17
Orientadora:
Prof.ª Drª Thannya Nascimento Soares
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
MELHORAMENTO DE PLANTAS
Contribuição dos marcadores moleculares para o estudo de
diversidade genética e diversificação de espécies do gênero
Manihot Mill. (Euphorbiaceae) no Cerrado
KÁSSIA MARQUES CORRÊA MIRANDA
1 Goiânia – GO
2
KÁSSIA MARQUES CORRÊA MIRANDA
Contribuição dos marcadores moleculares para o estudo de
diversidade genética e diversificação de espécies do gênero
Manihot Mill. (Euphorbiaceae) no Cerrado
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do título de Doutora em Genética e Melhoramento de Plantas.
Orientadora:
Prof.ª Drª Thannya Nascimento Soares Coorientador:
Prof. Dr Marcos José da Silva
Goiânia, GO – Brasil 2018
3 Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do
Programa de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.
Marques Corrêa Miranda, Kássia
Contribuição dos marcadores moleculares para o estudo de
diversidade genética e diversificação de espécies do gênero Manihot Mill. (Euphorbiaceae) no Cerrado [manuscrito] / Kássia Marques Corrêa. - 2018. LXVII, 67 f.
Orientador: Prof. Thannya Nascimento Soares; co-orientador Dr. Marcos José da Silva.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Goiás, Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos (EAEA), Programa de Pós-Graduação em Genética & Melhoramentos de Plantas, Goiânia, 2018.
1. Microssatélites. 2. especiação. 3. cpDNA. 4. Variabilidade genética. I. Nascimento Soares, Thannya, orient. II. Título.
5
“O êxito da vida não se mede pelo caminho que você conquistou, mas sim
pelas dificuldades que superou no caminho”
Abraham Lincoln
6 Aos meus Avós, Adelicia e Orondino e aos meus
pais Fábio e Selma, pelo amor incondicional e o apoio sem medidas.
7 Ao meu esposo, Jhonatta Miranda Silva, pela paciência, cuidado e amor nessa jornada.
8
Agradecimentos
À Deus por me confortar nos momentos de dificuldades e desanimo, mostrando que no final todo o esforço valerá a pena.
A Universidade Federal de Goiás e ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas pelo apoio na realização do trabalho.
Aos órgãos de fomento que financiaram o desenvolvimento desse trabalho, sendo eles MCTI/CNPQ/Universal 14/2014, proc. 456530/2014-2 e PRONEM/FAPEG/CNPq 07/2016, proc. 201710267000539. A pesquisa atual foi desenvolvida no contexto do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) em Ecologia, Evolução e Conservação da Biodiversidade, apoiado pelo MCTIC/CNPq e FAPEG (proc. 465610 / 2014-5).
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Fundação de Amparo à pesquisa do estado de Goiás (FAPEG) pela concessão da bolsa de estudo concedida durante o período de realização do doutorado.
À minha orientadora Dra. Thannya Nascimento Soares pelo convívio nesses seis anos, nos quais demonstrou acreditar e confiar na realização do meu trabalho. Aprendi a te admirar como profissional, mais hoje ainda mais como ser humano. Obrigada pela compreensão e zelo, principalmente nessa reta final.
Ao meu coorientador Dr. Marcos José da Silva, pelo apoio, pelas correções e disponibilidade em contribuir com o aperfeiçoamento deste trabalho e pela coleta do material em campo.
A professora Mariana pelo apoio na condução do trabalho.
Ao Laboratório de Genética & Biodiversidade da UFG pela possibilidade de utilização do espaço físico, equipamentos e material de trabalho.
Aos membros da banca examinadora, por terem aceitado o convite, afim de contribuir com o aperfeiçoamento deste trabalho.
A todos do Laboratório de Genética & Biodiversidade, por me ajudarem sempre que eu precisei... Todos vocês foram de extrema importância... Em especial aos meus amigos do
9 grupo “Cadê seu artigo?” rsrs. sendo eles Ueric, Vanessa, Thais, Rhewter, Lays, Ariane, Fernanda, Tatiane, Elias, Ramilla, Nicole, Patricia e Josimar, vocês sempre estiveram ali com uma palavra amiga, tornando essa caminhada mais descontraída e especial.
À pessoa que não foi com a minha cara no início, mais hoje é a irmã mais velha que a vida me deu “Rejane”, obrigada por me apoiar sempre, nunca desistir de me fazer ver a vida com outros olhos, quando a angustia e o desespero me acometia.
À minha amiga Warita, pelas palavras de apoio e sempre se fazer presente, mesmo que distante.
Ao meu esposo Jhonatta, por todo amor, companheirismo e compreensão nessa jornada. Aos meus avós e pais, que sempre lutaram e não mediram esforços em me mostrar o principal valor da vida “o amor”, em cada gesto e palavras de vocês isso se torna vivo e real na minha vida. Além disso, obrigada por fazer de mim quem sou hoje, e por me mostrar que a caminhada jamais será fácil, mais que a persistência faz toda diferença. À minha família e a família que ganhei com meu casamento, obrigada por torcerem por mim. Em especial ao meu afilhado João Guilherme (JG) e a minha pitica Maria Eduarda (Duda) que enchem minha vida de alegria.
10
SUMÁRIO
RESUMO... 9 ABSTRACT... 10 1 INTRODUÇÃO GERAL... 11 2 Amplificação cruzada de marcadores microssatélites para espécies de Manihot
(Euphorbiaceae) silvestres endêmicas do Cerrado ... 13 3 Diversidade genética e Delimitação de Manihot purpureocostata Pohl e Manihot
orbicularis Pohl (Euphorbiaceae)…...….…..…..…..…..…..…..…..…..…..….
31 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 65 5 REFERÊNCIAS... 66
11 RESUMO
CORRÊA, K. M. Contribuição dos marcadores moleculares para o estudo de diversidade genética e diversificação de espécies do gênero Manihot Mill. (Euphorbiaceae) no Cerrado. 2018. 68 f. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 20181.
O gênero Manihot pertence à família Euphorbiaceae, sendo esta uma família que se destaca entre as Angiospermas pela sua diversidade e complexidade o que dificulta a identificação taxonômica das espécies. Poucos são os estudos genéticos com espécies selvagens de Manihot, os quais são importantes na caracterização dessas espécies. O objetivo geral do trabalho foi disponibilizar marcadores moleculares polimórficos capazes de acessar a diversidade e divergência genética de espécies do gênero Manihot. Para alcançar estes objetivos foram transferidos dez marcadores microssatélites desenvolvidos para Manihot esculenta em 15 espécies de Manihot endêmicas do Cerrado brasileiro, dos quais foram selecionados os melhores para a avaliação do polimorfismo em três espécies (M. irwinii D.J. Rogers & Appan, M. orbicularis Pohl e M. purpureocostata Pohl). Além dos marcadores microssatélites, dois marcadores cloroplastidiais foram utilizados para acessar a variabilidade genética intra e interespecífica de M. purpureocostata, M. orbicularis e uma população com características morfológicas intermediárias entre estas duas espécies. Todos os marcadores microssatélites amplificaram em 14 espécies, sendo que a porcentagem de locos polimórficos por espécie variou de 70 a 100%, além de apresentarem níveis satisfatórios de diversidade genética, demonstrando serem adequados na condução de trabalhos genético-populacionais em espécies de Manihot endêmicas do Cerrado. A diversidade genética das populações de M. orbicularis (0,594) e M. purpureocostata (0,659) mostrou-se alta, corroborando com o encontrado na literatura para espécies de Manihot, o que pode indicar que este é um padrão das especies dessa família. Para os dados cloroplastidiais também foi detectada alta diversidade haplotípica para M. orbicularis (0,983) e M. purpureocostata (0,933). No entanto, para M. pupureocostata foi observado baixa diversidade nucleotídica (π = 0,002597 +/-0,001560). Isso demostra que poucos sítios são polimórficos e poucas são as mutações que diferem os haplótipos. Os dados microssatélites não detectaram estruturação genética significativa entre as espécies, entretanto os dados cloroplastidiais captaram a diferenciação genética entre espécies. A ditância genética entre as populações se mostrou relacionada com a distância geográfica (r2 = 0,105, p = 0,038). De modo geral as espécies M. purpureocostata e M. orbicularis estão bem delimitadas entre si. Entretanto, as populações de M. orbicularis são bastante distintas geneticamente, o que indica um processo de diferenciação ainda incompleto, possivelmente relacionado ao isolamento por distância, associado aos efeitos da deriva genética dentro das populações. Além disso, a população intermediária alocou-se em M. orbicularis, sendo que a variação morfológica desta população pode ser explicada pela plasticidade fenotípica.
