Controle Biológico e Microbiológico de Qualidade de Medicamentos (FFI 402) CONTROLE MICROBIOLÓGICO DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS

(1)

Controle Biológico e Microbiológico de Qualidade de

Medicamentos (FFI 402)

CONTROLE MICROBIOLÓGICO DE

PRODUTOS NÃO ESTÉREIS

(2)

Produtos não

-

est

é

reis

Conceito:

Admite-se carga microbiana limitada;

(cosméticos, formulações de uso tópico e orais).

Determinar a carga microbiana presente no produto; (qualitativo/quantitativo).

Objetivos:

Comprovar a ausência de m.o patogênicos e

determinar o número de m.o viáveis em função do tipo de utilização.

Agentes infectantes oportunistas (m.o saprófitas); Cepas patogênicas (proibitivos);

Pessoas imunossuprimidas;

Comprometer a estabilidade do produto, perda da eficácia terapêutica.

(3)

Fatores necess

á

rios

à

adequa

ç

ão dos n

í

veis de m.o

no produto terminado

Fatores diretos de contaminação: água, matérias-primas e material de

acondicionamento.

Fatores indiretos: limpeza, instalações inadequadas, pessoal não

paramentado ou submetido a exames periódicos…

Fatores que contribuem para ↑ ou ↓ da carga microbiana: a) Fórmula: ptn e carboidratos ↑

sacarose, sorbitol, propilenoglicol ↓

b) pH: Neutro (↑ m.o), ácidos e alcalinos (↓m.o)

b) Atividade da água: incorporação de conservantes

(4)

Padrões microbianos em produtos não est

é

reis

Primeiro insumo farmacêutico com especificação relativa à qualidade microbiológica: gelatina, USP XII 1942 (104 bactérias totais por grama);

Hoje: 103/g e ausência de patógenos específicos em 10g (USP XVIII).

Variações em função da origem da matéria prima, uso final, via de administração.

No Brasil: limite para levedura seca (2ª Edição), 7,5 x 103 _{bct/g e 50 fungos/g}

Fitoterápicos:

(Portaria 123, 1994) Especificação para matérias primas vegetais: < 105_{/g do total}

de viáveis; < 104_{/g fungos; < 10}3_{/g enterobactérias; ausência de Salmonella sp., S.}

aureus, P. aeruginosa, E. coli e Aspergillus.

Atualmente (outubro 2009): orientações aplicáveis a quaisquer formas farmacêuticas; presença de mos totais e patogênicos.

(5)

(6)

Para cosméticos,

CTFA

: seus padrões são

referência internacional:

- Tolerância de não mais que 500 UFC/g em

produtos para bebês e para a área dos olhos e < 10

3

UFC/g para todos os outros. E nenhum produto

deve conter conteúdo microbiano nocivo para o

usuário.

(7)

Produtos cosm

é

ticos

Tipo I: < 102 UFC/g de mo totais aeróbios, ausência de

Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus, coliformes totais e fecais em 1g(mL); ausência de clostrídios sulfito-redutores também em 1g (talco);

Tipo II: difere do acima no limite de aeróbios, < 103 UFC/g.

Tipo I: produtos para uso infantil, para área dos olhos, e

para os que entram em contato com mucosa;

Tipo II: demais produtos susceptíveis à contaminação.

(ANVISA 1997, padrão proposto Grupo de Microbiologia da Associação Brasileira de Cosmetologia)

(8)

a.Contagem de microorganismos mesófilos totais

aeróbios, não mais que 103_{UFC/g ou ml;}

Limite máximo: 5 x 103 _{UFC/g ou ml}

b.Ausência de Pseudomonas aeruginosa em 1g ou 1ml; c.Ausência de Staphylococcus aureus em 1g ou 1ml; d.Ausência de Coliformes totais e fecais em 1g ou 1ml; e.Ausência de Clostrídios sulfito redutores em 1g

(exclusivamente para talcos).

