LEVANTAMENTO DE ZOOPLÂNCTON, FITOPLÂNCTON E
MICROORGANISMOS PRESENTES EM UM BIOSSISTEMA INTEGRADO DE CULTIVO DE PEIXES
Autores: Gustavo BACHMANN, Cecília de Souza VALENTE, Maria Risoleta Freire MARQUES, César Ademar HERMES, Isabel Cristina MÜLLER
Identificação autores: (Bolsista Interno de Graduação IFC-Campus Rio do Sul, Mestranda Universidade Federal de Santa Catarina, Professora Universidade Federal de Santa Catarina, Professor Campus Rio do Sul, Professora Orientadora IFC-Campus Rio do Sul)
Introdução
O I.F. Catarinense/Câmpus Rio do Sul está localizado na cidade polo do Modelo Alto Vale de Piscicultura Integrada (MAVIPI), desenvolvido e implantado na região do alto vale do Itajaí pela EPAGRI-SC (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina); este modelo de produção consiste na produção de peixes, em sistema que prioriza e estimula a produção primária como principal fonte alimentar dos peixes, com utilização de fertilizantes orgânicos (esterco de suínos), sem troca de água (somente manutenção de nível) e com utilização de policultivo (criação de várias espécies de peixes num mesmo viveiro, cada uma ocupando níveis tróficos diferentes no ecossistema do viveiro de criação).
A piscicultura em geral, possui um risco potencial de enfrentar problemas com enfermidades. Uma das estratégias para prevenir este tipo de problema, é o aprofundamento do conhecimento sobre o comportamento das enfermidades, as relações com o ambiente e com os próprios peixes, para propor estratégias de manejo, produtos e aplicações. Animais aquáticos tem uma relação muito próxima com o ambiente externo, quando comparados a animais terrestres. Patógenos em potencial podem se manter e proliferar no ambiente externo (água) (HANSEN; OLAFSEN, 1999; VERSCHUERE et al., 2000). O fitoplâncton apresenta papel essencial na quebra de matéria orgânica e ciclagem de nutrientes (NIU et al., 2011). O controle biológico tem se mostrado uma ferramenta útil com bom potencial na aquicultura de modo geral, envolvendo o uso de bactérias probióticas, capazes de estimular o crescimento e melhorar o estado de saúde dos animais. Os efeitos desta estratégia envolvem mecanismos de ação variados, como a estimulação da resposta imune, possíveis efeitos antivirais, melhora da função digestiva e da nutrição, via o fornecimento de nutrientes essenciais e melhora na
qualidade de água (SCHULZE et al., 2006; VERSCHUERE et al., 2000). O desenvolvimento de tecnologias alternativas para a produção de pescado, com
do Itajaí e possui aspectos relevantes para melhorar a competividade, lucratividade, produtividade, gestão ambiental da água e suporte tecnológico aos sistemas de produção.
O objetivo deste trabalho é avaliar a presença de fito ou zooplânctons, bem como a presença microrganismos probióticos ou patogênicos.
Material e Métodos
Questionários foram aplicados com os produtores participantes. Foram coletados exemplares de tilápia e amostras de água (com plânctons) periodicamente em cultivos nos município de Agrolândia e Lontras – SC. Das amostras de tilápia, realizou-se biometria, bem como a extração de brânquias, intestino e pele. Estas foram conservadas em álcool 70% e mantidas em temperatura ambiente. Já as amostras de água foram conservadas em diferentes soluções, sendo elas: Álcool 70 e 95%, solução fixadora de Lugol e in natura. As amostras em solução de Lugol acético, especificamente, foram utilizadas para observação em microscópio ótico. As demais foram utilizadas para técnicas de biologia molecular em diferentes conservantes para padronização. As amostras observadas em microscópio foram montadas entre lâmina e lamínula e observadas nos aumentos de 400X e 1000X.
