 1998). Por esta razão, os canais para K+ no músculo liso estão ligados à regulação do tônus contrátil, e fatores que regulam a atividade dos canais para K+ podem ter efeitos importantes sobre o tônus e também sobre o diâmetro dos vasos e dessa forma, sobre a resistência vascular, fluxo sangüíneo e pressão arterial.
Na tentativa de explorar os mecanismos envolvidos na manutenção das contrações oscilatórias em preparações isoladas de músculo liso, numerosos
estudos têm mostrado a importância dos diferentes tipos de canais para K+. Porém, muitas informações são conflitantes a respeito da participação destes canais sobre as contrações oscilatórias. Por exemplo, canais para K+ ativados
por Ca2+ (Kca) têm importante papel na manutenção das oscilações e seu
bloqueio inibe as contrações oscilatórias em artéria basilar de rato (Omote & Mizusawa, 1996), artéria mesentérica de rato (Okazaki et al., 2003) e artéria auricular de coelhos (Omote & Mizusawa, 1993). Porém, o bloqueio de Kca não
tem efeito sobre as oscilações em artéria caudal de ratos hipertensos (Lamb & Webb, 1989) e aumenta as oscilações em bexiga isolada de cobaia (Imai et al., 2001). Dessa forma, a participação dos diferentes tipos de canais para K+ pode variar, dependendo do leito e do animal estudado.
Recentemente, trabalhos vêm mostrando a função das junções intercelulares do tipo Gap sobre as contrações oscilatórias (Griffith et al., 2004). Muitos autores relacionam o fenômeno de contrações oscilatórias com a participação das junções intercelulares do tipo gap. De fato, o bloqueio das junções gap abole as oscilações em músculos lisos vasculares e não vasculares (Watts et al., 1994; Tsai et al., 1995; Watts & Webb, 1996; Palani & Manchanda, 2006).
Considerando esta série de aspectos comuns entre o controle das funções cardiovasculares, nossa hipótese é que a labilidade da pressão arterial causada pela DSA em ratos poderia gerar atividade oscilatória nos vasos isolados desses anmais. Esta atividade oscilatória poderia estar relacionada com flutuações na concentração citosólica de Ca2+ nas células do MLV. Ainda,
a DSA poderia acarretar algumas variações nas respostas vasculares frente a estímulos de contração e relaxamento em artérias aortas isoladas.
2. OBJETIVOS
O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de investigar a influência da DSA sobre o efeito de agentes contráteis e relaxantes na aorta isolada de ratos DSA e sham-operados. Além disto, investigamos os mecanismos envolvidos na gênese/manutenção das contrações oscilatórias ocorridas em aortas de ratos DSA.
Os seguintes parâmetros foram analisados:
1 – Ocorrência de alterações na reatividade vascular em aortas de ratos submetidos à DSA;
2 – Influência do endotélio sobre as contrações oscilatórias em aortas isoladas de ratos DSA;
3 – Contribuição de diferentes tipos de canais para K+ sobre as oscilações contráteis em aortas isoladas de ratos DSA;
4 – Participação do Ca2+ intra e extracelular sobre as contrações oscilatórias em aortas isoladas de ratos DSA;
5 – O papel das junções intercelulares do tipo GAP sobre a reatividade vascular e sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Animais experimentais e desnervação Sino-Aórtica
Neste trabalho foram utilizados ratos Wistar machos, com peso variando entre 180 e 210g. A cirurgia foi realizada sob anestesia com ketamina (50mg/Kg/i.p) e xilazina (5mg/Kg/i.p.). De acordo com a técnica descrita por Krieger (1964), foram seccionadas bilateralmente, as aferências dos barorreceptores aórticos e carotídeos (DSA). Os animais foram acomodados em posição supina e submetidos a uma incisão de 3 cm na linha média do pescoço. Após cuidadosa dissecação do local, os nervos e a musculatura vizinha foram expostos e a desnervação dos barorreceptores aórticos foi realizada pela secção do nervo laríngeo superior no ponto mais próximo do nervo vago e ressecção do tronco simpático, caudal ao gânglio cervical superior, também foi removido. Após este procedimento, os seios carotídeos foram desnervados pela remoção dos nervos da região da bifurcação da artéria carotídea comum. Em ratos Sham-operados (SO) foi feita a desnervação fictícia.
