PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM DEAE -CELULOSE

PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM

DEAE -CELULOSE

• Os assuntos abordados nessa aula são:

-

Dosagem de proteínas

-

Métodos cromatográficos para separação de

proteinas e para a separação de imunoglobulinas

unesp Prof. Helio José Montassier

Métodos de Isolamento de Biomoléculas

O

isolamento ou purificação

de uma proteína é uma etapa que precede

os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D

e a compreensão de suas propriedades biológicas.

Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou

seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína

individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais

eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

Métodos de purificação

1 proteína isolada

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:

1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)

3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)

Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas:

4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

Métodos de Isolamento de Biomoléculas

Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.

Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar

separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: separação de moléculas pela massa molecular

géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca iônica:

separação de moléculas pela carga elétrica

géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente

Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):

separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso géis possuem carácter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:

separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

- São reconhecidos, no mínimo, dois métodos diferentes que podem ser usados,

separadamente ou combinados, para se obter uma preparação de IgG ou de IgM com grau de elevada pureza. Um desses métodos é a cromatografia de troca iônica e o outro é a

filtração em gel. A cromatografia de troca iônica é um dos métodos mais conhecidos para se fazer a separação de proteínas séricas e o isolamento de imunoglobulinas. Esse método se fundamenta no fato de as proteínas apresentarem cargas elétricas e poderem se ligar

eletrostaticamente na matriz de troca iônica, a qual possui uma carga oposta à das proteínas. - A força de interação com que as proteínas se ligam a esse tipo de matriz de troca iônica depende da densidade de cargas elétricas da proteína bem como do pH e da força iônica do meio onde a proteína se encontra. Dessa forma, para se eluir (“desligar”) as proteínas

adsorvidas eletrostaticamente a esse tipo de matriz, deve-se aumentar a força iônica do meio, aumentando-se a concentração dos sais do tampão de eluição, uma vez que os sais

adicionados vão competir com as proteínas pelos sítios carregados dessa mesma matriz. - Outra forma de se promover a eluição é alterar o pH do tampão de eluição, pois, à medida em que o pH do meio onde se encontra a proteína se aproxima do ponto isoelétrico dessa mesma proteína, a somatória da carga elétrica da mesma se aproxima de zero, de forma que essa proteína perde a capacidade de continuar ligada à matriz de troca iônica.

• Há dois tipos básicos de matrizes de troca iônica: uma delas é recomendada para a interação com proteínas carregadas positivamente, sendo a matriz trocadora de

cátions, como é o caso do carboxi-metil-celulose (CM-celulose), enquanto que o outro tipo é recomendado para a interação com proteínas carregada negativamente, sendo a matriz trocadora de ânions, como o dietil-amino-etil-celulose (DEAE-celulose). No caso de se fazer a separação de IgG, a resina ou matriz recomendada é DEAE-celulose.

• O método mais indicado para se conseguir um melhor grau de pureza e de

rendimento da fração IgG é se fazer primeiramente a precipitação da fração gama-globulina de um soro sanguíneo com sulfato de amônio ou sulfato de sódio, tal como foi feito na aula anterior. Essa fração gama globulina depois de dialisada para se eliminar o excesso de sais usados na precipitação, depois de ter a sua concentração protéica determinada, é colocada em uma coluna previamente montada de DEAE – celulose. (Relação é de 10mg de proteína a ser purificada para 1ml da resina DEAE-Celulose)

Método de Dosagem de Proteínas das Frações

Gama-Globulinas Precipitadas com Sulfato de

Amônio.

Cromatografia de Troca Iônica em

DEAE-Celulose para Purificação de

2.- Método para preparação da coluna deDEAE–celulose para a separação de Ig G

2.1.- Materiais

2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento com soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH).

2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de

amônio e dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna de DEAE – celulose. A concentração protéica dessa coluna deve ser

previamente determinada.

2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e preparada para ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de cânulas de pequenas pinças para regulagem do fluxo da coluna.

2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0.

2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados com a numeração de 1 a 15.

2.2.- Método

2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar abrindo cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna para 12 gotas por minuto. Quando não houver mais tampão acima da resina e com a coluna fechada, deve ser adicionada a solução de gama globulina, com muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, abrir vagarosamente a coluna para deixar a solução de gama globulina entrar na resina, fechando a coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado de modo a permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir o fluxo da coluna, começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o

fluxo novamente para 12 gotas por minuto.