DEMAIS PRODUTOS

COSMÉTICOS SUSCEPTÍVEIS A CONTAMINAÇÃO

MICROBIOLÓGICA TIPO – II

a.Contagem de microorganismos mesófilos totais

aeróbios, não mais que 102_{UFC/g ou ml}

Limite máximo: 5 x 102 _{UFC/g ou ml}

b.Ausência de Pseudomonas aeruginosa em 1g ou 1ml; c.Ausência de Staphylococcus aureus em 1g ou 1ml; d.Ausência de Coliformes totais e fecais em 1g ou 1ml; e.Ausência de Clostrídios sulfito redutores em 1g

(exclusivamente para talcos).

PRODUTOS PARA USO INFANTIL

PRODUTOS PARA ÁREA DOS

OLHOS

PRODUTOS QUE ENTRAM EM

CONTATO COM MUCOSAS TIPO – I

LIMITES DE ACEITABILIDADE ÁREA DE APLICAÇÃO E FAIXA

ETÁRIA

(9)

M

é

todos

de

an

á

lise

2. Transporte e preparo da amostra para análise;

Envolvem tanto os medicamentos não estéreis quanto os cosméticos, abrangem três etapas fundamentais:

1. Amostragem, englobando coleta;

(10)

1. Amostragem:

Deve ser representativa

Critérios para obtenção da amostra:

• Sacos e barricas (pulverizados) fração da parte superior,

inferior e mediana.

•Assepsia na área próxima, vedação, líquidos

Coleta e Transporte

Temperatura adequada, material limpo, recipiente de boca larga

(capacidade para 100g(mL).

Quantidade a ser analisada 10g(ml) – 1g(ml)

(11)

Preparo da amostra

Presença de conservante Inativação do conservante;

Ajuste do pH;

Homogeneização da amostra;

(12)

2. M

2. Mé

é

todos de Contagem Microbiana

• Em meio sólido, com semeadura da amostra em

profundidade (

pour plate

);

• Em meio sólido, com semeadura da amostra em

superfície;

• Membrana filtrante;

(13)

2.

2. M

M

é

todos

de Contagem

de

Contagem

Microbiana

10 g (mL)

(Tampão fosfato ou NaCl-peptona pH 7,2) 1:10

3-5 dias (30-35°C, bactérias)

5-7 dias (20-25°C, fungos)

Meio sólido com semeadura da amostragem em profundidade (

pour

plate

) ou em superfície (

spread plate

)

1 - 2 mL

Limitação (Pour Plate): amostras q conferem opacidade ao meio, UFC/mL < 1 Limitação (Spread Plate): carga microbiana < 2 UFC/mL(g)

Ágar caseína-soja/ágar nutriente

Ágar Sabouraud-dextrose/ágar batata

(14)

Método spread plate harmonizado

• Adicionar em duplicata 0,1 ml no TSA e SDA e

espalhar nas superfícies dos meios prontos.

• Contar as placas com crescimento com menos

250 colônias para TAMC e menos que 50

(15)

Método pour plate harmonizado

• Adicionar 1 ml da diluição na placa (90 mm) e adicionar

15 a 20 ml de meio TSA e SDA em duplicata.

• Incubar TSA 30-35

o

_{C por 3 a 5 dias.}

• Incubar SDA 20-25

o

_{C por 5 a 7 dias}

• Contar as placas com crescimento com menos 250

colônias para TAMC e menos que 50 colônias para

TYMC.

(16)

Membrana filtrante:

Alíquotas (líquida), filtração através de membranas.

Depositadas nas placas

1. Filtração (membrana nitrato ou acetato de celulose 0,45 µm)

10mL ou 1g amostra (passagem membrana).

Diluir se necessário contagem entre 10 e 100 colônias.

Lavar;

1 membrana (para cada meio) Bactérias

Leveduras/Fungos

n° colônias desenvolvidas;

Cálculo UFC/g ou mL da amostra.

(17)

Método harmonizado

• Transferir quantidade validada para dois filtros.

• Lavar cada filtro com método validado;

• Depositar um filtro em TSA e outro em SDA;

• Incubar TSA 30-35

o

C por 3 a 5 dias.

(18)

2.