A pressão arterial foi aferida por método direto, canulando-se a veia e a artéria femoral com cânula de polietileno conectada a transdutor de pressão. A freqüência cardíaca foi obtida pelas próprias cânulas através dos registros de pressão arterial pulsátil. A eficácia da DSA foi avaliada com intervenção de injeção intravenosa de fenilefrina (3-4 µg/Kg), sendo considerados como modelos de DSA os animais que responderam com bradicardia não inferior a 20 bpm frente a aumento mínimo da pressão arterial
de 40 mmHg, provocadoi pela injação de fenilefrina. Também foi analisada a pressão arterial média dos animais e a ocorrência de LPA.
3.2 – Medida da pressão arterial média e labilidade da pressão arterial
Registros da pressão arterial foram realizados por um período mínimo de 30 min. A pressão arterial e a freqüência cardíaca foram digitalizados para um computador onde os dados foram medidos e analisados.
A determinação da labilidade da pressão arterial foi realizada através do cálculo do desvio padrão da pressão arterial continuamente medido por certo período de tempo (Blanc et al., 1999; Miao et al., 2001; Eto et al., 2003). A labilidade da pressão arterial foi expressa como desvio padrão da média dos valores de pressão arterial.
3.3 - Montagem de preparações de aortas isoladas
Decorridos 3 dias após a cirurgia, animais DSA e SO tiveram as aortas isoladas, dissecadas de tecidos conjuntivos e gordurosos logo após o sacrifício por decapitação. Anéis de 3 mm de comprimento foram preparados e montados entre ganchos de metal inseridos no lúmem dos vasos e acoplados a transdutores de registro de tensão isométrica. As artérias foram preparadas com ou sem endotélio vascular, sendo este removido por ação mecânica. O sistema foi montado em câmara própria para órgão isolado contendo solução de Krebs, com a seguinte composição (em mM): NaCl 118,0; KCl 4,7; KH2PO4
com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2) em temperatura constante de
37ºC.
Após decorridos 60 minutos de repouso e sob tensão basal de 1,0 g, as preparações foram submetidas aos protocolos experimentais descritos a seguir.
Em todos os protocolos, a verificação da integridade ou remoção do endotélio foi realizada com adição de acetilcolina (1 µM) em preparações pré-contraídas com fenilefrina (0,1 µM). Foram consideradas com endotélio íntegro as preparações isoladas de ratos DSA e SO, que apresentaram relaxamento ≥ 80%.
3.4 - Análise Estatística.
Os resultados das medidas de pressão arterial média (PAM) e labilidade de pressão arterial (LPA) foram analisados estatisticamente por teste t de Student.
Os resultados de tensão isométrica foram expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de experimentos em preparações de aorta obtidas de diferentes animais. Os gráficos foram realizados através do programa GraphPad Prism (GraphPad Software Corporation, versão 2.0, 1997).
As determinações da EC50, concentração que produz 50% da
resposta máxima, que foi expressa em valores de pD2 (-log EC50) e efeito
dos mínimos quadrados utilizando-se o programa GraphPad Prism (graphPad software, versão 2.00, 1997). A análise estatística utilizada para comparação entre os valores de pD2 ou efeito máximo foi a análise de variância (ANOVA)
one-way, seguido do pós-teste de Newman Keuls, pelo programa GraphPad Prism (graphPad software, versão 2.00,1997) e Teste t de Student, pelo programa GraphPad Prism (GraphPad Software Corporation, versão 2.0,1997).
4. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
4.1 - Curvas concentração-efeito cumulativas em anéis de aortas de ratos DSA e SO para agentes contráteis:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina (EC50) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. A seguir, foram
realizadas curvas concentração-efeito cumulativas em preparações com (E+) ou sem (E-) endotélio para fenilefrina (0,1 nM a 10 µM), serotonina (10 nM a
100 µM) ou KCl (4,7 a 120 mM) e em preparações E- para tetraetilamônio (10 µM a 100 mM) ou cloreto de bário (10 µM a 100 mM). Em outras séries de experimentos, foram realizadas curvas concentração-efeito cumulativas para preparações E- para fenilefrina (0,1 nM a 10 µM) após pré-incubação (30 min) das preparações com inibidor da NO sintase, L-NAME (100 µM), inibidor da ciclo-oxigenase, indometacina (10 µM) ou bloqueador das junções do tipo Gap, ácido 18β-glicirretínico (18β-GA, 100 µM).