DNA foi extraído de amostras de água e de tecido animal, utilizando-se o protocolo de Maciel (2002), no Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica (UFSC). As amostras foram maceradas em tampão de lise (TE 1x +SDS 1%) contendo Proteinase K. Após permanecer em banho seco a 65ºC por uma hora, adiciona-se solução iônica de NaCl 5M e detergente CTAB 10%. Repetindo-se o processo de banho seco (40 minutos à 65ºC) adiciona-se clorofórmio:isoamil(24:1). O microtubo então é centrifugado a 14000 rpm a 4ºC por 8 minutos. Separa-se o sobrenadante em novo microtubo e adiciona-se isopropanol 100%. Armazena-se os tubos Overnight à uma temperatura de -20ºC. Posterior à estes passos, uma nova centrifugação é realizada por 8 minutos a 8000 rpm a 4ºC. O sobrenadante é descartado por inversão e o precipitado é ressuspendido com 50 µl de água para biologia molecular. Estas amostras por sua vez, são então submetidas a eletroforese em gel de agarose 1%.
Foi realizada a amplificação do DNA da enzima RUBISCO por PCR no Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica (UFSC). Foram utilizados iniciadores descritos por Fraga (2011), como a seguir: Forward primer: 5’-TGC TTT ACG TTT AGA AGA TAT GCG TAT TCC-3’ e Reverse primer: 5” AGA AAC GTT CTC TCC
AAC GCA 3”. Além disso, foram utilizados iniciadores universais para a amplificação de RNA 16 S (característico de procariotos), segundo Muyzer et al (1993). As condições de ciclagem para o primer RUBISCO e 16S estão na tabela 1. Ao término da amplificação, as amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 2%.
Tabela 01 – Condições de ensaio utilizadas para amplificação por PCR
Primer PCR Programação Ciclagem
PCR RUBISCO 94ºC por 1’ e 30’’, seguido de 30 ciclos de 94ºC por 15’’, 47ºC por 30’’ e uma extensão final de 5’ a 72ºC.
PCR 16S
94ºC por 5’, seguido de 20 ciclos de 94ºC por 30’’, 65 até 55ºC por 30’’ (-0,5ºC/ciclo) e 72ºC por 30’’. Seguido de 5 ciclos de 94ºC por 30’’, 55ºC por 30’’,
72ºC por 30’’, 72ºC por 5’ e 4ºC para finalização.
Resultados e discussão
Na Figura 1, estão representadas amostras de fitoplânctons fixadas em solução de lugol acético observadas em microscópio óptico em aumento de 1000x. Embora não identificada nestas amostras, a micro alga Spirulina platensis tem demonstrado resultados positivos em crescimento (peso e comprimento) para Tilápia do Nilo, quando utilizada como alimento para pós-larva (MOREIRA et al., 2010). A comunidade fitoplanctônica tradicionalmente é identificada através de microscopia óptica, entretanto, métodos alternativos e complementares à microscopia permitem uma identificação completa de toda a comunidade (WOLLSCHLÄGER et al., 2015).
Figura 01 – Fitoplânctons fixados em solução de lugol acético observados em microscópio óptico. A – Clorófita, Gênero
Pediastrum; B – Clorófita, Gênero Scenedesmus; C – Cianobactéria Merismopedia e ao canto direito uma Clorófita do
gênero Scenedesmum; D – Não identificada. Fonte: Do Autor, 2015.
Na Figura 2, é possível observar os resultados das técnicas de biologia molecular. Para a identificação do fitoplâncton nas amostras de água utilizou-se o iniciador da enzima RUBISCO, pois é um iniciador universal para tecidos vegetais e algas (considerando que a RUBISCO só é encontrada nestes organismos). Este iniciador também foi utilizado nas amostras de peixe, pois poderia ser possível encontrar DNA de algas em regiões como brânquias e pele, no entanto, não houve amplificação nos tecidos animais, caracterizando a ausência de algas. Vale ressaltar a importância de usar o primer do RNA 16S, pois também tratar-se de um primer universal, no entanto para organismos procariotos. Posteriormente as amostras serão utilizadas para correr em DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e sequenciadas para a identificação dos microrganismos presentes no cultivo e associados aos animais.