Palavras-chave: Diversidade genética, Diversidade nucleotídica, marcadores microssatélites.
____________________
1 Orientadora: Drª Thannya Nascimento Soares. ICB-UFG
12 ABSTRACT
CORRÊA, K. M. Contribution of the molecular markers to the study of genetic diversity and diversification of species of the genus Manihot Mill. (Euphorbiaceae) in the Cerrado 2018. 68 f. Thesis (Doctor of Science in Genetics and Plant Breeding) – School of Agronomy, Federal University of Goiás, Goiânia, 20181.
The genus Manihot belongs to the Euphorbiaceae family, which is a family that stands out among the Angiosperms for its diversity and complexity, which become difficult to make the taxonomic identification of the species. There are few genetic studies with wild species of Manihot, which are important in the characterization of these species. The aimed of the work was to provide polymorphic molecular markers capable of accessing the diversity and genetic divergence of species of the genus Manihot. In order to reach these objectives, ten microsatellite markers developed for Manihot esculenta were transferred to 15 species of Manihot endemic to the Brazilian Cerrado, from which we selected the best markers for the polymorphism evaluation in three species (M. irwinii DJ Rogers & Appan, M. orbicularis Pohl and M. purpureocostata Pohl). In addition to the microsatellite markers, two chloroplastid markers were used to access the intra and interspecific genetic variability of M. purpureocostata, M. orbicularis and a population with intermediate morphological characteristics between these two species. All microsatellite markers were amplified in 14 species, and the percentage of polymorphic loci per species ranged from 70 to 100%, in addition to presenting satisfactory levels of genetic diversity, demonstrating that they are adequate for the conduction of genetic-population works in endemic species of Manihot. The genetic diversity of the genetic-populations of M. orbicularis (0.594) and M. purpureocostata (0.659) was high, corroborating with the literature for Manihot species, which may indicate that this is a pattern of the species of this family. Chloroplastid data also showed high haplotypic diversity for M. orbicularis (0.983) and M. purpureocostata (0.933). However, for M. pupureocostata, low nucleotide diversity was observed (π = 0.002597 +/- 0.001560). This shows that few sites are polymorphic and there are few mutations that differ from haplotypes. Microsatellite data did not detect significant genetic structuring between species, however chloroplastid data identified the genetic differentiation between species. The genetic difference between the populations was related to the geographic distance (r2 = 0.105, p = 0.038). In general, the
species M. purpureocostata and M. orbicularis are well delimited among themselves. However, M. orbicularis populations are quite genetically distinct, which indicate a incomplete differentiation process, possibly related to isolation by distance, associated with the effects of genetic drift within populations. In addition, the intermediate population was assigned to M. orbicularis, and the morphological variation of this population can be explained by phenotypic plasticity.
Keywords: Genetic diversity, Nucleotide diversity, microsatellite markers.
_________________
1 Advisor: Drª Thannya Nascimento Soares. ICB-UFG
13 1 INTRODUÇÃO GERAL
O gênero Manihot Mill. pertence à família Euphorbiaceae e provavelmente originou-se no continente Mesoamericano e foi se diversificando ao longo do continente Sul-Americano, particularmente no Brasil, para onde 80% de suas espécies são referidas (Nassar, 2000; Duputié et al., 2011). Nassar (1978) classificou a região central do Brasil como centro de diversificação primária devido à ampla diversidade e endemismo de espécies do gênero Manihot nesta região. Estudos filogenéticos, citogenéticos e filogeográficos apontam uma recente diversificação para o gênero (Chacón et al., 2008; Duputié et al., 2011), relatando ter surgido há cerca de 6 milhões de ano no final do Mioceno.
A espécie de maior interesse econômico dentro de Manihot é M. esculenta (mandioca), sendo essa a única espécie alimentícia cultivada do gênero, considerada importante mundialmente, por ser uma rica fonte de carboidratos. Contudo, diante de tantas espécies selvagens ainda não exploradas, faz com que haja uma lacuna de conhecimento para esse gênero. Estudos demostram potencial de espécies silvestres de Manihot, como M. glaziovii na produção de biodiesel (Líns et al., 2014), borracha (Rogers & Appan, 1973) e fontes interessantes de genes relacionados a resistência ao vírus do mosaico (Alves et al., 2011). É importante ressaltar ainda, que estudos taxonômicos têm revelado novas espécies endêmicas do Cerrado, indicando que há muito a se conhecer sobre este gênero (Silva, 2014, 2015, 2016).
Dentre as lacunas de conhecimento sobre o gênero Manihot Mill., os aspectos genéticos são relevantes tanto para fins de conservação, quanto para o uso destas espécies como recursos genéticos. A distribuição da diversidade genética nas populações está relacionada com a atuação de forças evolutivas como deriva e seleção que visam diferenciar as populações, enquanto que o fluxo gênico tende a homogeneizar (Ellstrand, 2014). Assim, compreender esses eventos evolutivos proporciona verificar padrões de diversificação das espécies ao longo de sua história evolutiva (Richardson et al., 2014).
Para acessar a variabilidade genética de uma espécie se faz necessário a utilização de ferramentas como marcadores moleculares. A associação de diferentes tipos de marcadores, como os microssatélites nucleares e sequências intergênicas cloroplastidiais é importante, pois permite avaliar padrões de divergência entre e dentro de espécies (Yu et
14 al., 2013; Alves-pereira et al., 2018). Além disso, são marcadores que demonstram cenários evolutivos diferentes, enquanto microssatélites evidenciam como a variabilidade genética encontra-se distribuída atualmente (Petit et al., 2005), os cloroplastidiais tendem a demonstrar processos ancestrais, que podem estar relacionados com processo de diversificação de espécies próximas evolutivamente (Palma-Silva et al., 2011; Rodrigues et al., 2014).
As espécies M. orbicularis e M. purpureocostata são endêmicas do cerrado goiano, com algumas características muito semelhantes como, por exemplo, a morfologia floral, em alguns casos simpátricas e com indícios de formarem híbridos naturais. No entanto, não há marcadores específicos para essas espécies, e em alguns casos o custo do desenvolvimento dos iniciadores espécie- específicos podem os tornar desvantajosos. Deste modo, uma alternativa ao desenvolvimento desses marcadores é a transferibilidade entre espécies evolutivamente próximas (Barbará et al., 2007). Considerando a gama de marcadores microssatélites disponíveis para Manihot esculenta (mandioca), essa alternativa se torna viável, uma vez que o nível de transferibilidade está relacionado com a proximidade evolutiva entre os táxons (Soares et al., 2013; Miranda et al., 2016). Em relação aos marcadores cloroplastidiais, já se tem a descrição do genoma cloroplastidial completo para M. esculenta (Daniell et al., 2008), mas não foram desenvolvidos marcadores específicos para a espécie, sendo assim uma alternativa é o uso de marcadores universais desenvolvidos para Angiospermas (Shaw et al., 2005).
Diante do cenário de carência de estudos que visem avaliar a variabilidade genética de espécies silvestres de Manihot endêmicas do bioma Cerrado, os objetivos deste trabalho foram disponibilizar marcadores moleculares informativos capazes de acessar a variabilidade genética intra e interespecífico, colaborando com o melhor conhecimento da história evolutiva das populações destas espécies. Para atingir aos objetivos propostos foi testada a amplificação cruzada de dez marcadores microssatélites desenvolvidos para M. esculenta em quinze espécies de Manihot selvagem endêmicas do Cerrado (capítulo 1). O capítulo 2 associa dois tipos de marcadores moleculares (microssatélites e cloroplastidiais) para acessar a diversidade genética e delimitação de M. purpureocostata e M. orbicularis.