4.2 - Curvas concentração-efeito cumulativas em anéis de aortas de ratos DSA e SO para agentes relaxantes:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina (EC50) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. Sobre a
pré-contração com fenilefrina (EC50) foram realizadas curvas concentração-efeito
cumulativas em preparações E- para pinacidil (10 nM a 1 µM), nitroprussiato de
Também foram realizadas curvas concentração-efeito cumulativas para acetilcolina (0,1 nM a 10 µM) após pré-incubação por 15 min com heptanol (1 mM) ou 30 min com 18β-GA (75 µM).
Em outras séries de experimentos, após 30 min de incubação com prazosim (1 µM), as preparações foram contraídas com PGF2α (EC50) e foram
realizadas curvas concentração-efeito cumulativas em preparações E+ ou E -para isoprenalina (0,1 nM a 10µM) ou forscolina (10 nM a 10 µM).
4.3 – Estudo da resposta contrátil estimulada com fenilefrina frente a concentrações crescentes de cálcio extracelular:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina (EC50) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. As
preparações foram estimuladas com fenilefrina (EC50), em solução de Krebs
zero-Ca2+ contendo EGTA 1mM até o desaparecimento da resposta, ou seja, a depleção dos estoques intracelulares de Ca2+ sensíveis à fenilefrina. A seguir, as aortas foram mantidas em solução de Krebs zero-Ca2+ sem EGTA e foram realizadas curvas concentração-efeito cumulativas para Ca2+ (0 a 3 mM) sob estimulo com fenilefrina (10 µM), em aortas E+ e E- isoladas de ratos DSA e
SO.
4.4 – Influência do endotélio vascular sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina (EC50) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. As contrações
endotélio vascular íntegro, o efeito de drogas que interferem com a cascata do relaxamento via NO: a) L-NAME (100 µM); b) L-Arginina (1 mM); c) ODQ (1 µM) e d) oxihemoglobina (10 µM), além do inibidor da ciclo-oxigenase indometacina (10 µM) foram incubados por 30 min antes da indução das contrações oscilatórias com fenilefrina. Os parâmetros como frequência de contração (ciclos/tempo), amplitude (g) e tensão basal (g) foram avaliados.
4.5 – Efeitos dos moduladores de canais para K+ sobre as contrações
oscilatórias em aortas de ratos DSA:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina (EC50) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. As
contrações oscilatórias em preparações E- foram induzidas com fenilefrina e os moduladores dos canais para K+ foram adicionados ao banho: a)
tetraetilamônio (5 mM); b) 4-aminopiridina (100 µM); c) cloreto de bário (30 µM); d) pinacidil (0,2 µM); e) glibenclamida (1 µM); f) apamina (1 µM); g) iberiotoxina (0,1 µM). Os parâmetros como frequencia de contração (ciclos/tempo), amplitude (g) e tensão basal (g) foram avaliados antes (controle) e após a adição dos compostos sobre as contrações oscilatórias.
4.6 – Participação do Ca2+ intra e extracelular e junções gap sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina (EC50) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. As contrações
oscilatórias foram induzidas com fenilefrina em aortas E- e drogas que interferem com a disponibilidade de Ca2+ intra e extracelular foram testadas: a)
antagonista de receptores de IP3 do RS (2-APB, 20 e 50 µM); b) antagonista de
receptores de riandina do RS (rianodina, 1 a 5 µM); c) inibidor da Ca2+ATPase do RS (tapsigargina, 1 µM); d) ativador dos canais de Ca2+ do tipo “L” (Bay K
8644, 10 a 100 nM); f) bloqueador dos canais de Ca2+ do tipo “L” (verapamil, 0,2 µM e 1 µM); g) inibidor do trocador Na+/Ca2+ (DMB, 5 µM) ou h) bloqueador dos canais de cloreto ativados por Ca2+ (NPPB, 50 µM). Também foram testados os bloqueadores das junções do tipo GAP heptanol (5 µM a 0,3 mM) ou 18β-GA (50 µM). Em alguns protocolos, estas substâncias foram adicionadas na cuba para orgãoes isolados quando as oscilações induzidas por fenilefrina já estavam estáveis. Outras vezes, estas substâncias foram incubadas no banho antes das oscilações serem estimuladas com fenilefrina.