Figura 02 – Técnicas de biologia molecular. A – Eletroforese em gel agarose 1% de extração; B – Eletroforese em gel agarose 2% PCR rubisco, onde A1 à A6, amostras de tecido animal e A7 à A10, amostras de água.
Conclusão
No presente trabalho, foi possível confirmar a presença do fitoplâncton, tanto por microscopia ótica como por biologia molecular. Utilizamos destes dois métodos de identificação, pois naturalmente, a microscopia permite uma identificação primária e superficial dos organismos ali presentes, ou seja, não é possível ter com exatidão a espécie encontrada. Já a identificação através de biologia molecular, permite que identifiquemos com exatidão as espécies presentes nas amostras. Posteriormente, serão desenhados iniciadores para o RNA 16S (iniciador universal para identificação de procariotos) e iniciadores
específicos para microorganismos probióticos previamente encontrados na literatura. Após a amplificação da região genômica correspondente ao RNA 16S, estes produtos de PCR serão sequenciados e serão identificadas as espécies de bactérias presentes no sistema MAVIPI monitorado. Além disso, uma perspectiva para a continuação deste trabalho é o isolamento das bactérias em meio de cultura. Monitoraremos o cultivo durante todo o ciclo de produção – desde a liberação dos alevinos no viveiro – acompanhando assim a dinâmica de sucessão do fitoplâncton. Posteriores acompanhamentos e estudos mais aprofundados buscarão possíveis patógenos e/ou probióticos em cultivos de tilápia no modelo MAVIPI na região do Alto Vale do Itajaí – SC.
Referências
FRAGA, A. P. M. Padronização e avaliação de métodos moleculares para a detecção do vírus da
síndrome da mancha branca em amostras de plâncton e sedimento coletadas em viveiros de camarões marinhos, Litopenaeus vannamei. 2011. Tese (Mestre em Aquicultura). – Centro de Ciências Agrárias,
Universidade de Santa Catarina, Santa Catarina. 2011.
HANSEN, G.H., OLAFSEN, J.A. Bacterial interactions in early life stages of marine cold water fish. Microbial Ecology 38, 1–26, 1999.
MACIEL, M. L. T. Contribuição para o desenvolvimento de uma proposta de monitoramento e certificação sanitária em cultivo de camarão marinho no Estado de Santa Catarina. Dissertação de mestrado. Curso de pós-graduação em Aqüicultura. Universidade Federal de Santa Catarina. 2002. 38p
MOREIRA, R. L.; COSTA, J. M.; QUEIROZ, R.V.; MOURA, P.S.; FARIAS, W.R.L. Utilização de
Spirulina platensis como suplemento alimentar durante a reversão sexual de Tilápia do Nilo. Revista
Caatinga, Mossoró, v.23, n.2, p.134-141., 2010.
MUYZER, G., DE WAAL, E.C., UITTERLINDEN, A.G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, v. 59 (3), p. 695-700, 1993.
NIU, Y.; SHEN, H.; CHEN, J.; XIE, P.; YANG, X.; TAO, M.; MA, Z.; QI, M. Phytoplankton community succession shaping bacterioplankton community composition in LakeTaihu, China. Water Research 45, 4169 – 4182, 2011.
SCHULZE, A.D.; ALABI, A.O.; TATTERSALL-SHELDRAK, A.R. et al. Bacterial diversity in a marine hatchery: balance between pathogenic and potentially probiotic bacterial strains, Aquaculture, v.256, p.50-73, 2006.
VERSCHUERE, L., ROMBAUT, G., SORGELOOS, P., VERSTRAETE, W., Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Review 64, 655–671, 2000. WOLLSCHLÄGER J.; WILTSHIRE, K.H.; PETERSEN, W.; METfiES, K. Analysis of phytoplankton distribution and community structure in the German Bight with respect to the different size classes. Journal of Sea Research. Artigo no prelo – 2015.
Projeto realizado com recursos do CNPq: Chamada CNPq/MPA – nº 42/2012 e Chamada MCTI/MAPA/MDA/MEC/MPA/CNPq Nº 81/2013.