13 CAPÍTULO 1
Amplificação cruzada de marcadores microssatélites para espécies de
Manihot (EUPHORBIACEAE) silvestres endêmicas do Cerrado
1
K. M. Corrêa2, M. J. Silva4, M. P. C. Telles2,3, R. A. Guimarães2, P. R. O. Oliveira2, T. G. Ribeiro2, T. P. Mendes2 e T. N. Soares2
1Capítulo elaborado conforme as normas do periódico científico Genetics and Molecular Research;
2 Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil
3 Escola de Ciências Agrárias e Biológicas, Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia, Goiás,
Brasil
4 Departamento de Botânica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia,
14 AMPLIFICAÇÃO CRUZADA DE MARCADORES MICROSSATÉLITES EM 1
ESPÉCIES DE Manihot Mill. (EUPHORBIACEAE) ENDÊMICAS DO 2
CERRADO 3
4
K. M. Corrêa1, M. J. Silva3, M. P. C. Telles1,2, R. A. Guimarães1, P. R. O. Oliveira1,
5
T. G. Ribeiro1, T. P. Mendes1 e T. N. Soares1
6 7
1 Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas,
8
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil 9
2 Escola de Ciências Agrárias e Biológicas, Pontifícia Universidade Católica de Goiás,
10
Goiânia, Goiás, Brasil 11
3 Departamento de Botânica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
12
Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil 13
14
Autor correspondente: K. M. Corrêa / T. N. Soares 15
E-mail: kassia_mc@hotmail.com / tnsoares@gmail.com 16
17
RESUMO 18
O gênero Manihot possui um grande número de espécies endêmicas do Cerrado ainda 19
pouco conhecidas geneticamente. Neste contexto, o trabalho tem como objetivo testar a 20
amplificação cruzada de dez marcadores microssatélites desenvolvidos para Manihot 21
esculenta Crantz (mandioca) em 15 espécies de Manihot endêmicas do Cerrado 22
brasileiro, com o intuito de disponibilizar marcadores informativos para estudos de 23
genética de populações no gênero. Os pares de primers com amplificação satisfatória 24
foram avaliados quanto ao polimorfismo utilizando oito indivíduos de cada espécie. Os 25
15 marcadores polimórficos foram combinados em três conjuntos multiplex para a
26
genotipagem em analisador genético de DNA. Os parâmetros de diversidade genética 27
dos marcadores polimórficos foram avaliados em 24 indivíduos de cada uma das três 28
espécies analisadas (M. irwinii D.J. Rogers & Appan, M. orbicularis Pohl e M. 29
purpureocostata Pohl). Os dez pares de primers amplificaram para 14 espécies. A 30
porcentagem de locos polimórficos por espécie variou entre 70 e 100%. Nove 31
marcadores apresentaram os melhores padrões de amplificação e polimorfismo que 32
foram combinados em três conjuntos para a genotipagem multiplex. Estes marcadores 33
apresentaram 51, 75 e 75 alelos em M. irwinii, M. orbicularis e M. purpureocostata, 34
respectivamente. Os níveis de diversidade genética dos marcadores transferidos foram 35
satisfatórios e mostraram-se úteis para a realização de estudos genético-populacionais 36
em espécies de Manihot endêmicas do Cerrado. 37
38
Palavras chave: diversidade genética; Euphorbiaceae; SSR; transferibilidade. 39
40
INTRODUÇÃO 41
Os marcadores moleculares constituem ótimas ferramentas para a realização 42
de estudos sobre diversidade, estrutura genética populacional e identificação individual, 43
permitindo conhecer a forma de atuação dos processos microevolutivos sobre as 44
espécies de plantas nativas (Soares et al., 2013; Miranda et al., 2016). Assim, 45
marcadores microssatélites quando disponíveis podem ser utilizados em diferentes 46
abordagens, auxiliando na resolução de problemas relacionados à taxonomia, análise de 47
paternidade, biologia reprodutiva, delimitação de espécies e estrutura genética 48
populacional (Collevatti et al., 2016; Rodrigues et al., 2016; Silva et al., 2017). Esses 49
marcadores são especialmente úteis para os estudos de variabilidade genética, por 50
16 apresentarem padrão de herança codominante, multialelismo, além de serem abundantes 51
e bem distribuídos ao longo do genoma (Goldstein e Schlötterer, 2001; Li et al., 2002; 52
Ellegren, 2004). 53
Uma das poucas limitações de uso dos marcadores microssatélites é o 54
relativo alto custo e tempo necessários para o seu desenvolvimento. Desta maneira, o 55
teste de amplificação cruzada de marcadores microssatélites disponíveis para uma 56
espécie em outras congêneres ou próximas filogeneticamente é uma alternativa 57
interessante, antes de se investir no desenvolvimento de marcadores espécie-específicos. 58
Além disso, estudos de transferibilidade têm mostrado sucesso na disponibilização de 59
marcadores microssatélites para plantas nativas do Cerrado (Soares et al., 2013; 60
Bernardes et al., 2014; Miranda et al., 2016), cujos genomas ainda não estão 61
disponíveis. 62
O gênero Manihot Mill tem origem Mesoamericana e apresenta mais de 100 63
espécies (Silva, 2014), sendo o Cerrado brasileiro seu principal centro de diversificação 64
com cerca de 60 espécies, sendo 56 delas endêmicas (Duputié et al., 2011, Silva et al., 65
2017). Estudos têm mostrado mostram que este gênero apresenta espécies com 66
problemas de delimitação taxonômica, e ainda tem sua taxonomia carente de estudos no 67
Brasil, para onde foram descritas várias espécies novas nos últimos anos (Silva et al., 68
2013, Silva, 2014, Silva, 2015, Silva, 2016, Silva et al., 2017). No entanto, pouco se 69
conhece sobre a diversidade genética destas espécies, especialmente na região Centro-70
Oeste. 71
A vantagem em se estudar espécies do gênero Manihot está no fato de que, 72
embora não se tenha marcadores microssatélites disponíveis para elas, existe 73
marcadores para M. esculenta (Chavarriaga-Aguirre, 1998; Mba et al., 2001; Okogbenin 74
et al. 2006; Raji et al., 2009, Kunkeaw et al., 2011), os quais podem ser transferidos 75
17 para as espécies nativas e endêmicas do Cerrado. Estes marcadores microssatélites têm 76
auxiliado nos programas de melhoramento e conservação de recursos genéticos da 77
mandioca, por exemplo avaliando a diversidade genética e identificando duplicatas em 78
banco de germoplasma (Siqueira et al., 2011; Moura et al., 2013). Estes mesmos 79
marcadores microssatélites podem ser utilizados para estudos genéticos das populações 80
de espécies silvestres do gênero Manihot. 81
O presente trabalho teve por objetivo testar a amplificação cruzada de 82
marcadores microssatélites desenvolvidos para Manihot esculenta Crantz (mandioca 83
cultivada) em 15 espécies congêneres endêmicas do Cerrado. 84
85
MATERIAL E MÉTODOS 86
87
Os testes de amplificação foram realizados com uma amostra de três 88
indivíduos de cada uma das 15 espécies estudadas de Manihot provenientes do Cerrado, 89
no Centro-Oeste brasileiro (Tabela 1). Para a avaliação do polimorfismo dos 90
marcadores, a amostra foi ampliada para 8 indivíduos por espécie. Os marcadores 91
polimórficos foram ainda, analisados quanto aos parâmetros de diversidade genética, 92
em 3 espécies (M. orbicularis, M. purpureocostata e M. irwinii), contendo 24 93
indivíduos cada, totalizando 72 indivíduos. 94
A extração do DNA foi realizada a partir de tecido vegetal estocado em 95
sílica-gel conforme metodologia proposta por Doyle e Doyle (1987). O DNA obtido foi 96
quantificado em gel de agarose 1%, por meio de uma análise comparativa com os 97
marcadores 50 λ, 100 λ, 200 λ e, posteriormente, diluído a uma concentração final de 98
1,5 ng/µL para ser utilizado nas reações em cadeia da polimerase (PCR). 99
18 Foram testados dez marcadores microssatélites nucleares desenvolvidos 100
para Manihot esculenta Crantz, sendo oito (GA 134, GA 136, GA 126, GA 21, GA 12, 101
GA 131, GA 16, GAGG5) por Chavarriaga-Aguirre et al. (1998) e dois (SSRY 12 e 102
SSRY 82) por Mba et al. (2001). 103
As reações de PCR foram montadas para o volume final de 10 μL, contendo 104
4,5 ng de DNA e 0,18 μM de iniciadores (foward + reverse), 0,15 μM de dNTP, 2,16 105
mg de BSA, 1X de tampão (Tris-HCl 10 mM [pH 8,3], 50 mM de KCl, MgCl2 1,5 106
mM), DNA polimerase Taq 0,75 U. O programa de amplificação teve as etapas de 107
desnaturação do DNA a 94º C por 5 minutos, seguida por 30 ciclos contendo os passos 108
de desnaturação do DNA a 94º C por 1 minuto; anelamento dos primers de 54 a 65°C 109
(dependendo do iniciador) por 1 min; extensão da molécula de DNA a 72º C por 1 110
minuto; extensão final a 72º C por 45 minutos. A temperatura de anelamento dos 111
primers foi ajustada para cada marcador, até ser verificado um bom padrão de 112
amplificação no gel de agarose 3%. 113