4.7 - Quantificação da expressão gênica de conexina 43 por PCR Real-Time
A extração do RNA total foi realizada pelo método do TRIzol, seguindo as instruções do fabricante. Segmentos de artéria aorta (10-15 mm) foram isolados de ratos DSA e SO e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. A seguir, estes tecidos foram homogenizados em 1 ml de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e o RNA total foi extraído conforme instruções do fabricante (Kihara et al., 2006). Resumidamente, após 2 etapas de extração com clorofórmio, o RNA foi precipitado com isopropanol e os “pellets” de RNA lavados 2 vezes com solução de etanol 70%. Após secagem, os “pellets” de RNA foram resuspensos em água tratada com DEPC e a concentração de cada amostra foi medida. DNA residual foi removido usando DNase I
(Amersham, Piscataway, NJ, USA). Para cada 20 µl de reação de transcriptase reversa, 4 µg de RNA total foram misturadas com 1 µl de oligodT primer (0.5 µg; Invitrogen) e incubados por 10 min a 65ºC. A seguir, efetuou-se o protocolo padrão de transcrição reversa, utilizando a enzima SuperScript III: após resfriamento em gelo, a solução foi misturada com 4 µl do primeiro tampão, 2 µl de 0.1 M DTT, 1 µl de dATP, dTTP, dCTP and dGTP (10 mM cada), e 1 µl SuperScript III transcriptase reversa (200 U; Invitrogen) e incubados por 60 min a 50ºC. A reação foi inativada por aquecimento por 15 min a 70ºC. Para os estudos de quantificação de expressão gênica realizamos experimentos utilizando o PCR Real-Time (Applied Biosystems- GeneAmp 5700). Neste sistema, a amplificação da seqüência alvo é detectada em tempo real pela emissão de fluoróforo, que ocorre quando há formação de dupla fita na região codificada pelo par de primers: Cx43 (forward: 5’-TTCCTCGTGCCGCAATTAC-3’, reverse: 5’-CGATTTTGCTCTGCGCTGTA-3’) e GAPDH (forward: GATGCTGGTGCTGAGTATGTCG-3', reverse: 5'-GTGGTGCAGGATGCATTGCTGA-3').
O PCR Real-Time foi realizado por meio do sistema SYBR Green, onde o fluoróforo se encontra no tampão do PCR: em cada fase de anelamento, o fluoróforo se intercala na dupla fita, liberando a fluorescência que é proporcional ao número de cópias. Neste sistema, a validação do resultado passa por um processo chamado de curva de dissociação: o produto do PCR é aquecido de 60 até 900C, o que leva à separação da dupla fita, com conseqüente diminuição da fluorescência. Com a curva de dissociação, é possível determinar a especificidade da amplificação.
4.8 - Expressão protéica (western-blot) para conexina 43
As artérias aortas de ratos DSA e SO foram isoladas, homogeneizadas e a concentração de proteína total foi quantificada pelo método descrito por Bradford (1976). Os homogenatos de artérias foram eletroforeticamente separados por SDS-PAGE gel a 10% (Bio-Rad; Hercules, CA) e então transferidos, durante 12 h a 4°C, para membranas de PVDF (Amersham Biosciences) em solução contendo 25 mM Tris, 190 mM glicina, 20% metanol e 0,05% SDS. As membranas foram bloqueadas por 60 min em temperatura ambiente em solução Tris tamponada (10 mM Tris, 100 mM NaCl e 0,1 tween 20) com leite me pó desnatado (5%). Então, as membranas foram incubadas por 4 horas com o anticorpo primário para detecção de conexina 43 (diluição 1:1500). Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário anti-coelho (diluição 1:1000) conjugado a peroxidase de rábano (Bio-Rad; Hercules, CA, USA). Os imunocomplexos foram detectados por um sistema de detecção de quimioluminescência para peroxidase (ECL Plus, Amersham International; Little Chalfont, UK) seguida de autoradiografia (Hyperfilm ECL, Amersham International). Os “blots” de proteínas foram quantificados pelo programa Scion Image. As mesmas membranas foram usadas para determinar a expressão protéica de α-actina usando anticorpo monoclonal anti-α-actina (diluição 1:1500). A expressão da proteína α-actina foi usada para normalização da expressão protéica de conexina 43 em cada amostra.