2.2.2.- Testar de cada fração colhida, por coloração rápida e com reativo

apropriado em uma microplaca, a presença de proteína, misturando-se l da fração com l do reativo.

2.2.3.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no

comprimento de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M pH 8,0.

2.2.4.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene a -20ºC para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.

Gama-Globulina

3ml 12 gotas/min

Concent raç ão Tempo ou volume Coletor de frações

Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica

Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.

Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia: Tempo 1 Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão Tempo 2 Tempo n Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações

Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada

com a resina, com base em propriedades moleculares como:

• massa molecular • carga elétrica • solubilidade • afinidade Amostra com diferentes componentes Resina embebida em tampão Tempo zero Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.

Cromatografia de troca iônica

A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.

Trocadora de ânions Trocadora de cátions

DEAE

CM

Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna

Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.

Na

Cl

+

A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 1) adsorção das proteínas com carga contrária à

resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga;

2) eluição das proteínas adsorvidas.

+ + + + + + + + + + +

No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):

Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina.

Mais frequentemente utiliza-se um aumento da

concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna.

PI ácido + básico -neutro -COOH -COO -NH₃ H+ + -H+ -NH₂

Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.

Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1

Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Proteínas apresentam carga positiva quando em meio ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em meio alcalino em relação ao seu pI.

Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.

A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos aminoácidos ácidos e básicos.

Carboximetil~celulose

(trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose_{(trocadora de ânions)}

Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica

Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição.

As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).

_ = = _ + + + + + (+) (+) (+) (+) 0. 10 M 0. 15 M 0. 20 M Eluição NaCl Não retidas

DEAE

CM

Tipos de Resina de troca Iônica

Tipos de Resina de troca Iônica

Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES

Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH₂N+_(CH

3)3 Troca aniônica

resina de polistireno

Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO₃-_{H Troca Catiônica}

resina de polistireno

DEAE -celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas - CH₂CH₂N+_(C

2H5)2 ácidas e neutras

CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas - CH₂COOH básicas e neutras

DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração básico - CH₂CH₂N+_(C

2H5)2 e troca iônica de proteínas

ácidas e neutras

CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração ácido - CH₂COOH e troca iônica de proteínas

básicas e neutras

Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular

grãos (beads) da resina com poros grão da resina poroso

proteína grande proteína pequena Tampão “empurra” moléculas através da resina tubos

Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.

Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo).

Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).

Moléculas com massas diferentes

Cromatografia de afinidade:

Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre

Desprezar proteínas não retidas Lavagem Eluição pH 2,0 ou sal Antígeno A puro Anti-A interage apenas com a proteína A -Mistura de proteínas Coluna empacotada com esse gel

Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-A Adsorção Complexo Ag-AC é desfeito Um dos métodos mais

eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto).

Ligante

grupo-específico

Especificidade

Proteína A Região Fc de IgG Proteína G Região Fc de IgG

Concanavalina A Grupos glicosil- ou

manosil-1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo - análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores

- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com “tag” ou “marcação”

- glutationa-S-transferase - poli-Histidina

2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina G, que permitem a purificação de

anticorpos por cromatografia de afinidade

Ligante

grupo-específico

Especificidade

Proteína A Região Fc de IgG Proteína G Região Fc de IgG

Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-Cibacron Blue Várias enzimas, albumina

lisina Plasminogênio, RNA ribossomal arginina proteinases tipo tripsina

benzamidina proteinases tipo tripsina

calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina heparina Fatores de coagulação, lipases,

hormônios, receptores estoróides, etc Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos

de His expostos

1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo - análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores

- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com “tag” ou “marcação”

- glutationa-S-transferase - poli-Histidina

2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

8-AEA-cAMP

8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate

(ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP)

Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que

permitem a purificação de anticorpos por cromatografia

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina.

A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco.

Estratégias para acoplamento de ligantes à resina Reagente Alvo no ligante

Braço espaçador covalente entre a resina e o ligante

Ligação reversível não covalente

ligante

Molécula-alvo (analito)

Preparo da resina de afinidade:

Passo 1. Ativação da resina

Passo 2. Acoplar o ligante

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