A verificação do polimorfismo dos marcadores foi realizada em eletroforese 114
em gel de acrilamida 6% corado com nitrato de prata (Creste et al., 2001), utilizando-se 115
como referência os marcadores de peso molecular 10 bp e 50 bp (InvitrogenTM). 116
Os marcadores que apresentaram os melhores perfis de bandas no gel de 117
poliacrilamida e polimorfismo foram marcados com fluorescência para a genotipagem 118
em analisador genético de DNA (modelo ABI3500 - Applied Biosystems). A escolha da 119
cor da fluorescência baseou-se na amplitude de variação de tamanho dos alelos de cada 120
loco, para a montagem de multiplex para a eletroforese. A atribuição dos alelos para 121
cada indivíduo foi realizada no software GeneMapper 5.0 (Applied Biosystems). 122
A partir dos genótipos dos 72 indivíduos das espécies M. orbicularis, M. 123
purpureocostata e M. irwinii, os marcadores polimórficos foram avaliados quanto a 124
19 possíveis erros de genotipagem em função de alelos nulos, dropout e stutter (Van
125
Oosterhout et al., 2004), utilizando-se o programa MICRO-CHECKER versão 2.2.3. O 126
poder de discriminação individual para cada loco e para o conjunto de locos foi avaliado 127
pelas estimativas da probabilidade de identidade genética (I) e da probabilidade de 128
exclusão da paternidade (Q) (Wagner and Sefc, 1999), realizadas no programa 129
IDENTITY 4.0. Os parâmetros de diversidade genética (riqueza alélica, 130
heterozigosidade esperada e observada) e o teste de equilíbrio de Hardy- Weinberg 131
(HWE) dos locos foram estimados no programa GDA (Lewis e Zaykin, 2000), o 132
desequilíbrio de ligação usando a correção de Bonferroni foi realizado no programa 133 FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2002). 134 135 RESULTADOS 136 137
Dos dez marcadores testados apenas um (GAGG5) não amplificou para uma 138
das 15 espécies (M. irwinii). Com isso, a maioria amplificou e apresentou polimorfismo 139
em grande parte das espécies, variando entre 12 e 15 espécies para as quais eles foram 140
polimórficos. Foram detectados entre 7 e 10 locos polimórficos por espécie (Tabela 2). 141
Os nove marcadores que exibiram os melhores padrões de amplificação 142
(Tabela 3) apresentaram entre 3 e 16 alelos por espécie, com médias de 5,7, 8,3 e 8,3 143
alelos por loco para M. irwinii, M. orbicularis e M. purpureocostata, respectivamente 144
(Tabela 4). 145
Detectou-se a presença de alelos nulos no loco GA 136 para M. orbicularis 146
e M. irwinii, no loco Ga 126 para M. orbicularis e M. purpureocostata, no loco GA 16 147
para M. irwinii e no loco SSRY 12 para M. orbicularis. No loco GA 126 para M. 148
orbicularis foram ainda detectados sttuters. Não houve alterações significativas ao 149
20 desequilíbrio de ligação (P > 0,05) para nenhum par de locos em nenhuma espécie. 150
Foram observados desvios ao EHW (P< 0,05) nos locos GA 21 para todas as espécies, 151
GA 136 para M. irwinii e M. orbicularis, GA 16 e SSRY 82 para M. irwinii, GA 126 M. 152
orbicularis e M. purpureocostata e GA 131 para M. orbicularis. 153
Os valores médios de heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho)
154
foram, em sua maioria, compatíveis com o número de alelos encontrados por loco 155
(Tabela 4). O conjunto dos nove marcadores selecionados apresentaram boa capacidade 156
de discriminação individual, nas espécies M. orbicularis e M. purpureocostata estes 157
locos apresentaram, respectivamente, as melhores estimativas de probabilidade geral de 158
exclusão de paternidade (0,999 e 0,998) e de probabilidade de identidade (9,13 x 10-10 e 159 2,61 x 10-9) (Tabela 4). 160 161 DISCUSSÃO 162 163
A maioria dos estudos disponíveis na literatura realizam a transferibilidade 164
de marcadores microssatélites para uma ou poucas espécies. O presente estudo realizou 165
a transferibilidade de marcadores microssatélites para 15 espécies do gênero Manihot 166
endêmicas do Cerrado brasileiro, o que representa um diferencial em relação ao que se 167
tem sido feito até o presente momento. 168
Roa et al. (2000) avaliaram o sucesso da transferibilidade de dez locos 169
microssatélites para seis espécies de Manihot, incluindo duas subespécies de M. 170
esculenta. Os resultados mostraram níveis de polimorfismo entre 6 a 10 locos 171
polimórficos por espécie, sendo um pouco menor quando comprado ao encontrado no 172
presente estudo. Além desse trabalho, outro estudo de desenvolvimento e 173
transferibilidade de marcadores microssatélites de M. esculenta avaliou esses 174
21 marcadores em quatro espécies silvestres (M. epruinosa, M. glaziovii, M. brachyandra e 175
M. tripartita), verificando que 94% desses marcadores amplificaram em espécies 176
congêneres, enquanto que para espécies da mesma família e de outro gênero esse 177
número foi bem reduzido (Raji et al., 2009). 178
Os resultados encontrados no presente estudo corroboram com outros 179
trabalhos que mostram que o sucesso na transferibilidade de marcadores microssatélites 180
está relacionado com a proximidade evolutiva entre as espécies (Soares et al., 2013; 181
Bernardes et al., 2014; Miranda et al., 2016). Além disso, o presente estudo e os estudos 182
de transferibilidade com o gênero Manihot dão suporte aos estudos filogenéticos que 183
demostram a baixa resolução taxonômica para alguns conjuntos de espécies nesse 184
gênero (Duputié et al., 2011), isso devido à alta taxa de transferibilidade verificada no 185
presente estudo. 186
O número de alelos por loco verificado nesse estudo foi próximo ao 187
observado no artigo de desenvolvimento desses marcadores, que variou de 1 a 15 alelos 188
por loco (Chavarriaga-Aguirre et al., 1998). Além disso, resultados semelhantes aos 189
encontrados neste estudo podem ser visualizados nas pesquisas de Mühlen et al. (2013) 190
e Siqueira et al. (2011) para variedades de M. esculenta, onde os autores obtiveram um 191
número médio de alelos por loco entre 3,4 e 9,9, respectivamente. Observa-se assim que 192
o presente estudo teve um bom nível de transferibilidade e polimorfismo. 193
Os nove marcadores selecionados apresentaram alto poder de exclusão de 194
paternidade (Evett e Weir, 1998) e são adequados na discriminação individual (Paetkau 195
et al., 1995). No entanto, alguns locos apresentaram alelos nulos e isso pode ser 196
explicado por mutações nas regiões de anelamento dos primers das espécies que os 197
apresentaram, o que impede que ocorra o anelamento adequado dos primers (Callen et 198
al., 1993). 199
22 Dos locos que desviaram ao EHW, alguns apresentaram alelos nulos, o que 200
pode ser uma possível explicação para o desvio encontrado. Roa et al. (2000) obteve 201
resultados similares quanto a presença de alelos nulos em locos avaliados para outras 202
espécies de Manihot. A análise com mais populações e com um maior número de 203
indivíduos por população poderá confirmar este resultado. 204
O presente estudo disponibilizou entre sete e dez marcadores microssatélites 205
polimórficos para as 15 espécies de Manihot estudadas. Tais resultados são promissores 206
e de grande valia para a realização de estudos de variabilidade genética destas espécies. 207
Assim, a disponibilização destes marcadores por transferibilidade, reduziu o custo e 208
tempo para a sua obtenção, por não ter sido necessário o desenvolvimento de 209
marcadores espécie-específicos. Além disso, os sistemas de genotipagem multiplex 210
propostos neste trabalho contribuirão para a obtenção dos dados com um melhor custo-211 beneficio. 212 213 Conflito de interesse 214
Os autores declaram não haver conflito de interesse. 215
216
AGRADECIMENTOS 217
O desenvolvimento desse trabalho contou com o apoio financeiro dos projetos 218
MCTI/CNPQ/Universal 14/2014, proc. 456530/2014-2, CNPq/Fapeg/PRO-CENTRO-219
OESTE nº31/2010, Genpac 02 - proc. 563839/2010-4 e 201110267000125. Além disso, 220
houve contribuição da CAPES no fornecimento de bolsas para o trabalho de 221
K.M.Corrêa, R.A. Guimarães, P.R.O. Oliveira, do CNPQ na bolsa de apoio técnico a 222
pesquisa de T.P Mendes (proc. 372704/2015-8), da FAPEG na bolsa de iniciação 223
cientifica de T.G Ribeiro (proc. 201410267001438) e do subsídio de produtividade do 224
23 CNPq no trabalho de M.P.C. Telles, M.J. Silva e T.N. Soares. Current research is
225
developed in the context of National Institutes for Science and Technology (INCT) in
226
Ecology, Evolution and Biodiversity Conservation, supported by MCTIC/CNpq (proc.