5 - RESULTADOS
Os resultados deste trabalho estão apresentados em duas partes distintas para facilitar o entendimento e a compreensão dos dados. Na primeira parte, estão apresentados os resultados de reatividade vascular a agentes contráteis e relaxantes e os dados obtidos nos ensaios de biologia molecular. Na segunda parte, estão apresentados os resultados sobre o estudo das contrações oscilatórias.
Parte I
Reatividade Vascular em aortas isoladas de ratos após a DSA
5.1 - Pressão arterial média, freqüência cardíaca e labilidade da pressão arterial
Os registros de pressão arterial média (PAM) de ratos após DSA (n=40) e SO (n= 32) estão representados na figura 1 e os valores da PAM, freqüência cardíaca e labilidade da pressão arterial podem ser vistos nas figuras 1a,b,c respectivamente. Não houve variação da PAM quando comparados os dois grupos de animais. Não houve diferença entre a média da pressão arterial e da freqüência cardíaca dos ratos DSA (112,9 ± 8,2 mmHg, 484 ± 21 bpm, respectivamente) e os ratos SO (103,6 ± 5,4 mmHg, 461 ± 17 bpm, respectivamente). Porém, animais DSA apresentaram maior labilidade na pressão arterial (DSA: 17,3 ± 2,8 mmHg; SO: 3,9 ± 1,4 mmHg) (Fig. 1c), caracterizada por picos de alterações na pressão arterial média, como pode ser visualizados na figura 1.
Figura 1. Registro representativo da pressão arterial média e da freqüência cardíaca em ratos DSA e SO. (a) Pressão arterial média (PAM), (b)
freqüência cardíaca (FC) e (c) variabilidade da pressão arterial (desvio padrão da pressão arterial média). Diferença estatística * P<0,01.
a) b) 50 60 70 80 90 100 110 120 SO DSA P res são a rt e ri a l méd ia (mmHg ) 0 5 10 15 20 25 SO DSA V a ri a b ili d ad e d a p ressã o art e ri al ( mmHg ) * 0 200 400 600 SO DSA Fr e q uê nc ia c a rdía c a ( bpm ) c)
5.2 – Reatividade vascular a agentes contráteis
5.2.1 – Reatividade vascular à fenilefrina
A fenilefrina induziu contração de forma concentração-dependente dos anéis de aorta de ratos DSA e SO. Os valores de força de contração (em gramas) estão representados graficamente nas figuras 2 e 3. As respostas contráteis mostraram ser diferentes quanto à presença ou ausência de endotélio nos dois grupos de animais estudados, sendo o efeito máximo da fenilefrina (Emax) sempre menor em preparações com endotélio (E+). Não houve
diferença significante entre os grupos DSA e SO no que se refere à potência contrátil da fenilefrina (pD2), tanto em preparações E+ (pD2 DSA: 7,41 ± 0,12,
n=6; SO: 7,50 ± 0,10, n=7) como em preparações E- (pD
2 DSA: 7,80 ± 0,09,
n=9; SO: 7,76 ± 0,08 n=13). Porém, a fenilefrina mostrou ter maior eficácia (Emax) em aortas de animais DSA do que em aortas de animais SO, tanto em
preparações E- (Emax DSA: 1,89 ± 0,12g, n=9; SO: 1,42 ± 0,06g, n=12) como
Figura 2. Efeito contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Curvas concentração-efeito cumulativas para fenilefrina (Fe) em aortas com (E+) e sem (E-) endotélio. Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis
expressas em g de tensão. -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 1 2 DSA E-DSA E+ SO E-SO E+ Fe Log [M] Ten são ( g )
Figura 3. Efeito contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no efeito máximo (Emax) nas curvas concentração-efeito cumulativas da fenilefrina em
preparações E+ e E-; B) representa os valores depotência (pD
2). Diferença estatística * P<0,05; ** P<0,01. DSA E- DSA E+ SO E- SO E+ 0 1 2
*
*
**
*
A Ema x (T en sã o, g ) DSA E- DSA E+ SO E- SO E+ 0 4 5 6 7 8 9 10 B pD 2 Fe ( -l og E C50 )5.2.2 – Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil à fenilefrina