2. M

M

é

todos

de

Contagem

Microbiana

Incubação

Contagem das colônias

Cálculos

TAMC 2 / 4 4/2 = 2 Fator de Diluição: 10 20UFC/mL

Contador / Lupa / Iluminação artificial/ Contador / Registrador TYMC 1/2 = 0,5 Fator de Diluição: 10 <10UFC/mL

(19)

Contagem

(20)

N

ú

mero mais Prov

á

vel

Estimativa fundamentada em probabilidade;

Diluição seriada em tubos contendo meio de cultura e observação

do crescimento.

Diluição do ensaio Amostra inoculada

Tubos com todos

9ml 9ml 9ml 9ml 9ml

100 ₁₀-1 ₁₀-2 ₁₀-3 ₁₀-4 ₁₀-5

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Crescimento depois da incubação Sem crescimento Inóculo sem diluição 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

(21)

+ + -1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 100 ₁₀-1 ₁₀-2 ₁₀-3 ₁₀-4 ₁₀-5 Inóculo sem diluição 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml + + + + + + + + + + -3 -3 [-3 2 0] 0

Confrontar dados com tabelas estatísticas específicas

• Imprecisão maior que os outros métodos;

• Permitir maior revitalização dos mais debilitados; • Práticas para amostras pouco solúveis e translúcidas; • Útil quando se espera valores baixos de contagem.

(22)

(23)

Preparar pelo menos 3 séries com 3 tubos.

3 alíquotas de 1 g ou 1 ml são inoculados em 3 tubos

com 9 a 10 ml de TSB.

O mesmo para outras diluições.

Incubar todos os tubos não mais do que 3 dias.

Determinar o NMP na tabela (só TAMC).

(24)

Determinar a adequa

ç

ão do m

é

todo de contagem

Determinar se o método permite a detecção de mos na presença do

produto.

Usar <100 UFC do organismo a ser inoculado;

Recuperação deve estar dentro de 50%;

TAMC = Total aerobic microbial count (no TSA, incluindo fungos)

TYMC = Total combined yeast/mould count (no Sab.4%-Dextrose Agar, incl.

(25)

Crit

é

rios de aceita

ç

ão de qualidade

microbiol

ó

gica para formula

ç

ões não est

é

reis

S. aureus/ P. aeruginosa/ BG (-) bile-tolerante

101

102

Uso inalatório (prep. Líquidas para nebulização) E. coli 101 102 Preparações aquosas de uso oral E. coli 102 103

Preparações não aquosas de uso oral Organismos especificados: Ausência em 1g ou mL TYMC UFC/g TAMC UFC/g Via de administração *BP 2008 harmonizado

(26)

Pesquisa de

Pat

ó

genos

Espec

í

ficos

Principais patógenos pesquisados (devido a sua presença indesejada) nas formulações farmacêuticas.

Pseudomonas aeruginosa (prep. tópicas, colírios, regiões próximas aos olhos) Staphylococcus aureus (tópicos em geral)

E. coli (orais)

Salmonella sp (orais) Coliformes

(27)

Harmonização

Escherichia coli

Salmonella spp

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Clostridium sp

.

Gram (-) bile-tolerantes

Candida albicans

(28)

Testes de promo

ç

ão de crescimento

Validação de meios de cultura;

Utilizar cepas referência de coleções de culturas;

Níveis de inóculo < 100 UFC.

Recuperação deve ser com um fator de 2 do controle

(95% limite de confiança para NMP).

(29)

Procedimento

Procedimento –

–

Meios de Enriquecimento

Produtividade x Especificidade

10 g (mL)

Caldo caseína-soja (S. aureus e P.

aeruginosa).

Caldo lactose (Salmonella sp. e E. coli)

Incubação a 36 ± 1o_C

de 24 a 48h.

100 mL

Diferenciação: identificação do microorganismo

Transferir alíquotas dos meios de enriquecimento para meios de cultura de isolamento e diferenciação.

(30)

Staphylococcus aureus

(método harmonizado, 2008): Caldo caseína-soja (TSB)

30-35oC, 18-24h

Subculturas em ágar Manitol (colônias amarelas, halo amarelo). 30-35o_{C, 18-72h}

Confirmar por identificação.