227 465610/2014-5) and FAPEG. 228 229 REFERÊNCIAS 230 231
Barbará T, Palma-Silva C, Paggi GM, Bered F, Fay MF, Lexer C (2007) Cross-species 232
transfer of nuclear microsatellite markers: potential and limitations. Mol. Ecol. 16: 233
3759 3767. 234
Bernardes V, dos Anjos DE, Gondim SG, Murakami DM, Bizão N, Telles MP (2014) 235
Isolation and Characterization of Microsatellite Loci in Byrsonima cydoniifolia 236
(Malpighiaceae) and Cross-Amplification in B. crassifolia. Appl. Plant Sci. 2: 237
1400016. 238
Callen DF, Thompson AD, Shen Y, Phillips HA, Richards RI, Mulley JC (1993) 239
Incidence and origin of 'null' alleles in the (AC)n microsatellite markers. Am J 240
Hum Genet. 52:922–927. 241
Chavarriaga-Aguirre P, Maya MM, Bonierbale MW, Kresovich S, Fregene MA, Tohme 242
J, Kochert G (1998) Microsatellites in cassava (Manihot esculenta Crantz): 243
discovery, inheritance and variability. Theo and App Gene. 97: 493–501. 244
Collevatti RG, Olivatti AM, Telles MPC, Chaves LJ (2016) Gene flow among 245
Hancornia speciosa (Apocynaceae) varieties and hybrid fitness. Tree Genetics & 246
Genomes. 12:74. 247
Creste S, Tulmann Neto A and Figueira A (2001) Detection of single sequence repeat 248
polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. 249
24 Plant Mol. Biol. Rep. 19: 299-306.
250
Doyle JJ and Doyle JJ (1987) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus (San 251
Francisco, Calif.). 12: 13-15. 252
Duputié A, Salick J, Mckey D (2011) Evolutionary biogeography of Manihot 253
(Euphorbiaceae), a rapidly radiating Neotropical genus restricted to dry 254
environments. J. of Biogeo. 38: 1033–1043. 255
Ellegren H (2004) Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat rev 256
Gene. 5:435–445. 257
Evett IW and Weir BS (1998) Interpreting DNA evidence: Statistical for forensic 258
scientists. Sunderland: Sinauer Associates, Inc. Publishers. 278. 259
Goudet J (2002) Fstat. (Version 2.9.3.2.): A computer program to calculate F-statistics. 260
J. Hered. 86: 485-486. 261
Lewis PO and Zaykin D (2000) Genetic Data Analysis: Computer program for the 262
analysis of allelic data (software). 263
Mba REC, Stephenson P, Edwards K, Melzer S, Nkumbira J, Gullberg U, Apel K, Gale 264
M, Tohme J, Fregene M (2001) Simple sequence repeat (SSR) markers survey of 265
the cassava (Manihot esculenta Crantz) genome: Towards an SSR-based 266
molecular genetic map of cassava. Theo and App Gene. 102: 21–31. 267
Miranda EAGC, Boaventura-Novaes CRD, Braga RS, Reis EF, Pinto JFN, Telles MPC 268
(2016) Validation of EST- derived microsatellite markers for two cerrado- 269
endemic Campomanesia (Myrtaceae) species. Gene Mol.Ecol. 15: 1-6. 270
Moura EF, Neto Farias JT, Sampaio JE, Da Silva DT, Ramalho GF (2013) 271
Identification of duplicates of cassava accessions sampled on the North Region of 272
Brazil using microsatellite markers. Acta Amaz. 43: 461–468. 273
Mühlen GS, Alves-Pereira A, Clement CR, Valle TL(2013) Genetic diversity and 274
25 differentiation of Brazilian bitter and sweet manioc varieties (Manihot Esculenta 275
Crantz , Euphorbiaceae ) based on SSR molecular markers. J. of the Soc for the 276
Anthr of low South America. 11: 66–73. 277
Obae SG, Brand MH, Connolly BA, Beasley RR, Lance SL (2017) Microsatellite 278
Markers for Aronia melanocarpa (Black Chokeberry) and Their Transferability to 279
Other Aronia Species. HortScience. 52: 20–23. 280
Olsen KM, Schaal BA (2001) Microsatellite variation in cassava (Manihot esculenta, 281
Euphorbiaceae) and its wild relatives: further evidence for a southern Amazonian 282
origin of domestication. Amer Jour of Bot. 88: 131–142. 283
Van Oosterhout C, Hutchinson WF,Wills DPM, Shipley P (2004) MICRO-CHECKER: 284
Software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. 285
Mol. Ecol Not. 4: 535–538. 286
Paetkau DCW, Stirling I, Strobeck C (1995) Microsatellite analysis of population 287
structure in Canadian polar bears. Mol. Ecol. 4: 347-354. 288
Raji AAJ, Anderson JV, Kolade OA, Ugwu CD, Dixon AGO, Ingelbrecht IL (2009) 289
Gene-based microsatellites for cassava (Manihot esculenta Crantz): prevalence, 290
polymorphisms, and cross-taxa utility. BMC Plant Biology. 1-11. 291
Roa AC, Chavarriaga-Aguirre P, Duque MC, Maya MM, Bonierbale MW, Iglesias C, 292
Tohme J (2000) Cross - Species Amplification of Cassava (Manihot esculenta) 293
(Euphorbiaceae) Microsatellites : Allelic Polymorphism and Degree of 294
Relationship. AmerJouRl of Bot. 87: 1647–1655. 295
Rodrigues EB, Collevatti RG, Chaves LJ, Moreira LR, Telles MPC (2016) Mating 296
system and pollen dispersal in Eugenia dysenterica (Myrtaceae) germplasm 297
collection: tools for conservation and domestication. Genetica. 144: 139- 146. 298
Silva MJ, Sodré RC, Almeida LCS (2013) A new endemic species of Manihot 299
26 (Euphorbiaceae s. str.) from the Chapada dos Veadeiros, Goiás, Brazil. Phytotaxa. 300
131: 53-57. 301
Silva MJ (2014) Manihot veadeirensis (Euphorbiaceae s.s.): a new species from the 302
Brazilian Cerrado. Systematic Botany. 39: 1161–1165. 303
Silva MJ (2015) Two new wild cassava species (Manihot, Euphorbiaceae) from the 304
Brazilian Cerrado. Phytotaxa. 213: 131–139. 305
Silva MJ (2016) Manihot gratiosa and M.lourdesii spp. nov. (Manihoteae, 306
Euphorbiaceae) from the Brazilian Cerrado. Nordic Journal of Botany. 34: 66–74. 307
Silva M.J, Soares, T. N, Ordiale, P. R (2017) Morphological characteristics and genetic 308
evidence reveals a new species of Manihot (Euphorbiaceae, Crotonoideae) from 309
Goiás, Brazil. Phytokeys 77: 99-111.Siqueira MVBM, Borges A, Valle TL, 310
Veasey EA (2011) A comparative genetic diversity assessment of industrial and 311
household Brazilian cassava varieties using SSR markers. Bragantia. 70: 745– 312
752. 313
Soares TN, Sant'Ana LL, Oliveira LK, Telles MPC, Collevatti RG (2013) 314