Os valores de força de contração para aortas E- isoladas de ratos DSA e
SO na presença (30 min) ou na ausência de L-NAME (100 µM) estão representados graficamente nas figuras 4 e 5. As respostas contráteis mostraram ser indiferentes quanto à presença ou ausência de L-NAME nos dois grupos de animais estudados, sendo o efeito máximo da fenilefrina (Emax)
inalterado pela presença do inibidor. Não houve diferença significante na potência contrátil da fenilefrina (pD2) entre os grupos DSA e SO tratados com
L-NAME (7,46 ± 0,09, n=5; e 7,43 ± 0,025, n=6, respectivamente) ou na ausência do inibidor (7,80 ± 0,09, n=9; e 7,76 ± 0,08, n=13, respectivamente). De modo semelhante às preparações não tratadas, a presença de L-NAME não alterou o Emax para fenilefrina nos dois grupos estudados. Em presença de
L-NAME, o efeito da fenilefrina foi maior em aortas de ratos DSA (1,87 ± 0,06g, n=5) do que e aortas de ratos SO (1,33 ± 0,10g, n=6).
Figura 4. Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Curvas concentração-efeito cumulativas para fenilefrina (Fe) em aortas sem endotélio, antes após prévia incubação (30 min) com L-NAME (100 µM). Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis expressas em g de tensão. -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 1 2 DSA SO DSA + L-NAME SO + L-NAME Fe Log [M] Ten são ( g )
Figura 5. Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no efeito máximo (Emax) nas curvas concentração-efeito
cumulativas da fenilefrina em aortas sem endotélio, antes e após incubação (30 min) com L-NAME (100 µM) B) representa os valores de potência (pD2). Diferença
estatística ** P<0,01. DSA SO DSA+L-NAMESO+L-NAME 0 4 5 6 7 8 9 10 B pD 2 F e ( -lo g E C50 )
DSA SO DSA+L-NAME SO+L-NAME
0 1 2
**
**
Ema x ( ten são , g ) A5.2.3 – Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil à fenilefrina
Os valores de força de contração estão representados graficamente nas figuras 6 e 7, para aortas E- isoladas de ratos DSA e SO na presença (30 min) ou na ausência de indometacina (10 µM). As respostas contráteis para ambos os grupos estudados mostraram ser indiferentes quanto à presença ou ausência de indometacina. Na presença desse inibidor, o grupo DSA apresentou maior eficácia (Emax) para fenilefrina (1,67 ± 0,12g, n=6) quando
comparado ao grupo SO (1,21 ± 0,15g, n=6). A incubação com indometacina alterou significantemente a potência contrátil da fenilefrina (pD2). Os valores de
pD2 foram alterados pela presença de indometacina tanto em preparações
isoladas de ratos DSA (na ausência: 7,80 ± 0,09, n=9; e na presença do inibidor: 7,45 ± 0,05, n=6) quanto SO (na ausência: 7,76 ± 0,08, n=13; e na presença do inibidor 7,41 ± 0,03, n=6). Não houve diferença no valor de pD2
entre os grupos DSA e SO tratados com indometacina.
Figura 6. Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Curvas concentração-efeito cumulativas para fenilefrina (Fe) em aortas sem endotélio, antes e após incubação (30 min) com indometacina (10 µM). Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis expressas em g de tensão.
-10 -9 -8 -7 -6 -5 0 1 2 DSA SO DSA + Indo SO + Indo Fe Log [M] Tensão ( g )
Figura 7. Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no efeito máximo (Emax) nas curvas concentração-efeito
cumulativas da fenilefrina em aortas sem endotélio, antes e após prévia incubação (30 min) com indometacina (Indo, 10 µM). Diferença estatística * P<0,05; ** P<0,01. B) representa os valores depotência (pD2). Diferença estatística * P<0,05 em relação aos
controles (sem indometacina).