Meios de diferencia

ç

ão

(31)

Pseudomonas aeruginosa

(HARMONIZADO)

TSB, 18-24h;

Subculturas em Ágar Cetrimida – colônias esverdeadas com fluorescência (18-72h); Ensaio de oxidase;

(32)

Escherichia coli

(HARMONIZADO):

Diluição do produto (≥1g ou 1mL) em TSB (30-35oC, 18-24h); Transferir 1,0mL do TSB para 100mL de Caldo MacConkey

(42-44o_{C, 24-48h);}

Subcultivo em placa com ágar MacConkey (30-35oC, 18-72h);

Confirmar por identificação.

(33)

Salmonella sp

(HARMONIZADO):

Diluição do produto (≥10g ou 10mL) em TSB (30-35oC, 18-24h); Transferir 0,1mL do TSB para 10mL de RVSEB (30-35o_C, 18-24h);

Subcultivo em meio ágar

xilose-lisina-desoxicolato (XLD) (30-35o_{C, 18-48h)}_{- colônias}

vermelhas, núcleo negro. Confirmar por identificação.

(34)

Clostridium sp

(HARMONIZADO):

Diluição do produto (≥1g ou 1mL) em TSB (20-25oC, 2-5h); Usar o volume de TSB correspondente a 1g do produto em 2 porções iguais;

Aquecer 1 parte a 80oC por 10min;

Transferir 10mL das alíquotas para 2 frascos com meio reforçado para Clostridia (crescimento em anaerobiose de 30 a 35oC, 48h); Subcultivo de cada tubo em ágar Columbia (anaerobiose de 30 a 35o_{C, 48h);}

Teste da catalase (é catalase -), e só pode apresentar crescimento anaeróbico.

(35)

Candida albicans

(HARMONIZADO):

Inocular 10mL de uma diluição 1:10 do produto (≥1g ou 1mL) em 100mL SDB, (30-35oC, 3-5 dias);

Subcultivo em placa SDA (30-35o_{C, 24-48h);} Confirmar por identificação.

(36)

Provas adicionais

Capacidade de fermentação de diferentes açúcares;

Aproveitamento de sais amoniacais como única fonte de nitrogênio; Uso do citrato como única fonte de carbono (Ágar Citrato);

Formação de acetoína (reação de Voges-Proskauer); Reação da peroxidase, coagulase, etc;

Detecção de micoplasma, micotoxinas.

(37)

FEuropeia – limite de ação para AP (100mos/100mL) e ApI (10mos/100mL)

USP, água bulk ou acondicionada como produto.

Limites de alerta e de ação.

Padrões microbianos: os níveis de carga microbiana para água de uso

industrial (bulk) inexistem, exceto ao se referir à água estéril. Situação

contornada por cada empresa pela adoção do seu próprio padrão

interno.

Potabilidade: legislações e pré-requisitos variados nos diversos países.

(38)

Água na Indústria

• Água Purificada – limite de ação 100UFC/mL

• Água Purificada Estéril – água purificada esterilizada em embalagem apropriada.

• Água Estéril para Injeção – água para injeção acondicionada e esterilizada. Diluente para produtos parenterais;

• Água Estéril para Irrigação ~AEI, especificação não inclui material particulado;

• Água Estéril para Inalação – Água para injeção esterilizada em embalagem apropriada. Cumpre com os requisitos da APE, exceto quanto ao pH, que deve estar entre 4,5 e 7,5.

• Água Bacteriostática para Injeção – reconstituição de injetáveis de dose múltipla a partir do mesmo frasco.

• Água para injeção (bulk).

(39)

Análise da água

Potabilidade – característica depende da legislação de cada país.

Principais indicadores de contaminação fecal:

Coliformes totais: bacilos Gram (-) não esporulados, aeróbios ou anaeróbios facultativos, fermentam a lactose a 35 – 37oC de 24 a 48h com produção de gás.

Espécies dos gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella (obs.

Enterobacter se multiplica no ambiente livre).

Coliformes fecais ou termotolerantes: fermentam lactose a 44,5 ± 0,2oC 24h. Seguramente somente a Escherichia coli.