Transferability and characterization of microssatellite loci in Anacardium humile 315
A. St. Hil. (Anacardiaceae). Gene and Mol Res. 12: 3146–3149. 316
Wagner HW, Sefc KM (1999). IDENTITY 1.0. Centre for Applied Genetics, 317
University of Agricultural Sciences Vienna. Available at [http://www.uni-318
graz.at/~sefck] 319
27 Tabela 1. Localização das espécies de Manihot utilizadas no presente estudo e os vouchers depositados no herbário da Universidade Federal de 320
Goiás. 321
Coordenadas geográficas
Espécie Local Longitude Latitude Altitude
(m)
Voucher/ Herbário Universidade Federal de
Goiás
M. gabrielensis Allem Água Fria de Goiás- Goiás -47,6045 -14,9874 1131 M. J. Silva 4032 (UFG)
M. violacea Pohl Pirenópolis - Goiás -48,9172 -15,8394 925 M. J. Silva 5321(UFG)
M. saxatilis M. J. Silva & Sdoré Alto Paraíso de Goiás - Goiás -47,7369 -14,1113 1155 M. J. Silva 4702 (UFG)
M. alutacea D. J. Rogers & Appan Serra do Pouso Alto - Goiás -47,5081 -14,0541 1083 M. J. Silva 5522 (UFG)
M. attenuata Müll. Arg. Alto Paraíso de Goiás - Goiás -47,7931 -14,1453 1030 M. J. Silva 4503 (UFG)
M. divergens Pohl Água Fria de Goiás- Goiás -47,6045 -14,9874 1131 M. J. Silva 4028 (UFG)
M. mossamedensis Taub. Parque Estadual Serra Dourada - Goiás -50,1802 -16,0671 997 M. J. Silva 3527 (UFG)
M. confertiflora M. J. Silva Alto Paraíso de Goiás - Goiás -47,6326 -14,1679 1146 M. J. Silva 5572 (UFG)
M. pentaphylla Pohl Pirenópolis - Goiás -48,9172 -15,8394 925 M. J. Silva 6342 (UFG)
M. paviifolia Pohl Mossâmedes- Goiás -50,8579 -16,0746 985 M. J. Silva 3126 (UFG)
M. peltata Pohl Santa Bárbara - Goiás -47,75 -16,9833 638 M. J. Silva 4825(UFG)
M. tripartita (Spreng) Müll. Arg. Cocalzinho de goiás- Goiás -48,8333 -15,7819 1157 M. J. Silva 5821 (UFG)
M. orbicularis Pohl
Alto Paraíso de Goiás- Goiás -47,4232 -14,1735 1028 M. J. Silva 4384UFG)
Colinas do Sul - Goiás -47,9668 -14,1668 649 M. J. Silva 5504 (UFG)
Pirenópolis - Goiás -49,0376 -15,7423 808 M. J. Silva 6253 (UFG)
M. purpureocostata Pohl.
Alto Paraíso de Goiás - Goiás -47,7913 -14,1599 1072 M. J. Silva 4531 (UFG)
Alto Paraíso de Goiás/Vale da Lua - Goiás -47,7801 -14,1749 1020 M. J. Silva 3867 (UFG)
Alto Paraíso de Goiás/Vila São Jorge -47,8239 -14,1749 982 M. J. Silva 4150 (UFG)
M. irwinii D. J. Rogers & Appan
Corumbá de Goiás- Goiás -48,7853 -15,8403 1067 M. J. Silva 5805 (UFG)
Pirenópolis- Goiás -49,0458 -15,7208 730 M. J. Silva 6389 (UFG)
28 Tabela 2. Amplificação cruzada de 10 locos microssatélites de Manihot esculenta Crantz para 15 espécies selvagens de Manihot endêmicas do 322
Cerrado. 323
Espécie Loco / temperatura de anelamento (°C) Nº de locos
polimórficos GA 21 GA 126 GA 136 GA 134 GAGG5 GA12 GA16 GA131 SSRY82 SSRY12
M. gabrielensis 58 63 61 58 54 61 64 60 58 61 10 M. violaceae 58 60 58 58 54 58 62 60 58 61 10 M. orbicularis 60 60 58 56 56 58 60 56 62 62 10 M. purpureocostata 60 60 58 56 56 58 60 56 62 62 10 M. saxatilis 58 60 59 58 55 60 65 61 59 63 10 M. alutacea 58 58 59 58 55 62 65 61 59 63 10 M. attenuata 58 58 60 59 54 60 65 61 59 61 10 M. divergens 58 60 59 58 55 60 61 58 57 61 10 M. irwinii 56 56 56 56 - 56 56 56 56 56 10 M. mossamedensis 56* 60 58 56 65 58 64 56 58 62 9 M. confertiflora 60 58* 58 59 54 60 64 58 59 61 9 M. pentaphylla 62 58 54 56 56 58 58* 56 58 60 9 M. paviifolia 61* 58* 56 56 58 62 60 61 58 63 8 M. peltata 60 63 60 58 60* 60* 60 61 58* 61 7 M. tripartita 59 60* 58 56 56 58 60* 56 58* 60 7
Nº de espécies com polimorfismo 13 12 15 15 13 14 13 15 13 15
* locos monomórficos; -: não amplificou. 324
325 326 327
29 Tabela 3. Multiplex utilizadas para as análises das espécies M. irwinii, M. orbicularis e M. purpureocostata.
328
Multiplex Marcadores Referência Fluorescência Amplitude do tamanho dos alelos (pb)
1 GA 134 Chavarriaga-Aguirre et al., 1998 6- FAM 303- 369 GA 136 PET 154- 176 GA 126 NED 204- 210 GA 21 VIC 103- 119 2 GA 12 Chavarriaga-Aguirre et al., 1998 6-FAM 131- 163 GA 131 PET 89- 99 GA 16 NED 99- 109
3 SSRY 12 Mba et al., 2001 NED 150- 380
SSRY 82 6-FAM 170- 210 329 330 331 332 333 334 335
30 Tabela 4: Caracterização de nove locos microssatélites de Manihot esculenta em três espécies selvagens de Manihot. A: número de alelos por 336
loco; HE: heterozigosidade esperada pelo Equilíbrio de Hardy-Weinberg; Ho: heterozigosidade observada; Q: probabilidade de exclusão de
337
paternidade; I: probabilidade de identidade. 338
M. irwinii M. orbicularis M. purpureocostata
Loco A He Ho Q I A He Ho Q I A He Ho Q I GA 21 3 0,656 0,500 0,349 0,203 8 0,773 0,869 0,544 0,094 7 0,797 0,833 0,571 0,082 GA 126 3 0,551 0,625 0,252 0,305 5 0,689 0,416 0,431 0,153 4 0,406 0,217 0,219 0,389 GA 134 11 0,875 0,791 0,719 0,035 13 0,890 0,833 0,746 0,028 16 0,908 0,875 0,781 0,021 GA 136 7 0,786 0,583 0,577 0,080 9 0,742 0,500 0,516 0,108 5 0,460 0,434 0,251 0,337 GA 12 7 0,609 0,583 0,390 0,192 9 0,621 0,625 0,419 0,173 13 0,850 0,916 0,683 0,044 GA 16 3 0,289 0,083 0,133 0,543 6 0,559 0,458 0,342 0,234 6 0,645 0,565 0,394 0,181 GA 131 6 0,541 0,583 0,336 0,244 5 0,713 0,541 0,433 0,149 6 0,549 0,500 0,340 0,239 SSRY 12 5 0,718 0,476 0,439 0,145 15 0,926 0,791 0,812 0,015 13 0,848 0.818 0,669 0,049 SSRY 82 6 0,535 0,428 0,320 0,257 5 0,599 0,500 0,366 0,207 5 0,736 0,863 0,492 0,118 Média 5,7 0,618 0,517 0,992 1,672 x 10-7 8,3 0,724 0,615 0,999 9,132 x 10-10 8,3 0,689 0,669 0,998 2,614 x 10-9 339 340
31 CAPÍTULO 2
Diversidade genética e delimitação de Manihot purpureocostata Pohl e Manihot
orbicularis Pohl (Euphorbiaceae)1
Kássia Marques Corrêa2,3,Mariana Pires de Campos Telles2,4,6, Marcos José Silva5,
Rejane Araújo Guimarães2, Warita Alves Melo2,6, Tatianne Piza Ferrari Abreu Jardim 2,6, Thannya Nascimento Soares2,3,6
1Capítulo elaborado conforme as normas do periódico científico Plant Systematic and Evolution;
2 Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil.