DSA SO DSA + Indo SO + Indo
0 1 2
**
*
Ema x ( T en sã o, g) ADSA SO DSA + Indo SO + Indo
0 4 5 6 7 8 9 10
*
*
B pD 2 Fe ( -l o g E C50 )5.2.4 – Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil à fenilefrina
Os valores de força de contração estão representados graficamente nas figuras 8 e 9, para aortas E- isoladas de ratos DSA e SO na presença (30 min) ou na ausência de 18β-GA (100 µM). As respostas contráteis foram semelhantes na presença ou na ausência de 18β-GA no grupo de animais SO. Os valores de pD2 e efeito máximo (Emax) da fenilefrina não foram alterado pela
presença do bloqueador. Porém, a presença de 18β-GA alterou significantemente o efeito máximo (Emax) da fenilefrina no grupo de animais
DSA (na ausência: 1,89 ± 0,12g, n=9, e na presença do bloqueador: 1,47 ± 0,10g, n=13). Os valores de pD2 não foram alterados pela presença de 18β-GA
tanto em preparações de ratos DSA (7,80 ± 0,09, n=9, vs. 7,66 ± 0,09, n=16) como SO (7,76 ± 0,08, n=13, vs. 8,04 ± 0,12, n=8). Não houve diferença nos valores de pD2 entre os grupos DSA e SO tratados com 18β-GA.
Figura 8. Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Curvas concentração-efeito cumulativas para fenilefrina (Fe) em aortas sem endotélio, antes e após incubação (30 min) com 18β-GA (100 µM). Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis expressas em g de tensão. -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 1 2 DSA DSA + 18β-GA SO SO + 18β-GA Fe Log [M] Tens ão ( g )
Figura 9. Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no efeito máximo (Emax) nas curvas concentração-efeito
cumulativas da fenilefrina em aortas sem endotélio, antes e após incubação (30 min) com 18β-GA (100 µM). B) representa os valores de potência (pD2). Diferença
estatística ** P<0,01.
DSA SO DSA+18β-GA SO+18β-GA
0 1 2 E m ax ( T en são , g )
**
ADSA SO DSA+18β-GA SO+18β-GA
0 4 5 6 7 8 9 10 B pD 2 F e (-l o g E C50 )
5.2.5 – Resposta contrátil à serotonina
A serotonina induziu contração de forma concentração-dependente nos anéis de aorta de ratos DSA e SO. Os valores de força de contração (em gramas) estão representados graficamente nas figuras 10 e 11. As respostas contráteis mostraram ser diferentes quanto à presença ou ausência do endotélio, somente em aortas de ratos DSA, havendo diferença tanto no efeito máximo (Emax: E+: 1,39 ± 0,10g, n=8 vs. E-: 1,82 ± 0,11g, n=10) quanto nos
valores de pD2 (E+: 5,05 ± 0,09, n=8 vs. E-: 5,86 ± 0,13, n=10). No grupo SO,
houve apenas diferença estatística nos valores de pD2 (E+: 4,76 ± 0,14, n=6 vs.
E-: 5,33 ± 0,16, n=7). Houve diferença significante entre o grupo DSA e SO no que se refere à potência contrátil da serotonina (pD2) somente nas preparações
E- (DSA: 5,86 ± 0,13, n=10 vs. SO: 5,33 ± 0,16, n=7). Em preparações E-, o
efeito máximo (Emax) foi maior em aortas de ratos DSA (1,82 ± 0,11g) em
comparação ao grupo SO E- (1,29 ± 0,08g).