(40)

Estreptococos fecais: origem da contaminação, predomina nas

fezes de animais; distância da fonte de contaminação;

Clostridium perfringens

: esporulado, indicador de contaminação

fecal muito remota;

Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, C. albicans

: indicativos

de tratamento não eficiente, pequeno tempo de sobrevida,

(41)

Padrões microbianos

Água potável: ausência de E. coli ou coliformes termotolerantes em

100mL;

Água na saída de tratamento: ausência de coliformes totais em

100mL;

Reservatórios e rede de distribuição: ausência de E. coli ou

coliformes termotolerantes em 100mL.

Quando cianobactérias > 20.000céls/mL: análise semanal de

cianotoxinas na água na saída do tratamento, na entrada de clínicas

de hemodiálise e indústrias de injetáveis;

Recomenda-se avaliar heterotróficos – indicativos das condições

de higiene.

MS, Portaria 36, 19/01/1990 MS, Portaria 518, 25/03/2004

(42)

Análise bacteriológica da água:

determinação quantitativa

Coleta

frasco estéril, desprezar a 1ª amostra, e mantê-la a

10

o

C se não analisar de imediato. Para amostras cloradas,

adicionar tiossulfato de sódio (0,1mL de solução a 10% para

100mL de água).

Contagem de viáveis totais valor absoluto sem

significado, controle somente sobre variação esperada, índice das

condições de higiene.

(43)

Identificação de coliformes totais e fecais:

Teste presuntivo: detecção de microorganismos que

fermentem a lactose.

Uso de caldos Lactose ou Lactose-SDS em tubos de Durham

invertidos. Formação de gás, resultado +

Membrana filtrante (meio Endo), colônias escuras, brilho

metálico +.

(44)

Teste confirmatório: há mos que não os coliformes que podem

fermentar a lactose como bacilos Gram (+) esporulados e leveduras.

Transferir amostras dos tubos + para tubos contendo meio seletivo Caldo Bile-Verde Brilhante que contém corante que impede proliferação de formas esporuladas e leveduras e componente que favorece proliferação de coliformes. O resultado é também a produção de gás a partir da fermentação da lactose.

(45)

Escherichia coli: caldo EC (lactose, proteases e sais biliares) Incubação a 44,5oC.

Em todas as etapas a contagem é realizada pela técnica de NMP, considerando a resposta positiva a fermentação da lactose.

(46)

Métodos alternativos

Custo x benefício

Controle da água na indústria

Contagem direta de células marcadas com fluoróforos: coloração com marcadores fluorescentes (para ácidos nucleicos). Nível detecção mo (viáveis x não viáveis), 2h.

ATP, luciferina, luciferase: detecção de qualquer tipo de microorganismo (limitação <102-103 UFC) (MicroCountTM _{digital, pré}

(47)

Automação e métodos alternativos para

enumeração microbiana

Contadores em espiral (↓ tempo e material) (4 x 102 _{a 4 x 10}5 _UFC);

AutoPlate 4000 (Spiral Biotech, USA) e ProtoCOL (Symbiosis, UK); Petrifilm e SimPlate, subtituição do crescimento tradicional em placa com ágar sólido;

Bioluminescência;

Epifluorescência direta (DAPI ou alaranjado de acridina);

Impedância: resistência ao fluxo de uma corrente alternada, que passa através de material condutor. Equipamentos disponíveis no mercado: Bactometer (BioMerieux) e Malthus AT – automatizados e avaliam > 100 amostras simultaneamente. Análise de quantidades grandes de amostra (de 10 a 100mL), ↑ sensibilidade.

(48)

Métodos rápidos para identificação microbiana

Sistemas miniaturizados e automatizados (exs. API e Vitek,

BioMerieux Inc

.).

Identificação genotípica: PCR, eletroforese de fragmentos de

DNA.

Cromatografia gasosa (Hewllet Packard) esterificação de ácidos

graxos produzidos pelo metabolismo de mos. Identificação de

cepas microbianas a partir de metabólitos específicos.

(49)

BD BBL™ Crystal™ - Sistema de Identificação de Microorganismos Clinicamente Relevantes

(50)