3 Programa de Pós-graduação e Genética e Melhoramento de Plantas - Escola de Agronomia – UFG,
Goiás, Brasil.
4 Escola de Ciências Agrárias e Biológicas, Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia, Goiás,
Brasil.
5 Laboratório de Filogenia Molecular de Plantas, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil
6 Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas,
32 Diversidade genética e delimitação de Manihot purpureocostata Pohl e 1
Manihot orbicularis Pohl (Euphorbiaceae)
2 3
Kássia Marques Corrêa1,2,Mariana Pires de Campos Telles1,3,5, Marcos José Silva4,
4
Rejane Araújo Guimarães1, Warita Alves Melo1,5, Tatianne Piza Ferrari Abreu 5
Jardim 1,5, Thannya Nascimento Soares1,2,5. 6
7
1Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas,
8
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. 9
2 Programa de Pós-graduação e Genética e Melhoramento de Plantas - Escola de
10
Agronomia – UFG, Goiás, Brasil. 11
3Escola de Ciências Agrárias e Biológicas, Pontifícia Universidade Católica de
12
Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. 13
4 Laboratório de Filogenia Molecular de Plantas, Instituto de Ciências Biológicas,
14
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil 15
5Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de
16
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – UFG, Goiânia, GO, Brasil. 17
18
Autor correspondente: K. M. Corrêa/ T. N. Soares 19
E-mail: kassia_mc@hotmail.com/ tnsoares@gmail.com 20
21
Resumo 22
A identificação taxonômica de espécies em Manihot é complexa, devido à 23
plasticidade morfológica foliar, homogeneidade floral e frequente hibridização 24
natural exibida por representantes do gênero. Assim, estudos genéticos com 25
espécies do gênero podem auxiliar na caracterização dessas espécies. Considerando 26
que grande parte dos estudos de diversidade genética é realizada com Manihot 27
esculenta (mandioca), se faz importante conhecer a distribuição da variabilidade 28
genética dentro e entre populações das espécies M. orbicularis e M. 29
purpureocostata, endêmicas do cerrado goiano, com algumas características muito 30
33 semelhantes como, por exemplo, a morfologia floral, em alguns casos simpátricas e 31
com indícios de formarem híbridos naturais. Nesse trabalho foram utilizados dois 32
tipos de marcadores moleculares, cpDNA e SSR, para acessar a variabilidade 33
genética intra e interespecífica de M. purpureocostata e M. orbicularis. Foram 34
amostrados 310 indivíduos provenientes de nove populações, sendo cinco 35
populações de M. orbicularis, três de M. purpureocostata e uma população com 36
características morfológicas intermediárias entre estas duas espécies. Avaliou-se a 37
diversidade populacional e total, a estrutura genética por meio da análise de 38
variância molecular (AMOVA), o FST par-a-par e o agrupamento genético
39
bayesiano para cada marcador. As análises das populações de M. orbicularis e M. 40
purpureocostata evidenciaram alta diversidade genética, corroborando com o 41
encontrado na literatura para espécies congêneres, sendo a diferenciação genética 42
alta entre as populações de M. orbicularis e baixa entre de M. purpureocostata. A 43
população com características intermediárias foi agrupada com as populações da 44
espécie M. orbicularis. Foi detectada alta diversidade haplotípica associada à baixa 45
diversidade nucleotídica, o que sugere efeito gargalo nas populações, seguido por 46
rápido crescimento populacional e acúmulo de mutações, provavelmente 47
relacionadas à recente diversificação do gênero. Este estudo mostra grande variação 48
entre populações de M. orbicularis, demostrando um processo de diferenciação 49
entre as suas populações, possivelmente devido à deriva genética associada ao 50
baixo fluxo gênico. 51
52
Palavras Chave: cpDNA, especiação, microssatélite, variabilidade genética 53
54
Introdução 55
O processo de evolução de uma espécie está relacionado com a 56
distribuição da diversidade genética observada em suas populações, resultante do 57
equilíbrio das forças evolutivas que geram deriva genética e seleção e forças que 58
agem na promoção de fluxo gênico (Ellstrand 2014). Esses eventos permite avaliar 59
a origem e manutenção das espécies ao longo do tempo (Richardson et al. 2014). 60
No processo de especiação leva-se em consideração o isolamento 61
reprodutivo entre populações, sendo esse o pressuposto utilizado para conceituar 62
34 biologicamente uma espécie (Mayr 1942). No entanto, esse conceito assim como 63
outros são constantemente questionados, pensando nisso De Queiroz (2007) traz 64
uma proposta de conceito unificado de espécie. Nessa proposta o autor reconheceu 65
espécies como linhagens de metapopulações em evolução. Assim, apenas o 66
processo de evolução deveria ser considerado ao conceituar uma espécie, as demais 67
propriedades, como por exemplo, o isolamento reprodutivo será considerado como 68
contingente, ou seja, propriedades que podem ou não ser adquiridas durante essa 69
evolução. 70
Com o intuito de acessar a variabilidade genética e compreender 71
padrões de diversificação das espécies ao longo de sua história evolutiva, os 72
marcadores moleculares têm emergido como importante ferramenta, pois 73
permitem-nos acessar diferentes partes do genoma de uma espécie e assim 74
responder várias questões pertinentes ao material de estudo (Yu et al. 2013; Zheng 75
et al. 2017; Alves-pereira et al. 2018). A combinação de diferentes tipos de 76
marcadores, como os microssatélites nucleares e sequências intergênicas 77
cloroplastidiais é importante, pois permite avaliar padrões de divergência entre e 78
dentro de espécies (Yu et al. 2013; Alves-pereira et al. 2018). Marcadores nucleares 79
como os microssatélites (SSR), são úteis na detecção de fluxo gênico 80
contemporâneo, por demonstrar como a variabilidade genética encontra-se 81
distribuída atualmente (Petit et al. 2005). Enquanto que, os marcadores 82
cloroplastidiais (cpDNA) permitem fazer inferências sobre fluxo gênico histórico e 83
compreender processos ancestrais, que podem estar relacionados com processo de 84
diversificação de espécies próximas evolutivamente (Palma-Silva et al. 2011; 85
Rodrigues et al. 2014). 86
O gênero Manihot pertence à família Euphorbiaceae, tem origem no 87
Mioceno na região Mesoamericana (Chacón et al. 2008; Duputié et al. 2011), 88
distribui-se amplamente no continente americano (Nassar 2000), mas possui centro 89
primário de diversificação na região central do Brasil (Nassar 1978). Considerando 90
a distribuição de espécies de Manihot da América do Sul, acredita-se que a 91
diversificação iniciou no bioma Cerrado a cerca de 6 milhões de anos (Chacón et al. 92
2008; Duputié et al. 2011). Além disso, estudos baseados em filogenias moleculares 93
datadas de espécies endêmicas do bioma Cerrado, evidenciam que esse bioma se 94
originou recentemente, cerca de 10 milhões de anos (Simon et al. 2009). Assim, 95
levando em consideração o endemismo de espécies nesse bioma, o qual abriga 80% 96