Figura 10. Efeito contrátil da serotonina em aortas de ratos DSA e SO. Curvas concentração-efeito cumulativas para serotonina (Ser) em aortas com (E+) ou sem (E-) endotélio. Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis
expressas em g de tensão. -8 -7 -6 -5 -4 0 1 2 DSA E-DSA E+ SO E-SO E+ Ser Log [M] Tens ão ( g )
Figura 11. Efeito contrátil da serotonina em aortas de ratos DSA e SO. Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no efeito máximo (Emax) nas curvas concentração-efeito cumulativas da serotonina em
aortas com (E+) e sem (E-) endotélio. B) representa os valores de (pD2). Diferença
estatística * P<0,05; ** P<0,01. DSA E- DSA E+ SO E- SO E+ 0 3 4 5 6 7 8 * ** ** B pD 2 S e r ( -lo g EC 50 ) DSA E- DSA E+ SO E- SO E+ 0 1 2 * ** A Ema x (T en sã o, g)
5.2.6 – Aumento progressivo na concentração extracelular de cálcio
A resposta contrátil aos incrementos de CaCl2 na solução de Krebs em
aortas estimuladas com fenilefrina (1 µM) pode ser vista nas figuras 12 e 13. As respostas contráteis mostraram não haver diferença quanto à presença ou ausência de endotélio nos dois grupos de animais estudados. Não houve diferença significante entre os grupos DSA e SO no que se refere à potência do CaCl2 (pD2), tanto em preparações E+ (pD2 DSA: 0,69 ± 0,10, n=5; SO: 0,51 ±
0,04, n=6) como em preparações E- (pD2 DSA: 0,68 ± 0,10, n=7; SO: 0,56 ±
0,13, n=7). Porém, a contração foi maior (Emax) em aortas de animais DSA do
que em aortas de animais SO em preparações E- (Emax DSA: 1,71 ± 0,11g, n=6;
SO: 1,25 ± 0,08g, n=7). Não houve diferença entre os dois grupos em preparações E+ (E
max DSA: 1,39 ± 0,14g, n=5; SO: 1,23 ± 0,10g, n=6).
Figura 12. Efeito de incrementos na concentração de CaCl2 sobre a
resposta contrátil de aortas de ratos DSA e SO. A figura representa a resposta contrátil ao CaCl2 em aortas estimuladas com fenilefrina (1 µM) em preparações com
ou sem endotélio. Os pontos representam média ± EPM.
0 1 2 3 0 1 2 DSA E-DSA E+ SO E-SO E+ CaCl2 (mM) Te ns ão ( g )
Figura 13. Efeito de incrementos de CaCl2 sobre a resposta contrátil à
fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Barras representam a média ± EPM.
A) representa os valores obtidos no efeito máximo (Emax) da resposta contrátil ao CaCl2 em aortas pré-incubadas com fenilefrina (1 µM) em preparações com ou sem
endotélio; B) representa os valores de pD2. Diferença estatística * P<0,05;
DSA E- DSA E+ SO E- SO E+ 0.0 0.2 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 pD 2 (-lo g E C50 ) B DSA E- DSA E+ SO E- SO E+ 0 1 2 A * * Ema x (T en são , g )
5.2.7 – Resposta contrátil ao KCl
O KCl induziu contração de forma concentração-dependente dos anéis de aorta de ratos DSA e SO (figuras 14 e 15). As respostas contráteis mostraram-se semelhantes quanto à presença ou ausência do endotélio, tanto no grupo DSA (Emax: E+: 1,71 ± 0,14 n=5 vs. E-: 1,43 ± 0,22 n=6) quanto no
grupo SO (Emax: E+: 1,57 ± 0,11, n=6 vs. E-: 1,19 ± 0,10, n=7). Não houve
diferença na eficácia do KCl quando comparados os dois grupos DSA e SO, tanto em preparações E+ ou E-.
Em relação à potência do KCl, não houve diferença quando comparados os dois grupos DSA e SO, tanto em preparações E+ ou E-. Porém, a presença do endotélio reduziu a potência do KCl tanto no grupo DSA (pD2: E+: 1,64 ±
0,02, n=6 vs. E-: 1,89 ±0,09, n=5) quanto no grupo SO (pD
2: E+: 1,58 ± 0,02,
n=7 vs. E-: 1,77 ± 0,03, n=7).
Figura 14. Efeito contrátil do KCl em aortas de ratos DSA e SO. Curvas concentração-efeito cumulativas para KCl em aortas com (E+) e sem (E-) endotélio. Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis expressas em g de tensão. -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 0 1 2 DSA E+ DSA E-SO E+ SO E-KCL Log [M] Te n sã o ( g )
Figura 15. Efeito contrátil do KCl em aortas de ratos DSA e SO. Barras representam a média ± EPM. A) representa os valores obtidos no efeito máximo (Emax)
da resposta contrátil ao KCl em preparações com (E+) ou sem (E-) endotélio; B)
representa os valores de pD2. Diferença estatística * P<0,05; *P<0,01.
DSA E+ DSA E- SO E+ SO E-0 1 1.5 2.0 2.5