35 das espécies de Manihot e a data de surgimento do bioma, pode-se verificar que 97
este último possui uma rápida diversificação relacionada ao Bioma (Chacón et al. 98
2008; Duputié et al. 2011). 99
As espécies do gênero Manihot apresentam hábitos variáveis, podendo 100
apresentar-se como arbustos e subarbustos ou árvores. No entanto, para esse gênero 101
a identificação taxonômica das espécies se torna complexa, devido à plasticidade 102
morfológica foliar, homogeneidade floral e frequente hibridização natural comum 103
entre seus táxons, particularmente, aqueles simpátricos e endêmicos do Cerrado 104
(Duputié et al. 2011). 105
Nesse trabalho foram utilizados dois tipos de marcadores moleculares 106
(cpDNA e SSR) para verificar os limites genéticos entre M. purpureocostata e M. 107
orbicularis espécies endêmicas do bioma Cerrado, haja vista as mesmas 108
compartilharem das folhas paralelas ao caule e rente a ele, dos racemos 109
subespicados com flores estaminadas agrupadas no ápice e as brácteas e bractéolas 110
de ambas as flores diminutas (até 2 mm comprimento) e apresentarem-se 111
simpátricas em áreas abertas do Cerrado sensu stricto, campos sujos, ou na 112
transição destes, desde áreas planas até topos de morros sobre solos argilo-arenosos 113
ou pedregosos (Inocêncio 2016), e portanto, apresentarem problemas de 114
delimitação taxonômica 115
Manihot orbicularis possui hábito ereto até 1,6 m, folhas orbiculares 116
ou suborbiculares com base e ápices obtusos a arredondados e frutos 117
conspicuamente arrestados na região de sutura dos carpelos, enquanto que M. 118
purpureocostata apresenta hábito ereto a decumbente e folhas ovais a largamente 119
lanceoladas ou combinações, nervuras róseas à vináceas e face abaxial glaucente e 120
frutos arrestados ou não na sutura dos carpelos (Rogers and Appan 1973; Inocêncio 121
2016). Portanto, M. purpureocostata e M. orbicularis fornecem um bom modelo de 122
estudo de divergência genética, e assim combinamos informações de dois 123
marcadores genéticos diferentes para abordar as seguintes questões: (1) como está 124
distribuída a diversidade genética entre as populações, tanto dentro quanto entre as 125
espécies? (2) Os dois marcadores utilizados apontam indícios de hibridização ou 126
alocam a população com características morfológicas intermediárias a uma das 127
espécies? 128
129 130
36 Material e métodos
131
Amostragem 132
Foram amostrados 310 indivíduos provenientes de nove populações, 133
sendo cinco de M. orbicularis (186 indivíduos), três de M. purpureocostata (93 134
indivíduos) e uma população com características morfológicas intermediárias (31 135
indivíduos), com tamanho amostral variando de 19 a 52 indivíduos por população 136
(Tabela 1). Ambas as espécies são endêmicas do Bioma Cerrado, sendo M. 137
purpureocostata e a população intermediária predominantemente encontradas no 138
Parque Nacional da Chapada dos Veadeiros (PNCV), e M. orbicularis com 139
ocorrência nas proximidades do PNCV e em Pirenópolis-GO (Figura 1). 140
141
Extração de DNA, genotipagem dos microssatélites e sequenciamento 142
A extração do DNA genômico foi realizada a partir de tecido foliar 143
fresco coletado e estocado em gel de sílica de acordo com o método proposto por 144
Doyle e Doyle (1987). Para genotipagem dos indivíduos foram utilizados nove 145
locos microssatélites transferidos de M. esculenta (GA 12, GA 21, GA 134, GA 146
126, GA 136, GA 131, GA 16, SSRY12 e SSRY 82) (Chavarriaga-Aguirre et al. 147
1998; Mba et al. 2001; Corrêa et al. 2018, artigo em preparação). As reações em 148
cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas para o volume final de 10 μL, 149
utilizando 4,5 ng de DNA e 0,18 μM de iniciadores (forward + reverse), 0,15 μM 150
de dNTP, 2,16 mg de BSA, 1X de tampão (Tris-HCl 10 mM [pH 8,3], 50 mM de 151
KCl, MgCl2 1,5 mM), DNA polimerase Taq 0,75 U. A amplificação seguiu os 152
passos de desnaturação inicial do DNA a 94°C durante 5 min; seguida por 30 ciclos 153
contendo os passos de desnaturação do DNA a 94º C por 1 min; anelamento dos 154
primers de 56 a 62°C (dependendo do iniciador) por 1 min; extensão da molécula 155
de DNA a 72º C por 1 minuto; extensão final a 72º C por 45 minutos. 156
A detecção dos fragmentos amplificados foi realizada por um sistema 157
automatizado de eletroforese capilar ABI Prism 3500 (Applied Biosystems®, CA) 158
e um padrão de tamanho GeneScan LIZ600TM (Applied Biosystems). Os 159
indivíduos foram genotipados utilizando o software GeneMapper 5.0 (Applied 160
Biosystems), sendo os genótipos confirmados em “escada alélica”, na qual se 161
37 realizou uma nova eletroforese capilar, com o número mínimo de indivíduos (em 162
duplicata) que continham todos os alelos de um dado loco. 163
Para a realização da PCR, selecionou-se 198 indivíduos dentre os 310, 164
com cerca de 22 indivíduos analisados por população com duas regiões intergênicas 165
cloroplastidiais: psbA- trnH (Shaw et al. 2005) e trnC-ycf6 (Demesure et al. 1995). 166
Em cada reação de PCR foi adicionado 4 μl de DNA e 11 μl de mix, contendo H2O 167
Milli-Q, primer (forward e reverse), BSA (Bovine Serum Albumin), tampão da 168
enzima 10X com MgCl2, dNTP’s e enzima Taq-DNA-polimerase, totalizando um 169
volume final de 15μl. 170
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit ExoSAP, 171
composto das enzimas Exonuclease I recombinante (Exo) e Shrimp Alkaline 172
Phosphatase (SAP), sendo que a cada 5 μl de produto de PCR foram adicionados 1 173
μl de Exo e SAP. As reações de sequenciamento foram realizadas nas duas direções 174
(forward e reverse) visando a determinação de acurácia das bases utilizando um 175
analisador automático de eletroforese capilar ABI Prism 3500 (Applied 176
Biosystems®, CA) e o kit de sequenciamento BigDye Terminator v3.1 Cycle. 177
Todas as etapas dos estudos moleculares ora apresentados foram realizadas no 178
Laboratório de Genética & Biodiversidade do Instituto de Ciências Biológicas da 179
Universidade Federal de Goiás. 180
181
Análise de dados 182
Locos microssatélites nucleares 183
Os locos microssatélites foram caracterizados para as duas espécies de 184
Manihot e a população intermediária, quanto a possíveis erros de genotipagem 185
relacionados à presença de alelos nulos, dropout e stutter no programa MICRO-186
CHECKER versão 2.2.3 (Van Oosterhout et al. 2004). Posteriormente, verificou-se 187
o poder de discriminação individual para cada loco e para o conjunto de locos, por 188
meio das estimativas da probabilidade de identidade genética (I) e da probabilidade 189
da exclusão de paternidade (Q), realizadas no programa IDENTITY 1.0 (Wagner e 190
Sefc 1999). Além disso, foram estimados os índices de diversidade genética por 191
loco: riqueza alélica, heterozigosidades esperada (He) e observada (Ho), teste de 192
equilíbrio de Hardy- Weinberg (HWE) e desequilíbrio de ligação, usando a 193
correção de Bonferroni, no programa GDA (Lewis e Zaykin 2002). 194
